DE3731227A1

DE3731227A1 - Immunoassay-reagenzien, -kits- und -verfahren

Info

Publication number: DE3731227A1
Application number: DE19873731227
Authority: DE
Inventors: Nathan Citri
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1986-09-19
Filing date: 1987-09-17
Publication date: 1988-06-30
Also published as: AU7862387A; AU594503B2; GB2197468A; GB8721276D0; CH675309A5; IL80313A0; FR2604259B1; GB2197468B; CA1294871C; FR2604259A1; IT1223303B; NL8702235A; IT8721950A0

Description

Die Erfindung betrifft Immunoassay-Reagenzien zum Bin den und zum Nachweis von Antikörpern, Test-Kits für Enzym-Immunoassays und heterogene spezifische Bindungs assay-Verfahren zum Bestimmen eines nichtgebundenen Antikörpers oder eines Haptens oder Antigens in einem flüssigen Medium.

Spezifische Antikörper-Bindungsassayverfahren, auch Immunoassay-Verfahren genannt, sind rasch an Bedeutung gewinnende analytische Techniken, die aufgrund ihrer hohen Spezifizität und Empfindlichkeit in großem Umfang in Diagnose und Forschung eingesetzt werden. Die frühe ren Versionen dieser Technik, die Radioisotopenmarkie rungen verwendeten, sind in den letzten Jahren in zu nehmendem Maße von Enzymimmunoassay-(EIA-)Techniken er setzt worden, die Enzymmarkierungen verwenden, wodurch diese Techniken gleich empfindlich, aber sicherer, ein facher und preiswerter sind.

Unter den EIA-Techniken werden allgemein die sogenann ten "heterogenen" Assay-Verfahren verwendet, die enzym markierte Antikörper oder Antigene einsetzen, die auf sensibilisierten Oberflächen von festen Trägern, wie zum Beispiel Reagenzgläsern, Polysterol-Perlen oder Platten, die mit versenkten "Schächten" versehen sind, angebracht ("immobilisiert") sind. Solche Techniken werden im allgemeinen mit der Abkürzung "ELISA" bezeichnet, die für "enzym-linked immunosorbent assay" steht. In einer abgewandelten Form ist diese Technik mit der bekannten Verwendung eines sogenannten "zweiten Antikörpers", nämlich eines Antiserums zum spezifischen "ersten" Antikörper, kombiniert. Der zweite Antikörper dient als ein nichtspezifischer Detektor für jeden "ersten" Antikörper, entweder im freien Zustand oder gebunden an sein spezifisches Antigen in einem Antigen- Antikörper-Komplex.

Gemäß einer Version des oben genannten Verfahrens, die auch auf die bekannte Technik des "beschichteten Rohres" zurückwirkt, wird ein Antigen auf der Innenwandoberflä che eines Reagenzglases angebracht, in dem die Bin dungsreaktion dann durchgeführt wird, woraufhin der freie spezifische Antikörper zu besagtem Antigen, der in der Testprobe vorhanden ist, auf der Reagenzglas oberfläche über das dort immobilisierte Antigen gebun wird. Danach wird die flüssige Reaktionsmischung aus dem Reagenzglas entfernt, das letztere wird ausge waschen und eine zweite Lösung, die einen enzymmarkier ten zweiten Antikörper enthält, wird in das Reagenzglas gegeben. Dieser markierte zweite Antikörper wird auch immobilisiert, indem er sich an jedem Antikörper bindet, der über das Antigen an die Reagenzglasoberflä che gebunden ist. Das Reagenzglas wird wieder geleert, gespült und mit einem geeigneten Substrat gefüllt, das auf die Enzymmarkierung des zweiten Antikörpers an spricht, und die enzymatische Aktivität wird gemessen. Diese Aktivität ist direkt proportional zur Antikörper konzentration in der Testprobe.

In den vergangenen Jahren ist festgestellt worden, daß der "zweite Antikörper" in Immunoassay-Techniken durch ein besonderes Protein ersetzt werden kann, nämlich das sogenannte "Protein A", das ein Hauptbestandteil der Zellwand vieler Stämme von Staphylokokkus aureus ist. Dieses Protein A ist kovalent an die Zellwand der Sta phylokokken gebunden, kann aber gelöst werden und ist in der Lage, viele Klassen von Immunoglobulin-Molekülen mit hoher Affinität zu binden. Es bindet so auch Anti körper-Antigen-Komplexe. Das gelöste Protein A kann darüber hinaus markiert werden, zum Beispiel mit radio aktivem Jod oder mit Enzymen, und enzymmarkierte Pro tein-A-Präparate entwickeln sich jetzt zu einem zuneh mend beliebten Bestandteil von Immunoassay-Kits, in de nen sie als der Detektor dienen.

