DE2847444A1

DE2847444A1 - Vorrichtung und hilfsmittel zur durchfuehrung mikroelektrophoretischer verfahren

Info

Publication number: DE2847444A1
Application number: DE19782847444
Authority: DE
Inventors: Benjamin Wolf Brunbaum
Original assignee: National Aeronautics and Space Administration NASA
Current assignee: National Aeronautics and Space Administration NASA
Priority date: 1977-11-10
Filing date: 1978-11-02
Publication date: 1979-05-23
Also published as: US4130471A; FR2408832A1; CH642454A5; GB2007711A; GB2007711B; DE2847444C2; ES474998A1; FR2408832B1; CA1116062A; ES481037A1

Description

Anmelder: NATIONAL AERONAUTICS AND SPACE ADMINISTRATION NASA Headquarters Washington, D.C, U.S.A.

Erfinder: Benjamin Wolf BRUNBAUM 112 Turk Drive Morago, Californien, U.S.A.

Vertreter: Dipl.-Ing. Meissner, Hans Dipl.-Ing. Bolte, Erich Patentanwälte, Sievogtstraße 21, D-2800 Bremen 1 Bundesrepublik Deutschland

Vorrichtung und Hilfsmittel zur Durchführung mikroelektrophoretischer Verfahren

Die Erfindung betrifft Gelplatten und Membranen, die mit Entwicklungsreagentien vorimprägniert sind und welche zur Ausführung neuer klinischer und medizinischrechtlicher Verfahren verwendet werden können, die durch die kürzliche Entwicklung mikroelektrophoretischer Apparaturen ausführbar geworden sind.

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In einer weiteren Patentanmeldung derselben Aniuelderin, nämlich P 27 52 029.2, die am 22.November 1977 eingereicht worden ist, ist eine in verschiedenen Richtungen verbesserte mikroelektrophoretische Vorrichtung beschrieben, durch welche mikroelektrophoretische Verfahren bzw. Untersuchungen stark vereinfacht und standardisiert werden. Diese Vorrichtung umfaßt (a) Modelle, in welchen sowohl eine Membran oder eine Platte in derselben, Grundapparatur verwendet werden kann, (b) Modelle, in welchen die zweidimensionale Zerlegung einer Eiweißprobe, die auf eine gelgefüllte Schale bzw. Platte aufgebracht worden ist, ermöglicht wird und (c) einen Probenapplikator und weitere Hilfsmittel, die das gleichzeitige und präzise Einsetzen und Ausrichten von beispielsweise 10 Proben erlauben.

Diese Apparatur kann in vorteilhafter Weise mit verschiedenen konventionellen Vorrichtungen und Techniken, die mit in einzelne Abteile unterteilten Gelplatten bzw. -schalen arbeiten, wie sie von Siebert et al. in US-PS 3 616 387 (vgl. Figur 5 und Spalte 3, Zeilen 53 bis 55) beschrieben sind,und mit geschlitzten Membranen, wie sie von Zec in US-PS 3 317 418 (vgl. B'igur 7) beschrieben sind, verwendet werden. Auch bei Verwendung zusammen mit den in der vorliegenden Anmeldung erläuterten Hilfsmitteln ermöglicht sie den Forschern und Laboratoriumstechnikern eine neue und verbesserte Methodologie zur Trennung spezifischer Proteine des Blutes in Mikrolitermengen. Diese spezifischen Proteine werden dann durch Anwendung von immunologischen Techniken oder - häufiger - durch Anwendung von Indikatorfarbstoffen, die sich chemisch mit einer ganz bestimmten und keiner anderen Eiweiß- bzw. Proteinart verbinden, identifiziert. Die Berührung dieser Farbstoffe mit den für die Elektrophorese bestimmten Pro-

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ben erfolgt in der Form eines Überzuges, und zwar entweder als Celluloseacetatmembran auf Gel oder als Gel auf einer Celluloseacetatmembran. Die Überzüge sind mit dem geeigneten spezifischen Substrat vorimprägniert worden, so daß auf der Celluloseacetatmembran ein permanenter visueller Nachweis des Musters erzeugt wird, gleichgültig, ob die Membran als Unterlagemedium oder als Überzug dient. Diese Technik ist von Grunbaum in der Arbeit ^MAn Automatic One-to-Eight Sample Applicator for Fast Qualitative and Quantitative Microelectrophoresis of Plasma Proteins...", Microchem. J. 20, 495-510 (1975) beschrieben worden.

Die Apparatur ist anwendbar in der reinen Forschung sowie auf den Gebieten der Medizin, Immunologie, Genetik, Biochemie und der Gerichts-Naturwissenschaft.

Elektrophoretische Verfahren, die in erheblichem Maße die Anwendbarkeit der Apparatur erhöhen, umfassen Bestimmungen signifikanter polymorpher Enzymsysteme wie Milchsäure-Dehydrogenase (LDH), alkalische Phosphatase (AP) und Kreatin-Phosphokinase (CPK). Sie kann für diagnostische Zwecke zur Bestimmung von spezifischen Antikörpern von Antigenen im Blut verwendet werden. In Gerichtslaboratorien kann sie zur Phänotypisierung genetischer Varianten von Enzymen oder anderen Proteinen im Blut zum Zwecke der Identifizierung oder Individualisierung dienen.

Eine partielle Liste der Faktoren im Blut, die unter Verwendung der Apparatur bestimmt werden können, umfaßt folgende Substanzen:

Milchsäure-Dehydrogenase (LDH)

alkalische Phosphatase (AP) Kreatin-Phosphokinase(CPK) Erythrocytsäure-Phosphatase (EAP)

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Glucose-ö-phosphat-Dehydrogenase (G-6PD) Adenylatkinase (AK) Hämoglobin (Hb)
Haptoglobin (Hp)

gruppenspezifische Komponente (Gc)

Lipoprptein (Lp)
Adenosin-Deaminase (ADA) 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (6-PGD) Glyoxylas-e I (GLO-I) Glutamin-pyruvin-transaminase (GPT)

Esterase D (EsD)
Glutathion-Reduktase (GsR) Immunoglobuline (Ig)

Eine Methodologie zur Phänotypisierung weiterer Systeme befindet sich in der Entwicklung.

