DE3138489A1

DE3138489A1 - Verfahren zur durchfuehrung einer immunologischen bestimmung

Info

Publication number: DE3138489A1
Application number: DE19813138489
Authority: DE
Inventors: Giorgio Milano Chieregatti; Ernesto Torino Gnemmi; Enzo Melzo Milano Murador
Original assignee: Farmitalia Carlo Erba SRL
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1980-09-30
Filing date: 1981-09-28
Publication date: 1982-05-19
Also published as: GB2084317B; GB2084317A; IT1139491B; IT8124162A0

Description

1A-55 195 -O

Be Schreibung Verfahren zur Durchführung einer immunologischen

Bestimmung

Die Erfindung betrifft ein Antigen-gebundenes Konkurrenz-Enzyinimmunoassay und stellt ein neues Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Antigenen, einschließlich Haptenen dar. Sie bezieht sich auch auf ein Test-Kit, das bei diesem Verfahren angewandt werden kann. In diesem Zusammenhang wird auf das unter dem Handelsnamen "Alice" bekannte Verfahren und Test-Kit verwiesen.

Der Ausdruck "Antigen" wie er hier verwendet wird, bedeutet nicht nur Substanzen, die selbst im Stande sind, in Tieren die Bildung von Antikörpern hervorzurufen, d. h. Immunogene, sondern auch auf Substanzen, die als Haptene bezeichnet werden, die nach Konjugation mit einem Trägermolekül im Stande sind,die Bildung von spezifischen Antikörpern hervorzurufen.

In der GB-PS 1 549 069 ist ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung ναι Antigenen unter Anwendung einer Enzym-Markierung beschrieben. Dieses Bestimmung:: verfahren bzw. Assay umfaßt grundsätzlich einen Vergleich der Reaktion zwischen einem bekannten Antigen (Ag ), das unlöslich gemacht worden ist, z. B. durch

/2

1A-55 195 -Z-

Bindung an ein Trägermaterial mit derjenigen des zubestimmenden bzw. nachzuweisenden Antigens (Ag ) bei dem gleichen Markierungssystem. Das Markierungssystem besteht aus einem ersten Antikörper (Ab ), der mit dem unlöslich gemachten bekannten sowie mit dem in der flüssigen Phase enthaltenen (unbekannten) Antigen reagiert, einem zweiten Antikörper (Ab ), der einen Antikörper zu dem ersten Antikörper darstellt und an den ein markierendes Enzym gebunden ist, vorzugsweise durch kovalente Bindung. Nach Trennung der festen von der flüssigen Phase wird die Enzym-Aktivität in einer der Phasen bestimmt.

1 2*

Das gesamte Markierungssystem Ab -Ab wird üblicherweise als Enzymimmun-Komplex oder "EIC" bezeichnet.

Das EIC stellt eine "Universal-Markierung"ä3% Dar erste Antikörper (Ab ) des EIC muß zu den Antigenen (Ag und Ag ) spezifisch sein. Er kann gebildet worden sein durch Injizieren des bekannten Antigens Ag in ein Tier z. B. ein Schaf, und Blutentnahme nach

2 einer geeigneten Zeit. Der zweite Antikörper Ab wird gebildet durch Injizieren des Immunoglobulins oder der Fc-Fraktion des Immunoglobulins des ersten Tieres in eine zweite Tierart, z. B. einen Esel, und Blutentnahme nach einer geeigneten Zeit. Der angegebene zweite Antikörper wird kurz als "Esel-Anti-Schaf-IgG" bezeichnet. Es wird dann mit dem Enzym umgesetzt, um ihn zu markieren. Der markierte zweite Antikörper Ab , der als " Es el-AnU-Schaf IgG*" bezeichnet wird, kann allgemein angewandt werden, ohne Rücksicht auf die Art des Antigens. Es ist lediglich notwendig eiran Schaf das Antigen zu injizieren, um den ersten Antikörper zu bilden,

2* da diese "Universalmarkierung¹¹ Ab mit jedem

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1A-55 195

1
beliebigen Antikörper Ab reagiert, der im Schaf gebildet worden ist. Es ist daher nicht erforderlich, eine große Vielzahl von Enzym-markierten Antikörpern herzustellen, wie es bei den meisten bekannten Assays der Fall war, und die durch die Bindung eines speziellen Enzyms an einen Antikörper auftretenden Probleme brauchen nur einmal gelöst zu werden.

Dieses bekannte Verfahren kann sehematisch folgen-

1) 1 2* dermaßen zusammengefaßt werden; Träger - Ag~<-Ab -Ab

Agf^}

wobei die Klammern ein Vergleichsverfahren (manchmal als "Konkurrenzverfahren" bezeichnet) angeben und das * ein?Enzym-Markierung bedeutet.