Vor kurzem haben Lars Bjorck et al. in The Journal of Immunology Vol. 133, Nr. 2, Auf. 1984, Seiten 969-974 ih ren Befund hinsichtlich der Reinigung und den Eigen schaften von Streptokokken-Protein G als einem neuartigen IgG-Bindungsrezeptor beschrieben.

Wie dort beschrieben, wurde Protein G, ein Protein aus der Bakterienzellwand mit Affinität zu Immunoglobulin G (IgG), aus einem menschlichen Gruppe-G-Streptokokken stamm (G 148) isoliert, und es wurde festgestellt, daß dieses Protein alle menschlichen IgG-Unterklassen und auch Kaninchen-, Mäuse- und Ziegen-IgG bindet.

In einem weiteren Artikel von Bo Akerstrom et al., in The Journal of Immunology Vol, 135, Nr. 4, Oktober 1985 Seiten 2589-2592 wurde die Avidität von Protein G für verschiedene monoclonale und polyclonale Ig der G- Klasse, sowie die Verwendung von radioaktiv markierten Protein G zur Bindung und zum Nachweis von Antikörpern untersucht.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die bekannten Enzymimmunoassays hinsichtlich der Spezifizität und der Empfindlichkeit weiter zu verbessern.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe bei einem gattungs gemäßen Immunoassay-Reagenz durch einen Gehalt an nichtlebensfähigen stabilisierten bakteriellen Zellen mit einem aktiven Rezeptor für Immunoglobulin und einem aktiven Marker-Enzym gelöst.

In einer ersten bevorzugten Ausführungsform der vorlie genden Erfindung weist dieses Reagenz einen Gehalt an nichtlebensfähigen stabilisierten Staphylokokkenzellen auf.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vor liegenden Erfindung weist das Reagenz einen Gehalt an nichtlebensfähigen stabilisierten Streptokokkenzellen auf.

Die vorliegende Erfindung stellt damit eine weitere wichtige Verbesserung der obengenannten ELISA-, Pro tein-A- und Protein-G-Techniken dar und basiert auf dem erfinderischen Grundgedanken, daß das enzymmarkierte Protein A und das radioaktiv markierte Protein G durch intakte nichtlebensfähige stabilisierte bakterielle Zellen mit einem aktiven Rezeptor für Immunoglobulin und einem aktiven Marker-Enzym, die einer geeigneten Vorbehandlung unterworfen worden sind, ersetzt werden können. So können zum Beispiel Staphylokokkenzellen wirksam und schnell Immunoglobulin (sowie jeden spezi fischen "ersten Antikörper") kraft des Proteins A in ihren Zellwänden binden, und G-Streptokokkenzellen können kraft des Proteins G in ihren Zellwänden Immunoglo bulin ähnlich binden. Gleichzeitig wird die Enzymmar kierung von Enzymen zur Verfügung gestellt, die natür licherweise in den Zellen vorhanden sind (d. h. die en dogenen oder autochtonen Enzyme), deren Aktivität leicht gemessen werden kann, oder in besonders bevor zugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wie weiter unten beschrieben, ist die Enzymmarkierung oder der Marker das Ergebnis eines Gens für besagtes Enzym, das in eine Mutterzelle eingesetzt worden ist.

Das erfindungsgemäße Reagenz, nämlich eine Suspension von geeignet behandelten bakteriellen Zellen, hat be trächtliche Vorteile als "Detektor-Suspension" gegen über allen bekannten Detektoren für Antikörper oder de ren Komplexe, indem es Arbeit, Zeit und Kosten vermei det, die in folgenden Schritten liegen:

(a) Isolieren des Bindungsproteins oder Herstellen von Anti-Immunoglobulinen;
(b) Herstellen des Enzyms, das als Markierung ver wendet werden soll;
(c) Binden der Enzymmarkierung an das Bindungs protein - ein bekannt kostspieliger Schritt - und/oder
(d) radioaktives Markieren von Proteinen.

Im Licht der speziellen Eigenschaften des erfindungsge mäßen Reagenzes stellt die Erfindung auch einen Test- Kit für Enzymimmunoassays zur Verfügung, der einen oder mehrere Behälter aufweist, die eine wäßrige Sus pension von nichtlebensfähigen stabilisierten bakte riellen Zellen mit einem aktiven Rezeptor für Immuno globulin und einem aktiven Marker-Enzym oder ein stabi lisiertes Trockenpräparat solcher Zellen, das für eine in-situ-Rekonstitution geeignet ist, enthalten.

