DE3751249T2

DE3751249T2 - Protein L und ihre Untereinheiten, mit immunglobulinbindender Aktivität, Verfahren zur Herstellung, Reagenssatz, pharmazeutische Zubereitung und ein Peptococcus-magnus-Stamm.

Info

Publication number: DE3751249T2
Application number: DE3751249T
Authority: DE
Inventors: Lars Bjoerck; Mats Erntell; Erling B Myhre
Original assignee: Hightech Receptor AB
Current assignee: Affitech Oslo No AS
Priority date: 1986-07-22
Filing date: 1987-02-11
Publication date: 1995-08-31
Anticipated expiration: 2007-02-12
Also published as: JPS6332372A; US4876194A; ES2071610T3; EP0255497B1; EP0255497A2; ATE121419T1; DE3751249D1; EP0255497A3; JP2528302B2

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf eine neues Protein, genannt Protein L (L für light chain) und Subfragmente davon mit einer Immunoglobulinbindungsaktivität, ein Verfahren für die Herstellung des Proteins und Fragmente aus Stamm (312) der Bakterienart des Peptococcus magnus, den genannten Stamm, einen Reagenziensatz und eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend das Protein oder die Fragmente.
Proteine, die fähig sind, das Fc-Fragment von Immunoglobulin (Ig) zu binden sind bekannt und können therapeutisch und analytisch verwendet werden. Protein A bindet somit das Fc-Fragment von humanem IgG, mit Ausnahme von IgG3, zeigt jedoch eine schwache Reaktivität mit IgG von verschiedenen Tierarten, wie von wichtigen Laboratoriumstieren, z.B. der Ratte oder der Ziege, welche die Verwendung von Protein A als IgG-Reagenz einschränken. Ein anderes Protein, das Protein G bindet das Fc-Fragment aller humanen IgG-Subklassen und ebenfalls von vielen Tieräquivalenten.
In Molecular Immunology, Vol. 22, No. 8, pp. 879-885 beschreiben Erling B. Myhre und Mats Erntell die Immunoglobulin-Bindungskapazität von einigen Peptococcus magnus Stämmen. Es werden jedoch keine Daten präsentiert, welche auf den involvierten Bindungstyp und die Substanzart schliessen lässt.
Diese Erfindung bezieht sich auf ein Protein, das humanes IgG, IgM und IgA (wahrscheinlich ebenfalls IgD und IgE, diese Klassen wurden noch nicht getestet) und ebenfalls Ratten-, Mäuse-, Ziegen- und Kaninchen IgG (Ig von anderen Tierklassen sind noch nicht getestet worden) binden kann. Im Gegensatz zu anderen Ig-bindenden bakteriellen Proteinen wie Protein A und G, ziegt Protein L keine Affinitität zur Fc-Region. Stattdessen bindet dieses neue Protein Ig Kappa- und Lambda-leichte Ketten, was heisst, dass Protein L als allgemeine Bildungssubstanz für alle Ig-Klassen von verschiedenen Tierarten verwendet werden kann.
Das neue Protein L hat ein scheinbares Molekulargewicht von 95'000 auf SDS-PAGE und es hat sich erwiesen, dass Subfragmente des Proteins mit kleineren Molekulargewichten eine immunglobulinbindende Aktivität besitzen.
Demzufolge bezieht sich die Erfindung auf ein Protein L mit einer Bindekapazität der leichten Ketten der Immunglobuline IgG, IgM, IgA, IgD und IgE und auf Subfragmente von Protein L, mit einer Bindungsaffinität für leichte Kappa- und/oder Lambdaketten aller Immunoglobulinklassen.
