DE3050311C2 - Verfahren zur herstellung fester Tr{ger f}r Prote ine zu analytischen Zwecken - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines festen Trägers gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und dessenVerwendung zur Identifizierung oder zum Nachweis von Proteinen oder der ihnen eigenen Antikörper durch Immunoassaymethoden.

Die Erfindung beruht hauptsächlich auf dem Befund, daß es möglich ist, Proteine aus einem Gel (wie es gegenwärtig in der Protein­ biochemie verwendet wird, z. B. einem für die elektrophoretische Trennung von Proteinen verwendeten Gel) auf Nitrocellulosefolien zu überführen, d. h. auf die Cellulose-Salpetersäureester-Träger in Form dünner Folien, die zusätzlich andere Celluloseester enthalten können, wie Celluloseacetat. Die Überführung der Proteine aus dem Gel kann quantitativ sein und die immobilisierten Proteine bilden einen exakten Abdruck des Musters, das in dem Gel vorhanden war.

Die Polyacrylamidgelelektrophorese ist in jedem Labor, in dem Proteine analysiert und gereinigt werden, zu einem Standardhilfsmittel ge­ worden. Meistens sind die Menge und die Lage des Proteins von Interes­ se, und eine Anfärbung ist dann ausreichend. Es kann jedoch auch von Bedeutung sein, eine Aktivität eines Proteins mit einer speziellen Bande auf dem Gel in Beziehung zu setzen. Zuweilen können enzymati­ sche und Bindungsaktivitäten in situ nachgewiesen werden, indem man Substrate oder Liganden in das Gel diffundieren läßt. Bei der Immunoelektrophorese läßt man das Antigen gegen den Antikörper diffundieren oder sich elektrophoretisch bewegen. Wo das Antigen und der Antikörper aufeinander einwirken, wird dann ein Niederschlag gebildet. Es wurden Modifikationen beschrieben, bei denen das Anti­ gen durch direktes Eintränken der Trennmatrix in Antiserum ausgefällt wird. Die Wahl der elektrophoretischen Systeme wird dann stark durch die Notwendigkeit eingeengt, ein Gel mit ausreichender Porengröße zur Verfügung zu haben, um die Diffusion des Antikörpers und/oder Antigens zu gestatten. Derartige Systeme hängen auch von der Konzen­ tration und vom Typ des Antigens oder Antikörpers ab, um ein physi­ kalisch immobiles Aggregat zu ergeben. Es wurden daher bereits Ver­ suche unternommen, die in Gelen isolierten Proteine auf feste Träger zu übertragen.

Der Transfer von Elektropherogrammen aus Gelen auf Nitrocellulose­ folien wurde bereits im Fall von DNA (Southern, E.M. [1975], J.Mol. Biol. 98, 503-517) beschrieben. Bei dieser Methode wurde jedoch die Immobilisierung des DNA-Gelmusters auf die Nitrocellulose passiv ohne Elektrophorese erzielt. Eine Analyse von Protein, das durch Bakterienkolonien auf Agarplatten gebildet worden war, wurde durch Adsorption an antikörperbeschichteten Plastikfolien durchgeführt (Broome S., Gilbert W. [1978] Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 2746-2749). Nitrocellulosefolien wurden auch zur Adsorption von Immunoglobulinen, die von in einem Gel wachsenden Hybridomakolonien abgesondert werden, verwendet (Sharon J., Morrison S.I. & Kabat E. A., [1979] Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76, 1420-1424). Keine dieser Me­ thoden betrifft elektrophoretisch transferierte Proteine und, wie beschrieben, sind sie nicht geeignet, um gleichzeitig mit einer unbeschränkten Anzahl individueller Antigen-Antikörper-Reaktionen zu operieren, wie es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren der Fall ist.

Ein Versuch für die Verwendung der Elektrophorese für den Transfer von DNA auf Nirtrocellulosefilter ist kurz von Arnheim & Southern (Cell 11, 363 [1977]) beschrieben worden. Ihre Methode ist jedoch für deren Aus­ führung nicht gut genug beschrieben, und offensichtlich der früher von den gleichen Autoren beschriebenen Methode unterlegen, die sich auf die Diffusion stützt. Obgleich diese Methode 1977 veröffentlicht wurde, wurde sie nicht in größerem Rahmen angewandt, obwohl ihr früheres Verfahren auf Basis der Diffusion in außerordentlich großem Umfang verwendet wird. Die gleichen Autoren bedienen sich in nachfol­ genden Publikationen des früheren Verfahrens.

Bittner et al. (Analytical Biochemistry 102, 459 [1980]) beschreiben den elektrophoretischen Transfer von DNA auf Nitrocellulose und auf Diazobenzyloxymethyl-Cellulose-Papier (DBM-Papier), ferner den elektrophoretischen Transfer von Proteinen auf DBM-Papier. In dieser Publikation wird jedoch nicht auf einen elektrophoretischen Transfer von Proteinen auf Nitrocellulose hingewiesen, weil die Autoren offen­ sichtlich dem damals verbreiteten Vorurteil unterlagen, daß Proteine von Nitrocellulose nicht genügend stark adsorbiert werden und eine chemische Bindung, wie sie von DBM-Papier hergestellt wird, zur Fixierung der Proteine notwendig sei.

Eine weitere Methode für denTransfer von Proteinen aus Gelen auf Nitrocellulose wurde von Bowen et al. (Nucleic acids Research, 8, 1 [1980]) beschrieben. Der Transfer wird ebenfalls durch direkten Kon­ takt eines Gelelektropherogramms mit einer Nitrocellulosefolie be­ wirkt. Um die Immobilisierung der Proteine auf der Nitrocellulose zu erhalten, versuchen die Autoren jedoch zuerst die Proteine von dem als Detergens bei der vorangegangenen Elektrophorese verwendeten Natriumdodecylsulfat zu befreien, indem sie das Detergens aus dem Gel in eine Pufferlösung diffundieren lassen. Lediglich bei einer zweiten Stufe läßt man die Proteine auf die Nitrocellulose diffun­ dieren. Die Methode ist zeitraubend und der Transfer ineffizient (≲10% des ursprünglichen Proteins).

Renart et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. 76, 3116, 17979) verwenden ein modifiziertes Polyacrylamidsystem, dessen Vernetzung chemisch rückgängig gemacht werden kann, um die Transfergeschwindigkeit der Proteine, welche im Gegensatz zu dem elektrophoretischen System der vorliegenden Erfindung ebenfalls durch Diffusion bewirkt wird, zu erhöhen. Sie verwenden auch eine modifizierte Cellulose, die gebun­ dene reaktive Gruppen enthält und Proteine kovalent bindet. Diese modifizierte Cellulose besitzt den Nachteil der Notwendigkeit, un­ mittelbar vor der Verwendung hergestellt zu werden, was drei Stufen einer chemischen Behandlung des Papiers und die organische Synthese einer Verbindung, die nicht rasch verfügbar ist, erfordert. Ihr Ver­ fahren ist daher mühsam in die Praxis umzusetzen.