Die Erfindung betrifft spezielle Gelschalen- und Deckeleinheiten, welche für die Elektrophorese geeignete Gele enthalten, sowie, in besonderen Ausführungsformen, eines oder mehrere spezifischer Substrate zum Sichtbarmachen von Proteinen, die der Elektrophorese unterworfen worden sind. Diese Schalen sind vorzugsweise durch Parallelrippen, die sich von ihrer flachen Bodenfläche aus nach oben erstrecken, in mehrere Abteile unterteilt, so daß die gleichzeitige Analyse verschiedener Parameter möglich ist.

Die Erfindung betrifft weiterhin/Membranen, die mit spezifischen Substraten zur Sichtbarmachung von Proteinen, die auf den <Jelschalen der Elektrophorese unterworfen worden sind, vorimprägniert sind. Diese Membranen können eine Unterlageschicht aus festem Polyester aufweisen und so nach dem Gebrauch dauerhaft lagerfähige Elektrophoretogramme darstellen.

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Die beschriebenen Schalen und Membranen sind so ausgestaltet, daß sie sich zur Verwendung in der kürzlich entwickelten verbesserten elektrophoretischen Apparatur eignen, die in der weiter vorn bereits genannten Patentanmeldung beschrieben ist.

Mit Hilfe dieser Vorrichtungen ist es jetzt unter anderem möglich, genau und schnell gleichzeitige elektrophoretische Trennungen mehrerer polymorpher Proteinsysteme unterschiedlichen Ursprungs oder unterschiedlicher Natur, sowohl auf einem Gel als auch auf einer Membran durchzuführen und sichtbare Nachweise von Mustern zu entwickeln, die durch Berührung der der Elektrophorese unterworfenen Proben entweder mit einer Membran oder einem Gel (entsprechend der jeweiligen Situation) entwickelt worden sind, wobei die Membran oder das Gel mit einem geeigneten spezifischen Substrat zum Sichtbarmachen des der Elektrophorese unterworfenen Proteinsystems vorimprägniert worden ist.

Die Verfügbarkeit der neuen abgepackten Gele und Membranen, beide für die Elektrophorese und, wenn mit spezifischen Substraten vorimprägniert, zur Entwicklung der elektrophoresierten (d.h. elektrophoretisch behandelten) Proteine, erlaubt ein hohes Ausmaß an Standardisierung zwischen weit auseinanderliegenden Laboratorien. Eine solche Verbesserung wird auf medizinisch-diagnostischem Gebiet willkommen sein, von ganz unschätzbarem Wert ist sie jedoch bei Massenuntersuchungen auf dem Gebiet der Phgnotypie, wie sie sowohl in der genetischen Forschung als auch zu Identifizierungszwecken für gerichtliche Untersuchungen u.a. durchgeführt werden.

Die beigefügten Zeichnungen dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung. In den Zeichnungen bedeuten

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Figuren 1A bis U

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eine Darstellung zweier Ausfuhrungsformen der Grundapparatur gemäß der Erfindung in auseinandergezogener Form und im Querschnitt: links mit einer Membran und einer Membranbrücke; rechts mit einer Gelschale und einer Geltemperaturkontrollplatte;

Figur 2 einen Querschnitt durch die zusammengesetzte Apparatur mit Membran und Membranbrücke;

Figur 3

Figuren 4A bis 4D

eine Vorderansicht des Tanks von Figur 1 zusammen mit einer Gelschale und einer Temperaturkontrollplatte ;

eine auseinandergezogene Vorderansicht der Apparatur von Figur 2 mit Membran und Membranbrücke ;

Figur 5

Figur 6 Figur 7 eine Seitenansicht der Temperaturkontrollplatte, die mit der Gelschale benutzt wird;

eine Detailansicht der Applikator spitze von Figur 1;

eine Draufsicht auf eine in Abteile unterteilte Schale;

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Figuren 7A und

24.10.7β

Querschnitte durch die Gelschale mit den Abteilen von Fi gur 7 sowie einer Gelschale ohne Unterteilungen;

Figur eine Draufsicht auf einen einrastenden, dicht schließenden Deckel für die Gelschalen von Figuren 7 und 8;

Figur

Figuren 12 und

Figur

einen Querschnitt durch die Vorderansicht einer Gelschale mit Abteilen bzw. Unterteilungen, die zur Aufnahme eines Gleitdeckels bestimmt ist;

Querschnitte durch die Vorderansicht einer weiteren Ausführungsform einer Gelschale mit Abteilen, auf die der Gleitdeckel aufgesetzt ist;

einen Querschnitt durch die Vorderansicht einer Schale mit Deckel, wobei die Schale ein Gel enthält, welches von einer geschlitzten Membran überlagert ist;

eine Draufsicht auf eine in vier Abteile unterteilte Schale, welche ein Gel enthält und eine über dieses gelegte, geschlitzte Membran;

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Figur 16

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einen Querschnitt durch die Vorderansicht einer Schale gemäß Figur 15 zusammen mit dem einschieb baren Deckel (Gleitdeckel);

Figur 17

10

eine Draufsicht auf ein geschlitztes Blatt Filterpapier, welches mit verschiedenen Ent-Wicklergemisehen zum Entwickeln der elektrophoresierten Proteine imprägniert ist;

Figur 18

15

eine Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform des geschlitzten Blattes von Figur 17» welches aus einer Polyester-Grundschicht besteht, welche mit Celluloseacetat beschichtet ist;