Die Erfindung schlägt weiter vor, einen Test-Kit zum Durchführen von Immunoassays zur Verfügung zu stellen, der in einer abgepackten Kombination einen oder mehrere feste Träger aufweist, wobei auf wenigstens einem Teil von deren Oberfläche ein Einfang-Antikörper oder ein Hapten oder Antigen, das spezifisch für den Antikörper ist, der untersucht werden soll, fixiert ist, und einen oder mehrere Behälter, die eine wäßrige Suspension der erfindungsgemäßen stabilisierten bakteriellen Zellen oder ein stabilisiertes Trockenpräparat solcher Zellen, die für eine in-situ-Rekonstitution geeignet sind, um eine wäßrige Suspension von Zellen zu erhalten, enthalten.

Basierend auf dem obigen Konzept, betrifft die Erfin dung auch ein heterogenes spezifisches Bindungsassay verfahren zur Bestimmung eines nichtgebundenen Anti körpers in einem flüssigen Medium, das folgende Schrit te umfaßt:

i) Inkubieren einer Probe des flüssigen Medi ums in Kontakt mit einem festen Träger, auf dessen Oberfläche ein Antigen oder Hapten be festigt ist, das für den Antikörper spezifisch ist;
ii) Abtrennen des festen Trägers von der Pro be des flüssigen Mediums und Spülen desselben mit einer wäßrigen Lösung, um alle Spuren der Probe zu entfernen;
iii) Inkubieren des festen Trägers in Kontakt mit einer wäßrigen Suspension von nichtle bensfähigen stabilisierten bakteriellen Zellen und einem aktiven Marker-Enzym;
iv) Abtrennen des festen Trägers von der Sus pension und Waschen desselben mit einer wäß rigen Lösung; und
v) Inkubieren des festen Trägers in Kontakt mit einem geeigneten Substrat und Untersuchen auf enzymatische Aktivität des Marker-Enzyms auf Zellen, die auf der Oberfläche des festen Trägers erhalten geblieben sind.

Das erfindungsgemäße spezifische Bindungsassay-Verfah ren kann für die Bestimmung eines Haptens oder Antigens in einem flüssigen Medium angewendet werden, indem ei ner Probe des besagten flüssigen Mediums ein für das Hapten oder Antigen, das bestimmt werden soll, spezifi scher Antikörper hinzugefügt wird und das Reaktionsge misch in Kontakt mit einem festen Träger inkubiert wird, der auf seiner Oberfläche dasselbe Hapten oder Antigen, das untersucht werden soll, fixiert aufweist, wobei in Schritt (i) ein spezifischer Antikörper zu be sagtem Antigen oder Hapten zur Testprobe hinzugefügt wird und als Resultat der Bindung von besagtem Hapten oder Antigen in besagter Probe die Menge an Antikörper, die zur Bindung des Haptens oder Antigens, das auf der festen Oberfläche fixiert ist, zur Verfügung steht, proportional verringert wird. Die oben beschriebenen Schritte ii) bis v) werden dann durchgeführt und die enzymatische Aktivität, die in Schritt v) bestimmt wird, ist umgekehrt proportional zur Konzentration des Haptens oder Antigens in der Probe. Diese Konzentration kann mit Verfahren berechnet werden, die bei Immunoas say-Techniken gut bekannt sind, zum Beispiel durch Ver gleich mit einer Referenzprobenreihe mit bekannten Standardkonzentrationen des Haptens oder Antigens.

Die Detektorzellsuspension der vorliegenden Erfindung kann in ähnlicher Weise in Immunoassays vom "Sand wich"-Typ verwendet werden, nämlich in Assays, in denen ein "Einfang-Antikörper" auf einer festen Oberfläche immobilisiert ist, um in der Testprobe vorhandenes Anti gen einzufangen, und ein "Tracer"-Antikörper dann auf diese Antigen aufgebracht wird, um ein "Sandwich" zu bilden. Die Bindung des "Tracer"-Antikörpers wird kon ventionell von einer Markierung angezeigt, die in das Antikörper-Molekül eingebaut ist.

Beim vorliegenden Verfahren kann die Detektor-Suspen sion verwendet werden, um die Notwendigkeit zum Markie ren des zweiten Antikörpers zu beseitigen. Das einzige Erfordernis ist, daß die Detektorzellen nicht an den Einfang-Antikörper gebunden werden dürfen. Das Erfor dernis kann dadurch erfüllt werden, daß man Antikörper, die Protein A nicht binden (z. B. IgY aus Hähnchen- Serum oder aus Eidotter), oder modifizierte Antikörper verwendet, in denen das F_c-Segment fehlt (z. B. Fab oder F[ab']₂).

Eine selektive Bindung an den zweiten Antikörper kann bei herkömmlichen Antikörperpräparaten oft beobachtet werden, wodurch angezeigt wird, daß der Einfang- Antikörper in einer Konfiguration fixiert ist, die den das Protein A bindenden Teil (F_c-Segment) des Immuno globulins für die Bindung der Detektorzelle unbrauchbar macht.