Das Protein und seine Subfragmente könne als Reagenz für die Bindung, Trennung und Identifikation von Immunoglobulinen verwendet werden. Die Erfindung betrifft demzufolge ebenfalls einen Reagenziensatz, welcher Protein L oder Subfragmente davon enthält.
Das neue Protein kann ebenfalls für die Absorbtion von Antikörpern (Immunoglobulinen) vom Blut von Patienten mit Autoimmunleiden verwendet werden. Demzufolge betrifft die Erfindung ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Protein L oder Subfragment davon als aktive Bestandteile enthält, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Adjuvantien und Excipienten.
Das Protein gemäss der Erfindung kann hergestellt werden, indem Peptococcus magnus 312 mit Enzymen, z.B. proteolytischen Enzymen wie Papain, Trypsin und Pepsin oder durch Mutanolysin behandelt wird. Mutanolysin wird bevorzugt. Die proteolytischen Enzyme solubilisieren Protein L, zersetzen jedoch ebenfalls das Protein, wenn die Enzymkonzentration zu hoch ist oder die Reaktionszeit zu lang ist. Demzufolge müssen die Enzymmenge, der pH, die Reaktionszeit und die Temperatur getestet werden um optimale Bedingungen zu ermitteln. Es hat sich erwiesen, dass zur Solubilisierung des gesamten Proteins L bis zu 5 mg Papain pro 1 ml 10%ige (vol/vol) Zellsuspension, vorzugsweise bis zu 1,0 mg/ml und insbesondere bis zu 100 ug/ml verwendet werden sollten, wenn eine Stunde bei 37ºC inkubiert wird. Zu 1 ml 10% (vol/vol) Zellsuspension sollten bis zu 500 g/ml Trypsin zugegeben werden, vorzugsweise bis 100 ug/ml wenn während einer Stunde bei 37ºC inkubiert wird und es sollten mindestens 0,1 U Mutanolysin (Sigma enthaltend 1500- 3000 U/mg) zugegeben werden, wenn während 2 Stunden bei 37ºC inkubiert wird, vorzugsweise 0,1 bis 500, insbesondere 0,1 - 100, am bevorzugtesten 5- 50 U.
Um das Protein L zu solubilisieren und es in Subfragmente mit Immunglobulin-Bindungsaktivität zu zersetzten, sollte Papain in einer Konzentration von mindestens 100 ug/ml Zellsuspension zugegeben werden, Trypsin von mindestens 50 ug/ml und Mutanolysin von mindestens 50 U unter den gleichen Bedingungen wie oben zugegeben werden.
Die oben genannten optimalen Konzentrationen können natürlich geändert werden, wenn die Temperatur und die Inkubationszeit geändert werden. Der pH beeinflusst ebenfalls die optimalen Konzentrationen.
Die Reaktionen werden gestoppt, indem lodacetamid zum Papain, Benzamidin, zum Trypsin zugegeben wird und der pH auf 7,5 eingestellt wird für Mutanolysin.
Der Stamm (312) von Peptococcus magnus 312 von welchem das neue Protein hergestellt werden kann, ist isoliert worden aus der Urethra einer Frau, die mit einem spontanen Abort in der klinischen Abteilung der klinischen Mikrobiologie im Universitätsspital Lund, Schweden, hospitalisiert worden ist.
Der Peptococcus magnus Stamm 312, welcher bei der ATCC am 21. Juli 1986 mit der Nummer 53516 hinterlegt worden ist und Mutanten und Varianten davon mit einer Bindungsaktivität für Immunglobuline aller Klassen und Arten können erfindungsgemäss ebenfalls verwendet werden.

