DE3533671A1

DE3533671A1 - Verfahren zur beschleunigung einer antigen-antikoerper-reaktion

Info

Publication number: DE3533671A1
Application number: DE19853533671
Authority: DE
Inventors: Matsuura Kasugai Aichi Akira; Yamamoto Oaza-Okimura Aichi Ryohei; Kimura Aichi Shigeki
Original assignee: Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1984-09-26
Filing date: 1985-09-19
Publication date: 1986-03-27
Also published as: US4692330A; JPS6179164A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beschleunigung einer Antigen-Antikörper-Reaktion, insbesondere unter Zugabe eines Beschleunigers oder von Beschleunigern wie Dextran oder Alkylenglykol(en) und/oder Polyalkylenglykol(en zur Reaktionsmischung der Antigen-Antikörper-Reaktion,

Das Verfahren kann sowohl zum Nachweis von Substanzen in biologischen Flüssigkeiten, als auch zum Isolieren und Reinigen von Substanzen dienen, beides jeweils im Rahmen einer Antigen-Antikörper-Reaktion.

Antigen-Antikörper-Reaktionen sind bislang allgemein bei dem spezifischen Nachweis von Spurensubstanzen in biologischen Flüssigkeiten mittels Immunoassay-Verfahren eingesetzt worden. Desweiteren sind sie anwendbar bei der Isolierung und/oder der Reinigung von Spurenkomponenten in biologischen Flüssigkeiten durch verschiedene Techniken, etwa der Affinitätschromatographie. Beispielsweise wurde die Reinigung eines Antikörpers zu Thyrotropin mittels Affinitätschromatographie bekannt,und zwar durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion und ein Immunoassay für Thyrotropin unter Verwendung des gereinigten Antikörpers (vgl. Clinical Chemistry, Vol.27(8), 1981). Es wurde weiterhin von einer Reinigung eines carzinoembryonalen, (CEA)-verwandten Antigens mittels Affinitätschromatographie und einer Antigen-Antikörper-Reaktion berichtet (vgl. Cancer Research, VoI 41, 713-720, 1981).

-Z-

3533S?-¹ ίο

Antigen-Antikörper-Reaktionen haben Jedoch den Nachteil, daß sie bis zu ihrer Vollendung mehrere Stunden benötigen (vgl. EP-PS 0051183, S.2, Zeilen 6 bis 9). Um diesen Nachteil genauer darzulegen, mögen die folgenden Beispiele von Immunoassayprozessen dienen:

1) Die Bestimmung von Insulin durch ein Enzym-Immunoassay brauchte zwei Stunden für die Primärreaktion bei 30⁰C und eine Nacht für die Sekundärreaktion bei 4° C (vgl. Clinica Chimica Acta, Vol. 120, 261-265

(1980) und FEBS LETTERS, Vol. 99 (l), 172-174 (1979).

2) Die Bestimmung von cC-Fötoprotein durch ein Radioimmunoassay erforderte drei Stunden (vgl. Journal of Immunological Methods, Vol. 39, 363-368, (1980), " und

3) Die Bestimmung von Trijodthyronin und Thyrotropin dauert bei Raumtemperatur oder bei 37⁰C zwei Stunden (vgl. Clinical Chemistry, Vol. 31 (3), 415-419,1985).

Jüngste Erfolge in der Immunologie haben es möglich gemacht, einige Substanzen in relativ kurzen Zeiträumen zu bestimmen. So sind beispielsweise Immunoassayprozesse

'"' 25 in 45 oder 60 Minuten möglich (vgl. Blood, Vol. 6l(2), ·' 311-317, 1983). Dennoch benötigen Antigen-Antikörper-

!, Reaktionen immer noch einen längeren Zeitraum als andere

biochemische oder chemische Analysen.

ORIGINAL

353367 '

Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Antigen-Antikörper-Reaktion zur Bestimmung einer Substanz in einem Organismus oder zur Isolierung und Reinigung einer Substanz mittels verschiedener Techniken wie etwa der Affinitätsehromatographie zu beschleunigen oder zu fördern.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die Zugabe von die Reaktion beschleunigenden Substanzen gelöst. Unerwarteterweise wurde festgestellt, daß Dextran oder Alkylenglykol(e) und/oder Polyalkylenglykol(e) in diesem Sinne wirken.