Ein Test-Kit, der angepaßt ist, um das erfindungsgemäße Assay-Verfahren zur Bestimmung eines Haptens oder Anti gens in einem flüssigen Medium durchzuführen, kann zu sätzlich einen oder mehrere Behälter aufweisen, die standardisierte Lösungen eines spezifischen Antikörpers zu besagtem Hapten oder Antigen, das untersucht werden soll, enthalten. Die erfindungsgemäßen Test-Kits können weiterhin fakultativ abgepackte Hilfsreagenzien oder -lösungen zur Durchführung des Assay-Verfahrens auf weisen, wie z. B. Pufferlösungen, standardisierte Refe renzlösungen der zu bestimmenden Analysesubstanz, Sub stratlösungen und Detektorreagenzien zur Messung der Aktivität des endogenen Enzyms, das als Markierung dient, usw. Solche Test-Kits, die ein lyophilisiertes stabilisiertes Präparat von Staphylokokkus-aureus-Zel len aufweisen, können zusätzlich abgepacktes wäßriges Medium zur Bildung der erforderlichen wäßrigen Suspen sion besagter Zellen in situ aufweisen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird auch ein Test-Kit zur Verfügung ge stellt, der zusätzlich einen Absorptionsmittelträger aufweist, welcher ein für das Marker-Enzym spezifisches Reagenz enthält.

Wie oben angegeben, werden die Staphylokokkenzellen der vorliegenden Erfindung in geeigneter Weise vor ihrer Verwendung behandelt, um sicherzustellen, daß die Zell suspension sicher (d. h. nichtpathogen), standardisiert und stabilisiert ist, während sie ihre Bindungsfähig keit und die Aktivität des Marker-Enzyms, das ausge wählt ist, um als Markierung zu dienen, beibehält. Es ist festgestellt worden, daß diese Erfordernisse z. B. dadurch erfüllt werden können, daß die Staphylokokken zellen durch Behandlung mit 0,5%iger Formaldehydlösung bei Raumtemperatur für zwei Stunden, gefolgt durch 5-15minütiges Erhitzen auf etwa 50 bis 70°C fixiert wer den. Die behandelten Zellen können z. B. als 10%ige Suspension mit einem Konservierungsstoff wie Natrium azid bei 4°C oder als gefriergetrocknete Pellets von Staphylokokkenzellen, die in zugeschmolzenen Ampullen aufbewahrt werden, konserviert werden. Alternativ dazu kann ein sicheres und stabiles Reagenz durch Gefrier trocknung einer Suspension von Staphylokokkenzellen und Lagern des Produktes in zugeschmolzenen Ampullen erhal ten werden. Die gefriergetrockneten Zellen können zur Verwendung in situ durch Suspendieren in einem geeigne ten flüssigen Medium rekonstituiert werden.

Es soll angemerkt werden, daß, sowohl stabilisierte Staphylokokkenzellen kommerziell erhältlich sind, die Standardbehandlung zu deren Stabilisierung normaler weise jegliche darin aufgefundenen endogenen Enzyme inaktiviert. Nichtlebensfähige stabilisierte Staphylo kokkenzellen mit einem aktiven Rezeptor von Immunoglo bulin und einem aktiven Marker-Enzym sind also bis heu te nicht verfügbar gewesen und auch nicht zur Verwen dung als Immunoassay-Reagenzien vorgeschlagen worden.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Marker-Enzym endogene Katalase, und die Katalase aktivität der Staphylokokkenzellen wird untersucht.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen der vor liegenden Erfindung werden als Reagenzien nichtle bensfähige stabilisierte Staphylokokkenzellen mit einem aktiven Rezeptor für Immunoglobulin und einem aktiven Marker-Enzym verwendet, wobei das Gen für besagtes En zym durch gentechnologische Verfahren, die für sich be kannt sind, in eine Mutterzelle eingesetzt worden sind.

Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung wurde ein genmanipulierter Stamm der Cowan-Staphylokokken herge stellt, der sich vom Originalstamm darin unterscheidet, daß er ein Gen zur Bildung von β -Laktamase aufweist.

Der allgemeine Vorteil in der Verwendung dieses Ansat zes des Einsetzens eines neuen Gens liegt darin, daß man nicht auf Enzym-Marker bauen muß, die zufällig im Originalstamm vorhanden sind. So kann zum bestehenden Repertoire der endogenen Enzyme ein neuer vererblicher Marker hinzugefügt werden, der geeigneter für Immunoas says ist.