Gegenstand der Erfindung ist das im Anspruch 1 beschriebene Verfahren. Die Übertragung der Proteine aus dem Gel auf den Nitrocelluloseträger wird also erfindungsgemäß mit Hilfe eines elektrischen Feldes durchge­ führt, das an das die Proteine enthaltende Gel angelegt wird, wodurch eine elektrophoretische Wanderung der letzteren verursacht wird, beispiels­ weise nachdem man zuvor mit Hilfe eines Standardelektrophoreseverfah­ rens eine Trennung in Form eines Elektropherogramms durchgeführt hat. Das elektrische Feld wird derart angelegt, daß die Proteine in Richtung auf die sich mit dem Gel in Kontakt befindende Nitrocellu­ losefolie wandern, vorzugsweise senkrecht zu der Ebene des Gels. Wie nachstehend erläutert wird, ist es überrachend, daß es möglich ist, eine getreue Wiedergabe der Anordnung der in dem Gel anwesenden Proteine zu erhalten, da man eine Streuung der Proteine in dem Gel unter dem Einfluß des inhomogenen elektrischen Feldes sowie nicht verhersehbare Schwierigkeiten aufgrund der Anwesenheit ionischer Detergentien hätte erwarten können, und da die chemische Grundlage für die Bindung der Proteine an die Nitrocellulose ungeklärt ist. Die auf der Nitrocellulosefolie immobilisierten Proteine sind gegenüber dem Waschen der Folie stabil, beispielsweise gegenüber der Behandlung mit geeigneten Salzlösungen, z. B. Kochsalz-Lösung (physiologische Natriumchloridlösung).

Wenn die Folien für diagnostische Zwecke oder andere wissenschaftliche Untersuchungen, einschließlich Immunoassay-Verfahren, verwendet werden sollen, müssen die Folien mit geeigneten Proteinen behandelt werden, die die verbliebenen Adsorptionskapazitäten der Nitrocellulose­ folie sättigen. Dies erfolgt durch Sättigung der Folie mit einem indi­ viduellen nichtspezifischen Protein oder mit einer Mischung derarti­ ger Proteine oder mit Totalserum oder irgendeiner Kombination dieser Bestandteile allein und/oder zusammen mit dem Bestandteil der an­ schließenden Immunoassay-Stufen. Die einzige Einschränkung ist, wie nachstehend beschrieben, diejenige, daß diese nicht mit irgendeinem der spezifischen Antikörper in dem Immunoassay interferieren oder kreuzreagieren sollten.

Somit wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bildung fester Trä­ ger für Proteine in Form von Nitrocellulosefolien, die eine Wiedergabe eines Elektropherogramms von Proteinen in einem Gel enthalten, dieses Elektropherogramm auf eine Nitrocellulosefolie übertragen, indem man das Gel mit einer Nitrocellulosefolie in Kontakt bringt und die Übertragung durch Elektrophorese erzielt, und gewünschtenfalls sämtliche verbliebenen Adsorptionskapazitäten der Folie für Proteine sättigt, indem man mit einem geeigneten Medium inkubiert, das Proteine enthält, die durch Nitrocellulose adsorbiert werden können.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens wird der Trans­ fer der Proteine auf die Nitrocellulosefolie durch senkrecht zu der Ebene der auf das Gel aufgebrachten Nitrocellulosefolie ausgeführten Elektro­ phorese bewerkstelligt.

Mit dem Begriff Protein, wie er vorliegend verwendet wird, sind Proteine als solche zu verstehen und auch natürlich auftretende Proteinkonjugate wie Glycoproteine, Lipoproteine oder Protein-Nuklein­ säurekomplexe.

Der erfindungsgemäße elektrophoretische Transfer der Proteine aus dem Gel auf die Nitrocellulosefolie ist durch seine Einfachheit und Viel­ seitigkeit ein entscheidender Schritt nach vorne bei der Analyse von Proteinen. Ein Grund hierfür ist, daß die Auflösung des ursprüng­ lichen Elektropherogramms erhalten bleibt, und daß die Ausbeute der Proteine gewöhnlich hoch ist. Weiterhin ist es aufgrund ihrer Neigung, während des Trocknens zu springen und zu zerbrechen, gewöhnlich schwierig, getrocknete Polyacrylamidgele für die Autoradiographie herzustellen. Die Trocknung von Nitrocellulosefolien ist trivial und erfordert lediglich einen Haartrockner oder eine andere Quelle für warme Luft. Da die Proteine auf einer sehr dünnen Schicht konzentriert werden, sollte die Autoradiographie von ¹⁴C- und ³⁵S-markierten Proteinen selbst ohne 2,5-Diphenyloxazol-Imprägnierung hocheffizient sein. Auf den Nitrocellulosefolien immobilisierte, tritiierte Proteine können für die Fluorographie durch kurzes Eintauchen in eine 10%ige Diphenyloxazol-Lösung in Aether behandelt werden.

Es ist überraschend, daß sich die Proteine während des elektrophore­ tischen Transfers in dem Gel weder durch Diffusion noch als Folge eines ungleichmäßigen elektrischen Feldes ausbreiten. Die Proteine scheiden sich auf der Nitrocellulosefolie in Form einer exakten Wie­ dergabe der Lage in dem ursprünglichen Gel ab. Was besonders überra­ schend ist, ist daß die Proteine auf die Nitrocellulose zuwandern und an diese gebunden werden aus Gelen, die Detergentien enthalten, welche die Eigenschaften der individuellen Proteine in komplexer und nicht vorhersehbarer Weise beeinträchtigen. Wird z. B. Laurylsulfat (Natrium­ dodecylsulfat) als Denaturierungsmittel verwendet, sind die Proteine sämtlich negativ geladen. Dies würde darauf hinweisen, das möglicher­ weise die Proteine während des elektrophoretischen Transfers von Detergensmolekülen umhüllt bleiben. Andererseits würde man erwarten, daß die Anwesenheit des Detergens die Bindung der Proteine an die Nitrocellulose verhindern würde. Dies tritt nicht ein: überschüssiges Detergens wird offensichtlich entweder durch Elektrophorese oder Diffusion entfernt, oder wenn es an die Nitrocellulose gebunden wird, erfolgt dies in nicht ausreichender Menge, um die Bindung der Proteine zu beeinträchtigen. Es könnte auch zerstört werden, wenn es die Elektrode erreicht. Wird jedoch das Detergens zerstört oder entfernt, könnte man erwarten, daß es auch aus den Proteinen abgespalten wird, und diese würden dann das Vorzeichen ihrer elektrischen Ladung umkeh­ ren und in die entgegengesetzte Richtung wandern. Dies tritt jedoch nicht ein. Ist jedoch andererseits Detergens noch mit den Proteinen zum Zeitpunkt ihrer Abscheidung auf der Nitrocellulosefolie assoziiert, ist es überraschend, daß der Protein-Detergenskomplex in ziemlich genau der gleichen Weise adsorbiert wird wie die Proteine.