Jedes im Handel erhältliche Dextran kann als Beschleuniger im Sinne der Erfindung verwendet werden. Das Dextran hat vorzugsweise ein Molekulargewicht von 100 bis 1.000.000, wobei seine Viskosität in Lösung der Reaktionsmischung berücksichtigt ist. Ein Bruchteil eines speziellen Molekulargewichtes oder eine Mischung von Bruchteilen verschiedener Molekulargewichte zeigen ähnliche Effekte.

Eine wirksame Konzentration des Dextrans in der Reaktionsmischung liegt 0.1% oder höher. Die obere Grenze der Dextrankonzentration ist nicht speziell bestimmt worden, obwohl sie aus Gründen der Viskosität des Dextrans unterhalb in 10% liegen sollte. Alkylenglyko.1 oder Polyalkylenglykol als andere Beschleuniger im Sinne der Erfindung sind durch die folgende allgemeine Formel darstellbar:

XX

R-4-0 — CH — CH-^- 0— R ¹

3533S⁷¹ g

AT-

wobei η eine ganzzahlige Zahl größer als 1 ist und R,, R_?, X und Y jeweils für ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe stehen.

Im einzelnen sind hier Äthylenglykol, Polyäthylenglykol, Propylenglykol, Polypropylenglykol und ähnliche Verbindungen von Interesse. Diese Alkylenglykole und/oder Polyalkylenglykole können entweder für sich oder in einer Mischung verwendet werden. Die wirksame Konzentration des/der Alkylenglykols bzw. -glykole und/oder Polyalkylenglykols bzw. - glykole in der Reaktionsmischung liegt 0.5% oder höher. Die obere Grenze liegt vorzugsweise unterhalb von 10%, wobei die Effekte der Viskositätserhöhung der Reaktionsmischung und damit die abnehmende Löslichkeit des Antigens, des Antikörpers und anderer enthaltener Bestandteile berücksichtigt sind.

Die Antigene, modifizierten Antigene, Antikörper und modifizierten Antikörper, die die Reagenzmittel in der

durch Zugabe von Dextran oder Alkylenglykol(en) und/oder Polyalkylenglykol(en) beschleunigten Antigen-Antikörper-Reaktion darstellen, schließen beispielsweise die folgenden Stoffe ein:

25

Antigene: unmodifizierte Antigene, natürliche Antigene ,. oder Fraktionen einer Verbindung zu einem

entsprechenden Antikörper,

ORtGINAL

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Modifizierte Antigene:

Antikörper:

mit einer nachweisbaren Gruppe wie einem Radioisotop, einem fluoreszierenden Stoff, einem Pigment, einem Enzym oder einem Metall markierte Antigene oder auf verschiedenen unlöslichen Trägern immobilisierte Antigene,

Antikörper zu verschiedenen Antigenen, zu Antikörpern (d.h, sog. sekundäre oder tertiäre Antikörper) oder Fraktfonen einer Verbindung zu einem Antigen dagegen, wie etwa F(ab')₂, Pab' und Fab,

modifizierte Antikörper:

mit einer nachweisbaren Gruppe wie oben beschrieben markierte Antikörper oder auf verschiedenen unlöslichen Trägern immobilisiert-Antikörper.

Die immunochemischen Reaktionen, auf welche die Erfindung angewandt werden kann, umfassen die Bestimmung von Spurensubstanzen, Pharmazeutika und Antikörpern durch ver-25 schiedene Methoden, wobei der Vorteil einer Antigen-Antikörper-Reaktion sowie deren Reinigungseffekte auf Substanzen ausgenutzt wird.

ORIGINAL

353367

Die Beschleunigung einer Antigen-Antikörper-Reaktion nach dem Verfahren verkürzt die Bestimmungszeiten, wodurch schnelle klinische Diagnosen möglich werden. Zudem erweist sich die wirksame Isolierung und Reinigung von Substanzen 5 aus Organismen wie etwa Spurenhormone durch ein immunologisches Verfahren im medizinischen und biochemischen Bereich als sehr hilfreich.