Figur 18A

Figur 19

20

25

Figur 20

30

einen Querschnitt durch das Blatt von Figur 17»

einen Teil eines entwickelten Elektrophoretogrammes, auf welchem drei Proteingemische in Gegenwärt von je zwei geeigneten Protein-Standardpräparaten in zwei verschiedenen Konzentrationen getrennt worden sind;

eine Draufsicht auf eine viereckige Schale mit einer eingegossenen Schicht eines Geles, welches mit Ampholinen, die zum Elektrofokussieren dienen, ver-

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vermischt ist;

Figur

eine Draufsicht auf eine viereckige Schale, die mit einem zuvor eingegossenen Gel gefüllt ist, welches zur Elektrophorese des Haptoglobin-Hämoglobin-Komplexes oder anderer Proteine dient;

Figur

10

eine Vergrößerung des Bereiches der Schale von Figur 21, in welcher die die Probe aufnehmenden Vertiefungen in dem Gel angeordnet sind;

15

Figur 22A den Bereich der Schale von Figur

22, jedoch versehen mit einer entfernbaren geschlitzten Wegwerfschablone aus Plastikmaterial;

Figur 22B einen Querschnitt der Vorderansicht der Schalen-Schablonen-Einheit von Figur 22A;

Figur 23 eine Draufsicht auf eine Schale 20 mit einem zuvor eingegossenen Gel,

welches für die Uberkreuz-Elektrophorese bestimmt ist.

Die Apparatur der eingangs genannten Anmeldung wird zunächst mit Bezug auf die Figuren 1A bis 1F, 2 und 4 25 soweit es sich um die Ausführungsform mit einem Membransystem handelt - und mit Bezug auf die Figuren 1A, 1B, 1E bis U und 3 - soweit es sich um die andere Ausführungsform mit einem Gel handelt - beschrieben. Die einzelnen Figuren werden gleichzeitig erläutert, um Wieder-

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holungen zu vermeiden und die Zusammenhänge zu verdeutlichen.

Hinsichtlich des Membransystems zeigen die Figuren 1 und 2 Querschnitte der Apparatur in auseinandergezogener und zusammengesetzter Form, während die Figuren 4A bis 4D eine auseinandergezogene Vorderansicht derselben Teile darstellen.

Die Vorrichtung besteht aus einem Tank bzw. Behälter 10, welcher eine Elektrolytlösung (nicht dargestellt) enthält. In dem Behälter sind Zwischenwände 19 fest angeordnet. Weiterhin sind entfernbare Zwischenwände 24, eine Scheidewand 23, Elektrodenrahmen 26 und 28, welche sich aus Schlitzen in der Innenwand 8 bis in Schlitze in der Innenwand 9 erstrecken, vorgesehen. Auf der Scheidewand 23 sitzen ein Membranhalter 14 und zwei der entfernbaren Zwischenwände 24. Man erkennt weiterhin die Nut 20 des Membranhalters 14, die am oberen Ende der Scheidewand 23 anliegt. Der Membranhalter 14 weist Zungen 21, 22 und Zähne 18 auf. Die Zähne 18 greifen in in Perforationslöchern in einer Membran 16 ein und halten den Mittelteil der Membran gespannt. Die Enden der Membran 16 tauchen in die Elektrolytlösung (nicht dargestellt) ein. Die Membran muß aus einem Material hergestellt sein, das die Elektrolytlösung in alle Bereiche derselben saugt, so daß die Membran stets gesättigt bleibt. Darüberhinaus muß die Membran eine ausreichende Festigkeit aufweisen, um der Kraft der Zähne zu widerstehen, wenn sie naß ist. Die Membran kann beispielsweise aus Celluloseacetat, Papier oder dem Material Cellogel hergestellt sein. Eine Celluloseacetatmembran kann als beständiger Nachweis der Analyse aufbewahrt und gelagert werden.

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Eine Applikatoreinheit 30 paßt auf die Abdeckung 12. Die Applikatoreinheit ist mit zwei Füßen 33134 ausgestattet. Der Fuß 34 weist einen von.ihm abstehenden Registrierstift 38 auf, während der Fuß 33 mit einem abstehenden Laufstift 35 ausgestattet ist. Der Registrierstift 38 und der Laufstift 35 sind so ausgebildet, daß sie in einen, Laufstiftschlitz bzw. Registrierstiftloch an der Abdeckung 12 bzw. dem Probenhalter eingreifen können.

Die Abdeckung 12 weist männliche und weibliche Verbindungen 11,13 auf, welche den Kontakt mit dem Elektrodendraht 29 über Federzwischenverbindungen 15 bzw. 17 an dem Elektrodenrahmen 926 herstellen. Wenn die Abdeckung 12 von dem Behälter 10 abgenommen wird, wird die elektrische Verbindung zu dem Elektrodendraht 29 durch die Federverbindungen unterbrochen. Der Elektrodendraht 29 ist in seinen Einzelheiten in Figur 1B dargestellt. Ein Platindraht 29 läuft um den geschlitzten Umfang des Elektrodenrahmens 26. Der Draht ist mit Metallkontakten 25 und 27 verbunden, die eine Leitung zu den Federverbindungen 15 und 17, die in Figur 2 dargestellt sind, herstellen. Wie man aus Figur 4D erkennt, sind die beiden Elektrodenrahmen 26 und 28 in den Behälter 10 eingesetzt, welcher in seinen Wänden Schlitze aufweist, die die Rahmen aufnehmen können.

In den Figuren 1F und 4A ist die Applikatoreinheit dargestellt, welche mehrere Applikatorknöpfe 39 aufweist, die ihrerseits dazu dienen, einen Applikator zu halten, der in seinen Einzelheiten in Figur 6 dargestellt ist.