Unter der Bezeichnung "Nitrocellulose", wie sie für die festen Träger der vorliegenden Erfindung angewandt wird, sind Salpetersäureester der Cellulose, gewünschtenfalls in Mischung mit anderen Celluloseestern zu verstehen. Somit kann reine Nitrocellulose verwendet werden, wie bestehend aus dem Celluloseester mit etwa 3 Salpetersäuregruppen je 6 C-Atomen. Alternativ können Salpetersäureester mit weniger als einer derartigen Anzahl von Gruppen verwendet werden. Werden gemischte Ester der Salpetersäure und andere Säuren verwendet, können diese letzteren irgendwelche Säuren sein, die normalerweise zur Herstellung von Cellu­ loseestern verwendet werden, vorzugsweise aliphatische Säuren mit 1 bis 7 C-Atomen wie Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure oder Valerian­ säure. Bevorzugt wird eine "Nitrocellulose" verwendet, die im Handel unter der Bezeichnung "Millipore" (in den Handel gebracht von der Fir­ ma Millipore, Bedford, Mass. USA) bekannt ist, eine Porengröße von 0,45 Mikron hat und einen gemischten Ester von Salpetersäure und Celluloseacetat darstellt. Die Porengröße der zu verwendenden Cellu­ loseester kann innerhalb breiter Grenzen variieren, vorzugsweise zwischen einer Größe von 0,025 und 14 Mikron.

Die Folien können Dimensionen aufweisen, die typischerweise 12×14 cm betragen, entsprechend dem am häufigsten verwendeten Plattengelelektro­ phoresesystem (Howard, G. A. & Traut, R. R., 1973, FEBS Letters 29, 177-180); sie können jedoch im Bereich liegen von beispielsweise dem Mikrosystem (50×75 mm) unter Verwendung von Mikroskopobjektträgern (Linz, A., Collatz E. O., Wool, I. G., Molec. gen. Genet [1976], 144, 1-9) bis zu dem ursprünglichen Makro-(20×20 cm)-System (Kaltschmid, E., Wittmann, H.G. [1970], Proc. Natl. Acad. Sci. US 67, 1276-1280). Die Gelplattendicke kann vorzugsweise im Bereich von 0,8 bis 5 mm liegen.

Die auf die Nitrocellulosefolien überzuführenden Elektropherogramme können in verschiedenen Gelmedien erhalten worden sein, wie Agarose, Agar und insbesondere Polyacrylamid. Gewöhnlich wird die elektro­ phoretische Trennung der Proteine in einem Gel in Gegenwart von Proteindenaturierungsmitteln, wie z. B. anionischen Detergentien, ins­ besondere Estern von höheren aliphatischen Alkoholen mit zwischen 8 und 20 C-Atomen, hauptsächlich mit Natriumdodecylsulfat, durchgeführt. Als Proteindenaturierungsmittel wird insbesondere auch Harnstoff ver­ wendet. Bei dem elektrophoretischen Transfer der Proteine gemäß dem er­ findungsgemäßen Verfahren bestimmt die Natur des bei dem Transfer verwendeten jeweiligen Proteindenaturierungsmittels und Puffers die Richtung des bei der Elektrophorese anzuwendenden elektrischen Feldes. In Gegenwart von Natriumdodecylsulfat wandern die Proteine stets auf die Anode zu. Auf jeden Fall kann die Wanderungsrichtung der Proteine bei einem gegebenen Substrat bestimmt werden, indem man Nitrocellulose­ folien auf beiden Seiten des Gelelektropherogramms aufbringt.

Die in den üblicherweise bei der elektrophoretischen Trennung von Proteinen verwendeten Gelplatten erhaltenen Elektropherogramme können, gemäß bekannten Techniken, eindimensional oder zweidimen­ sional sein. Der Transfer der Elektropherogramme auf die Nitrocellu­ losefolien kann nach jeder geeigneten Technik erfolgen, die im Prinzip eine elektrophoretische Kammer, in die die Gelplatte eingebracht wird und die ein geeignetes Medium enthält, verwendet, und die Nitrocellu­ losefolie wird auf die Seite der Platte aufgebracht, auf die die Proteine zuwandern. Eine bevorzugte Anordnung für einen derartigen Transfer besteht aus: einem Spülkissen, das als Scotch Brite 96 (3M) bekannt ist und durch ein steifes Kunststoffgitter gestützt wird (Weg­ werf-Mikropipetten-Tablett, Medical Laboraty, Inc., New York); ein zweites Kissen und Kunststoffgitter gegenüber dem ersten enthält die Gelplatte mit der Nitrocellulosefolie, die mit Hilfe von Gummibändern, die um beide Kissen geschlungen sind, eben und fest aufgepreßt sind.

Bei Elektrophoresegelen, die in Anwesenheit eines Detergens oder in Gegenwart nichtionischer Detengentien verwendet werden, soll das Trans­ fermedium verdünnte Säure sein, um sicherzustellen, daß der pH unter halb der isoelektrischen Punkte sämtlicher Proteine liegt. Zum Bei­ spiel wird gewöhnlich verdünnte Essigsäure verwendet. Die Proteine wan­ dern dann auf die Kathode zu. Bei mit einem anionischen Detergens kom­ plexiertem Protein ist ein leicht alkalischer pH von etwa 7,5 bis zu etwa 10 geeignet, um die Detergens-Proteinkomplexe und die anodische Wanderung aufrechtzuerhalten. Ein pH von etwa 8,5 ist optimal, z. B. wenn Dodecylsulfat als Detergens verwendet wird.

Die die exakte Wiedergabe des Elektropherogramms im Gel enthalten­ den Nitrocellulosefolien können unter anderem für verschiedene Typen vom Immunoassays verwendet werden. Die vorliegende Erfindung umfaßt somit auch die Verwendung der nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellten festen Träger zur Identifizierung oder zum Nachweis von Proteinen oder der ihnen eigenen Antikörper durch Immuno­ assaymethoden. Die auf die Nitrocellulosefolie übergeführten Proteine können von irgend­ einer Quelle stammen: Tieren, Pflanzen, Bakterien, Viren, und können auch irgendwelche bekannte natürlich auftretende Proteinkonjugate sein, wie Glycoproteine und Lipoproteine, und können auch Protein- Nukleinsäurekomplexe sein, wie Ribosomen oder Zellkern-Ribonukleopro­ teinkomplexe. Unter der Klasse von Viren- und Bakterienproteinen be­ finden sich Pathogene und Tierproteine und Proteinkomplexe, die zu einer autoimmunen Erkrankung führen.