Bei einer bevorzugten Durchführungsform des erwähnten Verfahrens wird das EIC vorher gebildet. (Es kann häufig in einer Form hergestellt v/erden, die mehrere Monate stabil ist). Das Assay kann dann durchgeführt werden, indem man lediglich überschüssiges EIC mit der Probe des zu bestimmenden

ρ
Antigens Ag zusammenbringt, dann das unlöslich gemachte bekannte Antigen (als "Immunadsorbens" bezeichnet) mit dem das nicht umgesetzte EIC enthaltenen Reaktionsprodukt zusammenbringt, die feste von der flüssigen Phase trennt, die feste Phase wäscht und die Enzym-Konzentration in der festen Phase mißt, die der Menge an zu bestimmendem Anti-

gen Ag umgekehrt proportional ist. Dieses Verfahren besitzt den großen Vorteil gegenüber bis dahin bekannten Verfahren, daß nur eine Stufe "an Ort und Stelle" durchgeführt werden muß, d* h„ im klinischen Labor. Der größte Teil des "know-how", einschließlich

1A-55 195 - if -

der Reinigung der Reagenzien ist "bereits vom Hersteller durchgeführt worden, der das Immunadsorbens und das EIC als "Test-Kit" auf den Markt bringt.

Mit Hilfe des oben erwähnten bekannten Verfahrens konnten verschiedene Vorteile erreicht werden neben der Anwendung einer Universalmarkierung und der einzigen Trennungsstufe, nämlich die Möglichkeit ein Signal zu vervielfachen, der Tatsache, daß es nicht erforderlich ist, chemische Modifikationen an dem Antigen und Antikörper vorzunehmen, die bei der ersten Reaktion beteiligt sind>sowie weitere Vorteile aufgrund der Anwendung eines Enzyms anstatt einer radioaktiven Markierung.

Es hat sich nun gezeigt, daß bei diesem Assay der Trennungsschritt kritisch sein kann. Die Zugabe einer

-1

festen Phase, an der große Mengen Antigen Ag immobilisiert sind, kann das Reaktionsgleichgewicht zwischen dem Ab aus nicht umgesetztem EIC und dem Antigen Ag erheblich stören. Das trifft besonders zu auf Haptene, bei denen die Dissoziationskonstante der Ag-Ab -Reaktion verhältnismäßig hoch ist. Wenn andererseits, die Menge an auf der festen Phase immobilisiertem Antigen verringert wird, wird anderer-. seits die erforderliche Inkubationszeit zunehmend langer und die (Null-)Bindungsaktivität* ist beträchtlich niedriger und daher schwerer zu messen. *(zero-binding activity) Ein weiteres Problem tritt auf beim Nachweis und der Bestimmung von teuren bzw. nur in geringen Mengen vorhandenen Substanzen, z. B. LH (lutenisierendem Hormon), FSH (Follikel-stimulierendem Hormon), TSH (Schilddrüsen-stimulierendem Hormon) oder HGH (menschlichem

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1A-55 195 - y - S

Wachstumshormon). Die Herstellung von Immunadsorbentien, die derartige Substanzen enthalten, wäre außerordentlich teuer, aufgrund der Menge an Antigen, die auf der festen Phase benötigt wird. 5

Für jedes nach dem bekannten Verfahren nachzuweisende bzw. zu bestimmende Antigen mußte ein spezifisches Immunadsorbens hergestellt werden und um die oben erwähnten Probleme jeweils zu lösen, war es wieder und wieder notwendig, die Bedingungen zu optimieren und zu versuchen, die Menge an Antigen, die erforderlich ist, zu verringern ohne dadurch die zu messende Enzym-Aktivität zu stark zu verringern«

Ein Verfahren zur Bestimmung von Haptenen ist beschrieben worden von Sadeh et al„ in Journal of Immunological Methods 28, 125 (1979) und in der DE-OS 2 811 537. Bei diesem Verfahren wird ein bekanntes Hapten H mit einer Substanz X konjugiert

1 unter Bildung eines Konjugats H -X. Das Hapten-

1 2

Konjugat H-X und das zu bestimmende Hapten H werden dann mit Anti-Hapten Ab auf einem festen Träger in der Art eines heterogenen Assays umgesetzte Die feste Phase wird dann abgetrennt und markiert. Die Markierung ist ein Antikörper Ab zu der Substanz X, der Enzym-markiert ist. Die Enzym-Aktivität der festen Phase ist umgekehrt

proportional zu der Menge an Hapten H „ das bestimmt werden soll wie bei dem erwähnten Verfahren. Diese Modifikation löst die Probleme jedoch njdit und besitzt die folgenden Nachteile;

1, Bei diesem modifizierten Verfahren wird ein Antikörper angewandt, der zu den auf der festen Phase immobilisierten HapterEnspezifisch ist_o Dieser

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1A-55 195 - £ -

stellt das begrenzende Reagenz dar, d, h. das .Reagenz, an dem ein Mangel herrscht und dessen Menge in allen zu untersuchenden Proben identisch sein muß, um eine gute Genauigkeit der Bestimmung zu erreichen. Es ist schwierig, dieses Reagenz in standardisierter Weise herzustellen.

