DE2943648C2

DE2943648C2 - Spezifische Bindungs-Untersuchungsmethode zur Bestimmung einer Vielzahl von verschiedenen Liganden in einer einzigen Flüssigkeitsprobe

Info

Publication number: DE2943648C2
Application number: DE2943648A
Authority: DE
Inventors: Zohar Jerusalem Ben-Moyal; Bertold Fridlender; Udi Ramat-Gan Olshevsky; Regine Jerusalem Tirosh
Original assignee: AMES-YISSUM Ltd JERUSALAJIM IL; Ames Yissum Ltd
Current assignee: AMES-YISSUM Ltd JERUSALAJIM IL; Ames Yissum Ltd
Priority date: 1978-10-30
Filing date: 1979-10-29
Publication date: 1982-10-21
Also published as: AU519877B2; FR2440556B1; NL7907939A; GB2034466B; DE2943648A1; US4315907A; JPS5585252A; FR2440556A1; GB2034466A; SE7908936L; AU5218679A; IL55816A0; CA1128856A; IT7950687A0; IL55816A

Description

Bei üblichen spezifischen Bindungs-Untersuchungsmethoden wird die Testprobe mit einem Reagens verschiedener Zusammensetzungen vereint wobei das Reagens ein markiertes Bindungsmittel mit einer überwachbaren Markierungskompcnente und einer Bindungskomponente, die mit gegebenenfalls vorhandenen anderen Bestandteilen des Reagenses unter Bildung eines Bindungsreaktionssystems reagiert unter Ausbildung von zwei Spezies oder Formen des markierten Konjugats, nämlich einer gebundenen Spezies und einer freien Spezies, ist Die relativen Mengen oder Anteile des markierten Konjugats in der gebundenen Spezies, verglichen zu denen in der freien Spezies sind eine Funktion der Anwesenheit oder der Mengen des in der Probe nachzuweisenden Liganden. Durch radioaktiv markierte Substanzen wird eine hohe Nachweisempfindlichkeit ermöglicht Eine ausführliche Diskussion von RAI (Radioimmunoassays) findet sich in »Angew. Chem.« 88. Jahrg. 1976/Nr. 17, S. 565 bis 573. · Es sind Versuche gemacht worden, kombinierte heterogene spezifische Bindungs-Untersuchungsmethoden zu entwickeln, bei denen eine Vielzahl von Liganden gleichzeitig in einer einzigen Probe bestimmt werden kann. Solche kombinierten Untersuchungsmethoden würden zeit- und kostensparend gegenüber Untersuchungen der jeweils individuellen Verbindungen sein und wurden für die Untersuchung auch geringere Probemenger. benötigen, was von Bedeutung ist wenn es sich bei der Probe um Körperflüssigkeit, wie Serum, handelt. Kombinierte Untersuchungen sind besonders vorteilhaft für Reihenuntersuchungen. Ein Beispiel hier wäre die Diagnose der Immunität von Frauen gegenüber Viren oder anderen Antigenen, die für angeborene Mißbildungen verantwortlich sind, wie Rubella, Cytomegalovirus, Herpes Simplex-Virus und dem Parasit Toxoplasma. Bei einer kombinierten Untersuchung könnte die Immunität des Patienten gegenüber zwei oder mehreren dieser Antigene, angezeigt durch die Gegenwart von Antikörpern, gegen solche Antigene in dem Serum des Patienten in einer einzigen Untersuchung und unter Verwendung einer so einzigen Serumprobe bestimmt werden. Solche kombinierten Tests könnte man in großem Umfang für immunologische Untersuchungen bei Frauen anwenden, z. B. zum frühestmöglichen Zeitpunkt während der Schwangerschaft oder bei schon sehr fortgeschrittener Schwangerschaft und außerdem auch bei Untersuchungen der Mutter und des Kindes nach der Entbindung. Solche Immunodiagnose-Tests sind bisher getrennt durchgeführt worden im Hinblick auf die vorerwähnten Antigene, wobei man für jede Untersuchung eine besondere Probe des Serums benötigte.

Eine Reihe von Immunodiagnose-Tests ist für den getrennten Nachweis und die serologische Bestimmung von Rubella-Virus spezifischen Antikörpern und Cytomegalovirus (nachfolgend CMV bezeichnet) spezifisehen Antikörpern, einschließlich RIA und Enzym-Im- munoassay (EIA)-Versuchen beschrieben worden. Voller und Bidwell [Br. J. Exp. Path. 56:338 (1975) und 57:243 (1976)] wendeten ein Enzym-gebundenes Immunosor-

bents-Untersuchungsverfahren für die getrennte Bestimmung von Antikörpern gegenüber Rubella und CMV an. Bei diesem Verfahren wurden Polystyrol-Mikroplatten, die mit Rubella-Antigen beschichtet waren, mit Humanserum, enthaltend Rubella-Antikörper, inkubiert und danach wurde mit Anti-(Humanglobulin), markiert mit alkalischer Phosphatase, inkubiert Die Aktivität des gebundenen Enzyms wurde colorimetrisch gemessen.

In US-PS 40 16 043 wird die Bestimmung von Rubella-Antikörpern beschrieben, indem man auf eine Mikrotiterplatte, die mit Rubella-Antigen beschichtet - ist, ein sogenanntes »Sandwich«, bestehend aus der nachfolgenden Sequenz von Schichten: (festes virales Antigen)- Antikörper-(Viralantigen-Enzym) bildet.

Kirsti et al. [J. CHn. Microbiol. 4:117 (1976)] beschreiben ein indirektes Festphasen RIA-Verfahren zur Bestimmung von Rubella-Virus-spezifischen Antikörpern (IgG und IgM) in Humanserum. Gereinigter Rubella-Virus wurde auf Polystyrolkugeln absorbiert und die Antikörper, die an den Virus nach Inkubierung mit dem Serum gebunden waren, wurden durch eine anschließende Bindung von ^l25J-markierten AnIi-(Human-lgM) oder Anti-(Human-lgG) nachgewiesen. In ähnlicher Weise verwendete Forghani et al. [J. CHn. Microbiol. 4:479 (1976)] fixierte Virus-infizierte Zellen als Quelle des Antigens zum Bindjn der Antikörper in den untersuchten Sera, wobei ¹²⁵J-Ziegen-Anti-(Human-IgG) zur Bestimmung des spezifischen Antikörpers (einschließlich Rubellla-Antikörper), welcher an dem Antigen anhaftete, verwendet wurde. Ähnliche indirekte Festphasen-RIA-Versuche für CMV-Antikörper sind kürzlich von Forghani et al. [Infect und Immunity 14:1184 (1976)] und Knez et al. [J. Immunol. 117:2006 (1976)] beschrieben worden, wobei letzterer CMV-infizierte Zellen als Quellen des Antigens verwendete und der andere virallösliches Antigen fixiert an Mikrotiterplatlen. In beiden Fällen wurde ^l25J-Anti-(Human-Globulin) zum Nachweis des gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes verwendet