Die Erfindung wird anhand der Zeichnungen näher erläutert. IO Hierbei zeigen:

Fig. 1 Eichkurven für die Insulinbestimmung in Bei- I ' spiel 3, wobei A. für den Fall ohne Zugabe

von Dextran, ο für die Zugabe von 1% Dextran ■· * 15 T-500 und · von 3%^extran T-500 gilt,

$ ' Fig. 2 Eichkurven für ^e Insulinbestimmung in Bei- I spiel 4, wobei Δ für den Fall ohne Zugabe von

I Alkylenglykolen oder Polyalkylenglykolen, ο für

I 20 ' die Zugabe von 2% Äthylenglykols und · von 2%

% Polyäthylenglykols gilt.

\ Das Verfahren zur Beschleunigung einer Antigen-Antikörper-

Γ Reaktion kann folgendermaßen durchgeführt werden:

fc l) Als ein Verfahren, in dem während einer Antigen-Anti-

i' körper-Reaktion zwischen einem auf einem Träger

immobilisierten Antigen (Antikörper) und einem

ft·:

OFÜGJNAL

5 336 7"

Antikörper (Antigen) Beschleuniger zugeführt wird/v/erden, um diese Reaktion zu beschleunigen. Diese Durchführungsart des Verfahrens ist wirksam bei der Isolierung und

Reinigung einer Substanz.
5

il) Als ein Verfahren, in dem während der Bestimmung eines Antikörpers oder Antigens durch eine Reaktion zwischen einem auf einem Träger immobilisierten Antigen (Antikörper) und einem markierten Antikörper oder markierten Antigen und einem Antigen oder Antikörper Beschleuniger zur Beschleunigung der Reaktion der Reaktionsmischung beigegeben wird/werden.

Diese Durchführungsart ist wirksam bei dem Nachweis einer Spurensubstanz in einer biologischen Flüssigkeit durch ein sog. Immunoassay.

iii) Als ein Verfahren, in dem während einer Reaktion zwischen einem zu analysierenden Antigen, einem Antikörper (I) zu diesem Antigen und einem markierten Antikörper (II) zu einem"Antikörper (I)-Antigen-markierter Antikörper (II)-komplex" der Reaktionsmischung Beschleuniger beigefügt wird/werden,um diese Reaktion und eine weitere Reaktion zwischen dem gebildeten Komplex und dem unlöslich gemachten zweiten Antikörper zu dem Antikörper (I) zu beschleunigen.

- 8 ■ -

353367' /IZ

V^er-

Diese Durchführungsart ist wirksam bei der immunologischen Analyse eine Substanz in einer biologischen Flüssigkeit.

Es werden die folgenden beiden Methoden zur Bestimmung des Beschleunigungsprozesses des erfindungsgemäßen Verfahrens auf eine Antigen-Antikörper-Reaktion vorgeschlagen:

l) Eine Methode, bei der die Mengen von Immunoprodukten verglichen werden, die innerhalb eines bestimmten Zeitraumes in Beisein und in Abwesenheit des/der Beschleuniger (s) gebildet werden, wodurch der Beschleunigungseffekt im erstören Fäll bestimmbar ist.

2) Eine Methode, bei der Eichkurven für Immunoprodukte erstellt werden, die in Beisein und in Abwesenheit des/der Beschleuniger(s) gebildet werden, und der Beschleunigungseffekt itn ersteren Fall durch Vergleich von Adsorp- tionsänderungen in beiden Fällen bestimmt wird.

Diese beiden Methoden zur Bestimmung des Beschleunigungsprozesses von Antigen-AntikÖrper-Reaktionen dienten auch für die Abschätzung dieser Wirkung in den nachfolgenden Beispielen, anhand derer das erfindungsgemäße Verfahren eingehender erklärt wird, allerdings nicht in einschränkendem Sinne.

ORiGiNAL

Beispiel 1: Beschleunigungseffekt einer Zugabe von Dextran auf eine immunologische Reaktion, bestimmt durch Bestimmungsmethode (l).