Gewünschtenfalls kann die Lage der Proteine in den Folien durch ein Anfärbeverfahren bestimmt werden. Die Proteine können auf der Nitro­ cellulosefolie beispielsweise unter Verwendung von Amidoschwarz ge­ färbt werden und überschüssige Farbe kann z. B. unter Verwendung von Methanol/Essigsäure/Wasser entfernt werden.

Für die Verwendung bei Immunoassay-Verfahren müssen die verbliebenen Bindekapazitäten der Nitrocellulosefolien durch Behandlung mit einem oder mehreren Proteintypen, die von den immobilisierten verschieden sind und keine Kreuzreaktion mit igendeinem der anschließend ver­ wendeten Antikörper eingehen, gesättigt werden. Dies kann direkt nach der Durchführung des Transfers erreicht werden. In einer vorangehen­ den Stufe werden die verbliebenen Bindungspositionen der Nitrocellu­ losefolie durch Behandlung mit nichtspezifischen Proteinen, beispiels­ weise Rinderserumalbumin, gesättigt. Derartige Proteine werden mitVor­ teil in physiologischer Salzlösung verdünnt, und die Nitrocellulose­ folie wird mit dieser Lösung vorzugsweise bei leicht erhöhter Tempera­ tur, z. B. zwischen etwa 30 und 50°C, bevorzugt bei etwa 40°C inkubiert und mit physiologischer Salzlösung gewaschen. Nach dieser Vorbehand­ lung können noch Proteinbindungsstellen vorliegen, die noch nicht vollständig blockiert sind und die auch blockiert werden müssen, wenn Immunoassays durchzuführen sind. Liegt aufgrund der verbliebenen Bin­ dungsstellen oder des Austausches von nichtspezifischem Protein eine Hintergrundadsorption vor, kann diese verhindert werden, indem man die Inkubierung mit dem ersten Antiserum und diejenige mit dem Indikator­ antikörper in fortgesetzter Gegenwart des gleichen nichtspezifischen Proteins und zusätzlich in Gegenwart von Gesamtserum, das von der gleichen oder einer verwandten Spezies wieder Indikatorantikörper herrührt, als Träger durchführt. Die fortgesetzte Anwesenheit dieser Proteinmischungen blockiert verbliebene Bindungspositionen und trägt auch dazu bei, durch Konkurrenz den Austausch von Antikörpern mit Proteinen zu verhindern, die zuvor an nichtspezifischen Positionen gebunden worden sind. Das so verwendete Trägerserum sollte nicht von einer Spezies sein, die Immunoglobuline enthält, die mit dem Indika­ torantikörper kreuzreagieren. Die bevorzugten Bedingungen für die Durchführung dieser Stufen liegen bei Konzentrationen von 3% (Gew./ Vol.) Rinderserumalbumin als nichtspezifisches Protein und 10% (Vol./ Vol.) Trägerserum, sämtlich verdünnt in physiologischer Salzlösung. Alternativ können die Behandlungen mit dem nichtspezifischen Protein und dem als Träger verwendeten Serum separat statt in Kombination mit den Behandlungen mit Antiserum und Indikatorantikörper durchgeführt werden. Der Immunoassay mit dem zu analysierenden Antiserum kann durch Inkubation mit diesem Serum, das gemäß der erwarteten Antikörper­ konzentration verdünnt worden ist, gewöhnlich im Bereich von 1 : 10 bis 1 : 1000 in physiologischer Salzlösung, z. B. im Bereich von 2 Stunden bis zu einer Nacht bei Raumtemperatur durchgeführt werden, wonach ausgiebig mit physiologischer Salzlösung gewaschen wird. Der Indikator­ antikörper ist radioaktiv markiert oder mit einer fluoreszierenden Substanz oder mit einem Enzym, das eine Farbreaktion mit seinem Substrat ergeben kann, konjugiert. Der Indikatorantikörper wird gewöhnlich in einer Mischung des vorstehend genannten ersten nichtspezifischen Proteins und des Trägerserums auf das etwa 50fache verdünnt, 30 Minu­ ten inkubiert und wieder in physiologischer Salzlösung gewaschen.

Diese Methoden werden unter Anwendung von per se bekannten Techniken und unter Verwendung bekannter Indikatoren durchgeführt. So kann z. B. ¹²⁵J-markiertes Immunoglobulin bei der Autoradiographie, mit Fluores­ zein konjugiertes Immunoglobulin für die fluorometrische Methode oder mit Meerrettich-Peroxidase konjugiertes Immunoglobulin für die Enzym­ immunomethode verwendet werden, wobei im Fall der Meerrettich-Peroxidase­ methode o-Dianisidin in Gegenwart von Wasserstoffperoxid als Substrat für die Peroxidase zur Erzeugung einer Farbreaktion verwendet wird, bei der das gefärbte Reaktionsprodukt unlöslich und an der Stelle seiner Bildung immobilisiert bleibt.

Mit Hilfe dieser Immunoassaymethoden ist es möglich, unter Verwendung bekannter auf den Nitrocelluloseträger übergeführter Proteine unbe­ kannte pathologische Antikörper in einem Serum, beispielsweise einem tierischen Serum oder Humanserum, zu identifizieren. Umgekehrt kann unter Verwendung bekannter Antikörper in einem Serum und bekannter nach der erfindungsgemäßen Methode auf der Nitrocellulosefolie immo­ bilisierter Proteine die Gegenwart derartiger Proteine in Lösung in einer unbekannten Probe aufgrund ihrer Fähigkeit, mit der Antikörper­ reaktion auf dem festen Träger zu konkurrieren, mit Hilfe gut bekann­ ter Verfahren bestimmt werden. Im ersten Fall können die bekannten Proteine, die z. B. von einem eindimensionalen Elektropherogramm in einem Gel transferiert worden sind, auch getrennt werden, indem man die Folie in verschiedene Streifen, entsprechend jedem isolierten Protein, oder parallele Replikstreifen, die sämtliche getrennten Proteine enthalten, aufschneidet. Mit derartigen Streifen können ver­ schiedene individuelle Seren, die unbekannte Antikörper enthalten, leicht identifiziert werden.