Aus DE-OS 28 01 026 ist ein Formstück, das mit Antikörpern, Enzymen, anderen Proteinen, Antigenen oder Haptenen bedeckt ist und in das Innere eines Reagenzglases paßt, bekannt Das Reagenzglas mit dem in der vorstehenden Weise beschichteten Formstück kann dann für eine Vielzahl von analytischen Verfahren, abhängig von dem auf dem Formstück aufgetragenen Material eingesetzt werden. Besteht der Überzug beispielsweise aus Antikörpern, so kann das Reagenzglas dann für Immunoassays, einschließlich Radioimmu- noassays verwendet werden. Dabei ist der Hauptvorteil, der durch die Verwendung des beschichteten Formstükkes eintritt, darin zu sehen, daß man nicht mehr das Reagenzglas selbst mit einem Überzug versehen muß, sondern diesen Überzug eben auf das Formstück aufgebracht in das Reagenzglas einbringen kann. Es wird dort dargelegt, daß man zwei gleiche oder verschiedene Ringe in ein Reagenzglas einbringen kann. Die in der Flüssigkeit enthaltenen Substanzen können dann zunächst mit den Substanzen auf einem Ring eo reagieren und dann, nachdem man das Reagenzglas umgedreht hat, mit den Substanzen auf den anderen Ring. Dabei wird nicht zwischen den Substanzen, die auf den beiden Ringen aufgetragen sein können, d. h. nicht darin, ob die Bedeckung aus Antikörpern, anderen Proteinen, Antigenen oder Haptenen besteht, unterschieden. Deshalb kann man der DE-OS 28 01 026 nicht entnehmen, ob die Autoren eine Vielfach-Immunoassay oder mehrfache Analysen anderer Art, z. B. enzymatischer Analysen beabsichtigte. Die Lehre erschöpft sich einfach darin, daß man gewisse Reagenzien auf einen Ring und andere Reagenzien auf den anderen Ring aufbringen kann, und daß die Lösung in dem Reagenzglas dann mit diesen Reagenzien jeweils die beabsichtigte Reaktion eingeht

Bei all diesen vorerwähnten Untersuchungen sind getrennte Testvorrichtungen und getrennte Untersuchungsverfahren zur Bestimmung des einzelnen Antikörpers erforderlich.

In den US-Patentschriften 37 20 760 und 39 52 091 werden gleichzeitige multiple Radioimmunoassays beschrieben, mittels welcher man qualitativ die Gegenwart von 1 oder mehreren spezifischen Gruppen von Antikörpern erkennen kann. Diese Untersuchung ergibt aber nur ein einfaches »Ja/Nein«-Ergebnis, denn die Untersuchung kann nicht ein Antigen von einem anderen unterscheiden und kann deshalb keinerlei quantitative Ergebnisse liefern. Ist der Test positiv, dann müssen getrennte Untersuchungen durchgeführt werden, um festzustellen, welches jeweilige Antigen oder welche Antigene nun tatsächlich vorhanden sind (siehe insbesondere Spalte 4, Zeilen 46 bis 64 in US-PS 37 20 760, und Spalte 1, Zeilen 49 bis 53 in US-PS 39 52091).

In US-PS 39 28 553 und Acta Endocrinol.81:487-497 (1976) wird für die Thyroidhormone T-3 und T-4 eine kombinierte spezifische Bindungsuntersuchung für verwandte Haptene beschrieben, bei welcher man verschiedene Markierung für jedes der zu bestimmenden Haptene verwendet, und in der DE-OS 28 03 154 werden solche Versuche für Vitamin B-12 und Folate beschrieben. Für jedes der zu untersuchenden Haptene wird eine unterschiedliche Markierungsart verwendet, nämlich ¹²⁵J und ¹³¹J- Solche Untersuchungen haben den entscheidenden Nachteil, daß man getrennte oder mehrere Instrumente zum Messen der verschiedenen unterschiedlichen Markierungen benötigt. Es wäre darum sehr wünschenswert, eine kombinierte Unlersuchungsmethode zu haben, bei welcher man die gleiche Markierung für alle zu untersuchenden Liganden verwenden könnte.

Habcrmann et al. beschreibt in J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 14:494-601 (1976) ein kombiniertes RIA-Verfahren für T-3 und T-4 unter Verwendung der gleichen Markierung (¹²⁵J), aber hier ist eine sehr komplizierte Folge von Trennstufen erforderlich, um durch Säulenchromatographie das markierte T-3 von dem markierten T-4 zu trennen.

Die Erfindung betrifft eine spezifische Bindungs-Untersuchungsmethode zur Bestimmung einer Vielzahl von verschiedenen Liganden in einer einzigen Flüssigkeitsprobe, bei welcher man

(a) die Probe mit Reagenzien, einschließlich einem markierten Bindungsmittel und einem Festphasenbindungsmittel, kombiniert und mit dem Liganden ein Bindungsreaktionssystem mit einer Festphasengebundenen Spezies und einer freien Spezies des markierten Bindungsmittels ausbildet, wobei die Menge der Markierung in jeder der entstandenen Festphasen-gebundenen Spezies einer Funktion der Gegenwart oder der Menge des entsprechenden Liganden in der Probe ist,

(b) die Festphasen-gebundenen Spezies von den freien Spezies abtrennt und

(c) die Menge der Markierung in den abgetrennten Festphasen-gebundenen Spezies mißt.

' die dadurch gekennzeichnet ist, daß man

(d) die Probe mit Reagenzien für die jeweils verschiedenen zu bestimmenden Liganden unter Bildung eines einzigen, ungeteilten Reaktionsgemisches in Berührung bringt, wobei die Markierung für alle markierten Bindungsmittel ic den verschiedenen mit der Probe kombinierten Reagenzien gleich ist, und das Festphasenbindungsmittel für die verschiedenen zu bestimmenden Liganden differeiizierbar von den anderen Festphasenbindungsmitteln für die anderen zu bestimmenden Liganden abtrennbar ist, und daß

(e) jede gebildete Festphasen-gebundene Spezies von der oder den anderen gebildeten Festphasen-gebundenen Spezies und von allen restlichen freien Spezies abgetrennt wird und die Menge der Markierung in jeder der so abgetrennten Festphasen-gebundenen Spezies gemessen wird.

Erfindungsgemäß ist somit eine kombinierte heterogene spezifische Bindungs-Untersuchungsmethode unter Verwendung der gleichen Markierung für alle zu bestimmenden Liganden gleichzeitig in einer einzigen Probe möglich, indem man unterschiedlich abtrennbare Festphasen-Bindungsmittel, entsprechend jedem einzelnen Liganden, anwendet .

Bei Beendigung der Untersuchungsmethode wird jede jeweilige Festphase von der anderen (und von den zurückbleibenden Flüssigphasen-markierten Bindungsmitteln) getrennt, und die in jeder Festphase gemessene Markierung ist eine Funktion der Gegenwart oder der Menge des jeweiligen Liganden in der Probe.