Die spezifischen Vorteile des Gens für β -Laktamase lie gen darin, daß es alle folgenden Erfordernisse erfüllt:

1. Das Enzym ist weitgehend zellgebunden.
2. Das Enzym ist für das Substrat vollständig zugänglich.
3. Das Enzym ist sehr stabil, und seine Aktivität kann beim Verarbeiten der Zellen gut erhalten werden.
4. Das Enzym hat eine sehr hohe Umsatzrate.
5. Das Substrat ist stabil und preiswert, und seine Verwendung zieht keine Gesundheitsgefah ren oder Sicherheitsvorkehrungen nach sich.
6. Der Assay der β -Laktamase-Reaktion ist einfach, schnell und sehr empfindlich.
7. Der Assay erfordert keine Instrumentierung, und eine dauernde Aufzeichnung der Ergebnisse kann ohne zusätzliche Manipulationen beibehal ten werden.

Wie weiter oben angegeben, ist von verschiedenen Arten von Streptokokken-Pyogenen bekannt, daß sie Zellwand proteine erzeugen, die als Rezeptoren für den F_c-Teil des Immunoglobulins dienen können. Der Rezeptorspezifi zität solcher Proteine kann mit der Art des erzeugenden Stammes variieren. Von besonderem Interesse sind Strep tokokken der Arten C und G, die leistungsfähige Rezep toren mit breiter Spezifität erzeugen. Solche bakte riellen Zellen können in analoger Weise zu derjenigen, die für die Cowan-I-Zellen beschrieben ist, als Reagen zien verwendet werden. Die folgenden Unterschiede müs sen jedoch beachtet werden:

1. Die breitere Spezifizität von Streptokokken- F_c-Rezeptoren erlaubt die Ausdehnung der gegen wärtigen Methodologie auf den Nachweis von Im munoglobinen, die Protein A nicht ausreichend binden.
2. Die Streptokokken-Zellen besitzen keine Ka talase, weisen aber eine reiche Vielfalt anderer zellgebundener Enzyme auf, einschließlich Hämo lysinen, die als endogene Indikatoren der Bindung an das Immunoglobulin-Molekül dienen können.
3. In Analogie zur genetischen Modifizierung des Cowan-Stammes, wie weiter oben beschrieben, lie fert das Einsetzen von geeigneten Genen zusätzli che Enzymmarkierungen, die in Immunoassay-Diag nose-Kits vorteilhaft sein können.

Aus dem eben Gesagten wird deutlich, daß Strepto kokkenzellen, die F_c-Rezeptoren besitzen, selbst als Quelle für Reagenzien zum Nachweis einer Vielzahl von Immunoglobinen dienen können. Wenn es bevorzugt wird, können solche Zellen in Kombination mit dem zuvor be schriebenen Cowan-Reagenz verwendet werden. Die kombi nierte Verwendung beider Zellarten kann eine von mehre ren Formen annehmen:

1. Das Reagenz kann aus einer Mischung beider Zellarten bestehen. Jede Art kann ihre eigene kennzeichnende Enzymmarkierung tragen, oder ein einziger Assay kann verwendet werden, falls eine ähnliche Enzymaktivität als Markierung für beide Zellarten gewählt wird.
2. Die gemischten Zellen sind miteinander verbun den (z. B. mit Glutaraldehyd), um ein kombinier tes Reagenz zu bilden, das nun eine einzige En zymmarkierung trägt (z. B. β -Laktamase), aber zwei Arten von F_c-Rezeptoren.
3. Ein kombiniertes Reagenz wird durch Interak tion mit Immunoglobulinen gebildet, die im Assay vorhanden sind oder bewußt zu diesem Zweck hinzu gesetzt sind.

Obwohl die Erfindung in den folgenden Beispielen in Zu sammenhang mit bestimmten bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wird, so daß deren Aspekte vollständiger verstanden und gewürdigt werden können, ist es nicht beabsichtigt, die Erfindung auf diese besonderen Aus führungsformen zu beschränken. Im Gegenteil ist es be absichtigt, alle Alternativen, Modifikationen und Äqui valente im Rahmen des Schutzumfanges der Erfindung, wie sie sich aus den Ansprüchen ergibt, abzudecken. Die folgenden Beispiele, die bevorzugte Ausführungsformen beinhalten, dienen also dazu, die praktische Umsetzung dieser Erfindung zu veranschaulichen, wobei die gezeig ten Besonderheiten selbstverständlich nur beispielhaft und zum Zwecke einer anschaulichen Diskussion der be vorzugten Auführungsform der vorliegenden Erfindung verstanden werden sollen und vorgelegt werden, um die wahrscheinlich nützlichste und am einfachsten verständ liche Beschreibung der Formulierungsprozesse sowie der Prinzipien und konzeptionellen Aspekte der Erfindung zur Verfügung zu stellen.