Wachstumsbedingungen

P. magnus kann in Hackfleisch-Glucosebrühe (CMG) oder in Peptonhefeglucosebrühe gezüchtet werden. Es bestand kein merklicher Unterschied bei der Bindefähigkeit zwischen Bakterien, welche in den beiden Medien gezüchtet wurden. Es wurden weitere Arbeiten mit Bakterien durchgeführt, die in CMG Brühe gezüchtet wurden, da die anaeroben Stämme in diesem Wachstum besser wuchsen. Nach der Inkubation während 16 Stunden bei 37ºC wurden die festen Fleischpartikel aus der Kultur durch Zentrifugation bei 200 g während 10 Minuten entfernt. Die überstehende Flüssigkeit, die Bakterien enthielt, wurde in ein neues Zentrifugenglas transferiert und die Organismen wurden durch Zentrifugation bei 2000 g während 10 Minuten pelletiert. Die Bakterien wurden zweimal gewaschen und in phospatgepufferter Kochsalzlösung (PBSA) (120 nM NaCl, 30 mM Phosphat, 0,02% Natriumazid) suspendiert. Die Bakterienkonzentration wurde durch Zentrifugation bei 10'000 während 5 Min. in Kapillarröhrchen in einer Miniaturzentrifuge bestimmt (Microfuge Model 152, Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA).
Die auf Ig-Bindung analysierten P. Magnus Stämme wurden durch die Morphologie, biochemische Tests und Gaschromatographie (Holdeman L.V. Cato E.P. und More W.E.C. (1977) Anaerobe Laboratory, 4th edition, Virginia Polytechnic Institute, Blacksburg, VA) identifiziert. Einer aus sechs getesteten P. magnuns Stämmen (Stamm 312) zeigte Affinität für IgG bei Bindungsexperimenten.
Gemäss dem oben genannten Handbuch ist der neue Peptococcus Stamm ein gram-positives anaerobes Cocci, welches kein fermentierbares Kohlenhydrat erfordert. Die Grösse beträgt 0,6 um.Bei der Kultivation auf Pepton-Hefeextrakt (PY) und Glucose (PYG) sind die Produkte aus PYG gemäss einer Analyse durch Chromatographie vorwiegend Essigsäure (Etherextrakt) und kleine Mengen Milchsäure, Bernsteinsäure und Ameisensäure (methyliert). Bei der Kultivation in Gegenwart von Zelluloseglycolat (CMC) wird ebenfalls vorwiegend Essigsäure, kleine Mengen Propionsäure und Buttersäure (Etherextrakt) und kleine Mengen Milchsäure und Bernsteinsäure (methyliert) produziert. Es wird spurenweise bis mässig Wasserstoff produziert. Der Stamm fermentiert schwach Fructose und Glucose zu einem pH von 5,5 bis 6,0. Gelatine wird unterschiedlich fermentiert und die Katalasereaktion ist unterschiedlich. Das Sediment ist körnig, es wird NH&sub3; und etwas Gas gebildet. Es wird unterschiedlich mit Hippurat gebildet und Pyruvat wird selten gebildet. Einige Stämme wachsen in Gegenwart von Tween -80 besser. Der Rest der Teste im Handbuch sind negativ.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt die Analyse durch Electrophorese aus SDS-PAGE und Western blot von Proteinen, die aus P. magnus 312 mit verschiedenen Enzymen solubilisiert wurden;
Fig. 2 zeigt die gleiche Analyse wie in Fig. 1 eines mit Mutanolysin solubilisierten Proteins; und
Fig. 3 zeigt ein Bindungstest von radiomarkiertem Protein 2 an verschiedene Immunglobuline.

Beispiel 1

Peptococcus magnus 312 wurde auf Blutagarplatten während 2 Tage bei 37ºC gezüchtet. Die Platten wurden mit 0,05M Tris, pH 7,4, welcher 5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) enthielt und auf 10 Volumenprozent eingestellt. 0,5 ml der Suspension wurden zweimal mit 0,01 M Tris-HCl-Puffer pH 8,0 gewaschen. 27,5 ul L-Cystein (1M) und 50 ul (2 mg pro ml) Papain (Sigma) (100 ug) wurden zugegeben und die Mischung wurde 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe von lodacetamid auf eine Endkonzentration von 10 mM unterbrochen. Die Mischung wurde Zentrifugiert und der Ueberstand gefroren. Die Bakterien wurden bei 80ºC während 30 Minuten abgetötet und mit PBSAT (0,12 M NaCl, 0,03M Phosphat, 0,02% NaN&sub3; 0,05% Tween pH 7,2) gewaschen. Die Bakterien wurden in PBSAT auf 1 Volumenprozent und auf die IgG Bindungskapazität getestet (siehe unten).