Das markierte Bindungsmittel liegt vorzugsweise in Form eines markierten Bindungspartners für alle der zu untersuchenden Liganden vor, so daß es sich in gleicher Weise an alle Liganden bindet. Unter Verwendung eines solchen bevorzugten markierten Bindungsmittels werden die Komplexe, die durch Binden der verschiedenen Liganden an ihre jeweiligen Festphasen-Bindungsmittel unterschiedlos durch das Binden des markierten Bindungsmittels markiert Dies wird nachfolgend «o dargestellt, wobei Li. L₂ ... L_n die Vielzahl der verschiedenen nachzuweisenden Liganden sind, l·— Bi, (— B₂, ... I—B_n, die entsprechenden Festphasen-Bindungsmittel darstellen, und BA* das markierte Bindungsmittel ist welches in der Lage ist, sich an alle Li bis L_nZU binden.

Komplexbildungs-Reaktionen

Markierungs-Reaktionen

L₁+I-B₁-I-B, -L, - +BA*-^r-B₁-L₁-BA* L₂+H-B₂-H B₂-L₂- +BA* -1-B₂-Iw₇-BA*

L„+l- B_n-HB_n-L_n- +BA*-KB_n-L_n-BA*

50

55

Nach einer bevorzugten Verfahrensweise ist nicht nur eine kombinierte Bestimmung unter Verwendung einer einzigen Art von Markierung (durch ein * in der obigen Beschreibung gekennzeichnet) möglich, sondern es wird auch ein einziger Typ des markierten Bindungsmittels verwendet (BA*), unabhängig von der Anzahl der verschiedenen zu bestimmenden oder nachzuweisenden Liganden.

Diese Methode ist besonders geeignet zur gleichzeitigen Bestimmung einer Vielzahl von unterschiedlichen Antikörpern in einer einzigen Probe mittels einer indirekten Festphasen-Technik, wie sie zuvor beschrieben wurde. Unter verschiedenen Antikörpern werden Antikörper gegenüber verschiedenen Antigenen (z. B. Antikörper gegen CMV-Antigen und Antikörper gegen Rubella-Antigen) verstanden. Eine solche bevorzugte kombinierte indirekte Festphasen-Aniikörper-Untersuchungsmethode schließt die Stufen ein:

a) Vereinigen der Probe mit einer V^:elzahl unterschiedlich abtrennbarer Festphaser-Träger, von denen jeder ein Antigen spezifisch für jeweils einen der nachzuweisenden Antikörper gebunden hat, wodurch jeder der verschiedenen in der Probe vorhandenen Antikörper an den jeweiligen verschieden abtrennbaren Festphasen-Träger durch Bindung an das spezifische, an diesen Träger gebundene Antigen gebunden wird, und dadurch einen Festphasen-Träger-gebundenen Antikörper-Komplex bildet,

b) Vereinigen des erhaltenen Festphasen-Träger-gebundenen Antikörper-Komplexes mit einem Antikörper, der eine Markierung enthält und in der Lage ist, sich in allen der Vielzahl der verschiedenen nachzuweisenden Antikörper zu binden, wodurch der Festphasen-Träger-gebundene Antikörper-Komplex an den markierten Antikörper gebunden ist

c) Abtrennen der unterschiedlich abtrennbaren Festphasen-Träger von den anderen Trägern und von allen nicht an irgendeinen der Träger gebundenen Antikörper, und

d) Messen der jeweiligen Menge der Markierung, die an den jeweils abgetrennten Festphasen-Träger gebunden ist.

Die Erfindung schließt auch ein Testmittel zur Durchführung des Verfahrens, enthaltend als Reagenzien für die verschiedenen nachzuweisenden Liganden ein markiertes Bindungsmittel und ein Festphasenbindungsmittel, ein, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Markierung in allen markierten Bindungsmitteln die gleiche ist und das Festphasenbindungsmittel für die verschiedenen zu bestimmenden Liganden differenziert abtrennbar von den anderen Festphasenbindungsmitteln für die anderen zu bestimmenden Liganden ist.

Es gibt eine Reihe von Methoden für die Herstellung der unterschiedlich abtrennbaren Festphasen-Bindungsmittel gemäß der vorliegenden Erfindung. Zum Beispiel kann jedes jeweilige Festphasen-Bindungsmittel aus einem einzigen, zusammenhängenden Festphasen-Träger, welcher das Bindungsmittel daran gebunden enthält, bestehen. Solche Festphasen-Träger, die beim erfindungsgemäßen Verfahren angewendet werden können, sollen im wesentlichen fest sein und eine geeignete Form haben, z. B. kugelig, rohrförmig, stabförmig oder streifenförmig. Die Trägerkörper sollen aus einem Material bestehen, das mit dem Bindungsmittel entsprechend den nachzuweisenden Liganden beschichtet werden kann, und der Überzug kann nach allen bekannten kovalenten oder nichtkovalenten Verfahren erfolgen. Bevorzugte Trägerkörper für die vorliegende Erfindung sind Polystyrolrohre, -kugeln oder -streifen; diese Kugeln oder Streifen sollen vorzugsweise eine Größe haben, daß sie in Reagenzgläsern üblicher Art, wie sie für lmmunoassay-Untersuchungen verwendet werden (etwa 75 mm Länge und 12 mm Durchmesser) passen. Die für jede Bestimmung

zu verwendenden Trägerkörper müssen untereinander unterscheidbar sein, damit man das mit jedem der jeweiligen Trägerkörper assoziierte spezifische Bindungsmittel identifizieren kann. Dies kann man dadurch erreichen, daß man die Trägerkörper unterschiedlich hinsichtlich der Form, der Größe und/oder der Farbe ausbildet.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung dient das Gefäß (z. B. ein Reagenzglas), in welches die Probe inkubiert wird, als einer der Trägerkörper, der mit dem Bindungsmittel beschichtet ist. Gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform wird die Innenoberfläche des Gefäßes oder der Teil davon, der mit der Probe in Berührung kommt, in bekannter Weise mit einem der Bindungsmittel, die spezifisch gegenüber dem zu untersuchenden Liganden sind, beschichtet. In solchen Fällen, bei denen die Verfahrensweise für die gleichzeitige Bestimmung von nur zwei Liganden gedacht ist, kann das zweite Bindungsmittel (das gegenüber dem zweiten Liganden spezifisch ist) auf Polystyrolkugeln beschichtet sein, die hintereinander in das Gefäß gebracht werden, und die Kugeln brauchen dann keine besondere Identifizierung zu tragen. Um weitere Liganden in die Untersuchungsmethode einzuschließen, würde man unterscheidbare Trägerkörper für die entsprechenden zusätzlichen, benötigten Bindungsmittel auswählen. Solche zusätzlichen Träger können von unterscheidbarer Form, Größe oder Farbe sein, und die Größe sollte so sein, daß sie das Volumen innerhalb des Reagenzglases, das in Berührung mit der flüssigen Reaktionsmischung steht, auszufüllen in der Lage sind.