2. Bei der Reaktion an der festen Phase treten ähnliche Probleme auf wie bei dem oben beschriebenen älteren Verfahren. Kurz gesagt, ist die Reaktionsgeschwindigkeit aufgrund von Diffusionsproblemen gering (da der Antikörper in fester Phase in geringerer Menge gegenüber den Antigenen vorhanden ist).

3. Für jede Bestimmungsart ist ein unterschiedliches Anti-Hapten Ab auf dem festen Träger erforderlich, d. h. je nach der Art des zu bestimmenden Haptens«

Unter Berücksichtigung all dieser Probleme wurde nun ein neues Verfahren entwickelt, das,während es alle Vorteile des oben erwähnten bekannten Verfahrens besitzt, nicht zu einer Störung des Gleichgewichts bei der ersten immunologischen Ag-Ab -Reaktion führt. Wie die bekannten Verfahren kann es als "Konkurrenz-" (oder Vergleichs-) Verfahren bezeichnet werden und ist heterogen.

Die Erfindung betrifft ein immunologisches Bestimmungsverfahren mit Enzym-Markierung (enzyme-linked immunoassay) zur Bestimmung eines Antigens, das die folgenden Schritte umfaßt: (1) Markierung von (i) einem bekannten Antigen (Ag ) und (ii) einer Probe eines Antigens (Ag ), das bestimmt werden soll durch Reaktionen

/7

ΛΑ

1Α-55 195 - ϊ -

von (a) Ag bzw.Ag mit einem ersten Antikörper (Ab ),

1 2 wobei die Gesamtmenge Ag und Ag größer ist als die

1 1

Menge an Ab und der Antikörper Ab zu den Antigenen

1 2
Ag und Ag spezifisch ist und in einem Tier gebildet worden ist, und (b) zwischen Ab und einem zweiten

ρ ρ

Antikörper (Ab ), wobei Ab ein Antikörper zu dem Immunoglobulin oder einem Fragment davon der Tierart ist, in der der erste Antikörper (Ab ) gebildet worden ist und der Enzym-markiert ist, wobei die Reaktionen (a) und (b) in beliebiger Reihenfolge oder gleichzeitig

ausgeführt werden können; (2)Bildng eines Gemisches von Ag

und der Probe des zu bestimmenden Antigens Ag ; (3)

-1

Umsetzung des Ag in der flüssigen Phase mit einem Immunadsorbens, umfassend einen festen Träger; (4) Trennung der festen Phase von der flüssigen Phase und (5) Bestimmung der Enzym-Aktivität in einer oder in beiden Phasen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist_udadurch gekennzeichnet, daß das bekannte Antigen Ag kovalent an einem Reaktionspartner (X) für das bekannte Antigen gebunden ist unter Bildung eines Konjugats (Ag-X), das den Stufen (i)(a), (2) und (3) unterworfen wird, und daß das feste Immunadsorbens auf seiner Oberfläche einen Bindungspartner Y gebunden enthält, der im Stande ist,mit χ Bindungen

einzugehen und gegenüber dem Antigen'Ag inert ist, und daß das Konjugat Ag -X in Stufe (3) mit dem festen Immunadsorbens in einem stoichiometrischen Überschuß in Beziehung auf X umgesetzt wird, wobei die Stufen (i)(a), (I)(t>), (2) und (3) in beliebiger Reihenfolge oder gleichzeitig durchgeführt werden, wobei Stufe (2) immer vor Stufe (3) kommen muß.

Vorzugsweise wird die Markierung des Antigens durchgeführt bevor Ag -X mit dem Immunadsorbens umgesetzt

/8

4ft

1A-55 195 - t -

wird. So wird bei einer bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Gemisch aus

markiertem Konjugat Ag -X und markierter Probe des

ρ
Antigens Ag mit dem Immunadsorbens zusammengebracht.

Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Test-Kit für das Immunoassay zur Bestimmung eines Antigens, umfassend (a) ein Konjugat (Ag -X) aus einem Antigen (Ag ), das kovalent an einen chemischen Reaktionspartner (x) für das Antigen gebunden ist, (b) einem Enzym-Immunkomplex, der das Reaktionsprodukt ist aus einem ersten Antikörper, der in einem Tier erzeugt worden ist und der ein Antikörper zu dem Antigen ist, mit einem zweiten Antikörper (Ab ), der ein Antikörper zu dem Immunglobulin oder Fragment davon der Tierart ist, in dem der erste Antikörper gebildet worden ist und der Enzym-markiert ist, und (c) einem Immunadsorbens, umfassend einen festen Träger, der auf der Oberfläche einen Bindungspartner Y gebunden enthält, der mit X reagieren kann und gegenüber den Antigen und/oder einem anderen Antigen, das "vergleichbar" ist, d.h. eine vergleichbare Reaktion mit dem ersten Antikörper eingeht, inert ist. Da üblicherweise das zu bestimmende Antigen die gleiche Substanz ist