Beispiel 1 Herstellung einer stabilisierten Suspension von Staphylokokkus-aureus-Zellen

Staphylokokkus aureus (Stamm Cowan I, ATCC) wurde in TSB (Trypticase Soy Broth, Difco) in 500-m-Erlen meyerkolben auf einem hin- und herschwingenden Schüt telapparat 18 Stunden lang bei 37°C gezüchtet. Die Zellen wurden dann abzentrifugiert (10 min bei 10 UPM), zweimal mit Phosphat gepufferter physiologischer Koch salzlösung (PBS), pH 7,3, gewaschen und in 10 Volumen teilen PBS (pH 7,3), die 0,5% Formaldehyd enthielt, suspendiert. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Zellen wie zuvor abzentrifugiert und gewaschen und dann in 10 Volumenteilen PBS (pH 7,3) suspendiert. Die Suspension wurde 10 Minuten lang bei 60°C unter sanf ten Schütteln bebrütet, wie zuvor zentrifugiert und in 10 Volumenteilen PBS (pH 7,3) wieder suspendiert. Pro ben dieser Suspension, aufgestrichen auf AB3-(Difco-) Platten, zeigte nach 24 Stunden bei 37°C kein Wachs tum. Nach zwölfmonatiger Lagerung bei 4°C zeigte die Suspension keine Anzeichen einer Veränderung im Bin dungsverhalten oder in den katalytischen Eigenschaften. Vor Verwendung wurde die Suspension 1 : 10 in PBS ver dünnt.

Beispiel 2 Herstellung von gefriergetrocknetem stabilisiertem Staphylokokkus aureus Reagenz

Staphylokokkus aureus (Stamm Cowan I, ATCC) wurde, wie im obigen Beispiel 1 beschrieben, kultiviert und geern tet. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen, in 10 Volumenteilen frischem TSB wieder suspendiert, 10 Minu ten lang bei 60° bebrütet und in 0,5-ml-Portionen in Lyophilisierungs-Ampullen dispensiert. Nach Gefrier trocknung wurden die zugeschmolzenen Ampullen bei Raum temperatur (22-25°C) gelagert. Zur Verwendung wurde der Inhalt einer Ampulle in 5,0 ml PBS, das 0,01% Thiomersal enthielt, suspendiert.

Beispiel 3 Nachweis von Kaninchen-Anti-BSA

Mikrotiterplatten (U-Typ, Nunc) wurden durch Füllen der "Schächte" mit 100 µl 0,2%iger Glutaraldehydlösung in Boratpuffer, pH 9,0, und dreistündiges Bebrüten bei 56°C aktiviert. Die Platten wurden dann zehnmal mit zwei mal destilliertem Wasser gewaschen und mit Antigen beschichtet, indem die "Schächte" mit 100 µl Rinderse rumalbumin (bovine serum albumin, BSA) 50 mg/ml) ge füllt, die Platten 2 Stunden lang bei 37°C bebrütet und 18 Stunden lang bei 4°C gelagert wurden. Nach drei Waschungen mit PBS wurden die besetzten Oberflächen durch Füllen der "Schächte" mit 100 µl Ovalbumin (1,0 mg/ml) und zweistündiges Bebrüten bei 37°C blockiert, gefolgt von drei Waschungen mit PBS.

Kontroll-"Schächte" wurden wie oben hergestellt, wobei das BSA weggelassen wurde.

Antikörper zu BSA (Anti-BSA) wurden in Kaninchen pro duziert. Normales Kaninchenserum (normal rabbit serum, NRS) diente als nichtspezifische Kontrollsubstanz. Es wurden Reihenverdünnungen in PBS gemacht, und jeweils 100 µl wurden zu den antigenbeschichteten "Schächten" hinzugefügt. Nach 30minütigem Bebrüten bei 37°C wur den die "Schächte" dreimal mit PBS gewaschen. Zum Nach weis des Antikörpers, der vom Antigen zurückgehalten worden war, wurde ein aliquoter Teil (100 µl) einer Staphylokokkenzellsuspension (hergestellt gemäß Bei spiel 1 und 2) zu jedem "Schacht" hinzugefügt. Nach 20minütigem Bebrüten bei 37°C wurden die "Schächte" ein mal mit 1%igem Tween 20 und zweimal mit PBS gewaschen. Die Retention der Zellen durch den gebundenen Antikör per wurde mit Hilfe der Aktivitäten von saurer Phospha tase oder Katalase nachgewiesen, gemäß dem im israeli schen Patent Nr. 36496 beschriebenen Verfahren.