In der letzten Stufe der vorliegenden Methode werden die Trägerkörper, an welche die markierten Komplexe gebunden sind, voneinander getrennt und die physikalischen oder chemischen Eigenschaften (d. h. die Radioaktivität oder die enzymatische Aktivität) der Markierung, die mit jedem der Trägerkörper assoziiert ist wird getrennt in bekannter Weise gemessen. Die dabei erhaltenen Werte kann man mit entsprechenden Werten, die man aus bekannten positiven oder negativen Kontrollproben erhalten hat, die den spezifischen zu untersuchenden Liganden enthalten (positiv) oder nicht enthalten (negativ), vergleichen unter sonst identischen Verfahrensbedingungen. Das Verhältnis der Markierungsmessung bei der zu untersuchenden Probe zu dem der Kontrollprobe kann als Maß der Menge des spezifischen, in der zu untersuchenden Probe enthaltenen Liganden dienen. _v

Die Untersuchungsmethode ist zum Nachweis aller Liganden, für die es einen spezifischen Bindungspartner gibt anwendbar. Der Ligand ist im allgemeinen ein Peptid, Protein, Kohlehydrat Glycoproteän, Steroid oder ein anderes organisches Molekül, für den spezifische Bindungspartner in biologischen Systemen vorhanden sind oder synthetisiert werden können. Beispiele für Liganden sind immunologisch aktive Polypeptide und Proteine mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 4 000 000, wie Antikörper und antigenische Polypeptide und Proteine sowie Haptene mit Molekulargewichten zwischen 100 und 1500. Typische antigenische Polypeptide sind Angiotensin I und II, C-Peptide, Oxytocin, Vasopressin, Neurophysin, Gastrin, Secretin und Glucagone

Typische antigenische Proteine sind Insulin, chorionisches Gonadotropin (ζ. Β. HCG), carcinoembryonisches Antigen (CEA), Myoglobin, Hämoglobin, foHikelstimulierendes Hormon, menschliches Wachstumshormon, thyroidstimulierendes Hormon (TSH), humanes Placentalactogen, thyrocines Bindungsglobulin (TBG), Intrinsicfaktor, Transcobalamin, Enzyme wie alkalische Phosphatase und Milchsäuredehydrogenase und hepatitisassoziierte Antigene, wie Hepatitis B- Oberflächen-■5 Antigen (GB_sAg), Hepatitis-B-e-Antigen (HB₀Ag) und Hepatilis-B-Kern-Antigen (HB_cAg). Typische Antikörperliganden sind solche Antikörper von IgG, IgE, IgM und IgA, die spezifisch für alle der hier beschriebenen Antigene oder Haptene sind. Die Klasse der Haptenliganden besteht beispielsweise aus Thyroxin, Liothyronin und Östrogenen, wie östriol, Prostaglandine, Vitamine, wie Biotin, Vitamin Bl2, Folsäure, Vitamin E, Vitamin A und Ascorbinsäure (Vitamin C) und Arzneimittel. Die Erfindung ist besonders geeignet zur Bestimmung von Antikörpern zu viralen Antigenen wie Rubella und CMV.

Man kann davon ausgehen, daß jeder Typ einer Markierung, wie er zur Zeit bekannt ist, oder wie er noch entwickelt wird, und in spezifischen Bindungs-Untersuchungen angewendet wird, auch für die vorliegende Erfindung geeignet ist Bevorzugte Markierungen unter Berücksichtigung des derzeitigen Standes der Technik sind radioaktive Isotope (z. B. ¹²⁵J) und Enzyme (z. B. Phospha'ase). Alle anderen Parameter der

Untersuchungsmethode sind dem Fachmann bekannt. Dazu gehören insbesondere die zulässigen und bevorzugten Volumina und Verdünnungen der Proben, die Inkubationszeiten und -temperaturen, die Verfahren zum Assoziieren der jeweiligen Bindungsmittel mit den Festphasen-Trägern durch entweder kovalente oder nichtkovalente Bindung, Verfahren und Instrumentation zum Messen der Markierung und Methoden zum Vergleich der Untersuchungsergebnisse mit Standardwerten.

Die Reagens- oder Testmittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens enthalten alle die wesentlichen chemischen Elemente, die zur Durchführung der jeweiligen gewünschten Untersuchungsmethode benötigt werden. Diese Testmittel liegen in einer handelsfertigen, verpackten Form entweder als Zusammensetzung oder Mischung, sofern die Reagenzien miteinander verträglich sind, oder als em Kit in einer kombinierten Form, in welcher die Behälter mit den benötigten Reagenzien zusammen vorhanden sind, vor.

Das Testmittel enthält Reagenzien für die verschiedenen nachzuweisenden '.iganden, wobei jedes der Reagenzien ein markiertes Bindungsmittel und ein unterschiedlich abtrennbares Festphasen-Bindungsmittel der vorher erwähnten Art einschließt und mit dem

so entsprechenden nachzuweisenden Liganden ein Bindungsreaktions-System ausbildet in dem eine Festphasen-gebundene Spezies und eine freie Spezies der vorher beschriebenen Art vorliegt Wenn, gemäß einer bevorzugten Ausführungsform z. B. bei der kombinierten indirekten Festphasen-Methode das markierte Bindungsmittel in Form eines markierten Bindungspartners für alle der nachzuweisenden Liganden vorliegt dann benötigt man offensichtlich nur ein markiertes Bindungsmittel für alle die jeweiligen Reagenzien. In einem solchen Falle besteht das Testmittel aus einem einzigen markierten Bindungsmittel und unterschiedlich abtrennbaren Festphasen-Bindungsmitteln für alle die zu untersuchenden Liganden. Bei allen Ausführungsformen können selbstverständlich die Testmittel andere Reagenzien, wie sie aus dem Stande der Technik bekannt sind, und wie sie aus technischen und anwendungstechnischen Gründen wünschenswert sein können, einschließen, z.B. Puffer, Verdünnungsmittel,

230242/554

Standards und dergleichen.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher erläutert.

Tabelle für den Inhalt der jeweiligen Beispiele

Beispiel 1 Herstellung von löslichem CMV-Antigen Beispiel 2 Herstellung von löslichem Rubella-Antigen Beispiel 3 Herstellung von Festphasen-fbeschichietes

Reagenzglas)CM V-A η tigen Beispiel 4 Herstellung von Festphasen-ibeschichtete

Kugeln)Rubella-Antigen Beispiel 5 Herstellung von radiomarkiertem (¹²⁵J)-Ka-

ninchen-Anti-Human IgG Beispiele Bestimmung von CMV und Rubella-Anti-

körpertittern durch getrennte Radioimmu-

noassays
Beispiel 7 Kombinierte Radioimmunoassays für

CMV- und Rubella-Antikörper

Beispiel 8 Bestimmung von CMV- und Rubella-Antikörper durch getrennte Enzym-Immunoas-

says
Beispiel 9 Kombinierte Enzym-Immunoassays für

CMV- und Rubella-Antikörper

Beispiel 1

Herstellung von löslichem CMV-Antigen

Humane, primäre embrionale Fibroblaste wurden als Monoschichten in Schüttelflaschen, die ein Minimum des erforderlichen Mediums und 10% fötales Kalbsserum enthielten, gezüchtet. Die Zellen wurden mit CMV AD-169-Stamm (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA) mit einer Vielzahl von Infektionen von einer PIaque-bildenden Einheit (pfu) pro Zelle infiziert Nach Beendigung des cytophatischen Effektes wurden die Schüttelflaschen mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) enthaltend 0,8% Natriumchlorid, 0,02% Kaliumchlorid, 0,115% dibasisches Natriumphosphat (Na₂HPO₄-12 H₂O) und 0,02% monobasisches Kaliumphosphat (KH₂PO₄) gewaschen und die Zellen wurden vom Glas mit Glasstäben abgeschabt und anschließend durch Zentrifugieren mit 30Ox g während 10 Minuten peüetisiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt und die ausgefallenen Pellets (Stückchen) der Zellen wurden in 10 ml Glycinpuffer (enthaltend 0,85% Natriumchlorid und 0,05m Glycin wieder suspendiert; dabei wurde der pH mittels Natriumhydroxid auf 9,0 eingestellt).