1

wie das Antigen Ag reicht es aus, daß Y gegenüber Ag inert ist» (E^m Prinzip kann jedoch das zu bestimmende

2 1

Antigen (Ag ) leicht unterschiedlich sein von Ag und bei der oben angegebenen Definition des Kits, d. h. der Analysenanordnung, soll auch diese Möglichkeit eingeschlossen sein durch die alternative Definition des Antigens gegenüber dem Y inert sein muß). Vorzugsweise enthält das Kit zu Eichzwecken auch eine Lösung, die eine bekannte Menge an dem Antigen (Ag ) enthält,

/9

1A-55 195 - < -

zu dessen Bestimmung das Kit dienen soll.

Bei einer Durchführungsform des erfindungsgemäßen

2 Verfahrens kann die Markierung mit dem gesamten Ag reagieren vor der Reaktion mit dem Ag -X. Bei einer

2 1 anderen Ausführungsform werden das Ag und Ag -X gleichzeitig mit der Markierung umgesetzt. So kann

1 2
ein Gemisch von Ag -X und Ag mit der Markierung inkubiert werden. Bei beiden Arbeitsweisen wird die gesamte Markierung umgesetzt und der Anteil an

-1

. Markierung, der mit Ag -X reagiert hat, wird letztenendes in der festen Phase aufgenommen durch Umsetzung mit Y.

Das Verfahren wird durch das folgende Diagramm näher erläutert:

Inkubieren

/10

1A-55 195

3Ί38489

- X)

Trennen, Waschen, Substratzugabe, Ablesen der optischen Dichte der festen Phase

Feststoff

Y, Bindungspartner für X

X, kovalent an das Antigen Ag gebundener chemischer Reaktionspartner

zu bestimmendes Antigen (Ag )

/11

1Α-55 195

Vorgeformter Enzym-Immunkomplex (EIC), bestehend aus einem gereinigten Antikörper Ab y ,

der immunologisch gebunden ist an

2* "Universalmarkierung" <\ /^~7 Ab

Antikörper Ab -Rest

2 _HI Antikörper Ab -Rest

Enzym-Rest

Ein bevorzugtes allgemeines Verfahren zur Durchführung des Assays ist folgendes: Eine Menge an Ag -X (ausgewählt nach den gleichen Kriterien wie für radioaktiv markiertes Antigen bei Radio-Immunoassays) wird mit der Ag enthaltenden Probe und mit einer begrenzten Menge EIC (nicht ausreichend, um mit der Gesamtmenge Ag und Ag zu reagieren) umgesetzt. Wenn das Gleichgewicht erreicht ist (oder nach Ablauf einer geeigneten Reaktionszeit) wird eine feste Phase, die einen großen Überschuß Y (Bindungspartner für X) enthält, zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Wenn das gesamte Ag -X (sowohl das mit EIC umgesetzte als auch das nicht umgesetzte) an Y gebunden ist und damit an die feste Phase gebunden ist, wird die überstehende Flüssigkeit verworfen und die Enzymmenge in der festen Phase gemessen. Diese Menge ist umgekehrt proportional zu der

/12

1A-55 195 - Ά -

Ag -Konzentration in der Probe.

Bei der in homogener (flüssiger) Phase ablaufenden

1 2
Reaktion zwischen Ag -X, Ag und EIC wird die Reaktionszeit bestimmt durch die folgenden Faktoren:

a) die für die spezielle Bestimmung erforderliche Empfindlichkeit

b) die Affinität des Antikörpers Ab zu den Antigenen

c) die Entscheidung, ob die Bestimmung bzw. das Assay bei dem Gleichgewicht durchgeführt werden soll oder nicht (was von der erforderlichen Genaui gk e it abhängt).

Die heterogene (fest-flüssig) Reaktion zur Entfernung

1
des Komplexes EIC-Ag -X durch das an die feste Phase gebundene Y umfaßt eine Wechselwirkung, die vollkommen unabhängig ist von der oben beschriebenen Reaktion. Daher ist die Menge an Y nicht begrenzt durch die Notwendigkeit, daß es das Gleichgewicht der Reaktion in der homogenen Phase nicht stören darf. Sie kann von einem geringen Überschuß bis zu einem großen Überschuß variieren. Je größer der Überschuß an Y ist, um so schneller läuft die Reaktion ab und es besteht daher nur das Problem die Vorteile einer schnellen Reaktion auszunutzen gegenüber der Wirtschaftlichkeit bezüglich der Menge an Y. Im allgemeinen stellt es einen guten Kompromiß dar, wenn man mindestens so viel Y verwendet, daß man das Gleichgewicht innerhalb einer halben Stunde erreicht. Es bestehen auch gute Aussichten Substanzen *) zu verwenden, als sie für Antikörper-Antigen-Reaktionen üblich sind. Z. B. kann das Biotin-Avidin-System

*) Y mit viel höheren

Affinitätskonstanten /¹3

1A-55 195 - K5 -

angewandt werden: Avidin (Y) besitzt eine hohe Affinitätskonstante gegenüber Biotin (X). Die Vorteile dieses Systems werden später erläutert. Die Erfindung bezieht sich jedoch auch auf andere Fälle als das spezielle System, bei dem Y Avidin und X Biotin ist.