(l) Darstellung von auf Sepharose immobilisiertem

Insulin

1 mg von kommerziell erhältlichem, kristallinem Insulin, das aus der Pankreas von Schweinen stammt, wurde auf 20 ml CNBr-akti-

vierter Sepharose (hergst. v.d.Fa. Pharmacia AB) in herkömmlicher Weise immobilisiert. Daraufhin wurde es in eine Säule (0.1 ml) gefüllt und der dann folgenden Prozedur ausgesetzt

(2) Darstellung eines enzymmarkierten Anti-Insulinantikörpers

kommerziell erhältlicher Antikörper gegen

Insulin von Meerschweinchen wurde mit Pepsin versetzt und mit Mercaptoäthylamin reduziert, um ein Fab'-Fragment zu erhalten. Der SH-Rückstand des Fab'-Fragmentes wurde an den SH-Rückstand von ß-D-Galaktosidase, erhalten

aus Escherichiakoli unter Anwendung von Ν,Ν'-o-Phenylenedimaleimid, gebunden.

- 10 -

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(3) Bindung des enzymmärkierteh Anti-Insulinantikörpers an die Säule.

Der enzymmarkierte Anti-Insulinantikörper wurde mit einer Phosphatpufferlösung mit 0.15a Rinderserumalbumin "versetzt. 0.5 ml dieser Verdünnung wurde

durch die mit dem auf der Sepharose immobilisierten Insulin (vgl. Pkt. (I)) gefüllten Säule geleitet. Der enzymmarkierte Anti-Insulinantikörper wurde gleichzeitig mit derselben Phosphatpufferlösung mit 3% Glukose, Dextran T-500 (hergest. von d.Fa. Pharmacia AB) bzw. Dextran T-70 (hergest. v.d.Fa. Pharmacia Aß) versetzt. Jede dieser Lösung wurde dann wie oben beschrieben weiterbehandelt. Nach dem Waschen der Säule wurde eine wäßrige Lösung von O-Nitrophenyl-ß-D-Galäktosid (O-NPG), das ein Substrat für das Enzym darstellt, durch sie hindurchgeleitet, um eine enzymatisch« Reaktion auszulösen. Danach wurde" die Säule erneut gewaschen und die Menge von O-Nitrophenol im Säuleneluat, welches

2q das Produkt der enzymatischen Reaktion darstellt, durch Messung des Adsorptionsvermögen bei 420 nm bestimmt. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 aufgeführt. Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, ist das Adsorptionsvermögen direkt proportional zu der Menge von enzym- markiertem Anti-Insulinantikörper, die an die

Säule gebunden ist* Da de Fließrate konstant war, erhöhte offensichtlich die Zugabe von 3/ό Dextran die Menge des enzymmarkiertert Anti-Insulinantikörpers, die an die Säule gebunden war,

- 11 QRKMNAL" INSPECTED . ,

353367" (S

um etwa das 1,6 fache gegenüber der Kontrollmessung, worin sich ein signifikanter Beschleunigungseffekt auf die Antigen-Antikörper-Reaktion widerspiegelt.

Tabelle 1

Zusatz Adsorptionsvermögen bei 420 nm (Menge des enzymmarkierten Anti-Insulinantikörpers, an die Säule gebunden)

Keiner 0.433

Glukose 0.460

Dextran T-70 0.637

Dextran T-500 0.701

Beispiel 2;

' Beschleunigungseffekt einer Zugabe von Alkylen-

glykol oder Polyalkylenglykol auf eine immunologisehe Reaktion, bestimmt durch Bestimmungsmethode

(D.

Die Prozedur aus Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß das Dextran durch 1.5% Äthylenglykol, Propylenglykol bzw. Polyäthylenglykol mit

einem Molekulargewicht von etwa 6000 ersetzt wurde. Das Ergebnis ist in Tab. 2 aufgeführt. Ihr ist z'u entnehmen, daß die Zugabe von Polyalky lenglyk öler die Bindung des enzymmarkierten Anti-Insulinantikörpers an die Säule deutlich beschleunigte.

■:.;'■. - 12 -

Beispielsweise vergrößerte Polyäthylenglykol die Menge von enzymmarkierten Anti-Insulinantikörpern, die an die Säule gebunden war, um etwa das 1.34 -fache gegenüber der Kontrollmessung, worin sich auch hier ein signifikanter Bqschleunigungseffekt auf die Antigen-Antikörper-Reaktion zeigt.