Die Zellsuspension wurde 2 Minuten beschallt und anschließend über Nacht bei 4° C stehengelassen. Die Suspension wurde durch Zentrifugieren mit 7700 χ g während 30 Minuten geklärt, wobei das lösliche Antigen in der überstehenden Lösung zurückblieb. Dieses lösliche Antigen wurde bei - 70⁰C aufbewahrt.

Beispiel 2 Herstellung von löslichem Rubella-Antigen

Babyhamsternieren-21-C13-ZeHen wurden in Schüttelflaschen, enthaltend Dulbecos-modifiziertes Medium (DMEM) und 10% fötales Kalbsserum, gezüchtet und mit Rubella-Virus M-33-Stamm (American Type Culture Collection) infiziert 48 h nach der Infektion wurden die Flaschen täglich während einer Woche abgeerntet Zell-Debris wurde durch Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit entfernt Virales Antigen wurde durch Zentrifugieren bei 50 000 χ g während 1 h durch eine Schicht aus 20 Gew.-% Saccharose in TNE-Puffer (enthaltend 20 mMol (mM) lris-(Hydroxymethyl)aminomethan, 100 mMol Natriumchlorid und 1 mMol Äthylendiamintetraessigsäure; pH 7,4) pelletisiert Die so gebildeten Pellets wurden in TNE-Puffer nochmals suspendiert und die Suspension wurde beschallt bis sie klar war. Die resuspendierten Pellets wurden weiter in einem 20- bis 60%igem W/W-Saccharose-Gradienten in TNE-Puffer durch Zentrifugieren mit 38 000UpM während 2 h gereinigt. Die erhaltene virale Schicht

ίο wurde abgesondert und dialysiert während 4 h bei 4°C gegen Glycin-gepuffcrte Kochsalzlösung, pH 9 (beschrieben in Beispiel 1). Anschließend wurde bis zu einer Endkonzentration von 5% Glycerin zugegeben. Diese Rubella-Antigen-Lösung wurde in gefrorenem Zustand bei -70⁰C gelagert.

Bei s Diel 3

Herstellung von Festphasen(beschichtetes
Reagenzglas)CMV-Antigen

Das in Beispiel 1 erhaltene CMV-lösliche Antigen wurde mit Glycin-Puffer (beschrieben in Beispiel 1) bis zu einer Konzentration von 100 bis 150μg/ml des Proteins und einem Komplement-Fixierungstiter von 1/4 bis 1/8 verdünnt. Aliquote (0,2 ml) dieser Lösung wurden ganz genau und sorgfältig auf dem Boden eines 12x75-mm-PoIystyrolreagenzglases pipettiert und die Reagenzgläser wurden 16 h bei 4°C inkubiert Nach Beendigung der Inkubation wurde die in den Reagenzgläsern zurückbleibende Flüssigkeit entfernt und die Reagenzgläser wurden in einem Luftstrom getrocknet und mit Folie verschlossen und bei 4°C aufbewahrt

Beispiel 4

Herstellung von Festphasen(beschichtete Kugeln)-Rubella-Antigen

Die optimale Verdünnung des zu verwenden Rubella-Antigens zum Beschichten von Polystyrolkugeln wurde bestimmt, indem man Polystyrolreagenzgläser der in Beispiel 3 beschriebenen Art mit einer Reihe von Rubella-Antigen-Verdünnungen im Bereich von 1 :8 bis 1 :8000 beschichtete unter Verwendung von 0,2 ml der verdünnten Antigenlösung in jedem der Reagenzgläser.

Jedes der beschichteten Gläser wurde dann mit 0,2 ml serumenthaltendem Rubella-Antikörper, verdünnt 1 :100 in PBS und enthaltend 1% Rinderserumalbumin (BSA) inkubiert. Anschließend wurde zu jedem der Reagenzgläser ^l25J-markiertes Antihuman IgG (nachfolgendes Beispiel 5) zugegeben und darin inkubiert Nach Abtrennen der Flüssigkeit und Waschen wurde die in jedem der Reagenzgläser zurückgehaltene Radioaktivität gemessen. Auf diese Weise stellte man die Größenordnung, bei welcher man die höchste Btndungskapazität für Rubella-Antikörper erhielt fest Die Reagenzgläser sollten mit Rubella-Antigen-Lösung einer Verdünnung von etwa 1:150 bis 1:300 in Glycin- Puffer beschichtet werden.

Polystyrolkugeln mit einem Durchmesser von etwa 0,6 cm wurden mit PBS gewaschen und dann auf Filterpapier getrocknet Die Kugeln wurden in ein Becherglas gegeben und dann wurde eine Lösung von Rubella-Antigen, verdünnt 1 :200 mit Glycinpuffer, zugegeben, so daß alle Kugeln bedeckt waren. Man ließ das Becherglas mit seinem Inhalt 16 h bei 4°C stehen und dann wurde die Flüssigkeit dekantiert und die Kugeln wurden auf ein Filterpapierblatt gegeben und luftgetrocknet Die mit Rubella-Antigen beschichteten

Kugeln wurden in verschlossenen Behältern bei 4°C aufbewahrt.

Gewünschtenfalls kann man die Rubella-Antigen-beschichteten Kugeln mit Methanol behandeln, um den Virus zu aktivieren, wobei die viralen antigenischen Eigenschaften unverändert bleiben.

Beispiel 5

Herstellung von radiomarkierten
(¹²⁵J)-Kaninchen-Anti-Human IgG

Die IgG-Fraktion von Kaninchen-Anti-Human IgG-Serum erhielt man, indem man das Serum durch eine DEAE-Cellulosesäule, die mit 0,015m Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, ins Gleichgewicht gebracht worden war, schickte. Die so erhaltene IgG-Fraktion wurde mit ¹²⁵J radioaktiv markiert (Jodisierung gemäß der Chloramin-T-Methode, beschrieben von Hutchinson and Zeigler, Applied Microbiology, Dezember 1974, Seiten 935-942).

