DE2406959C3

DE2406959C3 - Anordnung und Verfahren zur Bestimmung von Antigenen

Info

Publication number: DE2406959C3
Application number: DE2406959A
Authority: DE
Inventors: Axel Dipl.-Chem. Dr. 3550 Marbach Sieber
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1974-02-14
Filing date: 1974-02-14
Publication date: 1979-02-08
Also published as: DK137970C; LU71827A1; US3930983A; NL7501489A; FR2261529B3; DK137970B; BE825572A; IE40601L; DE2406959B2; IT1031704B; DK52275A; GB1466040A; ATA106775A; IE40601B1; JPS50116631A; FR2261529A1; DE2406959A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Anordnung zur gleichzeitigen quantitativen oder qualitativen Bestimmung mehrerer Antigene in einer Vielzahl von Antigengemischen durch Immunelektrophorese, bestehend aus einer auf einem Träger aufgebrachten antikörperhaltigen Matrix sowie ein Verfahren zur Durchführung der Bestimmung.

Im menschlichen Serum und in Körperflüssigkeiten gibt es Proteinarten, die in der medizinischen Diagnostik nach bestimmten Krankheitsbildern oder nach physiologischen Aufgaben unter einem übergeordneten Begriff zusammengefaßt werden kennen. Zum Beispiel bezeichnet man die Proteine saures «i-Glykoprotein, Λΐ-Antitrypsin, Coeruloplasmin und Hapioglobin, die bei entzündlichen Krankheitsprozessen gegenüber den Normalwerten verändert sind, als akule-Phase-Proteine. Unter dem Begriff Immunglobuline faßt man die Proteine IgG, IgA, IgM, IgD und IgE zusammen. Sie sind von wesentlichem Einfluß auf die Immunabwehr des Organismus, und ihre Konzentrationen erfahren bei bestimmten Erkrankungen charakteristische Veränderungen.

Bei quantitativen Proteinanalysen ist es daher erforderlich, zur Diagnose oder zur Charakterisierung eines Krankheitsverlaufes mehrere Proteine einer solchen Gruppe zu untersuchen. Es ist zu erwarten, daß immer mehr solcher Proteingruppen aufgefunden werden, die bei bestimmten Krankheitsbildern Konzentralionsänderungen erfahren, die im Zusammenhang gesehen werden müssen.

Es ist daher für Reihenuntersuchungen von Patienten, die an akuten entzündlichen Erkrankungen leiden, wünschenswert, wenn man in einem Analysengang die Konzentrationswerte für beispielsweise alle vier Akute-Phase-Proteine ermitteln kann. Bisher ist es notwendig, je einen Analysengang für jede Proteinart durchzuführen.

Die Grundlage der immunologischen Nachweis- und Bestimmungsmethoden beruht auf der Eigenschaft von Antigenen mit spezifisch gegen die Antigene gerichteten Antikörpern, wie sie in den entsprechenden Antiseren enthalten sind stöchiometrisch unter Ausbildung von Präzipitaten zu reagieren. Die als einfache lineare und einfache radiale Immundiffusion bezeichneten Verfahren sind darauf aufgebaut daß Antigene in eine Antiserum enthaltende Matrix diffundieren und dabei einen Antigen-Antikörperkomplex bilden. Der Äquivalenzbereich der Komplexbildung wird bei entsprechender Konzentration der Ueaktanten durch Präzipitatlinien angezeigt die mit bloßem Auge beobachtet werden können oder nach Anfärbung mit geeigneten Farbstoffen sichtbar gemacht werden können.

Wird das Antigen durch ein elektrisches Spannungsfeld in einer Matrix, die einen homologen Antikörper enthält bewegt, so entsteht je nach der Wanderungsgeschwindigkeit des Antigens ein mehr oder weniger langgestrecktes Präzipitat. Die Diffusions- bzw. Wanderungswege sind jeweils das Maß für die Menge des zu bestimmenden Antigens. Wird keine Beziehung mit einer Standardantigenmenge hergestellt, so gilt die Präzipitatbildung als qualitativer Nachweis der unbekannten Substanz.

Diese als Immundiffusion bzw. Immunoelektrophorese bezeichiieten Techniken ermöglichen jedoch je Analysengang die Bestimmung von nur einem einzelnen Antigen. Eine Weiterentwicklung der Immunoelektrophorese wurde von L a u r e 11, Scand. J. elin. Lab. Invest, 29, suppl. 124, 21 bis 37 (1972), beschrieben, bei der mit Hilfe eines Antiserums, das Antikörper mit Spezifitäten gegen mehrere Antigene enthält, durch Elektroimmunodiffusion die Bestimmung mehrerer Antigene grundsätzlich möglich ist.