Beispiel 2

0,5 ml 10% (Vol/Vol) Suspension von P. magnus 312 in 0,05 M TRlS, pH 7,4, welche 5 m M EDTA enthielt, wurde zweimal mit 0,05 KH&sub2; PO4 pH 5,8 gewaschen. 10 ul 10 mg/ml Pepsin (Sigma) 100ug)wurde zugegeben und die Suspension wurde 60 Min. bei 37ºC inkubiert. Die enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe von 7,5 % NaHCO&sub3; bei einem pH von 7,5 unterbrochen. Die Mischung wurde zentrifugiert und der Ueberstand wurde gefroren. Die Bakterien wurden wie oben durch Wärme abgetötet und zweimal mit PBSAT gewaschen. Die Bakterien wurden in PBSAT suspendiert und auf 1% (Vol/Vol) gebracht und die IgG-Bindungskapazität wurde wie nachstehend getestet.

Beispiel 3

0,5 ml einer 10% (Vol/Vol) Suspension von P. magnus 312 in 0,05 M Tris pH 7,4, das 5 m M EDTA enthielt, wurde zweimal mit 0,05 M KH&sub2;PO&sub4;, welches 0,005 M EDTA pH 6,1 enthielt, gewaschen. 10 ul 10 mg/ml Trypsin (Sigma) (100 pg) wurden zugegeben und 60 Min. bei 37ºC inkubiert. Die enzymatische Reaktion wurde mit 25 ul 0,1 M Benzamidin unterbrochen, auf eine finale Konzentration von 5 mM. Die Mischung wurde konzentriert und der Ueberstand gefroren. Die Bakterien wurden durch Wärme wie oben abgetötet und zweimal mit PBSAT gewaschen und in PBSAT auf 1% (Vol/Vol) gebracht ünd die IgG Bindungskapazität wie nachstehend analysiert.

Beispiel 4

P. magnus 312 wurde in 0,05M Tris, pH 7,4, welches 5 m M EDTA enthielt, auf 10% (Vol/Vol) suspendiert. 0,5 ml wurde zweimal mit 0,05 M KH&sub2;PO&sub4; pH 5,8 gewaschen. Fünf Einheiten Mutanolysin (Sigma) wurden zugegeben. Die Mischung wurde bei 37ºC während 2 Stunden inkubiert. Die enzymatische Reaktion wurde durch Anheben des pH auf 7,5 unterbrochen, wobei 7,5% NaHCO&sub3; unter Kühlen in einem Reagenzglas auf Eis zugegeben wurden. Die Mischung wurde zentrifugiert und der Ueberstand gefroren und die Bakterien wie oben durch Wärmen abgetötet und zweimal in PBSAT gewaschen.

Bindungstests

A. IgG-Bindung an Zellen vor und nach der Enzymverdauung

Eine feste Menge von 125 I markiertem humanem IgG (ungefähr 10'000 cpm) wurde mit 200 ul 0,5% Bakteriensuspension (etwa 2x10&sup8;) Bakterien in einem Endvolumen von 225 ul gemischt. PBSA (0,12 M NaCl 0,03 M Phosphat, 0,02% NaN&sub3; pH 7,2), das 0,05% Tween 20 enthielt wurde während 30 Minuten bei 37ºC stehengelassen. Die Suspension wurde zentrifugiert, der Ueberstand abgesaugt. Die Radioaktivität der Kügelchen wurde gezählt und die Bindung als Prozent der zugegebenen Radioaktivität aufgezeichnet.
Es wurden folgende Resultate erhalten: Radioaktivität gebunden an die Bakterien % vor Papain-Verdauung nach Papain-Verdauung vor Pepsin-Verdauung nach Pepsin-Verdauung vor Trypsin-Verdauung nach Trypsin-Verdauung vor Mutanolysin-Verdauung nach Mutanolysin-Verdauung
Mit Papain, Trypsin und Mutanolysin wird die IgG-Bindungskapazität der Bakterien reduziert, was zeigt, dass Protein L partiell solubilisiert wurde. Unter den Bedingungen, welche hier verwendet wurden, scheint Pepsin keinen Einfluss auf die Bindung aufzuweisen.