Beispiel 6

Bestimmung von CMV- und Rubella-Antikörpertitern
durch getrennte Radioimmunoassays

Im vorliegenden Beispiel, wie auch in den nachfolgenden Beispielen wurden vier repräsentative Humansera für die Bestimmung von CMV- und Rubella-Antikörper verwendet. Diese vier Sera wurden mit A bis D bezeichnet und unterscheiden sich hinsichtlich ihres Titers an CMV- und Rubella-Antikörpern wie folgt:

Titer von Antikörpern für

Serum Probe

CMV

Rubella

A
B
C
D

hoch
mittel

sehr niedrig
mittel

mittel
hoch
mittel
niedrig

Die Titer von CMV- und Rubella-Antikörpern wurden in getrennten, zuvor durchgeführten Untersuchungen mittels der indirekten Festphasen-Rl A-Verfahrensweise vorbestimmt, wobei jedes Antigen in der vorher beschriebenen Weise auf die Innenfläche von Polystyrol-Reagenzgläsern aufgebracht worden war. Das angewendete Verfahren war das folgende:

1. Die unbekannte Serumprobe oder die Kontroll-(negativ-)Serumprobe wurde in PBS, enthaltend 1% BSA auf das lOOfache verdünnt

2. 200 μΐ der verdünnten Serumprobe wurden genau und sorgfältig auf den Boden eines Reagenzglases pipettiert, welcher mit dem jeweiligen Antigen (CMV-Antikörper oder Rubella-Antigen) beschichtet war.

3. Das Reagenzglas wurde 2 h bei 27° C auf einem Wasserbad inkubiert (Im Falle des CMV-Antigens wurde festgestellt, daß eine einstündige Inkubierung ausreichte.)

4. Nach Beendigung der Inkubierung wurde die Flüssigkeit im Reagenzglas durch Absaugen entfernt und das Reagenzglas wurde zweimal mit etwa 4 ml PBS gewaschen.

5. 200 μΐ einer Lösung von ¹²⁵J-Anti-Human-IgG (verdünnt mit PBS, enthaltend 1% BSA auf eine SDezifische Radioaktivität von 400-100 Counts/min [cpn]/ml) wurden genau und sorgfältig auf den Boden des beschichteten Reagenzglases pipettiert.

6. Das Reagenzglas wurde auf einem Wasserbad 1 h bei 37°C inkubiert.

7. Die Flüssigkeit im Reagenzglas wurde durch Absaugen entfernt und das Reagenzglas wurde zweimal mit etwa 4 ml PBS gewaschen.

8. Die im Reagenzglas zurückgehaltene Radioaktivitat (die »gebundene Spezies«) wurde durch einen Gamma-Strahlenmesser bestimmt.

Der relative Gehalt an Antikörper in jeder Serumprobe in bezug auf CMV- und Rubella-Antikörper wurde aus dem Verhältnis:

cpm der Serumprobe

cpm von Negativ(Kontroll)Serum

berechnet.

Die dabei erhaltnen Verhältnisse wurden zusammengefaßt und werden in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Serum CMV-Antikörner-Ver-Probe hältnisse (RIA)

(Serum verdünnt 1:100)

Rubella-Antikörper-Verhältnisse (RIA) (Serumverdünntl:100)

A	6,03
B	2,86
C	1.03
D	2,23

2,5

4.25 2.5 1 ?

Die lOOfache Verdünnung der Serumprobe in Stufe 1 war etwas willkürlich und wurde als Ergebnis der Titrationskurven gewählt, die man aus zwei Untersuchungsserien für CMV-Antikörper bzw. Rubella-Antikörper erhalten hatte, um in jedem der Fälle die

sogenannte »Endpunkts-Titration« festzustellen, die als die höchste Verdünnung definiert ist, bei welcher das cpm-Verhältnis zwischen der unbekannten Probe und der Kontrollprobe größer als 2 ist. Bei der empfohlenen lOOfachen Verdünnung konnte man Serumproben mit Verhältnissen von bis zu 1,5 als negativ für den spezifisch zu untersuchenden Antikörper ansehen; Proben mit Verhältnissen oberhalb 2,0 konnte man als positiv hinsichtlich des Antikörpers ansehen, während bei Verhältnissen zwischen 1,5 und 2,0 die Bestimmung unsicher war und der Versuch mit einer niedrigeren Verdünnung der Probe wiederholt werden sollte.

Beispiel 7

Kombinierte Radioimmunoassays für CMV- und Rubella-Antikörper

Die gleichzeitige Bestimmung der Titer von CMV-Antikörper und Rubella-Antikörper in den vorerwähnten Sera-Proben A-D wurde durchgeführt indem man

eo die Verfahrensschritte 1 -7 gemäß Beispiel 6 durchführte mit der Ausnahme, daß bei jedem Versuch Reagenzgläser verwendet wurden, die mit CMV-löslichem Antigen beschichtet waren und Polystyrolkugeln enthielten, die mit Rubella-Antigen (wie in Beispiel 4 beschrieben) beschichtet waren. Nach Stufe 7 (Beispiel 6) wurden die mit Rubella-Antigen beschichteten Polystyrolkugeln aus dem Reagenzglas entnommen und in ein sauberes, unbeschichtetes Reagenzglas überführt

14

Die in dem CMV-Antigen-beschichteten Reagenzglas zurückbleibende Radioaktivität und die auf den mit Rubella-Antigen beschichteten Polystyrolkugeln zurückbleibende Radioaktivität wurde mittels eines Gamma-Counters getrennt bestimmt.

In zwei Parallelserien der Kontrolluntersuchungen wurde genau das gleiche Verfahren durchgeführt mit der Ausnahme, daß man bei der einen Serie CMV-Antigen-beschichtete Reagenzgläser, enthaltend unbeschichtete Polystyrolkugeln, verwendete und bei der anderen Serie unbeschichtete Reagenzgläser, die jeweils eine Polystyrolkugel, beschichtet mit Rubella-Antigen, enthielten, verwendete.

Die Ergebnisse dieser simultanen Untersuchungen werden in Tabelle 2 bis 5 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, daß die in dem Simultanversuch bestimmten CMV- und Rubella-Antikörper-Titer praktisch identiscn sind mit den entsprechenden Werten, die man bei Kontrollversuchen gefunden hatte, und bei denen jeder Antikörper getrennt bestimmt worden war (Beispiel 6).

Tabelle 2 - Serum A

Sera- Antigen beschichtet

Verdün- auf
nungcn Reagenz- Kugeln

glas

¹²⁵J zurückgehalten

in

Reagenz- Kugeln

glas

(cpm) (cpm)

1 :32 —

1:128

1:512

:2048

:8192

: 32 CMV

:128

:512

-.2048

:8192

.32 CMV

:128

:512

:2048

:8192

Tabelle 3 - Serum B

Rubella

Rubella 8900

7800

4700

1850

850

— 9181

7471

4534

1979

912

4213

2610

1527

718

435

3517

2650

1760

951

511

Sera- Antigen beschichtet

Verdün- auf
nungen Reagenz- Kugeln

glas

¹²⁵J zurückgehalten

in

Reagenz- Kugeln

glas

(cpm) (cpm)

1:32

1:128

1:512

1:2048

1:8192

1:32
1:128
1:512
1:2048
1:8192

1:32

1:128

1:512

1:2048

1:8192

CMV

Rubella

Rubella 3520

2680

1610

902

620

5i84 4213 3302 1955 900

4987 4183 3167 2329 921

CMV —

3613

2678

1652

905

695 Tabelle 4 Serum C

Scra-Verdiinnungcn

Antigen beschichtet

auf

Reagenz- Kugeln

glas

^12SJ zurückgehalten

in

Reagenz- Kugeln

glas

(cpm) (cpm)