Die Applikatorknöpfe 39 werden mit einer Anzahl von Blattfedern 45 gehalten, die jeden Knopf einzeln an seinem Platz halten. Ein Freigabeknopf 40 ist mit einem

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verlängerten Arm 41 ausgestattet, der sich über alle parallel ausgerichteten Blattfedern 45 erstreckt. Wird der Knopf 40 nach unten gedrückt, so werden alle Blattfedern freigesetzt, was dazu führt, daß alle Applikatorknöpfe 39 infolge der Schwerkraft nach unten fallen. Der Freigabeknopf 40 ist mit einer Nut 42 ausgestattet, in welche, wenn der Knopf in der heruntergedrückten Stel lung ist, ein Verschlußstab 44 eingreift, so daß der Freigabeknopf in der unteren Stellung gehalten wird. Wird der Applikator nicht betätigt, so sitzt eine Schutzkappe (nicht dargestellt) über der öffnung in der Abdeckung 12.

In Figur 6 sind weitere Einzelheiten der Applikatorspitze 46 gezeigt. Die Applikatorspitze weist eine Kapillaröffnung 47 zur Aufnahme der Probenflüssigkeit auf. Die Applikatorspitze 46 wird durch zwei unter Federkraft stehende Splinte 49 an ihrer Stelle gehalten, so daß die Spitze leicht entfernt werden kann.

Die Applikatorspitze 46 kann unterschiedliche Länge oder Breite aufweisen, um so beispielsweise die Menge der darin enthaltenen Probe zu verändern oder um mehr als eine Aufbringungsstelle zu versorgen.

In den Figuren 1D und 4C ist der Membranhalter 14 in allen Einzelheiten dargestellt. Der Membranhalter ist einstückig aus einem flexiblen Plastikmaterial gegossen. Der Halter weist Zähne 18 auf und läßt sich nach innen biegen, so daß die Zähne 18 in die entsprechenden Perforationslöcher in einer Membran 16 eingreifen. Nach dem Freigeben geht von dem Halter 14 eine Zugkraft auf die Membran aus, so daß letztere gespannt gehalten wird. Um ein Reißen der Membran zu verhindern, sind die Zähne 18 vorzugsweise heibzylindrisehe oder zylindrische

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Vorsprünge, während die Membran-Perforationslöcher 113, siehe Figur 19, rund sind.

Das elektrophoretische Gelsystem wird durch die Figuren 1A, 1B, 1F bis U, 3 und 5 verdeutlicht, welche einen auseinandergezogenen Querschnitt und eine Vorderansicht der zusammengesetzten Teile zeigen. In diesem System sind die Membran 16 und der Membranhalter 14 durch eine Gelplatte oder -schale 103, eine Geltemperaturkontrollplatte 80 und einen Fließpapierstreifen 107 ersetzt.

Die Temperaturkontrollplatte 80 ist mit vier Haltern ausgestattet, von denen zwei, nämlich 82 und 84, gezeigt sind. Die Halter 82 und 84 dienen dazu, eine viereckige Schale 103 aufzunehmen und an der Stelle zu halten. Die Schale 103 enthält das Gelmaterial 104, z.B. ein Agarosegel, welches zur Lipoproteintrennung verwendet werden kann. Eine Temperaturkontrollflüssigkeit, die von der Flüssigkeitszufuhr 99 durch die Zuführöffnung zugeführt und durch die Abführöffnung 102 abgeführt wird, zirkuliert in der Platte 80; vgl. Figur 5.

In Figur 3 ist die Temperaturkontrollplatte 80 in dem Behälter 10 angeordnet. Die quadratische Schale 103 mit dem Gel 104 ist auf die Platte 80 gesetzt und wird von den Haltern 82,84 an Ort und Stelle gehalten. Die Schale 103 ist vorzugsweise aus einem Material hergestellt, das eine gute elektrische Isolierungswirkung hat und eine gute thermische Leitfähigkeit aufweist. Darüberhinaus muß die Schale gegenüber der ElektrolytflUssigkeit inert sein. Da die Platte zur Aufnahme einer quadratischen Schale ausgebildet ist, ist eine Drehung des

Gelmediums um 90° möglich. Eine größere Auftrennung kann erreicht werden, wenn man zwei Wanderungsrichtungen auf dem Gel 104 zuläßt. Zuerst wird die Probe auf

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einem linearen Weg durch den elektrischen Strom auseinandergezogen. Danach wird die Gelschale um 90° gedreht und es wird eine zweite Trennung in einer Richtung senkrecht zur ersten Richtung vorgenommen.

Der Kontakt mit der Elektrolytlösung erfolgt über die Dochte 106,108, welche an den Rändern auf dem Gel aufliegen und sich nach unten durch Dochtlöcher (nicht dargestellt) in der Platte 80 in die Elektrolytlösung erstrecken. Der Behälter 10 weist Dochthalter 110 und 111 auf, die die unteren Enden der Dochte aufnehmen und diese in der Elektrolytlösung an der Stelle halten. Die Dochthalter verhindern, daß die Dochte von dem Gel abgleiten und sie richten die Dochte aus, so daß sie das Gel 104 gleichmäßig über die ganze Oberfläche berühren. Die Ausrichtung der Dochte verhindert, daß sich ein Kontaktgradient ausbildet. Die Dochte 106 und 108 können beispielsweise aus Filterpapier oder einem Kunststoffschwamm-Material bestehen.

Während des Elektrophoreseprozesses fließt elektrischer Strom durch das Gel 104 und bewirkt dabei die Entstehung von Wärme in dem Gel. Durch die thermische Leitfähigkeit in dem Gel werden die Banden verbreitert, was zu Fehlern führt infolge einer ungenügenden Auftrennung. Diese Verbreiterung der Banden wird erleichtert, wenn man eine Flüssigkeit durch die Platte 80 leitet, deren Temperatur niedriger ist als die Umgebungstemperatur. Bei einigen Maßnahmen hat es sich als günstig erwiesen, wenn die Plattentemperatur bei etwa 4⁰C liegt. Fließpapierstreifen 107, die aus demselben Material hergestellt sind wie die Dochte 106,108 und die mit der Elektrolytlösung imprägniert sind, sind längs der Ränder der Oberfläche des Gels 104 angeordnet, um den elektrischen Kontakt zwischen dem Gel und den Dochten während der Elek-

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trophorese zu erleichtern.