Bei allen beschriebenen angegebenen Antikörpern ist die Methode sehr empfindlich, und es können geringe Mengen an elektrophoretisch ge­ trenntem Antigen sowie geringe Mengen an Antikörper in einem Serum mit niedrigem Titer nachgewiesen werden. Das Peroxidaseverfahren be­ sitzt den zusätzlichen Vorteil der Einfachheit und der Ermöglichung einer direkten visuellen Bewertung ohne spezielle Instrumentation. Da das Antigen auf einer Folie immobilisiert wird, ist kein Antikörper erforderlich, um mit dem Antigen einen Niederschlag zu bilden. Die Transfertechnik ist daher bei der immunoelektrophoretischen Analyse von Proteinen anwendbar, indem man einwertige Immunoglobulinfragmente bindet, oder Antikörper bindet, die gegen eine einzelne Determinante gerichtet sind, wie monoklonale Antikörper, die von Hybridomas gebil­ det werden. Dies konnte durch gängige immunoelektrophoretische Techniken nicht erreicht werden. Werden Hybridomaklone aus einer mit unreinem Immunogen immunisierten Maus erhalten, ist es möglich, die Technik zur Feststellung von Klonen zu verwenden, die einen gegen ein gewünschtes Antigen gerichteten Antikörper bilden. Unter der Voraussetzung, daß das gewünschte Antigen eine charakteristische Beweglichkeit bei der Polyacrylamidelektrophorese besitzt, kann das entsprechende Klon, ohne jemals ein reines Antigon gehabt zu haben, ausgewählt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren von Immunoassays ist auch anwendbar als Hilfsmittel zur Aussondierung von pathologischen Seren, die Auto­ antikörper, z. B. solche gegen Ribosomen oder andere Nukleoproteinkom­ plexe, enthalten. Die exakte Identifizierung der immunogenen Kompo­ nenten kann ein wertvolles diagnostisches Hilfsmittel für verschie­ dene pathologische Zustände sein.

Ein weiterer Vorteil der Immobilisierung von Proteinen auf Nitro­ cellulose ist die Einfachheit der Durchführung bei der Autoradio­ graphie. Herkömmliches Färben, Entfärben und Trocknen von Polyacryl­ amidgelen nimmt zahlreiche Stunden in Anspruch und die exakten Trocknungsbedingungen sind außerordentlich kritisch, insbesondere bei 18% Gelen, wie sie bei der zweiten Dimension für ribosomale Proteine verwendet werden. Werden Proteine auf einen Nitrocellulose­ träger wie vorliegend beschrieben transferiert, nimmt der elektro­ phoretische Transfer 1 Stunde in Anspruch, das Färben und Entfärben weniger als 10 Minuten und das Trocknen weitere 5 Minuten. Dies ist somit sowohl rascher als auch einfacher als bei herkömmlichen Verfah­ ren und umgeht die langwierige und gefährliche Maßnahme des Durch­ tränkens von Gelen in Diphenyloxazol.

Die Technik ist bei jedem analytischen Verfahren, das von der Bildung eines Protein-Liganden-Komplexes abhängt, anwendbar. Mit der Transfertechnik müßte das übliche Verfahren der Bildung eines Komplexes in Lösung und Zurückhalten desselben auf einer Membran umgekehrt werden: Das bereits an der Membran adsorbierte Protein müßte den Liganden aus einer Lö­ sung, in die die Membran eingetaucht ist, zurückhalten. Wechselwir­ kungen, die möglicherweise auf diese Weise analysiert werden können, schließen Hormon-Rezeptor-, cyclisches AMP-Rezeptor- und Protein- Nukleinsäure-Wechselwirkungen ein. Der Ligand kann auch ein Protein sein. Auf Polyacrylamidgelen getrennte Enzyme könnten geeigneterweise auf Transfer durch in situ-Versuche lokalisiert werden. Ein kritisches Erfordernis für die Anwendung ist das, daß das Protein nicht durch das Adsorptionsverfahren beeinträchtigt wird und daß die Bindungs­ positionen den Liganden und Substraten zugänglich bleiben. In dieser Hinsicht gelten ähnliche Überlegungen wie in der Affinitätschromato­ graphie und in Techniken mit unlöslichen Enzymen.

Die Methode kann auch für das Verfahren zur Analyse von aus Banden in Polyacrylamidgelen eluierten Proteinen mit der eindimensionalen Fingerprinttechnik angepaßt werden (Cleveland et al. [1977], J. Biol. Chem. 252, 1102-1106). Man könnte durch Jodierung in situ auf der Nitrocellulose markieren und dann die proteolytische Verdauung durch­ führen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die Temperaturen sind in °C angegeben.

Beispiel 1:

Ribosomales L7 und L12 von Escherichia Coli werden nach der in "Hamel, E., Koka, M. & Nakamoto, T. (1972) Biol. Chem. 247, 805-814" beschriebenen Methode aus 50S ribosomalen Untereinheiten extrahiert und nach der in "Möller, W., Groene, A., Terhorst, C. & Amons, R. (1972) Eur. J. Biochem. 25, 5-12" beschriebenen Methode durch Ionenaustauscherchromatographie an Carboxymethyl- und DEAE- Cellulose gereinigt. Man erzeugt bei einer Ziege Antikörper, indem man 250 µg Protein, das mit vollständigem Freund's Adjuvans emulgiert worden war, verteilt über mehrere Stellen intracutan injiziert. Man verabreicht Bacillus pertussis-Vakzine (1,5 ml) von Bordet- Gengou-Vakzine (Schweizerisches Serum- und Impfinstitut, Bern, Schweiz) subcutan mit jeder Antigeninfektion. Man verabreicht zusätz­ liche Injektionen der gleichen Formulierung an den Tagen 38, 79 und 110. Man entnimmt dem Tier am Tag 117 Blut und entnimmt das zu ana­ lysierende Antiserum aus der Jugularvene.

Man unterzieht eine Mischung von ribosomalen Gesamtproteinen von Escherichia coli einer zweidimensionalen Elektrophorese wie folgt:

Die Gele der ersten Dimension werden in Glasrohre (Innendurchmesser 2,4 mm) gegeben, wobei die sauren und basischen Proteine in getrennten Gelen mit entgegengesetzter Polarität laufen. Das Trenngel (8 M Harn­ stoff; 8% Acrylamid; 0,021 M EDTA; 0,5 M Borsäure; 0,4 M Tris; 0,3% N,N,N′,N′-Tetramethyläthylendiamin, 0,3% N,N′-Methylenbisacryl­ amid, pH 8,6, 3 µl/ml Gellösung von 10% Ammoniumpersulfat) mit Wan­ derung in Richtung der Anode besitzt eine Länge von 5 cm und das Gel mit Wanderung auf die Kathode zu eine Länge von 7,5 cm. Ein 5 mm Sammelgel (8 M Harnstoff; 4% Acrylamid; 0,2% N,N′-Methylenbisacryl­ amid; 0,002 M EDTA; 0,005 M Borsäure; 0,06% N,N,N′,N′-Tetramethyl­ äthylendiamin, pH 8,6; 20 µl/ml Gellösung von 0,5 mg/ml Riboflavin, 5 mg/ml Ammoniumpersulfat) wird oben auf das Trenngel aufgebracht. In einigen Fällen wird die Länge des Gels auf 10 cm erhöht, um mögliche schneller wandernde Proteine sichtbar zu machen (es werden keine gefunden). Der niedrigere Elektrodenpuffer ist 0,0064 M EDTA; 0,155 M Borsäure; 0,12 M Tris; der pH wird mit 10 M NaOH auf 8,6 ein­ gestellt. Vor der Verwendung werden die Gelrohre mit 1% Vol./Vol. Dimethyldichlorsilan in Toluol beschichtet und bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Man löst die Probe von ca. 100 µg des ribosomalen Gesamtproteins von E. coli in 40 µl bis 50 µl des Probenpuffers (8 M Harnstoff 0,002 M Na.EDTA; 0,005 M Borsäure, 0,06% N,N,N′,N′- Tetramethyläthylendiamin; 0,04% 2-Mercaptoäthonol; pH 8,6) unter Zusatz von 5 µl 0,05% Bromphenol-Blau (saure Proteine) oder 0,1% Pyronin G (basische Proteine) in 20% Glycerin als Markierungsfarb­ stoff und erhitzt 20 Minuten auf 40°C. Nach dem Kühlen auf Raumtem­ peratur wird die Probenlösung auf das Sammelgel aufgebracht und sorg­ fältig mit dem Reservoirpuffer überschichtet. Das Durchlaufen des Sammelgels erfolgt bei 100 V während 15 Minuten, und die Elektrophorese wird in Richtung der Anode bei 175 V und gegen die Kathode bei 275 V während insgesamt 5 Stunden fortgesetzt. Die Gele werden aus den Röhren mit einer feinen Nadel und Spritze durch vorsichtiges Injizie­ ren von 10% Glycerin zwischen das Gel und die Rohrwand entnommen. Nach der Entnahme werden die Gele in 0,3 N HCl 5 Minuten eingetaucht und in die Gellösung der zweiten Dimension 10 Minuten eingebracht.

Das Gel der zweiten Dimension ist beschaffen wie von Howard, G. A. & Traut, R. R. (1973), FEBS LETTERS 29, 177-180 beschrieben, mit Aus­ nahme dessen, daß die Menge an N,N′-Methylenbisacrylamid 0,38% Gew./Vol. beträgt. Die Elektrophorese erfolgt bei konstant 105 V während 14 Stunden. Die Dimensionen der Platte sind 11×14 cm bei einer Dicke von 2 mm.

Die Proteine werden dann auf die im allgemeinen Teil beschriebenen Nitrocellulosefolien transferiert, wobei man Millipore-Folien in Rollenform mit einer Porengröße von 0,45 µm verwendet. Die Folie wird kurz mit Wasser befeuchtet und wie beschrieben auf das Kissen aufgebracht. Das für die Elektrophorese verwendete Gel wird auf die Nitrocellulosefolie aufgebracht und es wird darauf geachtet, daß sämtliche Luftblasen entfernt werden. Das zweite Kissen und das Kunst­ stoffnetz werden zugegeben und es werden Gummibänder um sämtliche Schichten gebunden. Das Gel wird auf diese Weise fest und eben gegen die Nitrocellulosefolie gepreßt. Die Anordnung wird in eine elektro­ phoretische Entfärbungskammer eingebracht, wobei die Nitrocellulose­ folie der Kathode gegenüberliegt. Die Kammer enthält 0,7% Essigsäure. Man wendet eine Stunde lang einen Spannungsgradienten von 6 V/cm an. Der Transfer der Proteine auf die Nitrocellulose ist, wie aus dem Fehlen von nachweisbarem Protein in dem ursprünglichen Gel ersichtlich, quantitativ.

Die elektrophoretischen Transfers werden in 3% Rinderserumalbumin in physiologischer Salzlösung (0,9% NaCl/10mM Tris-HCl, pH 7,4) während einer Stunde bei 40°C durchtränkt, um zusätzliche Proteinbindungsposi­ tionen zu sättigen. Man spült in Salzlösung und inkubiert mit 5 ml der folgenden Komponenten: Das vorstehend erhaltene Ziegen-Antiserum mit einem Titer von 340 pMol von 70S Ribosomen je ml Serum, bestimmt durch Trübungsbildung (Howard G., Smith R. L., Gordon J. [1976], J. Mol. Biol. 106, 623-637), verdünnt in einem Verhältnis von 1 : 10 in Salzlösung, enthaltend 3% Rinderserumalbumin und 10% Kaninchen-Trägerserum. Die Folien werden in Salzlösung (etwa 5 Waschgänge während insgesamt 30 Minuten) gewaschen und mit dem zweiten (Indikator) Antikörper inku­ biert, der gegen die Immunoglobuline des ersten Antiserums gerichtet ist.

Eine Lösung von Meerrettich-Peroxidase-konjugiertes Kaninchen-anti- Ziegen-Immunoglobulin G (Nordic Laboratories, Tillburg, Niederlande) wird vor der Verwendung nach Anweisung des Herstellers rekonstituiert.

Die Meerrettich-Peroxidase-konjugierten Immunoglobulin-Präparate werden in einer Verdünnung von 1 : 2000 in Salzlösung, enthaltend 3% Rinder­ serumalbumin und 10% Kaninchenserum, verwendet. Die Transfers werden 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und wie vorstehend beschrie­ ben gewaschen. Für die Farbreaktion (basierend auf Avrameas, S. & Guilbert, B. [1971], Eur. J. Immunol. I, 394-396) werden die Transfers mit einer Lösung von 25 µg o-Dianisidin je ml/0,01% H₂O₂/10 mM Tris- HCl, pH 7,4 durchtränkt. Diese wird frisch aus Stammlösungen von 1% o-Dianisidin in Methanol und 0,30% H₂O₂ hergestellt. Die Reaktion wird nach 20 bis 30 Minuten durch Waschen mit Wasser beendet. Die Transfers werden zwischen Filterpapier getrocknet. Das Trocknen ver­ mindert beträchtlich die Verfleckung des Untergrunds. Die Transfers werden unter Lichtschutz aufbewahrt.

Die Flecken der kreuzreagierenden Proteine L7 und L12 können dann ein­ fach in dem zweidimensionalen Muster identifiziert werden.