CMV

:32 : 128 : 512 :2048 :8192

:32 :128 : 512 ' :204S :8192

:32 :128 :512 :2048 1:8192

Tabelle 5 - Serum D

Rubella

CMV —

1473

1250

870

685

595

1573

1314

920

706

672

4373 3391 2042 1174 641

4773 3137 2087 1320 632

Sera- Antigen beschichtet

Verdün- auf nungen Reagenz- Kugeln

glas

¹²⁵J zurückgehalten

in

Reagenz- Kugeln

glas

(cpm) (cpm)

1:32 1:128 1:512 1:2048 1:8192

1:32 1:128 1:512 1 :2048 1:8192

1:32 1:128 1:512 1:2048 1:8192

Rubella

CMV Rubella 5176

2035

1485

601

457

CMV — 4795

2252

1275

569

517

Beispiel 8

Bestimmung von CMV- und Rubella-Antikörper-Titern durch getrennte Enzym-Immunoassays

2309

1291

768

480

160

2571 1235 742 474 328

Die Titer von CMV- und Rubella-Antikörpern in den vier zuvor beschriebenen Sera-Proben A-D wurden durch eine vorhergehende getrennte Nachweismethode unter Verwendung von Polystyrol-Reagenzgläsern die, wie vorher beschrieben, mit dem jeweiligen Antigen beschichtet worden waren, durch die nachfolgende indirekt Festphasen-EIA-Methode vorbestimmt (Kaninchen-Anti-(Human-IgG), markiert mit alkalischer Phospatase):

1. Die unbekannte Serumprobe oder die Kontrollprobe (Negativprobe) wurde auf das lOOFache PBS, enthaltend 0.05% Polyäthyleti-sorbitan-monolaurat, verdünnt

2. 200 μΐ der verdünnten Serumprobe wurden genau und sorgfältig auf den Boden eines Reagenzglases pipettiert, dessen Boden mit Antigen (CMV-Antigen oder Rubella-Antigen) beschichtet worden war.

3. Das Reagenzglas wurde 2 h bei 37° C auf einem Wasserbad inkubiert (im Falle von CMV-Antigen wurde festgestellt daß eine eindstündige Inkubierung ausreichte).

4. Nach Beendigung der Inkubation wurde die Flüssigkeit in dem Reagenzglas abgesaugt und das Reagenzglas wurde zweimal mit etwa 4 ml PBS, enthaltend 0,05% Polyäthylensorbitan-monolaurat gewaschen.

5. 200 μΐ einer Lösung von alkalischem Phosphatase-Anti-(Human IgG) in BPS, enthaltend 0,05% Polyäthylen-sorbitan-monolaurat wurden genau und sorgfältig auf den Boden des beschichteten Reagenzglases pipettiert

6. Das Reagenzglas wurde 1 h bei 37° C auf einem Wasserbad inkubiert

7. Die Flüssigkeit in dem Reagenzglas wurde abgesaugt und das Reagenzglas wurde zweimal mit etwa 400mi PBS, enthaltend 0,05% Polyäthylensorbitan-monolaurat gewaschen.

8. 1 ml der Substratlösung (nachfolgend beschrieben) wurde zu dem Reagenzglas gegeben.

9. Das Reagenzglas wurde 1 h bei 37° C inkubiert und dann wurde die enzymatische Reaktion abgestoppt durch Zugabe von 300 μΐ einer 10 n-Natriumhydroxidlösung und anschließendem kräftigem Mischen.

10. Die optische Dichte bei 400—435 nm wurde gemessen.

Der relative Antikörpergehalt einer jeden Serumprobe in bezug auf CMV- und Rubella-Antikörper wurde aus dem Verhältnis:

O. D. der Serumprobe O. D. der negativen (Kontroll)-Probe

(O. D. = optische Dichte bei 400-435 nm) berechnet.

Die erhaltenen Verhältnisse werden in der nachfolgenden Tabelle 6 gezeigt.

Tabelle 6

Serum CMV-Antikörper-Ver-Probe hältnis (ElA)

(Serum verdünnt 1:100)

Rubella-Antikörper-Ver-

hältnis (ElA)

(Serum verdünnt 1:100)

A	25,2	3,73
B	5,1	4,43
C	1,5	2,82
D	10,6	1,5

4-Nitrophenylphosphat Diethanolamin Natrium azid Chlorwasserstoff säure

Ig

97 ml

0.2 g

1 Molar bis zu pH 9,8

Wie am Ende von Beispiel 6 erklärt, wurde die lOOfache Verdünnung der Sera-Proben als Ergebnis von getrennten Serien von Enzym-Immunoassays für jede der jeweiligen Antikörper festgestellt wobei die »Endpunkt-Titration« (in diesem Falle durch die höchste Verdünnung, bei welcher das O. D.-Verhältnis zwischen der unbekannten Probe und der negativen Probe höher als 2 ist) für jeden der Antikörper bestimmt wurde. Wie bei der RIA gemäß Beispiel 6 werden Serumproben mit Verhältnissen bis zu 1,5 als negativ, solche mit Verhältnissen oberhalb 2,0 als positiv und solche mit Verhältnissen zwischen 1,5 bis 2,0 als unbestimmt angesehen, und die unbestimmten müßten dann mit niedrigeren Verdünnungen nochmals wiederholt wer den.

Beispiel 9

25 Kombinierte Enzym-immunoassays für CMV- und Rubella-Antikörper

CMV- und Rubella-Antikörper-Titer wurden gleichzeitig in jedem der vorher erwähnten Sera A-D unter Anwendung der indirekten Festphasen-EIA-Methode bestimmt Dabei wurde das in den Stufen 1 bis 7 von Beispiel 8 beschriebene Verfahren wiederholt mit der Ausnahme, daß in Stufe 2 ein Polystyrol-Reagenzglas verwendet wurde, das mit CMV-Iöslichem Antigen beschichtet worden war, und das eine Polystyrolkugel mit einem Durchmesser von 0,6 cm, beschichtet mit Rubella-Antigen (wie in Beispiel 4 beschrieben) enthielt. Nach Stufe 7 wurde die mit Rubella-Antigen beschichtete Kugel aus dem mit dem CMV-Antigen beschichteten Reagenzglas entnommen und in ein sauberes Reagenzglas überführt. Dann wurden die Stufen 8,9 und 10 der vorher in Beispiel 8 beschriebenen Verfahrensweise getrennt durchgeführt mit einerseits dem CMV-Antigen-beschichteten Reagenzglas und andererseits mit dem unbeschichteten Reagenzglas, welches die Rubella-Antigen-beschichtete Kugel enthielt. .

Zwei Serien von Kontrolluntersuchungen wurden unter gleichen Bedingungen durchgeführt, wobei in einem Falle CMV-Antigen-beschichtete Reagenzgläser, enthaltend eine unbeschichtete Polystyrolkugel verwendet wurden, und im anderen Fall Rubella-Antigen-be- schichtete Polystyrolkugeln, die in einem unbeschichteten Reagenzglas enthalten waren. .