B. IgG-Bindung an solubilisiertes Protein L

Es wurden Proteine von P. magnus 312 wie oben beschrieben solubilisiert, mit unterschiedlichen Mengen Papain, Pepsin, Trypsin, bzw. Mutanolysin. Die Zellen wurden hinuntergewirbelt und 50 ul Ueberstand wurden einer Gelelektrophorese auf 10% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel unterworfen (SDS-PAGE). Zwei Gele wurden sumultan verwendet. Eines war mit Coomassie blue gefärbt, während die Proteine des anderen Gels auf eine Nitrozellulosemembrane durch Western blotting transferiert wurden; (H. Towbin, T. Stachelin und J. Gordon 1979 Proc. Natl. Acad. Sci, USA 76 4350). Die Membrane wurde dann mit ¹²&sup5;I-radiomarkiertem humanem IgG inkubiert. Das gefärbte Gel und das Autoradiogram des geplotteten Gels sind in Fig. 1 dargestellt.

Legende von Figur 1

Ein ml 10% (Vol/Vol) Suspensionen von P. magnus 312 wurden mit 0,1 mg Papain (Pap. A), 1,0 Papain (Pap. B), 0,1 mg Pepsin (Pep. A), 1,0 mg Pepsin (Pep. B), 0,1 mg Trypsin (Tryp. A), 1,0 mg Trypsin (Tryp. B), 5 U Mutanolysin (Mut. A), bzw. 50 U Mutanolysin (Mut. B), behandelt.
Nach den Verdauungen wurden die Bakterien herumgewirbelt und 50 ul des Ueberstandes wurden auf SDS-PAGE in 10% Gelen aufgetragen. Zwei Gele der gleichen Proben wurden simultan laufengelassen. Eines wurde mit Coomassie blue (Stain) gefärbt, das andere wurde auf Nitrozellulose (Blot) geblottet und mit ¹²&sup5;I-markiertem humanem IgG getestet. Molekurlargewichtsmarker sind durch Pfeile angegeben.
Von Fig. 1 ist offensichtlich, dass 1 mg Papain (Pap B) zuviel ist und dass diese Papainkonzentration das Protein zerstört (vergleiche Pap B in Blot, Fig. 1). Die getesteten Pepsinmengen solubilisieren keine IgG-Bindungssubstanzen. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass höhere Pepsinkonzentrationen das Protein solubilisieren könnten. Für Trypsin bewirken 100 ug kleine IgG-Bindungspeptide (Tryp A in Blot) während mit 1 mg keine IgG-Bindungsaktivität zurückbleibt (Tryp B im Blot). Mit Mutanolysin solubilisieren sowohl 5 als auch 50 Einheiten das Protein ohne seinen Abbau. Unter den getesteten Reagenzien scheint Mutanolysin das beste zu sein und es können wahrscheinlich auch grössere Mengen verwendet werden. Diese Resultate zeigen, dass für die Solubilisierung des ganzen Proteins nicht mehr als eine Menge von 1 mg Papain verwendet werden sollte und nicht mehr als 100 ug Trypsin und bis zu 50 U Mutanolysin oder sogar mehr, wenn eine Stunde, bzw. 2 Stunden bei 37ºC mit 1 ml einer 10% Vol/Vol Zellsuspension inkubiert wird.
Es ist jedoch aus Fig. 1 ersichtlich, dass die Subfragmente des Proteins L (siehe BLOT, Pap. B, Tryp A) ebenfalls IgG binden. Um immunoglobulinbindende Subfragmente von Protein L aus P. magnus zu solubilisieren, können grössere Enzymmengen verwendet werden. Mit den grösseren Enzymmengen wird das Protein L in Subfragmente abgebaut.
Aus der Mutalysinverdauung kann das Molekulargewicht des Proteins L auf ungefähr 95'000 geschätzt werden.