Bei einem Gemisch von zwei Antikörperarten liefert die Methode noch relativ übersichtliche Bilder. Die Länge der Immunpräzipitate ist aber abhängig von der Proteinkonzentration, so daß nicht ohne weiteres zu entscheiden ist, welcher der von der gleichen Auftragsstelle ausgehende Präzipitatgipfel einem bestimmten Protein zuzuordnen ist Völlig unübersichtlich werden die Verhältnisse, wenn mehr als zwei Antikörperarten auftreten.

Die wesentliche Einschränkung dieser Methode ist demnach, daß die Größenordnung der Konzentrationen und das elektrophoretische Verhalten der beiden Antigene einerseits voneinander abgesetzte Präzipitate liefern muß und daß andererseits bekannt sein muß, welches Präzipitat dem zu bestimmenden einzelnen Antigen zuzuordnen ist

Bei der Untersuchung von Patientenseren kann dies zu folgenschweren Fehlinterpretation der Ergebnisse führen. Mißverständliche Ergebnisse erfordern zudem eine Wiederholung der Bestimmung, für die geeignetes Material häufig nicht mehr vorhanden ist.

Es stellte sich daher die Aufgabe, eine Anordnung zur Bestimmung mehrerer Antigene einer Probe in einem einzigen Ansatz zu entwickeln, bei der Verwechslungen der ermittelten Konzentrationen ausgeschlossen sind.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst daß bei einer Anordnung der eingangs genannten Art die auf den Träger aufgebrachte antikörperhaltige Matrix aus mehreren aneinandergereihten, quer zur Wanderungsrichtung nebeneinanderliegenden, jeweils ein spezifisches Antiserum enthaltenden Streifen besteht.

Aus der Veröffentlichung Z. Klin. Chem. und Klin. Biochem., 8 (1970), Seiten 391 bis 193 ist zwar eine Anordnung bekannt, die es ermöglicht, in einer einzigen Probe die Bestimmung verschiedener Antigene durch zwei Elektrophorese-Schritte vorzunehmen. Die zweite Phase der Elektrophorese ermöglicht es, durch ver-

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schiedene Antiserum-haltige Gelstreifen die Bestand- von vier verschiedenen Antigenarten in sieben Proben,

teile der Probe zu differenzieren. Bei entsprechend längeren Trägerplatten lassen sich bei

Demgegenüber gestattet die Anordnung gemäß der Verwendung geeigneter Geräte jedoch beliebig mehre-

Erfindung die Untersuchung einer Vielzahl von Proben re Proben auftragen.

(in der Regel mindestens 6) gleichzeitig und, wenn ge- 5 Die Matrixstreifen können aber auch so angeordnet

wünscht, unter Mitführung von Standardsubstanzen zu werden, daß die Auftragstellen sich in einem schmalen

analysieren. Verschiedene in den einzelnen Proben ent- Streifen eines antiserumfreien Gels befinden, an das sich

haltene Antigene können durch einen einzigen Elektro- dann der erste Streifen mit einem antiseruinhaltigen Gel

phoreseschritt, gegebenenfalls auch quantitativ, be- anschließt Diese Anordnung hat den Vorteil, daß die

stimmt werfen. io Antigene nacheinander je nach ihrer Wanderungsge-

Es ist überraschend, daß bei einer elektrophoreti- schwindigkeit in das erste Gel eintreten. Das langsamste

sehen Wanderung eines Antigengemisches durch Antigen, das im ersten Streifen reagiert, stört somit bei

mehrere aneinandergereihte Matrixstreifen, wovon der Bildung des lmmunpräzipitats nicht die übrigen

jeder Streifen ein spezifisches Antiserum gegen ein Antigene, die schon weiter gewandert sind,

einziges Antigen enthält, sich jeder einzelne Matrix- 15 Die elektrophoretische Auftrennung erfolgt unter

streifen so verhält, als wäre die Elektrophorese nur mit den üblichen Bedingungen der Elektroimmunodiffusion

einer einheitlich mit einem Antikörper beladenen in einer dafür geeigneten Apparatur. Die antigene

Matrix durchgeführt. Die Antigene durchwandern werden als Lösungen in die Auftragsstellen mittels einer

diejenigen Matrixstreifen unangefochten, in denen sich Mikropette oder Mikroliterspritze eingeführt. Nach

ein anderes als das für sie spezifische Antiserum 20 Anlegen eines elektrischen Feldes von 7 bis 10 V/cm

befindet und präzipitieren ausschließlich in demjenigen wandern die Antigene so lange ungestört durch die

Matrixstreifen, der das für sie spezifische Antiserum aniiserumhaltigen Gelstreifen hindurch, bis sie in dem

enthält. Auf diese Weise ist die qualitative und entsprechenden Streifen auf die spezifisch gegen sie

quantitative Bestimmung von gleichzeitig mehreren gerichteten Antikörper treffen.