Tabelle 2

Zusatz ' Adsorptionsvermögen bei 420 nm

(Menge des enzymmarkierten Anti-Insulinantikörpers, an die Säule gebunden)

Keiner 0.521

Propylenglykol 0.625

Äthylenglykol 0.640

Polyäthylenglykol 0.700

Beispiel 3: Beschleunigungseffekt einer Zugabe von Dextran

auf eine immunologische Reaktion, bestimmt durch Bestinimungsmethode (2) anhand einer Eichkurve für Insulin. 25

Es wurden derselben enzymmarkierte Anti-Insulinantikörper und dasselbe auf Sepharose immobilisierte Insulin wie in Beispiel 1 verwendet. Jeweils 100 μΐ von verschiedenen

- 13 ORfGWAL

Insulinlösungen (θ, 10, 30, 100 und 300 jiU/ml) konnten mit 0.5 ml der Lösung des enzyiunarkierten Anti-Insulinantikörpers bei 30⁰C für eine Stunde reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde einer Säule von auf Sepharose immobilisierten Insulin zugeführt. Dann wurde die Säule gewaschen und mit einer O-NPG Lösung gefüllt, um dadurch eine enzymatische Reaktion bei 30⁰C für eine Stunde ablaufen zu lassen. Gleichzeitig wurden Lösungen des enzymmarkierten Anti-Insulinantikörpers mit 1 bzw. 3% Dextran T-500 derselben Behandlung unterworfen. Nach Beendigung der enzymatischen Reaktion wurde die Säule mit einer Natriumkarbonatlösung gespült und das Adsorptionsvermögen dieser Spülflüssigkeit wurde bei 420 nm gemessen, um die Eichkurven nach Fig. 1 zu erhalten. Diese Eichkurven zeigen deutlich, daß die Probe ohne Dextran eine kleinere Änderung des Adsorptionsvermögen bei 420 nm gegenüber den Proben mit Dextran, für die dieselbe Prozedur wiederholt wurde, aufweist. Es ist daher offensichtlich, daß die Berechnung der Insulinkonzentration anhand der Eichkurve

für die erstere Probe einige Streuungsfehler enthalten dürfte. Wenn zum Beispiel ein Serum mit etwa 30 Insulin einmal ohne und einmal mit 3% Dextran der Analyse unterzogen wurde, betrug die Kovarianz (in ⁰A) im ersteren Fall 34%, in letzteren hingegen 95%. Dies bedeutet, daß die Zugabe von Dextran die Zeitdauer der Antigen-Antikörper-Reaktion auf die Hälfte derer von konventionellen Verfahren reduzierte.

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Beispiel 4; Beschleunigungseffekt einer Zugabe von Äthylenglykol oder Polyäthylenglykol auf eine immunologische Reaktion, bestimmt durch Bestimmungsmethode (2), anhand einer Eichkurve für Insulin.

Die Prozedur aus Beispiel 3 wurde wiederholt,

mit der Ausnahme, daß das Dextran T-500 durch 2% Äthylenglykol oder 2% Polyäthylenglykol ersetzt wurde. Das Ergebnis zeigt Fig. 2. Die Eichkurven in Fig. 2 zeigen deutlich, daß

die Probe ohne Äthylenglykol oder Polyäthylenglykol eine kleinere Änderung des Adsorptionsvermögen bei 420 nm gegenüber den Proben mit Äthylenglykol bzw. Polyäthylenglykol, für die dieselbe Prozedur durchgeführt wurde, aufweist.

Es ist daher offensichtlich, daß die Berechnung der Insulinkonzentration anhand der Eichkurve für die erstere Probe einige Streuungsfehler enthalten dürfte. Wenn zum Beispiel ein Serum mit etwa 30 jiU/ml Insulin einmal

ohne und einmal mit 2% Polyäthylenglykol der Analyse unterzogen wurde, betrug die Kovarianz (in %)■ im ersteren Fall 30%, im letzteren 11%. Im Falle keiner Zugabe von Polyäthylenglykol dauerte es wenigstens doppelt solange, um ähn

liche Werte für das Adsorptionsvermögen zu erhalten wie im Falle der 2%igen Zugabe des Stoffes. Dies bedeutet, daß die Zugabe des

- 15 -

Äthylenglykols oder Pölyäthylenglykols die Zeitdauer* für die Antigen-Antikörper-Reaktion auf die Hälfte derer konventioneller Verfahren reduzierte.