Reinigung von Protein L

18,8 ml einer Suspension von P. magnus 312 10% (Vol/Vol) in PBS (0,12 M NaCl, 0,03 M Phosphat) wurde zweimal mit 0,01 M KH&sub2;PO&sub4; pH 6,8 gewaschen. 282ulMutanolysin (1000 U/ml) und 30 ul DNAse wurden zur Mischung zugegeben und 2 Stunden bei 37ºC in einem Wasserbad inkubiert. Die Reaktion wurde mit 7,5% NaHCO&sub3; bis zu pH 7,5 unterbrochen, wobei das Reagenzglas auf Eis gekühlt wurde. Die Suspension wurde zentrifugiert und 100 ul des Ueberstandes wurden für die spätere Analyse eingefroren.
Die verbleibenden 1,7 ml wurden auf eine 2 ml IgG-Sepharose (Pharmacia)-Säule aufgetragen. Die Probe wurde in das Gel fliessengelassen und die Säule, die mit PBSA äquilibriert war, wurde während einer Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Die nicht an die Säule gebundenen Proteine wurden mit 12 ml PBSA eluiert. Das absorbierte Material wurde dann mit 6 ml 0,1 M Glycinpuffer pH 2,0 eluiert. Während der Elution der Säule wurden 0,4 ml Fraktionen mit etwa 15 Minuten-Intervallen gesammelt. Der Proteingehalt dieser Fraktionen wurde durch ablesen der Absorbtion bei 380 nm (A&sub2;&sub8;&sub0;) abgeschätzt (vergl. Fig. 2). 30 ul des auf die Säule (A) aufgetragenen Materials, 30 ul der Peak-Fraktion bei der Elution mit PBSA (B), dreissig ml einer Fraktion am Ende dieser Elution (C), und 30 ul der Peak-Fraktion folgenden Elution mit 0,1 M Glyzinpuffer, pH 2,0 (b) wurden auf 10% SDS-PAGE laufengelassen (vergl. Fig. 2). Ein Gel wurde mit Coomassie blue (Stain) gefärbt und eines wurde auf Nitrozellulose übertragen und mit
¹²&sup5;I-radiomarkiertem humanem IgG getestet und einer Autoradiographie unterworfen (Blot). Wie in der Figur dargestellt, war nur eine Proteinbande in der Glycin-eluierten Spitzenfraktion gefärbt. Ueberdies war an diese Bande radiomarkiertes humanes IgG (vergl. Blot) gebunden und das Molekulargewicht der Bande war ungefähr 95'000. Demzufolge wurde hochreines Protein L erhalten. Die Peak-Fraktion (D) wurde dann gegen PBS dialysiert und radiomarkiert.

Radiomarkierung des Proteins L

100 ul der dialysierten Fraktion (vergl. oben) wurden mit 100 ul ¹²&sup5;I (0,2 mCi verdünnt in PBS) von Amersham gemischt, Lactoperoxidase (0,25 mmg/ml in PBS) von Sigma und 20 ul H&sub2;O&sub2; (30% in 1:20 000 verdünnt in PBS) von Merck gemischt. Die Mischung wurde während 2 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. 0,5 ml PBSAT wurden zugegeben und die Mischung wurde auf einer PD-10 Säule (Pharmazia) laufengelassen, um das radiomarkierte Protein L vom freien Iod abzutrennen. Die Fraktionen, die dem radiomarkiertem Protein entsprachen wurden gepoolt und für die nachstehenden Bindungsexperimente verwendet.