Antigenen möglich. 25 Nach einer Elektrophoresdauer von etwa 3 Stunden

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren ist die Reaktion beendet. Wird bei niedrigen Feldstär-

zur gleichzeitigen qualitativen oder quantiiativen ken, beispielsweise 2 bis 3 V/cm, gearbeitet, dauert die

Bestimmung von Antigenen in Antigengemischen durch Elektrophorese 8 bis 16 Stunden. Dabei erfolgt die

Verwendung dieser Anordnung. Ausbildung der raketenförmigen Immunpräzipitate,

Im folgenden wird die Erfindung an Hand von 30 deren Länge ein Maß für die Antigenkonzentration ist.

allgemeinen und speziellen Beispielen näher erläutert. Zweckmäßig erfolgt im Anschluß an die Elektrophorese

Immunoelektrophoresen werden am häufigsten auf eine Anfärbung der Antigen-Antikörperkomplexe mit Agar- oder Agarose-Gel als Matrix vorgenommen. Es geeigneten Farbstoffen, beispielsweise mit dem Farbkönnen jedoch auch andere gelbildende Substanzen wie stoff Coomassi Brilliant blue R nach bekannten Stärke, Gelatine oder Acrylamid verwendet werden. 35 Techniken. Die Messung der Präzipitatlinie kann mit

Die Zeichnung zeigt in Fig. I schematisch die einem Millimeter-Maßstab durchgeführt werden.

Herstellung einer erfindungsgemäßen Anordnung und In der Fig.2 ist gezeigt, wie sich eine erfindungsge-

in Fig.2 eine typische Verteilung der Präzipitate in mäße Bestimmung von gleichzeitig vier Antigenen in

einer erfindungsgemäßen Matrix nach Durchführung sieben Proben nach Anschluß der Elektrophorese und

einer Immunoelektrophorese. 40 einer angeschlossenen Anfärbung der Präzipitate

In der Fig. 1 ist dargestellt, in welcher Weise eine darstellt. 7 entspricht den Auftragsstellender Fig. 1.

Trägerplatte 1 mit Agar als Matrix mit Gelstreifen 2 bis Die Auswertung wird in der üblichen Weise über

5 beschichtet wird, wovon jeder Streifen ein bestimmtes Eichkurven vorgenommen.

monospezifisches Antiserum enthält. Die Streifen Zum Aufstellen einer Bezugskurve kann man sich 3

werden in der gewünschten Breite nacheinander ₄₅ oder 4 verschiedene Verdünnungen eines geeigneten

zunächst als flüssige antiserumhaltigc Lösung von Antigenstandards mit physiologischer NaCl-Lösung als

beispielsweise Agar oder Agarose in Elektrophorese- Verdünnungsflüssigkeit herstellen. Diese Verdünnungen

puffer auf der waagerecht liegenden Platte in der Form müssen so eingestellt werden, daß sie den bevorzugten

ausgegossen, daß man z. B. durch einen Block 6, Meßbereich, bei Plasmaproteinen z. B. 3 bis 30 mg/

vorzugsweise einen solchen aus Metall, die Fläche der 50 100 ml, abdecken. Die zu untersuchenden Patientensera

Platte, die mit dem nächsten Gel beschichtet werden werden vorteilhaft 1 :2 verdünnt aufgetragen,

soll, abgrenzt. Nach dem Erstarren des Gels wird der Eine nahezu geradlinig verlaufende Eichkurve erhält

Block weitergerückt und der nächste frei werdende man nach Auftragen der Präzipitatlängen als Funktion

Streifen mit flüssigem Gel ausgegossen. Die Gele haben der Standardantigen-Konzentration auf Millimeterpa-

in einer vorteilhaften Anwendung eine Breite etwa 2 bis 55 pier.

4 cm. Auf einer gebräuchlichen Platte 10 χ 10 cm Beim Verzicht auf eine quantitative Bezugnahme der

können somit bis zu vier oder fünf verschiedene zu bestimmenden Antigene ist die erfindungsgemäße

Gelstreifen aufgebracht werden. Der unterste Gelstrei- Anordnung zum quantitativen Nachweise von Antige-

fen 2 (kathodisch), gekennzeichnet mit (-), sollte das nen einzusetzen. Dabei ist nur zu registrieren, ob eine

Antiserum gegen das Antigen mit der geringsten 60 Präzipitatbildung des gesuchten Antigens mit dem

Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld, der entsprechend in die Matrix eingetragenen Antikörper

oberste 5 (anodisch) (in der Fig. 1 noch nicht eintritt oder nicht.