Die oben für das erfindungsgemäße Verfahren angegebenen Stufen können in irgendeiner beliebigen Reihenfolge durchgeführt werden. So ist es mög-

lieh, das Gemisch aus Konjugat Ag -X und der

2 Probe, enthaltend das Antigen Ag . vor oder nach

1 2* der Markierung der Antigene mit dem Ab —Ab -System umzusetzen oder sogar gleichzeitig, wenn die Reaktionsbedingungen für beide Reaktionen entsprechend ausgewählt werden.

Die Markierung wird vorzugsweise durchgeführt mit Hilfe des vorgebildeten Enzym-Immunkomplexes (EIC), Ab -Ab , Es ist jedoch auch möglich, die Antigene nacheinander mit dem spezifischen Antikörper Ab

2* umzusetzen und dann die "Universalmarkierung" Ab zuzugeben,

Die Enzym-Aktivität wird vorzugsweise an der festen Phase bestimmt. In diesem Falle ist sie der zu bestimmenden Menge an Antigen umgekehrt proportional.

Das EIC ist allgemein gesagt das gleiche Reagenz wie in der oben erwähnten GB-PS angegeben und es kann irgendeines der dort beschriebenen spezifischen EICs sein. Wie in dieser Druckschrift erwähnt, sind die Antikörper des EIC vorzugsweise von störenden Reaktion spartner befreit, z. B. durch Affinitäts-Chromatographie.

/14

Ag

1A-55 195 - 14 -

Das Antigen Ag kann irgendeines sein, das "vergleichbar" ist, d. h. entweder das gleiche wie

ρ
das Antigen Ag oder irgendein anderes Antigen, das dem Ag ausreichend ähnlich ist, um mit dem Antikörper Ab zu reagieren. X muß so gewählt werden, daß man eine stabile Bindung zwischen X und dem Antigen erreicht. Üblicherweise ist dies eine kovalente Bindung. Das Konjugat Ag -X darf bei der "Erkennung" des AntigensAg durch den spezifischen Antikörper Ab nicht stören. X darf im wesentlichen in den biologischen Flüssigkeiten, in denen das Assay durchgeführt werden soll (z. B. Plasma, Serum, Urin) nicht vorhanden sein (Spuren können im allgemeinen hingenommen werden) und darf mit den Bestandteilen der Probe nicht in Wechselwirkung treten (oder nur sehr schwach). Alle diese Erfordernisse gehen aus der oben angegebenen Definition der Erfindung hervor. Ferner ist X vorzugsweise

1. ein definiertes und stabiles Molekül

2. leicht chemisch modifizierbar, um eine maximale Re

mit/ -I

ättioosaEbeute dem Antigen Ag glatt zu erreichen

und dadurch das aufwendige Antigen zu sparen und 3. vorzugsweise iminunogen sein (oder in eine immunogengene Substanz überführbar sein), sodaß ein Anti-X-Antikörper als Bindungssubstanz Y für X angewandt werden kann.

Y besitzt vorzugsweise eine sehr hohe Affinität gegenüber X. Y ist üblicherweise ein Protein, um es leicht unlöslich zu machen. Am günstigsten ist es, wenn Y billig, leicht zugänglich bzw. herstellbar und standardisierbar ist.

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1A-55 195 - 1£ -

Bei einer bevorzugten Ausführung;?.form des erfindungsgemäßen Verfahrens ist X ein tierisches Protein, das in menschlichen Körperflüssigkeiten nicht enthalten ist, z. B. Kaninchen IgG, das kovalent an das Antigen Ag gebunden ist und Y ist ein Antikörper, der gegen das tierisches Pro-' tein in einer anderen Tierart gebildet worden ist, z. B. Esel -Anti-Kaninchen-IgG.

Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform,' die besonders dann anwendbar ist, wenn das Antigen ein kleines Molekül ist, wie Trijodthyronin (T^) ist X DNP, das gegebenenfalls über ein Kupplungsmittel an das Antigen Ag gebunden ist, und Y ein Antikörper zu DNP. Y kann hervorgerufen worden sein von einem DNP (dinitrophenyliertem) Protein-Konjugat..Das Kupplungsmittel kann günstigerweise ft-'-Aminobuttersäure sein, wenn das Antigen T-, ist.