-

Beispiel 5t Beschleunigungseffekt einer Zugabe von Dextran

auf eine immunologische Reaktion, bestimmt durch die Bestimmungsmethode (1)

(1) Darstellung eines enzymmarkierten Anti-Enolase-

antikörpers.

Die Prozedur aus Beispiel l-(2) wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß ein Anti-Enolaseantikörper von Kaninchen verwendet wurde. (2) Darstellung eines «onoklönalen Anti-Enolaseanti-

körpers.

Enolasewurde Mäusen injiziert. Diejenigen, die den Antikörper produzierten, wurden für den Versuch ausgewählt. Antikörper produzierende Hybridomas wurden aus der Milz dieser Mäuse und den

. Myelomazellen präpariert. Von den so erhaltenen Hybridomas wurden Kulturen angelegt und monoklonaler Anti-Enolaseantikörper (nachfolgend MCAb genannt) wurde aus dem Medium in herkömmlicher Weise isoliert.

(3) Darstellung eines Anti-Maus Ig^G-Antikörpers

(zweiter Antikörper), immobilisiert auf Sepharose.

Die Prozedur aus Beispiel l-(l) wurde wiederholt.

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(4) Bildung eines Enolase/Antikörper-Komplexes.

Eine Enolaselösung und eine MCAb-Lösung wurden vermischt. Die Mischung konnte 30 Minuten lang reagieren. Zur selben Zeit wurde dieselbe Mischung mit einem Zusatz von 1% Dextran T-500 derselben

Reaktion unterworfen. Um den MCAb/Enolase-Komplex der während der Reaktion gebildet wurde, zu bestimmen, wurde der Reaktionsmischung der enzymmarkierte Anti-Enolaseantikörper beigegeben, so daß sich ein MCAb/Enolase/enzymmarkierter Anti-

Enolaseantikörper bildete, der anschließend in eine Säule des zweiten Antikörpers, der auf Sepharose immobolisiert worden war, eingebracht wurde, so daß die Enzymreaktion wie in Beispiel 1 beschrieben ablaufen konnte.

Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse für verschiedene Mengen Enolase. Wie daraus ersichtlich, ist die in Anwesenheit von Dextran innerhalb einer bestimmten Zeit (d.h. 30 min) gebildete Menge des MCAb/Enolase-Komplexes 1.49 bis 1.6 mal so groß wie die ohne Dextran gebildete Menge, worin ein signifikanter Beschleunigungseffekt auf die Antigen-Antikörper-Reaktion zu sehen ist.

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	Tabelle 3
	Enolase Ad
Menge von
(ng/Röhre)
0.
2.
6.
.75
.25
.75

Adsorptionsfähigkeit bei 420 nm ohne Dextran mit Dextran

0.210 0.450 1.08

0.320 0.720 1.61

Beispiel 6t

Beschleunigungseffekt einer Zugabe von Polyäthylenglykol auf eine immunologische Reaktion, bestimmt durch Bestimmungsmethode (D.

Die Prozedur aus Beispiel 6 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß 1% Dextran T-500 durch 1.5% Polyäthylenglykol ersetzt wurde. Tabelle 4 zeigt das Ergebnis. Demnach war die im Beisein von 1.5% Polyäthylenglykol innerhalb einer bestimmten Zeit (d.h. 30 min) gebildete Menge des MCAb/Enolase-Komplexes 1.39 bis 1.45 mal größer als diejenige, die ohne Polyäthylenglykol gebildet wurde, wodurch der Beschleunigungseffekt auf eine Antigen-Antikörperreaktion deutlich wird.