Beispiel 2:

Die wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigten Proteine L7/L12 werden durch Elektrophorese in einem Gel, entsprechend ledig­ lich der zweiten Dimension von Beispiel 1, getrennt. Es wird das glei­ che Nachweisverfahren mit Peroxidase-konjugierten Kaninchen-anti- Ziegen-Immunoglobulin angewandt. Die in Vertiefungen von 1 cm am obe­ ren Ende des Gels aufgetragene Proteinmenge wird innerhalb eines wei­ teren Bereichs variiert. Im allgemeinen sind die Proteinbanden nach le­ diglich einer Elektrophoresedimension schärfer, so daß die Empfind­ lichkeit des Nachweises entsprechend höher ist. Eine signifikante Farb- Reaktion tritt bereits bei einer so geringen Menge wie 50 pg der Proteine L7/L12 auf.

Beispiel 3:

Man stellt ribosomale Hühnerleber-Untereinheiten her, trennt sie und gewinnt aus ihnen das Gesamtprotein wie bereits im einzelnen beschrieben (Ramjoue, H. P. R. & Gordon, J. [1977], J. Biol. Chem. 252, 9065-9070). Man tritiiert sie durch reduktive Methylierung mit Formaldehyd und Natriumbortritiid (Moore, G. & Crichton, R. R. [1974], Biochem. J. 143, 604-612). Das radioaktive Protein wird mit einer geeigneten Menge des nichtradioaktiven Trägerproteins der glei­ chen Art verdünnt, und man bringt 35 µg auf doppelte identische Gele auf. Sie werden wie in Beispiel 1 beschrieben einer zweidimensionalen Elektrophorese unterzogen. Ein Gel wird direkt 4 Stunden mit Coomassie­ blau R250 (0,1% in 7,5% Essigsäure und 50% Methanol) gefärbt und elektrophoretisch in 7,5% Essigsäure, 7,5% Methanol entfärbt. Das andere Gel wird elektrophoretisch, wie in Beispiel 1 beschrieben, auf Nitrocellulose aufgebracht, mit Amidoschwarz 3 Minuten (0,1% in 45% Methanol, 10% Essigsäure) gefärbt und mit 90% Methanol, 2% Essig­ säure entfärbt. Die individuellen gefärbten Flecken werden herausge­ schnitten und man bestimmt nach Verbrennung in einer Probenoxidations­ vorrichtung (Oxymat, Intertechnique, Frankreich) die Radioaktivität als ³H₂O. Die Effizienz des Transfers wird als Verhältnis der Radio­ aktivität in einem Fleck in der Nitrocellulosefolie zu derjenigen in dem entsprechenden Fleck in dem zweiten Gel berechnet. Die durch­ schnittliche Transfereffizienz beträgt (108 ± 20%) für diese Proteingruppe. Dies ist völlig quantitativ, und die angegebene Stan­ dardabweichung liegt innerhalb der Fehlergrenzen, mit der man indivi­ duelle Flecken herausschneiden kann.

Beispiel 4:

Man stellt wie in Beispiel 3 Untereinheiten von Hühner­ leberribosomen her, kombiniert sie in äquimolaren Mengen und verwen­ det sie, um Antikörper bei Reihen individueller Mäuse nachzuweisen. Jede Maus (BALB/C-Stamm) erhält 200 µg des in 125 µg Freund's Complete Adjuvant emulgierten Präparats, und man injiziert an einer Stelle intraperitoneal und an vier Stellen subcutan. Weitere Injektionen von 400 µg Ribosomen in physiologischer Salzlösung werden intraperitoneal an den Tagen 33, 57, 58 und 59 verabreicht. Den Tieren entnimmt man am Tag 71 durch Schwanzincision Blut. Die individuellen Mausseren werden auf ihren Gehalt an Antikörpern gegen individuelle ribosomale Proteine wie folgt untersucht. Man trägt das ribosomale Gesamtprotein aus Hühnerleber, hergestellt wie vorstehend (400 µg), als 14 cm lange Linie auf den oberen Teil einer Gelplatte auf, entsprechend der zweiten Dimension der Elektrophorese von Beispiel 1. Das Elektropherogramm wird auf eine Nitrocellulosefolie wie in Beispiel 1 übergeführt und mit Rinderserumalbumin in Salzlösung in der gleichen Weise behandelt. Die Folie wird dann in 5 mm breite Streifen parallel zur Richtung der Elektrophorese geschnitten. Jeder Streifen enthält dann einen repräsentativen Ausschnitt des gesamten ursprünglichen Elektrophero­ gramms. Die individuellen Mausseren werden dann auf das 50fache in physiologischer Salzlösung, enthaltend 3% Rinderserumalbumin und 10% nichtimmunes Ziegenserum, verdünnt. Jeder Nitrocellulosestreifen wird 6 Stunden bei Raumtemperatur in 250 µl dieser Lösung inkubiert und in physiologischer Salzlösung wie im ersten Beispiel gewaschen.

Der zweite Indikatorantikörper wird wie folgt hergestellt: Man reinigt hyperimmunes Schaf-anti-Maus-Immunoglobulin durch Affinitätschromato­ graphie an Sepaharose-gebundenen Maus-Myeloma-Proteinen, enthaltend α, µ, γ ₁, γ _{2 A} , γ _{2 B} , κ- und λ-Ketten. Die Jodierung wird nach der Chloramin-T-Methode (Matsku, I. & Zöller, M. [1977], Immunochistry, 14, 367-371) unter Verwendung von 450 µg Protein und 1,5 mCi Na¹²⁵J in einem 0,5 ml-Volumen während 60 Sekunden bei Raumtemperatur durchge­ führt. Die Reaktion wird mit überschüssigem Natriummetabisulfit und nichtradioaktivem NaJ bei einer Endkonzentration von 10 mM abgebrochen. Überschüssiges freies Jodid wird auf einer Sephadex G25 Säule, die zuvor mit physiologischer Salzlösung und 0,1% Rinderserumalbumin ge­ sättigt worden ist, entfernt. Der markierte Antikörper wird in 0,75% Rinderserumalbumin aufbewahrt. Die spezifische Aktivität beträgt ca. 1,5 µCi/µg. Dies wird in physiologischer Salzlösung, enthaltend 3% Rinderserumalbumin und 10% normales Ziegenserum, auf 10⁶ cpm/ml ver­ dünnt. Die Nitrocellulosestreifen werden in 250 µl dieser Lösung 6 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, in 5 Waschgängen mit physiolo­ gischer Salzlösung während 0,5 Stunden gewaschen, mit einem Haar­ trockner getrocknet und 6 Tage einem Kodak X-Omat R Film ausgesetzt. Das Autoradiogramm zeigt die Heterogenität der Reaktionen der indivi­ duellen Mäuse gegenüber einer komplexen Reihe von Immunogenen. Dieses Verfahren ist ein Prototyp für die Sondierung individueller Seren auf die Anwesenheit individueller Antikörper gegen eine komplexe Reihe von Immunogenen.