Bei einer anderen Ausfuhrungsform ist X Biotin und Y Avidin. Das System Biotin-Avidin als X-Y besitzt die folgenden Vorteile:

1. Avidin besitzt eine sehr hohe Affinität gegenüber Biotin: Affinitätskoeffizent = 10¹⁵ (vgl. Ag-Ab

1Cr - 10 ; Protein A-Fc Fragment von IgG; Lectin-Zucker 10-⁵ - 10 );

2. Die Affinität verändert sich nicht, wenn Biotin chemisch am Carbonsäurerest modifiziert wird oder wenn es auf einem festen Träger immobilisiert wird,·

3. Avidin kann leicht auf Glas oder Polystyrol adsorbiert werden·

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2ο

1A-55 195 - 1J& -

4. Biotin ist sehr leicht chemisch modifizierbar;

5. Avidin ist leicht zugänglich oder zu reinigen bzw. isolieren und ist ziemlich stabil bei einem pH-Wert unter 9,0;

6. Avidin ist kein Immunoglobulin und daher kann keine Reaktion mit dem markierten Anti-IgG, das in dem EIC vorhanden ist, auftreten;

7. Da es in großen homogenen Ansätzen erhältlich ist, kann Avidin leichter standardisiert werden als Antikörper. Biotin kann ebenfalls leicht standardisiert, werden.

■

Alle wichtigsten Vorteile des aus der GB-PS bekannten Verfahrens treten auch bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auf. Darüberhinaus können die folgenden zusätzlichen Vorteile erreicht werden:

1. Das unlöslich gemachte Bindungsmittel Y ist ein "Universalreagenz" und "unabhängig von der Art des zu bestimmenden Antigens.

2. Y wird in einem Überschuß gegenüber der Menge an X und damit an dem Antigen Ag angewandt und daher ist seine Herstellung weniger kritisch in Beziehung auf die Probleme der Standardisierung und Variationen zwischen verschiedenen Ansätzen, die bei dem bekannten Verfahren auftreten.

3. Die Trerinungsstufe ist ziemlich schnell.

! /17

1A-55 195

4. Die schnellere Trennung erlaubt es, automatisierte oder halbautomatisierte Systeme anzuwenden.

5. Ag -X ist besonders, wenn X ein Hapten mit

einem niederen Molekulargewicht in Form eines chemisch gut charakterisierten Moleküls ist, leicht bei verschiedenen Zubereitungen reproduzierbar.

6. Die in dem Assay angewandte Menge an Ag -X ist sehr gering: dadurch wird es möglich, das Assay zur Bestimmung teurer Antigene anzuwenden.

7. Die Herstellung von Ag -X unter Verwendung unterschiedlicher ⁿArmeⁿ oder Bindungspunkte der Molekularstruktur führt zu der Möglichkeit,die Affinität des Konjugats gegenüber dem Antikörper Ab zu eichen und damit die Empfindlichkeit und Spezifität wie sie für das Assay erforderlich ist, zu optimieren.

Die Unterschiede zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem in der erwähnten GB-PS angegebenen können durch folgende kurze Schreibweise zusammengefaßt werden, wobei die oben angegebenen Symbole verwendet werden:

Verfahren nach der Erfindung

Träger - Y - X - Ag¹- 7 Ab¹

Überschuß Ag -

Verfahren nach der GB-PS

1 *"> 1 2*

Träger - Ag -/Ab - Ab

Ag²

/18

1A-55 195

Die Unterschiede zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem von Sadeh et al. (a.a.O.) angegebenen, in Beziehung auf die Bestimmung von Haptenen kann einfach, unter Verwendung der gleichen Symbole wie eben folgendermaßen zusammengefaßt werden:

Verfahren nach der Erfindung

Träger -Y-X-H¹ - ) Ab¹ - Ab²* Überschuß H² -

Verfahren nach Sadeh et al

Träger - Ah^hf-H¹ - X - Ab*

ί -H²

Ab bedeutet das spezifische Anti-Hapten, während Y eine Substanz bedeutet, die nur gegenüber dem Haptenpartner X spezifisch sein muß, nicht gegenüber dem Hapten selbst.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Alle Konzentrationen und Prozente sind auf das Gewicht bezogen, "nm" bedeutet nanomolar, d. h. 10~^ molar und "mm" bedeutet millimolar, d. h. 10 molar.

Trijodthyronin (T ) wurde als Hapten ausgewählt, da

seine Bestimmung sehr strenge Erfordernisse und Begrenzungen hat, aufgrund der sehr geringen T^-Gehalte im Serum und der vergleichsweise wesentlich höheren Gehalte an Tyroxin (T,), einer sehr ähnlichen und möglicherweise zu Kreuzreaktionen führenden Substanz. Wenn eine Bestimmung die für T^ erforderliche Empfindlichkeit besitzt kann angenommen

/19

1A-55 195

werden, daß sie noch leichter auf viele andere Haptene angewandt werden kann.