Bindungseigenschaften von radiomarkiertem Protein L

Polyklonales humanes IgG (Kabi AG, Stockholm, Schweden) und Fragmente dieses Moleküls (F(ab')&sub2;, Fab, und Fc-Fragmente (hergestellt aus Polyklonalem und monoklonalem IgG wie durch Myhre E.B. und Kronvall G. Molec. Immun 17,1563-1573 und Erntell et al Scand. J. Immun 17, 201-209 beschrieben), humane Kappa- und Lambda-leichte Ketten und schwere Ketten, hergestellt aus reduziertem und alkyliertem polyklonalem IgG, humanes polyklonales IgM und IgA (aus Cappel Laboratories, Charge Nummern 17904 und 18447) wurden auf eine Nitrozellulosemembrane aufgetragen, wobei ein Fleckblotapparat von Schleicher und Schnell verwendet wurde.
Die Proben wurden entsprechend auf 100 ul PBS aufgetragen und die Mengen sind in Fig. 3 angegeben. Die Membrane wurde in veronal-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,25% Gelatine und 0,25% Tween 20 enthielt während einer Stunde mit vier 250 ml Portionen gewaschen. Die Nitrozellulosemembrane wurden dann während 24 Stunden in diesem Puffer, der 5x10&sup4; cpm/ml ¹²&sup5;I-radiomarkiertes Protein L enthielt. Nach dem Test wurde die Nitrozellulose viermal in 0,01 M EDTA, 1, M NaCl, 0,25% Gelatine und 0,25% Tween -20 während je 15 Minuten gewaschen und an der Luft getrocknet. Die Nitrozellulosemembrane wurde autoradiographiert, wobei sie einem Kodak XAR-5 Film mit einem Verstärkungsschirm während 3 Tagen bei -70ºC ausgesetzt war.
Wie in Fig. 3 gezeigt, ist das radiomarkierte Protein L stark an das polyklonale humane IgG, F (ab')2, IgM und IgA gebunden, während für die schweren Ketten an Fc-Fragmenten keine Reaktivität gefunden wurde. Protein L ist ebenfalls klar an die Kappa-leichten Ketten gebunden, während die Bindung an die Fab-Fragmente und Lambda-leichten Ketten schwach war. Aehnliche Experimente mit polyklonalem IgG von Ratten, Mäusen, Kaninchen und Ziegen haben eine starke Bindung von Protein L an IgG ebenfalls bei diesen Arten gezeigt (die Daten sind nicht dargestellt).
Die Resultate der hier beschriebenen Experimente demonstrieren dass Protein L an die leichten Ketten von IgG gebunden wird. Da die leichten Ketten bei verschiedenen Ig, welche zu verschiedenen Klassen gehören, vorhanden sind, bedeutet dies, dass Protein L höchstwahrscheinlich an alle Ig Klassen gebunden wird.

Claims

1. Protein, das ein zelloberflächen-mutanolysin-lösliches Protein ist und ein scheinbares Molekulargewicht von 95.000 (auf SDS-PAGE) und eine Fähigkeit hat, die leichten Ketten der Immunoglobuline IgG, IgM, IgA, IgD und IgE zu binden und seine Untereinheiten mit der gleichen Bindefähigkeit.

2. Verfahren zur Herstellung des Proteins gemäß Anspruch 1 und seiner Untereinheiten, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamme der das Protein exprimiert, wie z.B. Peptococus magnus Stamm 312, ATCC No. 53516, durch Mutanolysin löslich ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das lösliche Protein durch Affinitätschromatographie mit einem Liganden, der eine Affinität zu dem Protein hat, gereinigt wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand IgG, IgM, IgA, IgD oder IgE ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein durch Chromatographie auf IgG-Sepharose 4B gereinigt wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Mutanolysin in einer Menge von höchstens 100 mg Enzym pro ml 10 %iger (vol/vol) Zellsuspension zugefügt wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß nicht weniger als 0,1 U Mutanolysin pro ml 10 %iger (vol/vol) Zellsuspension zugefügt wird.

8. Reagenziensatz zur Bindung, Trennung und Identifikation der Immunoglobuline, dadurch gekennzeichnet, daß es ein zelloberflächen-mutanolysin-lösliches Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 95.000 und/oder seine Fragmente enthält, die die leichten Ketten der Immunoglobuline IgG, IgM, IgA, IgD und IgE binden.

9. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß es ein zelloberflächen-mutanolysin-lösliches Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 95.000 und/oder seine Fragmente enthält, die die leichten Ketten der Immunoglobuline IgG, IgM, IgA, IgD und IgE binden.