Beispiel 5:

Man unterzieht 1 µl Humanserum einer eindimensionalen Elektro­ phorese gemäß der allgemein verwendeten Methode (Laemmli, U. K. [1970], Nature 227, 680-685) mit einem 15% Acrylamidgel. Der elektrophoreti­ sche Transfer aus dem Gel auf die Nitrocellulosefolie findet in einem Medium statt, das 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Methanol enthält und einen pH von 8,3 besitzt, wobei die Folie sich auf der anodalen Seite des Gels befindet. Man bestimmt die Lage des Human-Immuno­ globulins G auf der Nitrocellulosefolie wie in der letzten Stufe von Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß man Peroxidase-konjugiertes Kanin­ chen-anti-human-IgG verwendet. Das Ergebnis zeigt eine Farbbande, die der anhand des Molekulargewichts der IgG-Fraktion in dem ursprüngli­ chen Elektropherogramm zu erwartenden Stelle entspricht. Dies zeigt, daß der Dodecylsulfatkomplex dieses Proteins mit Erfolg auf die Nitrocellulosefolie transferiert worden ist und auch seinen zugehöri­ gen Antikörper binden kann. Andere ähnliche Beispiele bei einer großen Vielfalt von Proteinen zeigen, daß im wesentlichen alle aus derarti­ gen Gelen, die Natriumdodecylsulfat enthalten, ohne Verlust an Auf­ lösung oder antigenem Verhalten transferiert werden, obgleich die Effizienz des Transfers nicht immer so hoch ist wie diejenige für Gele, die kein Detergens enthalten wie in Beispiel 3.

Claims (31)

1. Verfahren zur Herstellung eines festen Trägers enthaltend einen Abdruck eines Elektropherogramms von Proteinen in einem Gel, da­ durch gekennzeichnet, daß die Proteine aus dem Gel durch Elektro­ phorese auf eine poröse Nitrocellulosefolie transferiert werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Elektropherogramm aus einer Gelplatte, wie sie üblicherweise in der Proteinchemie verwendet wird und die ein Proteindenaturierungsmittel enthält, transferiert wird, wobei der elektrophoretische Transfer durch Anwendung eines elektrischen Feldes senkrecht zur Ebene der Gelplatte bewirkt wird und die Nitrocellulosefolie der Elektrode, gegen die die Proteine wandern, gegenüberliegt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Polyacrylamidgelplatte verwendet.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Agar-, Agarose- oder Stärkegelplatte verwendet.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Nitrocellulosefolie gegen die Gelplatte zwischen 2 Kissen, die durch elastische Bänder dicht zugsammengehalten werden, ge­ preßt und diese Anordnung in eine Elektrophoresekammer gebracht wird, die ein saures oder alkalisches Medium oder einen Puffer enthält.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als Proteindenaturierungsmittel in der Gelplatte ein anionisches Detergens verwendet wird und der elektrophoretische Transfer in Gegenwart eines Puffers im Bereich von pH 7,5 bis 10 erfolgt.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als Proteindenaturierungsmittel in der Gelplatte ein nichtionisches Detergens verwendet wird, und der elektrophoretische Transfer in Gegenwart von verdünnter Säure erfolgt.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als Proteindenaturierungsmittel Natriumdodecylsulfat oder Harnstoff verwendet wird.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Nitrocellulosefolie, die die transferierten Proteine enthält, mit nichtspezifischen Proteinen behandelt wird, um weitere Adsorptionsbindungsstellen zu sättigen.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung in physiologischer Salzlösung bei leicht erhöhter Temperatur durchgeführt wird.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung während etwa einer Stunde bei 40°C durchgeführt wird.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Abdruck des Elektropherogramms eindimensional ist.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Abdruck des Elektropherogramms zweidimensional ist.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die poröse Nitrocellulosefolie aus einer Mischung von Nitrocellulose mit einem anderen Celluloseester besteht.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Nitrocellulosefolie aus einer Mischung von Nitrocellulose und Celluloseacetat besteht.

16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Nitrocellulose in der Nitrocellulosefolie ein Salpetersäureester von Cellulose mit etwa 3 Salpetersäuregruppen je 6 C-Atome ist.

17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Nitrocellulose in der Nitrocellulosefolie ein Salpetersäureester der Cellulose mit weniger als 3 Salpetersäure­ gruppen je 6 C-Atome ist.

18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekenn­ zeichnet, daß von Tieren, Pflanzen, Bakterien oder Viren abge­ leitete Proteine transferiert werden.

19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekenn­ zeichnet, daß von bekannten natürlich auftretenden Proteinkon­ jugaten abgeleitete Proteine transferiert werden.

20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekenn­ zeichnet, daß von Glycoproteinen und Lipoproteinen abgeleitete Proteine transferiert werden.

21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekenn­ zeichnet, daß von Protein-Nukleinsäurekomplexen abgeleitete Proteine transferiert werden.

22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 oder 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß von Proteinkomplexen, die autoimmune Erkrankungen hervorrufen, abgeleitete Proteine transferiert werden.

23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Porengröße der Nitrocellulosefolie im Bereich von 0,025 µm und 14 µm liegt.

24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Porengröße der Nitrocellulosefolie etwa 0,4 bis 0,5 µm beträgt.

25. Verwendung eines gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24 hergestell­ ten festen Trägers zur Identifizierung oder zum Nachweis von Proteinen oder der ihnen eigenen Antikörper durch Immunoassay­ methoden.

26. Verwendung des festen Trägers gemäß Anspruch 25 zum Nachweis von in verschiedenen Seren enthaltenen Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger, der individuell spezifische, bekannte Proteine, die zuvor elektrophoretisch in ein oder zwei Dimensionen getrennt und auf den Nitrocelluloseträger transferiert worden sind, enthält, in Streifen geschnitten wird, die Abschnitte des gleichen Elektropherogramms re­ präsentieren, und daß die Streifen für die Durchführung der Immuno­ assays verwendet werden.

27.Verwendung des festen Trägers gemäß Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß sämtliche Seren oder Proteine in physiologischer Salzlösung verdünnt werden.

28 Verwendung des festen Trägers gemäß Anspruch 27, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Nitrocellulosefolie in Salzlösung gewaschen und mit einem Indikatorantikörper inkubiert wird.

29. Verwendung des festen Trägers gemäß Anspruch 28, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Indikatorantikörper radioaktiv markiert ist, und daß der Nachweis durch Autoradiographie durchgeführt wird.

30. Verwendung des festen Trägers gemäß Anspruch 28, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Indikatorantikörper mit einem fluoreszierenden Indikator konjugiert ist, und der Nachweis fluorometrisch durchge­ führt wird.

31. Verwendung des festen Trägers gemäß Anspruch 28, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Indikatorantikörper mit einem Enzym konjugiert ist, das mit einem geeigneten Substrat eine Farbreaktion ergibt, und daß der Nachweis colorimetrisch oder visuell durchgeführt wird.