Ergebnisse:

Das oben beschriebene Testsystem wurde verwendet, um die Empfindlichkeit der Detektoren, d. h. der Staphy lokokkenzellsuspensionen, die gemäß Beispiel 1 und 2 hergestellt worden waren, mit der Empfindlichkeit eines radioiodierten Protein-A-Präparates, das herkömmlicher weise in empfindlichen Festphasen-Radioimmunoassays verwendet wird, zu vergleichen. Die Resultate sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle I

Beispiel 4

Ein Gen zur konstitutiven Penicillinase-Bildung (pen I-) wurde in den Cowan-I-Stamm von Staphylokokkus aureus eingesetzt. Das Gen stammt aus einem Plasmid (PI₂₅₈ pen I 443) mit einem Stamm (RN 453) von Staphylokokkus au reus als Wirt (Novick, R. P., and Brodsky, R., 1982) und wurde mit der Phage o11 überführt. Die Transduktion verlief wie von Novick beschrieben (Novick, R. P., 1967). Eine stabilisierte Suspension dieser Zellen, die β -Laktamase als ihr Marker-Enzym aufweisen, wurde dann durch das Verfahren von Beispiel 1 hergestellt.

Beispiel 5 Nachweis von Antikörpern auf Brucella in Rinderseren

Eine Polysterol-Petrischale (Standardgröße, Miniplate) wurde an 8 ausgewählten Tupfen in gleichem Abstand durch Auftüpfeln von 50 µl einer 25%igen Glutar aldehyd-Lösung (Merck) aktiviert. Nach 150 Sekunden bei 24°C wurde die Schale mit Wasser gespült und 10 µl der Antigensuspension zu jedem Tupfen hinzugefügt. Die An tigensuspension bestand aus hitzeabgetöteten (90 Minu ten bei 72°C) Zellen von Brucella abortus, suspendiert in PS (0,5% Phenol und 0,85% NaCl in destilliertem Wasser) mit einer optischen Dichte, die 200 Klett- Einheiten entspricht. Die Tupfen wurden ausgiebig ge spült und die Petrischale mit 5 ml einer Blockierlösung überschichtet, die aus BSA (20 mg/ml) in PBS bestand. Nach 2 Stunden bei 37°C und 16 Stunden bei 4°C wurde die Blockierlösung abgegossen und die Petrischale zwei mal mit PBS, dann zweimal mit 0,05%igem Tween 20 in PBS und wieder mit PBS gespült. Die Schale wurde dann luftgetrocknet, und 20-µl-Proben von Rinderseren, ver dünnt wie in Tabelle II angegeben, wurden zu den mar kierten Tupfen hinzugefügt. Nach 60 Minuten bei 37°C wurde die Schale gespült und getrocknet wie zuvor, und jeder Tupfen erhielt 20 µl einer Detektorsuspension. Die Detektorsuspension bestand aus den genetisch modi fizierten Staphylokokkenzellen von Beispiel 4, suspen diert in PBS mit einer optischen Dichte, die 200 Klett- Einheiten entspricht. Nach Spülung und Lufttrocknung wurde die β -Laktamase-Aktivität der auf den Tupfen zu rückgehaltenen Detektorzellen überprüft, indem auf je den Tupfen ein Entwicklerstreifen gelegt wurde. Der Entwicklerstreifen war ein Abschnitt (12 × 15 mm) von Whatman Nr. 3 Filterpapier, das mit einer Reagenzlösung imprägniert worden war, die Jod (12 mM), Kaliumjodid (63 mM), lösliche Stärke (1,0% w/v) und Penicillin (50 mM) in PBS enthielt. Die Aktivität des Markerenzyms der Detektorzellen, nämlich β -Laktamase, wurde untersucht, indem die Zeit bestimmt wurde, die zum Erscheinen eines weißen Kreises im Zentrum des blau-schwarzen Detektor streifens notwendig war. Der weiße Kreis zeigt an, daß Jod von Penicillin-Säure aufgenommen und so aus dem Komplex, der die dunkle Farbe des Detektorstreifens ergab, entfernt worden war. Die Penicillin-Säure ist das Hydrolyse-Produkt eines β -Laktams (hier Penicil lin), katalysiert von β -Laktamase. Daher ist die Ent färbungsgeschwindigkeit des Kreisbereiches über dem markierten Tupfen umgekehrt proportional zur auf dem Tupfen zurückgehaltenen Menge an β -Laktamase.

Tabelle II

Die in der vorstehenden Beschreibung sowie den Ansprü chen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

Claims

1. Immunoassay-Reagenz zum Binden und zum Nachweis von Antikörpern, gekennzeichnet durch einen Gehalt an nichtlebensfähigen stabilisierten bakteriellen Zellen mit einem aktiven Rezeptor für Immunoglobulin und einem aktiven Marker-Enzym.

2. Reagenz nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Gehalt an nichtlebensfähigen stabilisierten Staphy lokokkenzellen.

3. Reagenz nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Gehalt an nichtlebensfähigen stabilisierten Strepto kokkenzellen.