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Zl

Tabelle 4

Menge von Enolase Adsorptionsvermögen bei 420 nm / /D-i, ¹I ohne mit

^ng/Konre; polyäthylenglykol Polyäthylenglykol

0.75 0.280 0.390

2.25 0,570 0.800

6.75 1.10 1.60

- 19 Zu s ammenfa s sung

-Zi-

Leerseite -

Claims

PATENTANWALTS BÜ RO PATENTANWÄLTE DIPL-ING. W. MEISSNER (1980) DIPL-ING. P. E. MEISSNER DIPL-ING. H.-J. PRESTING Zugelassene Vertreter vor dem Europaischen Palentarnt Professional Representatives befor« the European Patent Office Ihr Zeichen Ihr Schreiben vom Unsere Zeichen HERBERTSTR. 22, 1000 BERLIN 33 M/W/Go. Ama 3/01 AMANO PHARMACEUTICAL COMPANY, LIMITED 2-7, Nishiki 1-chome, Naka-ku, Nagoya-shi, Aichi, 460 Japan Verfahren zur Beschleunigung einer Antigen-Antikörper-Reaktioi 4 Patentansprüche:

1. Verfahren zur Beschleunigung einer Antigen-Antikörper-Reaktion, gekennzeichnet durch eine Zugabe von Beschleuniger (n) zu der Reaktionsmischung einer immunologischen Reaktion zwischen einem Antigen und/oder einem modifizierten Antigen und einem Antikörper und/ oder einem modifizierten Antikörper dagegen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Zugabe von Beschleuniger(n) zu der Reaktionsmischung einer immunologischen Reaktion zwischen einem Antigen und einem auf einem unlöslichen Träger immobilisierten Antikörper gegen genanntes Antigen.

-2-

TELETEX: TELEGRAMM TELEFOrJ- BANKKONTO: POSTSCHECKKONTO i TELEFAX. TELEX: INVENTION 030/891 CO J7 BERLINERBANKAG P MbISSNfR HLN-W 030/891 78 50

3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Zugabe von Beschleuniger(n) zu der Reaktionsmischung einer immunologischen Reaktion zwischen einem Antikörper und einem auf einem unlöslichen Träger immobilisierten Antigen gegen genannten Antikörper.

4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Zugabe von Beschleuniger(n) zu der Reaktionsmischung einer immunologischen REaktion zwischen einem Antigen,

,_Q einem anderen, mit einer nachweisbaren Substanz markierten Antigen und Antikörper dagegen.

5. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Zugabe von Beschleuniger(n) zu der Reaktionsmischung einer immunologischen Reaktion zwischen einem Antigen, einem anderen, mit einer nachweisbaren Substanz markierten Antigen und einem auf einem unlöslichen Träger immobilisierten Antikörper dagegen.

6. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Zugabe von Beschleuniger(n) zu der Reaktionsmischung einer immunologischen Reaktion zwischen einem Antigen und einem mit einer nachweisbaren Substanz markierten Antikörper dagegen.

7. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Zugabe von Beschleuniger(n) zu der Reaktionsmischung einer immunologischen Reaktion zwischen einem Antikörper und einem mit einer nachweisbaren Substanz

.J₅₀ markierten Antigen dagegen.

8. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Zugabe von Beschleuniger(n) zu der Reaktionsmischung einer immunologischen Reaktion zwischen einem Komplex, bestehend aus einem mit einer nachweisbaren Substanz

c markierten Antigen und einem Antikörper, und einem auf einem unlöslichen Träger immobilisierten Antigen gegen genannten Antikörper.

9. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Zugabe von Beschleuniger(n) zu der Reaktionsmischung einer immunologischen Reaktion zwischen einem Komplex, bestehend aus einem mit einer nachweisbaren Substanz markierten Antikörper und einem Antigen, und einem auf einem unlöslichen Träger immobilisierten Antikörper gegen genanntes Antigen.

10. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Zugabe von Beschleuniger(n) zu der Reaktionsmischung einer immunologischen Reaktion zwischen einem Komplex, bestehend aus einem Antikörper (I), einem Antigen und einem anderen , mit einer nachweisbaren Substanz markierten Antikörper (II), und einem auf einem unlöslichen Träger immobilisierten Antikörper (III) gegen genannten Antikörper (I).

11. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Zugabe von Beschleuniger(n) zu der Reaktionsmischung einer immunologischen Reaktion zwischen einem Komplex, bestehend aus einem Antikörper (I) und einem mit einer

nachweisbaren Substanz markierten Antigen, und einem auf einem unlöslichen Träger immobilisierten Antikörper (II) gegen genannten Antikörper (I).

12. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die nachweisbare Substanz ein Enzym ist.

13. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Beschleuniger Dextran ist.

14. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Beschleuniger ein Alkylenglykol und/oder ein Polyalkylenglykol ist.

ORIGINAL