aufgebracht), gekennzeichnet mit ( + ), das Antiserum Für die Bestimmung eignen sich alle Antigene, die

gegen das Antigen mit der höchsten Wanderungsge- unter geeigneten Bedingungen eine eieklrophoretische

schwindigkeit enthalten. In den untersten Streifen 65 Wanderung zeigen und gegen die spezifische Antiseren

werden dann die Auftragsstellen 7 eingestanzt, in die die erhalten werden können. Antigene, die unter den

zu untersuchenden Antigenlcsungen eingefüllt werden. gewählten Bedingungen als solche keine oder nur eine

Die Platte der Fig. 1 eignet sich also zur Bestimmung geringe elektrophoretische Beweglichkeit zeigen, kön-

ncn nach bekannten Methoden wie der Carbamylierung oder der Umsetzung mit ß-Propiolacton, Formaldehyd, Äthyienoxid u. ä. entsprechend modifiziert der erfindungsgemäßcn Besiirnmungsmeihode unterworfen werden Ein bevorzugtes Anwendungsgebiet der Methode liegt naturgemäß in der klinischen Diagnostik zum Nachweis bzw. zur Bestimmung der Bestandteile des Plasmas und der Körperflüssigkeiten. Es besteht jedoch kein Hinderungsgrund, die Anordnung und das Verfahren auch zur Bestimmung von mikrobiellen Stoffwechselprodukten oder Pflanzeninhaltssloffen einzusetzen, sofern sie antigene Eigenschaften zeigen.

Die eindeutige Zuordnung der Präzipitate zu den zu bestimmenden Antigenen macht die erfindungsgemäße Methode für Personen ohne besondere Quaüfikaiionen durchführbar. Sie wird somit als Routineniethode für Kliniken und Forschungslaboratorien mit gutem Erfolg eingeführt werden können.

Die Erfindung soll am nachstehenden speziellen Beispiel noch weiter erläutert werden.

Beispiel

Zur Herstellung einer Matrixplatte erhitzt man eine Mischung aus 1,5 g Agarose und 100 ml Barbitalpuffer, ph 8.6. μ 0,02. bis zum Sieden. Wenn sich die Lösung geklärt hat, läßt man abkühlen. Das Zumischen von Antiserum für die Herstellung antiserumhaltiger Matrixplatten erfolgt bei 56°C. die heiße, flüssige Agaroselösung kann in einem 56°C warmen Wasserbad auf diese fiir die Mischung optimale Temperatur abgekühlt werden. Das Wusserbad dient gleichzeitig zum Vorwärmen des Antiserums.

Auf einer Glasplatte 10 χ 10 cm wird mit Hilfe eines Metallblocks am unteren Rand ein etwa 2 cm breiter Streifen einer 1,5%igen Agaiosclösung von 56°C ausgegossen, der kein Antiserum enthält. Die Schichtdicke des Agarosestreifens beträgt etwa 1.5 mm. Es weiden etwa 3 ml Agaroselösung benötigt. Nach dem Erstarren des Gels wird der Metallblock um 2 cm weitergeschoben und 3 ml eines Agarosegels ausgegossen, das 2% eines Anti-C3-Serums vom Kaninchen enthält. In der gleichen Weise gießt man je einen Streifen mit 2% Anti-Transferrin, mit 5% Anti-/?-Lipoprotein und πϊίΐ 7% Anti-Haptoglobin-Scrum an. In den unteren Streifen stanzt man die Auftragsstellen mit 2.5 mm Durchmesser zur Aufnahme von 5 μΐ der zu untersuchenden Patientenseren.

Die elektrophoretische Auftrennung erfolgt nach Beschicken der Auftragsstellen bei einer Feldstärke von 10 V/cm 3 Stunden lang.

Die Länge der Präzipitate wird mit den entsprechenden Werten der mit Standardsubstanzen erhaltener Angaben in Beziehung gesetzt und erlaubt auf diese Weise die quantitative Bestimmung des Komplementfaktors C 3, des Transferrins, des ^-Lipoproteins und des Haptoglobins in einem Ansatz.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Anordnung zur gleichzeitigen qualitativen oder quantitativen Bestimmung mehrerer Antigene in einer Vielzahl von Antigengemischen durch Immunoelektrophorese in einem Schritt bestehend aus einer auf einen Träger aufgebrachten antikörperhaltigen Matrix, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix aus mehreren aneinandergereihten, quer zur Wanderungsrichtung nebenein-10 anderliegenden, jeweils ein spezifisches Antiserum enthaltenden Streifen zusammengesetzt ist

2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix aus einem antiserumfreien Streifen zur Aufnahme der Antigengemische und daran aneinandergereiht mehreren jeweils ein spezifisches Antiserum enthaltenden Streifen bestein.

3. Verfahren zur gleichzeitigen qualitativen oder quantitativen Bestimmung mehrerer Antigene in Antigengemischen gekennzeichnet durch Verwendung einer Anordnung nach Anspruch 1 oder 2.