Die restlichen Figuren erläutern verschiedene Ausführungsformen von Schalen und Deckeln bzw. Abdeckungen (Figuren 7 bis 16 und 20 bis 21A) sowie von Membranen (Figuren 17 bis 19) gemäß vorliegender Erfindung, die in der eingangs erwähnten Apparatur zur Durchführung diagnostischer Untersuchungen und zur Identifizierungzwecken verwendet werden·können.

In Figur 7 erkennt man eine Draufsicht auf eine Elektrophoreseschale 120, welche im wesentlichen aus einem quadratischen Behälter mit flacher Bodenfläche 128 und einer umlaufenden Wand 122 besteht. Eine Anzahl von geraden Unterteilungsrippen 121 trennen die Schalenfläche in einzelne Abteile, die dauerhaft gekennzeichnet sind, indem in jedes Abteil 160 ein Buchstabe eingedruckt ist. Die umlaufende Wand kann mit einer oberen Kante 123 versehen sein, die eine Schulter 129 bildet, die mit einem entsprechenden umlaufenden Rand an einer Abdeckung zusammenwirkt. Die in Abteile unterteilte Schale 120 ist in Figur 7A im Querschnitt dargestellt. In Figur 8 ist daneben, ebenfalls im Querschnitt, eine Ausführungsform einer üblichen Gelschale 103 dargestellt, die mit einer Gelschicht 104 gefüllt 1st.

Figur 9 zeigt eine Art einer Abdeckung für Gelschalen 103,120, welche im wesentlichen aus einer dünnen flachen Platte 127 besteht, welche einen umlaufenden Rand 126 aufweist und so ausgebildet ist, daß sie dicht in den umlaufenden Rand 123 an der Schulter 129 der Gelschalen 103,120 paßt. Eine zusammengesetzte Anordnung aus Schale und Abdeckung erkennt man in Figur 14. Diese besteht aus der Schale 120, der Abdeckung 125, der Gelschicht 104 und der geschlitzten Membran 95₁ alle im Querschnitt

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dargestellt. Die Ausführungsformen aus Schale und aufpreßbarer Abdeckung, die in den Figuren 7 bis 9 und dargestellt sind, können außerdem mit verschiedenen üblichen Hilfsmitteln zum dichteren Verschließen der Einheit und zum Stapeln versehen sein.

Die Figuren 10 bis 13 zeigen weitere Ausführungsformen der Schalen und Abdeckungen gemäß vorliegender Erfindung, wobei entweder eine Abdeckung 135 in einer von den Wänden einer Schale 130 gebildeten Laufrille oder aber eine Schale 140 in einer von den Wänden einer Abdeckung 145 gebildeten Laufrille gleitet. Eine ausreichende Abdichtung der zusammengefügten Einheiten aus Schale und Abdeckung kann auf verschiedene Weise erreicht werden. Beispielsweise können sowohl die Scha-Ie 140 als auch die Abdeckung 145 an gegenüberliegenden Seiten mit senkrecht zu den Laufrillenwänden 131» 132 verlaufenden Endwänden (nicht dargestellt) versehen sein, so daß die Enden der Einheit geschlossen sind. Es ist auch möglich, flache ebene Flächen (nicht dargestellt) oder Schultern in den Endwandbereichen der Schalen vorzusehen, die dicht mit den Abdeckungsflächen zusammenpassen und so eine zusätzliche Abdichtung bilden.

Figur 15 zeigt in der Draufsicht eine Schale, die der von Figur 14 entspricht, jedoch mit der Ausnahme, daß die Schale nur drei sie unterteilende Stege bzw. Rippen 121 aufweist. Kreisförmige Löcher II3 dienen zur Aufnahme der Zähne 18 des Membranhalters 14, der in den Figuren 1D und 4C gezeigt ist. In der Figur 15 sowie im Querschnitt derselben Schale, die in Figur 16 gezeigt ist, erkennt man also eine Schale 130 mit vier Abteilen, die von den drei Stegen bzw. Rippen gebildet werden. Man erkennt weiterhin in Figur 16 die

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zwischen den Laufrillen 131 gleitende Abdeckung 135. Die Abteile sind mit einem Gel 104 gefüllt, auf welchem die Elektrophorese verschiedener Blutenzym- und Proteinsysteme durchgeführt worden ist, sowie eine geschlitzte Membran 95, welche vier Streifen 160 aufweist, die mit den Buchstaben A, B, C und D markiert und durch Schlitze 96 getrennt sind. Die geschlitzte Membran liegt über dem Gel, so daß sie die Proteine auf dem Gel mit den Enzymsubstraten oder Farbreagentien, mit denen sie zuvor imprägniert worden ist, in Berührung bringt. Auf diese Weise ist beispielsweise eine Blutserumprobe, welche die Isoenzyme der Milchsäure-Dehydrogenase (LDH) enthält, auf das Gel 104 im Abteil A der Schale 130 aufgebracht worden, welches nach der elektrophoretischen Trennung mit dem Streifen A der Membran 95 in Berührung gebracht wurde, der zuvor mit Tetrazoliumfarbstoff oder anderen üblichen Komponenten imprägniert worden ist, die dazu dienen können, das Elektrophoretogramm dieses bestimmten Enzymsystems sichtbar zu machen. In entsprechender Weise wurden die anderen Abteile und Streifen (B,C,D) verwendet, um die Komponenten verschiedener polymorpher Enzyme des Blutes sowie anderer Proteinsysteme entweder aus der gleichen Blutprobe oder aus Blutproben verschiedenen Ursprungs festzustellen und zu identifizieren. In den übrigen Abteilen und unter Verwendung der Streifen B, C bzw. D wurden so Kreatin-Phosphokinase (CPK), alkalische Phosphatase (AP) und Gesamt-Protein gleichzeitig elektrophoretisiert und entwickelt; vgl.

ebenfalls Figur 15.