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden in den folgenden Tabellen 8 bis 11 zusammengefaßt.

Tabelle 8 - Serum A

Wenn der Untersuchungszweck nur in der Bestimmung besteht, ob ein jeweiliger Antikörper in der Serumprobe vorhanden oder nicht vorhanden ist, dann kann man anstelle der Messung der optischen Dichte in der obigen Stufe 10 eine positive Reaktion qualitativ (oder semiquantitativ) durch das Auftreten einer gelben Farbe, die man .mit dem bloßen Auge erkennen kann, feststellen.

Die in Stufe 8 verwendete Substratlösung war eine 4-Nitrophenyl-phosphat-Lösung in 10% Diäthanolaminpuffer. 1 I dieser Lösung enthält:

Sera-	Antigen beschichtet	Rubella	Enzym-Aktivilät	Kugeln	•l
Verdün	auf
nungen	Reagenz- Kugeln		Reagenz	(O.D.)	I
	glas		glas	0.235	j
			(O.D.)	0.250
1:32			0.107	I
1:128		0.014	h
1:512			I ff
1:2048		230 242/554
1:8192

I

—

17

Kuge'n

Kugeln

29

Kugeln

43

J

55

648

18

11 - Serum D

I

— Rubella

in pinf»r p'im'iopn I Intprsiirhiinp

Kugeln

W

die man bei einer Einzeluntersuchung in den

I

Controllversuchen bestimmt hatte.

Antigen beschichtet

(O.D.)

I

?p_

Antigen Dcscnicniei tnzym-AK
auf

- · - B,

(O.D.)

auf

Rubella

Enzym-Aktivität

0.353

1

XTa'
/erdün-

Reagenz- Kugeln Reagenz

ivuat

r-Orlsel/ims;

Reagenz

Rubella

0.261

0.250

I

IO

lungen

glas glas

Kugeln

0.169

Sera-

glas

Rubella

Reagenz

0.255

0.293

0.082

CMV Rubella 1.58

0.12

Verdün

glas

0.124

0.283

0.023

0.95

0.059

nungen

(O.D.)

0.072

0.209

0.029

CMV Rubella 0.053

0.33

0.037
0.015

CMV

0.049

0.007

1:32

0.030

0.274

0.12

1.217

0.015

1:128

0.010

0.224

0.09

0.232

■ —

Rubella

0.935

0.310

15

1:512

0.015

0.079

CMV — 1.670

0.143

0.487

0.333

1:2048

0.003

0.009

0.929

0.114

1:32

0.120

0.232

1:8192

0.039

0.349

0.053

1:128

0.035

0.085

CMV — 0.061

0.119

0.005

1:512

CMV

0.039

20

1:32

0.029

0.133

1:2048

1.107

1:128

0.015

1:8192

Antigen beschichtet

0.895

Enzym-Aktivität

1:512

0.015

auf

0.594

1:2048

0.037

Aus diesen Ergebnissen ergibt sich, daß

1:32

Reagenz

0.101

Reagenz

25

1:8192

jnd Rubella-Antikörper-Titer zuverlässig

1:128

- Serum B

glas

0.047

glas

imiiltan

1:512

(O.D.)

1:2048

Tabelle

1:8192

Antigen beschichtet

Enzym-Aktivilät

I Tabelle 9 -

-

auf

I Sera-

Reagenz
glas

in

Sera-

Antigen beschichtet Enzym-Aktivität

I Verdün

JU

Verdün

auf

nungen

Reagenz- Kugeln Reagenz

._

glas glas

CMV

1.095

(O.D.)

0.345

35

0.095

1:32

0.050

1:128

0.041

1:512

:2048
:8192

CMV

1.170
0.369

40

0.111

1:32

0.070

: 128

0.043

1:512

45

:2048

- Serum C

:8192

:32

I

: 128

I

50 I

:512

I

:2048

I

1

-.8192

I

:32

(

man CMV- I

: 128

I

quantitativ I

:512

bestimmen

:2048

cann, weil die Werte für die optische Dichte, die man bei

:8192

ier vorerwähnten simultanen Untersuchung gemessen

:32

iat, praktisch identisch sind mit den entsprechenden

: 128

Werten,

:512

:2048

:8192

:32
:128

1:512

1:2048

1:8192

Tabelle 10

Sera-

Verdün

nungen

1:32

1:128

1:512

:2048

:8192

Claims

Patentansprüche:

1. Spezifische Bindungs-Untersuchungsmethode zur Bestimmung eine · Vielzahl von verschiedenen Liganden in einer einzigen Flüssigkeitsprobe, bei welcher man

(a) die Probe mit Reagenzien, einschließlich einem markierten Bindungsmittel und einem Festphasenbindungsmittel, kombiniert und mit dem Liganden ein Bindungsreaktionssystem mit einer Festphasengebundenen Spezies und einer freien Spezies des markierten Bindungsmitteis ausbildet, wobei die Menge der Markierung in jeder der entstandenen Festphasen-gebundenen Spezies einer Funktion der Gegenwart oder der Menge des entsprechenden Liganden in der Probe ist

(b) die Festphasen-gebundenen Spezies von den freien Spezies abtrennt und

(c) die Menge der Markierung in den abgetrennten Festphasen-gebundenen Spezies mißt,

dadurch gekennzeichnet, daß man

(d) die Probe mit Reagenzien für die jeweils verschiedenen zu bestimmenden Liganden unter Bildung eines einzigen, ungeteilten Reaktionsgemisches in Berührung bringt wobei die Markierung für alle markierten Bindungsmittel in den verschiedenen mit der Probe kombinierten Reagenzien gleich ist und das Festphasenbindungsmittel für die verschiedenen zu bestimmenden Liganden differenzierbar von den anderen Festphasenbindungsmitteln für die anderen zu bestimmenden Liganden abtrennbar ist, und daß

2. Verfahren gemäß Anspruch !,dadurch gekennzeichnet, daß man als jeweiliges Festphasenbindungsmittel ein solches verwendet, das aus einem einzigen zusammenhängenden Festphasenträger mit dem daran gebundenen Bindungsmittel besteht.

3. Verfahren gemäß Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die Vielzahl der unterschiedlichen zu bestimmenden Liganden Antikörper der gleichen Klasse sind.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das markierte Bindungsmittel für alle zu bestimmenden Antikörper gleich ist, und ein Antikörper für die Klasse der zu bestimmenden Antikörper ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmenden Antikörper verschiedene Human-Gamma-Globulin-Antikörper sind und daß das markierte Bindungsmittel ein markiertes Anti-(Human-Gamma-Globulin) ist.

6. Testmittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 5, enthaltend als Reagenzien für die verschiedenen nachzuweisenden Liganden ein markiertes Bindungsmittel und ein Festphasenbindungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung in allen markierten Bindungsmittteln die gleiche ist und das Festphasenbindungsmittel für die verschiedenen zu bestimmenden Liganden differenziert abtrennbar von den anderen Festphasenbindungsmitteln für die anderen zu bestimmenden Liganden ist