Um die Wirkung der Art des Reaktionspartners X auf die Bestimmung zu untersuchen, wurden zwei sehr unterschiedliche Substanzen als X angewandt: ein großes Protein,Kaninchen-IgG, und ein kleines Hapten nämlich Dinitrophenol (DNP).

Beispiel 1 Komponenten
Ag² - Τ,

Ag -X = T,-Kaninchen-IgG hergestellt nach dem

Carbodiimid-Verfahren, mit einem Molverhältnis T-./Kanirichen-IgG = 2/1

1
Ab = Anti-T^-Antikörper, gebildet im Schaf und gereinigt durch Immunaffinität-Chromatographie

Ab = Anti-Schaf-IgG-Antikörper, gebildet im Esel und markiert mit dem Enzym

ß-Galactosidase von E. CoIi

1 2* EIC = gebildet aus Ab + Ab , die bis zur vollständigen Reaktion miteinander vermischt wurden und aufbewahrt bei 4 C bis zur Anwendung für die Bestimmung Träger-Y = Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, gebildet im Esel und kovalent gebunden an mikrokristalline Cellulose

Puffer = 50 mm Barbiton Puffer, pH 8,6, enthaltend 0,2 % Gelatine und 0,3 m NaCl

/20

1A-55 195

Analytisches Verfahren

EIC (-Ab¹-Ab²*) (200/jlI), T Standard-Lösung in Puffer (Ag²) (100^1) und T -Kaninchen-IgG^-Konjugat (Ag -X) (10OyU-I einer Verdünnung, enthaltend 100 nm/l Konjugat) wurden vermischt und 2 Stunden "bei Raumtemperatur inkubiert. Eine.Suspension von Cellulose-Anti-Kaninchen-IgG (Träger-Y) (200/*1, enthaltend 1 mg/ml feste Phase) wurde zugegeben und das Gemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.

Die feste Phase wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und gewaschen. Die an die feste Phase gebundene Menge an ß-Galactosidase wurde colorimetrisch mit Hilfe von o-Nitrophenyl-ß-galactopyranosid als Substrat gemessen (Craven et al., J. Biol. Chem. 240, 2468 (1965)

Ergebnisse

T^-Konzentration (nM/1)

Änderung 0) der optischen Dichte £iach 30 min Reaktion) (doppelte Ablesung)

% der Null-Bindung (Mittel)

1 2 k B 3 6 Λ2

519

Oj 534

0_;508
0,461
0j366
Oj 267
Oj 222

187

0,532

0,499 0_;405

0_;366

282

0,214

185

0,083 ; 0,084

100 100 93 78 63 42 30 23

/21

Si?

1A-55 195 -2H-

NSB = Unspezifische Bindung, d. h^, die Menge an Markierungssubstanz, die an die feste Phase auf andere Weise als über das T^-Kaninchen-IgG gebunden ist. Die Prozentsätze der Bindung sind berechnet nach Abzug von NSB

Beispiel 2 Komponenten

Ag², Ab¹, Ab²* und EIC wie in Beispiel 1. Ag¹-X = T^-DNP-Konjugat der Formel:

COOCH₃
CHp-CH-NH-GABA-DNP

Träger—Y = Anti-DNP-Antikörper, gebildet im Kaninchen und kovalent gekuppelt an mikrokristalline Cellulose
20

Analytisches Verfahren

Das Bestimmungsverfahren war das gleiche wie in Beispiel 1 mit Ausnahme der Ag -X-Konzentration, die auf 5nM/l verringert wurde, wodurch man eine höhere Empfindlichkeit erreichte..

/22

T »J V

1A-55 195

3b

Ergebnisse

!,-Konzentration (nm/1)

Änderung (4) der optischen Dichte (nach 6o min Reaktion) (doppelte Ablesung)

% der Null-Bindung (Mittel)

0
0,5

NSB

0,452 τ 0)499

0,422 ; 0,458

0,320 ; 0)397

0,295 ; 0_;305

0_f217 : O₁216

Oj.152 τ 0,130

0,137 7 O₁141

0,122 ; 0,122

100 90 77 50 27 5

■ 5

Beispiel 3

Die Bestimmung des Beispiels 2 wurde noch empfindlicher gemacht, indem die Menge an EIC auf die Hälfte verringert wurde, während alle anderen Reagenzien und Verfahrensschritte identisch waren.