Die Figuren 17 und 18 zeigen Draufsichten auf Teile von zwei verschiedenen geschlitzten Membranen, die mit Substraten oder anderen farberzeugenden Reagentien vorimprägniert worden sind, welche für die Proteinsysteme,

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die in den Zeichnungen angegeben sind, erforderlich sind.

So erkennt man in Figur 17 fünf Streifen 116 einer durch Schlitze 96 getrennten Membran 115, die mit den Buchstaben A, B, C,D und E bezeichnet sind und die sich bis zu den umlaufenden Randflächen 116 erstrecken. Die ganze Membran 115 kann aus Filterpapier hergestellt sein, wobei die Randflächen 116 mit Paraffin getränkt und die einzelnen Streifen mit Substraten oder Ent-Wicklungsflüssigkeiten imprägniert sind, die für die angezeigten Enzym- und Proteinsysteme, nämlich LDH(A), CPK(B), Plasmaprotein(C), Hämoglobin(D) sowie andere Systeme(XYZ)(E) erforderlich sind. Nach dem Entwickeln kann die getrocknete Membran als dauerhafter Nachweis des Elektrophoretogramms aufbewahrt werden.

In den Figuren 18 und 18A ist ein undurchlässiger Typ einer Membran dargestellt. Auch hier ist die Membran 136 wiederum durch Schlitze 96 in Streifen geteilt, wobei Jeder Celluloseacetatstreifen (A,B,C,D) mit einem bestimmten Enzymsubstrat und/oder Farbentwicklungssystem wie angezeigt, nämlich CPK, LDH, Phosphoglucomutase (PGM) sowie anderen Systemen (XYZ) auf dem Streifen A, B, C bzw. D imprägniert ist. Ein wesentliches Kennzeichen dieser bestimmten Membran ist jedoch, daß die Celluloseacetatstreifen 138 von einer inerten, resistenten und nicht porösen Polyesterplatte 137 (Mylar-Polyester) getragen werden, wie sich besonders deutlich aus Figur 18A ergibt, einem Querschnitt durch die Membran von Figur 18. Weitere Polymersubstanzen wie Polyamide, Polyimide, Polyäthylen, halogenierte Polyäthylene u.a. können ebenfalls anstelle eines Polyesters als inerte nicht poröse Unterlageplatte dienen, wenn dies im Einzelfall erwünscht ist.

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Figur 19 zeigt den Typ eines Musters, das sich auf einer Membran nach der Trennung und der Färbentwicklung zeigt. Drei Streifen 200, 201 und 202 einer Membran 95, welche durch Schlitze 96 getrennt sind, sind dargestellt. Jeder Streifenteil weist drei mit A, B und C bezeichnete Kolonnen 160 auf. Auf Jeden Streifen war eine andere polymorphe Blutenzymprobe aufgebracht worden, die anschließend elektrophoretisch auseinandergezogen, d.h. zur Wanderung weg vom ursprünglichen Aufbringungspunkt gebracht worden ist. Der Aufbringungspunkt ist die erste Reihe (I) unter dem Punkt A; von diesem aus geht die Wanderung zu den Strichen, die in den Entfernungen II, III, IV, V und VI angezeigt sind. Standardpräparate polymorpher Systeme laufen zusammen mit Jeder unbekannten Probe in zwei unterschiedlichen Konzentrationen B und C, um so die Identifizierung und die Mengenbestimmung der unbekannten Proben zu unterstützen. Durch Vergleich der Komponenten der unbekannten Substanz in Kolonne A des Streifens 200 mit den benachbarten Kolonnen B und C läßt sich leicht erkennen, daß die Komponente IV der Probe offensichtlich höher in der Konzentration ist als normal (B,C). Dasselbe gilt für die Menge der Komponente VI der Probe im Streifenteil 202. Bei der Probe im Streifen 201 erkennt man andererseits, daß die Komponente V fehlt und daß eine Komponente VI aufscheint, die in den Standardpräparaten B und C nicht vorhanden ist. In diesem Fall handelt es sich also um den Typ des gleichzeitig hergestellten Ein-Blatt-Nachweises, der mit der Vorrichtung und der Arbeitsweise gemäß vorliegender Erfindung durch geführt werden kann und der zur Identifizierung und quantitativen Bestimmung von bis zu 10 verschiedenen oder gleichen Proteinsystemen aus einer Blutprobe oder von bis zu 10 Blutproben dienen kann. Mit solchen Profilen wird die Aufgabe der Diagnostizierung ver-

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schiedener klinischer Zustände oder die Identifizierung von Klassen von Individuen erheblich vereinfacht infolge der Menge an Information, .die gleichzeitig auf einem Elektrophoretogramm erzeugt und beobachtet werden kann.

Figur 20 stellt eine Draufsicht auf die bereits beschriebene quadratische Schale 103 dar, welche mit einem Polyacrylamid-Gel·104, in welchem Ampholine dispergiert sind, gefüllt ist; diese Art von Isomeren von Polyaminopolycarbonsäuren werden üblicherweise für Elek trofokussierungsverfahren mit hoher Trennschärfe verwen det. Nach Anlegen eines elektrischen Feldes mit Hilfe von speziellen Elektroden (nicht dargestellt), welche direkt auf die Oberfläche des Gels gesetzt werden, bildet sich ein linearer pH-Gradient aus und die in einem solchen Gradienten elektrophoresierten Proteinmoleküle konzentrieren sich in sehr schmalen Zonen, in welchen die elektrische Nettoladung an einem gegebenen Molekül Null ist. In einem solchen System ist die einzige Variable, die die Trennung beeinflußt, der isoelektrische Punkt eines gegebenen Proteins. Es ist nicht erforderlich, in den Behälter 10 der Grundapparatur gemäß Figur 1A eine Pufferlösung zu geben. Die Kühlung des Gels mit der Platte 80 gemäß Figuren 3 und 5 ist sehr wichtig, weil eine sehr hohe Spannung angelegt wird, die eine hohe Stromstärke zur Folge hat, was wiederum die Entwicklung einer großen Wärmemenge bedeutet, die sofort abgeführt werden muß. Die erfindungs gemäße Apparatur erlaubt es, die Elektroden in beliebiger Richtung anzubringen. Darüberhinaus bietet sie eine einfache, leicht standardisierbare Alternative zu der schwierigen Herstellung von Gelen unmittelbar vor der Verwendung, eine Alternative, die hinsichtlich der Handhabung, des Transportes und der Lagerung den bisher

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handelsüblichen flexiblen Platten überlegen ist.