4. Test-Kit für Enzym-Immunoassays, gekennzeichnet durch einen oder mehrere Behälter, die eine wäßrige Suspension von nichtlebensfähigen stabilisierten bak teriellen Zellen mit einem aktiven Rezeptor für Immu noglobulin und einem aktiven Marker-Enzym oder ein sta bilisiertes Trockenpräparat solcher Zellen, die für ei ne in-situ-Rekonstitution geeignet sind, enthalten.

5. Test-Kit nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen ein Cowan-I-Stamm von Staphylokokkus-au reus-Zellen sind, die ein Gen für die Bildung von β-Lactamase enthalten, wobei das Gen für dieses Enzym in eine Mutterzelle eingesetzt worden ist.

6. Test-Kit nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Zellen des Gruppe-G-Streptokokken-Stam mes G 140 sind.

7. Test-Kit nach einem der Ansprüche 4 bis 6, gekenn zeichnet durch einen oder mehrere feste Träger, wobei auf wenigstens einem Teil von deren Oberfläche ein Einfang-Antikörper oder ein Hapten oder Antigen, das spezifisch für den Antikörper ist, der untersucht wer den soll, fixiert ist.

8. Test-Kit nach einem der Ansprüche 4 bis 7, gekenn zeichnet durch einen oder mehreren Behälter, die stan dardisierte Lösungen eines für das Hapten oder Antigen, das untersucht werden soll, spezifischen Antikörpers enthalten.

9. Test-Kit nach einem der Ansprüche 4 bis 8, gekennzeichnet durch einen Absorptionsmittelträger, der ein für das Marker-Enzym spezifisches Reagenz enthält.

10. Heterogenes spezifisches Bindungsassay-Verfahren zur Bestimmung eines nichtgebundenen Antikörpers in einem flüssigen Medium, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

i) Inkubieren einer Probe des flüssigen Medi ums in Kontakt mit einem festen Träger, auf dessen Oberfläche ein Antigen oder Hapten be festigt ist, das für den Antikörper spezifisch ist;
ii) Abtrennen des festen Trägers von der Pro be des flüssigen Mediums und Spülen desselben mit einer wäßrigen Lösung, um alle Spuren der Probe zu entfernen;
iii) Inkubieren des festen Trägers in Kontakt mit einer wäßrigen Suspension nicht lebensfähigen stabilisierten bakteriellen Zel len mit einem aktiven Rezeptor für Immunoglo bulin und einem aktiven Marker-Enzym;
iv) Abtrennen des festen Trägers von der Sus pension und Waschen desselben mit einer wäß rigen Lösung; und
v) Inkubieren des festen Trägers in Kontakt mit einem geeigneten Substrat und Untersuchen auf enzymatische Aktivität des Marker-Enzyms auf Zellen, die auf der Oberfläche des festen Trägers erhalten geblieben sind.

11. Verfahren nach Anspruch 10, angepaßt zur Bestim mung eines Haptens oder Antigens in einem flüssigen Medium, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Oberfläche des festen Trägers dasselbe Hapten oder Antigen, das untersucht werden soll, fixiert ist und daß in Schritt (i) ein für das Hapten oder Antigen spezifischer Anti körper der Testprobe hinzugefügt wird und, als Ergebnis der Bindung des Haptens oder Antigens in der Probe, die Menge an Antikörper, die für die Bindung des Haptens oder Antigens, das auf der festen Oberfläche fixiert ist, zur Verfügung steht, proportional verringert wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch ge kennzeichnet, daß die wäßrige Suspension Staphylokok kenzellen enthält, die durch Behandlung mit Wärme und Formaldehyd stabilisiert sind, um ihre Bindungsfähig keit und die Aktivität des Marker-Enzmys zu erhalten.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Marker-Enzym eine endogene Katalase ist und daß die Katalase-Aktivität der Staphylokokkenzellen unter sucht wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, da durch gekennzeichnet, daß der feste Träger mit einer wäßrigen Suspension von nichtlebensfähigen stabili sierten Staphylokokkenzellen mit einem aktiven Rezeptor für Immunoglobulin und einem aktiven Marker-Enzym inku biert wird, wobei das Gen dieses Enzyms in eine Mutter zelle eingesetzt worden ist.

15. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch ge kennzeichnet, daß die wäßrige Suspension stabilisierte Streptokokkenzellen enthält.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Marker-Enzym endogenes Hämolysin ist und daß die Hämolysin-Aktivität der Streptokokkenzellen unter sucht wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, da durch gekennzeichnet, daß die wäßrige Suspension einen Cowan-I-Stamm von Staphylokokkus aureus enthält, der ein Gen zur Bildung von β -Lactamase enthält, wobei das Gen für dieses Enzym in eine Mutterzelle eingesetzt worden ist.