/23

1A-55 195

Ergebnisse

Τ,-Konzentration Änderung (Δ) der (nm/1) optischen Dichte

(nach 60 min Reaktion) (doppelte Ablesung)

% der Null-Bindung (Mittel)

0,5 1
2

8 16

NSB

0,289 ; 0^298

0,211 : 0,224

0jl67 : 0yl88

0jl3l : O₇138

0_;101 τ O₇IOO

0_r082 : 0,088

0_;009 ; 0j072

0_;060 τ 0^,060

6224

Claims

Patentansprüche

10

. 1./ Verfahren zur Durchführung einer immunologischen Bestimmung unter Anwendung einer Enzym-Markierung, umfassend die folgenden Stufen;

5 (1) Markierung von (i) einem bekannten Antigen (Ag )

und (ii) einer Probe enthaltend ein Antigen (Ag ), das bestimmt werden soll, durch Reaktionen(a) von Ag bzw. Ag mit einem ersten-Antikörper (Ab ),

1 2 ■ ··■

wobei die Gesamtmenge Ag und Ag in einem Überschuß gegenüber Ab vorhanden ist und der Anti-

1 12

körper Ab zu den Antigenen Ag und Ag spezifisch ist und in einem Tier gebildet worden ist, und (b) zwischen Ab und einem zweiten Antikörper (Ab ), der ein Antikörper zu dem Immunoglobulin oder einem Fragment da/m der Tierart ist, in der der erste Antikörper (Ab ) gebildet worden ist und der mit einem Enzym markiert ist, wobei die Reaktionen (a) und (b) in beliebiger Reihenfolge oder gleichzeitig durchgeführt werden^

-ι (2) Bildung eines Gemisches von Ag und der Probe,

20

die das zu bestimmende Antigen Ag*

enthält^

/2

..j ι j ο η o g

1A-55 195 - 2 -

<4

(3) Umsetzung des Ag in flüssiger Phase mit einem Immunadsorbens, umfassend einen Feststoff;

(4) Abtrennung der festen Phase von der flüssigen Phase; und

(5) Bestimmung der Enzymaktivität in einer der beiden Phasen;

dadurch gekennzeichnet, daß das bekannte Antigen Ag kovalent an einen Reaktionspartner X für das bekannte Antigen gebunden ist unter Bildung eines Konjugats (Ag -X), das den Stufen 0) (a)t (2) und (3) unterworfen wird, daß das feste Immunadsorbens an seiner Oberfläche einen Bindungspartner Y gebunden enthält, der im Stande XSt₁, mit X Bindungen einzugehen und gegenüber dem Antigen

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Ag inert ist, und daß das Konjugat Ag -X in Stufe

(3) mit dem festen Immundasorb ens in einem stöchiometrischen Überschußjbezogen auf X,umgesetzt wird, wobei die Stufen (i)(a), (i)(b), (2) und (3) in beliebiger Reihenfolge oder gleichzeitig durchgeführt werden, vorausgesetzt, daß Stufe (2) vor Stufe (3) erfolgt.
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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X ein Dinitrophenolrest ist, der kovalent über ein Kupplungsmittel an

das Antigen Ag gebuni
zu Dinitrophenol ist.

das Antigen Ag gebunden ist und Y ein Antikörper

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Antigen Trijodthyronin ist.

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1A-55 195 - 3 -

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X Biotin und Y Avidin ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein Hapten ist.

6. Verfahren nach einem der vaherg^ieiden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß die Antigene markiert worden sind durch Umsetzung mit einem vorgebildeten Immunkomplex aus dem ersten Antikörper und dem markierten zweiten Antikörper

(Ab¹-Ab²*).

7o Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzym-Aktivität in der festen Phase bestimmt wird.
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8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet ,

1 2
daß die Antigene Ag und Ag durch die Reaktionen

(a) und (b)ιwie oben angegebenen_?markiert werden, bevor das Konjugat Ag -X mit dem Immunadsorbens umgesetzt wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet _s 1 2
daß die Antigene Ag und Ag gleich sind.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß die Stufen (I)U)₅ (i)(b) und (2) gleichzeitig

1Α-ί>5 195 - 4 -

durchgeführt werden und sich daran Stufe (3) anschließt.

11. Analyseneinheit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet , daß sie folgende Bestandteile umfaßt: (a) ein Konjugat (Ag -X) aus einem Antigen (Ag ), das kovalent an einen chemischen Reaktionspartner (X) für das Antigen gebunden ist, (b) einem Enzym-Immun-Komplex, der das Reaktionsprodukt von einem ersten Antikörper (Ab ), der in einem Tier gebildet worden ist und ein Antikörper zu dem Antigen ist, mit einem zweiten Antikörper (Ab ), der ein Antikörper zu dem Immunglobulin oder einem Fragment davon der Tierart ist, in der der erste Antikörper gebildet worden ist, und einem zweiten Antikörper (Ab ) mit einer Enzym-Markierung; und (c) ein Immunadsorbens, bestehend aus einem Feststoff, an dessen Oberfläche ein Bindungspartner Y gebunden ist, der mit X reagieren kann und" gegenüber dem Antigen Ag und/oder einem vergleichbaren Antigen, das sich von Ag unterscheidet, verträglich ist.

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