Figur 21 ist eine Draufsicht auf eine Schale 103, welche ein zuvor eingegossenes Gel 104 enthält. In dem Gel sind in einer Reihe 10 rechteckige Vertiefungen 148 zur Aufnahme von Proben gemacht worden. Der Teil der Schale, der die zur Probenaufnahme bestimmten Vertiefungen 148 enthält, ist in vergrößertem Maßstab in Figur 22 dargestellt, um weitere Einzelheiten zu zeigen. Die Schalen-Schablonen-Einheit erkennt man weiterhin in der Figur 22A (in Draufsicht) und in Figur 22B (im Querschnitt).

In diesen Figuren erkennt man, daß die umlaufende Wand 122 der Schale 103 mit zwei zylindrischen Vertiefungen 149 versehen ist, die zur Aufnahme von Stiften 151 dienen, mit welchen ein entfernbarer Kunststoffeinsatz bzw. eine solche Schablone 15 in der Schale befestigt werden kann. Die dargestellte Schablone 150 weist zehn Zungen 152 auf, mittels welcher die Vertiefungen 148 in dem Gel ausgebildet werden, wenn dasselbe zuerst in die Schale 103 gegossen wird und um die Vertiefungen in der Zeit zwischen der Herstellung und der Verwendung des Einsatzes frei von Flüssigkeit zu halten. Die in Figur 21 dargestellte Schale mit dem eingegossenen Gel wurde also in der Weise hergestellt, daß zunächst der Einsatz bzw. die Schablone 150 in eine leere Schale 103 eingesetzt wurde, indem die Stifte 151 in die Vertiefungen 149 gesteckt wurden. Ein Gel bildendes flüssiges Präparat wurde dann in die Schale gegossen, so daß sich nach dem Abkühlen das Gel 104 bildete. Die Schale mit dem Gel wurde mit einer geeigneten Abdeckung (nicht dargestellt) versehen; in dieser Form kann die Einheit zum Versand gebracht oder gelagert werden, ohne daß eine Beschädigung befürchtet werden muß, bis sie für die Elektrophorese gebraucht wird. Zu diesem Zeitpunkt wird der

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Plastikeinsatz bzw. die Schablone 150 entfernt und Proteinproben und Standardpräparate können in die Vertiefungen 148 des Gels für die Elektrophorese gegeben werden. Diese vorstehend beschriebene Art einer Schale wird hauptsächlich für die genetische Typisierung von polymorphen Proteinen verwendet, beispielsweise für die die Bestimmung des Haptoglobin-Hämoglobin-Komplexes; sie kann jedoch auch zur Trennung vieler anderer Proteingemische, die ein hochwirksames Trennmedium wie Acrylamidgel erfordern, verwendet werden. Das Polyacrylamidgel in der Schale kann entweder eine durchgehend gleichmäßige Polymerkonzentration oder eine sich linear oder stufenweise ändernde Konzentration aufweisen. Die Polyacrylamidmoleküle wirken als ein mechanisches Sieb, welches sowohl die Trennung als auch die Abscheidung unterstützt.

In Figur 23 ist eine quadratische Schale mit einem eingegossenen Gel dargestellt, in welcher die Verwendung spezifischer Antiseren bei der Kreuz-und-Quer-Elektrophorese bei der Analyse von australischem Antigen (infektiöse Hepatitis), Syphilis und anderen Infektionskrankheiten möglich 1st. Die Schale und die Methode können auch zur Artenidentifizierung bei der Prüfung von frischem oder getrocknetem Blut oder anderen physiologischen Flüssigkeiten eingesetzt werden. Man erkennt aus den Zeichnungen, daß die vorbereitete Gelschale im Grundsätzlichen der von Figur 21 entspricht, jedoch mit der Ausnahme, daß die Gelschicht 104 mit drei Linienpaaren von je 10 Vertiefungen 148 versehen ist, wobei die Linien mit 1, 2, 3, 4, 5 und 6 (160) bezeichnet sind.

Die Schalen werden in derselben Weise hergestellt wie die von Figur 21, wobei jedoch 6 Plastikschablonen anstelle einer einzigen (150), die für die Schalen der Figuren bis 22B benutzt wurde, verwendet werden müssen. Die

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Schablonenstifte 151 (Figuren 22A und 22B) fassen in zylindrische Vertiefungen 149 und die Schale wird dann in der bereits beschriebenen Weise.mit Gel 104 gefüllt. Vor der Verwendung werden die Schablonen entfernt, so daß die Vertiefungen 148 zur Aufnahme von Antigen- und Antiserumproben frei liegen. Die Gelvertiefungen werden paarweise verwendet, wobei die Antigenprobe in die Vertiefung gegeben wird, die auf der elektrisch negativen Seite des Paares (Reihen· 1, 3 und 5) liegt, die durch ein Minuszeichen (-), welches auf die linke Seite der umlaufenden Schalenwand 122 gedruckt ist, angezeigt ist; die spezifische Antiserumprobe wird in die Vertiefung auf der positiven Seite des Paares (Reihen 2, 4 und 6) gegeben. Wird Spannung an die bis zu 30 Proben in der Schale gelegt, so wandern die Antigen- und Antiserumproteine aufeinander zu und reagieren, wenn sie sich kreuzen oder treffen,und erzeugen eine sichtbare Niederschlagslinie. Neun solcher Linien 205, die sich nur zwischen bestimmten Paaren gebildet haben, sind in Figur 23 zu erkennen. Das Fehlen einer solchen Niederschlagslinie zwischen einem Paar von Vertiefungen zeigt die Abwesenheit des spezifischen Antigens in der Probe, die in die linke Vertiefung des Paares gegeben worden war, an.

Bei der Herstellung der verschiedenen vorbereiteten Gel schalen und Membranen der vorstehend beschriebenen Art ist es möglich, die Zugabe aller instabilen Substrate und Reagentien zu dem vorbereiteten Gel bzw. der vorbereiteten Membran bis zum Augenblick der Verwendung hinauszuzögern. Im Falle von Membranen ist es jedoch auch möglich, instabile Ingredientien sicher zum Zeitpunkt der Herstellung der Membran einzuschließen, indem man die Technik der Gefriertrocknung anwendet.

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Claims

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Patentansprüche

⁽ 1.)) Mikroelektrophoretisches Verfahren zur gleichzei- ^ -^ tigen Trennung und Identifizierung der Komponenten von zwei oder mehr Proteinsystemen, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) in jedes Abteil einer durch Rippen bzw.

Stege unterteilten Schale, welche ein geeignetes Gel enthält, Proben von unbekannten, nach Art und Herkunft verschiedenen Eiweißgemischen gibt,

(b) die so aufgebrachten Proben der Elektrophorese unterwirft,

(c) über das die Proben enthaltende Gel in der Schale eine Membran legt, die durch Schlitze in Streifen unterteilt ist, wobei die Schlitze so angeordnet sind, daß sie die

die Schalen unterteilenden Stege aufnehmen können, so daß eine dichte Berührung zwischen der Oberfläche des Gels und der Oberfläche der Membran zustandekommt,

(d) die in dem Gel verteilten Proteine mit geeigneten spezifischen Substraten und farbbildenden Reagentien, mit welchen die einzelnen Streifen der Membran entsprechend der Anordnung der Proteinsysteme in den einzelnen Abteilen des Gels zuvor imprägniert wor

den sind, reagieren läßt und

(e) die Membran entfernt und trocknet, so daß man ein zusammengesetztes Elektrophoretogramm erhält.

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ORIGINAL INSPECTED

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2.) Verfahren nach. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrophorese in der geschlitzten Membran durchgeführt wird und daß die spezifischen Substrate und farbbildenden Reagentien in dem Gel enthalten sind.
3.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gelabteile gleiche Proteinsysteme unterschiedlichen Ursprungs enthalten und daß die Membran mit einer Substrat- und Farbreagenzkombination imprägniert ist, die für dieses betreffende Gemisch erforderlich ist.
4.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens zwei Proteinsysteme, die bestimmt werden sollen, aus der Gruppe der polymorphen Enzymsysteme, welche Milchsäure-Dehydrogenase, alkalische Phosphatase und Kreatin-Phosphokinase umfassen, ausgewählt werden.
5.) Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein zusätzliches Proteinsystem bestimmt wird, wobei dieses Gemisch aus der Hämoglobin und Gesamt-Bluteiweiß umfassenden Gruppe besteht.
6.) Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß weitere polymorphe Proteinsysteme zur Füllung der Abteile einer Schale mit 10 Abteilen bestimmt werden, die aus der Phosphoglukomutase, Erythrocytsäure-Phosphatase, Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase, Adenylat-Kinase, Esterase D und Adenosin-Deaminase umfassenden Gruppe stammen.

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7.) Elektrophoretische Membran, bestehend, aus einer Celluloseacetatmembran, welche durch wenigstens einen Schlitz in wenigstens zwei Streifen unterteilt ist, wobei jeder Streifen mit einem Substrat- und farbbildenden Reagenz, welches für eines der polymorphen Proteinsysteme aus der Milchsäure-Dehydrogenase (LDH), alkalische Phosphatase (AP), Kreatin-Phosphokinase (CPK), Erythrocytsäure-Phosphatase (EAP),.Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase (G-6PD), Adenylatkinase (AK), gruppenspezifische Komponente (Gc), Lipoprotein (Lp), Adenosin-Deaminase (ADA), 6-Phosphoglukonat-Dehydrogenase (6-PGD), Glutamin-Pyruvin-Transaminase (GPT), Esterase D (EsD) u.a. umfassenden Gruppe spezifisch ist, imprägniert ist.
8.) Die geschlitzte Membran gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß dieselbe aus einer Polyestergrundschicht besteht, welche in den die Reagentien enthaltenden Streifenbereichen mit Celluloseacetat beschichtet ist.
9.) Elektrophoretische Gelschale, bestehend aus einer flachen, Gel enthaltenden Schale, die durch einen Unterteilungssteg in wenigstens zwei Abteile unterteilt ist, wobei jedes Abteil mit einem Substrat- und farbbildenden Reagenz imprägniert ist, welches für eines der polymorphen Proteinsysteme, die in Anspruch 7 aufgeführt sind, spezifisch ist.
10.) Gelschale nach Anspruch 9» weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß dieselbe mit einer dicht schließenden Abdeckung versehen ist, so daß die Einheit als geeignete mikroelektrophoretische Apparatur zur gleichzeitigen Bestimmung von bis zu 30 Prote-

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inproben durch Elektrophorese verwendet werden kann.
11.) Gelschale nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Schale und die Abdeckung in einer Gleitanordnung vereinigt sind.
12.) Gelschale nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß dieselbe in dem Gel 30 Paar für die Probenaufnahme, bestimmte Schlitze enthält, wobei die Paare so angeordnet sind, daß eine überkreuz-Wanderung von Antigen und Antiserum erreicht werden kann, so daß sich sichtbare Niederschlagslinien ausbilden.
13.) Gelschale nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Schale durch parallele Rippen bzw. Stege in 10 Abteile unterteilt ist.
14.) Gelschale nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel Ampholine vom Typ, wie sie zur Elektrofokussierung verwendet werden, enthält.

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