JPS6089755A - 診断用試薬及びその製造法並びにそれを用いる診断法 - Google Patents
診断用試薬及びその製造法並びにそれを用いる診断法Info
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- JPS6089755A JPS6089755A JP59137049A JP13704984A JPS6089755A JP S6089755 A JPS6089755 A JP S6089755A JP 59137049 A JP59137049 A JP 59137049A JP 13704984 A JP13704984 A JP 13704984A JP S6089755 A JPS6089755 A JP S6089755A
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- G—PHYSICS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
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- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
- Y10S436/813—Cancer
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は特に、とりわけ、肛門位のいぼ(anogen
ital warts)、yn部1−皮細胞内の新生腫
瘍(cervical 1ntraepithelia
l neoplasia、CIN)及びf−宮ラロ部侵
蝕麟状細胞癌(invasive squamousc
ell carcinoma of the uter
ine ceruix)などの疾J、すを有する、ヒト
のようなl!ri乳動物の同定を行うだめの試薬、並び
に方法に関する。本発明は、群(group)特異的乳
頭腫ウィルス(Papillomavirus)抗原に
対する抗体レベルが、肛門位のいぼ、CIN及び頚部鯖
状癌などの疾患を右する患者の血清中において産生され
るという1本発明者による発見に基づいている。
ital warts)、yn部1−皮細胞内の新生腫
瘍(cervical 1ntraepithelia
l neoplasia、CIN)及びf−宮ラロ部侵
蝕麟状細胞癌(invasive squamousc
ell carcinoma of the uter
ine ceruix)などの疾J、すを有する、ヒト
のようなl!ri乳動物の同定を行うだめの試薬、並び
に方法に関する。本発明は、群(group)特異的乳
頭腫ウィルス(Papillomavirus)抗原に
対する抗体レベルが、肛門位のいぼ、CIN及び頚部鯖
状癌などの疾患を右する患者の血清中において産生され
るという1本発明者による発見に基づいている。
上記症状を診断するために現在用いられる方法は、一般
に細胞サンプリング法を利用する。+In清又は他の体
液試験によって病態の診断ができるようになったため、
より高感度の病態診断法が提供され、かつ、かかる病態
の集団検診が可能となった。
に細胞サンプリング法を利用する。+In清又は他の体
液試験によって病態の診断ができるようになったため、
より高感度の病態診断法が提供され、かつ、かかる病態
の集団検診が可能となった。
一面において、本発明は、環装乳頭腫ウィルスピリオン
の蛋白質、又はその抗原抽出物を塗布した固体状もしく
は粒状の支持体からなる、肛門位のいぼ、CIN又は頚
部麟状癌の診断に有用な試薬を提供する。
の蛋白質、又はその抗原抽出物を塗布した固体状もしく
は粒状の支持体からなる、肛門位のいぼ、CIN又は頚
部麟状癌の診断に有用な試薬を提供する。
他面において1本発明は、肛門位のいぼ、GIN及び頚
部鯖状癌の診断において有用な診断用試薬の製造法を提
供し、該方法は、 (1) 固体状もしくは粒状の支持体を、環装乳頭腫ウ
ィルスピリオン又はその抗原抽出物と接触させる工程; (11) 該ピリオン又は抽出物を有する該支持体を、
該ピリオンの蛋白質又は抽出物が該支持体に固着するの
に適切な一定時間及び一定温度で湯煮する工程;並びに +1iil 該湯煮支持体に固着しなかった過剰のピリ
オンを除去する]二程 からなる。
部鯖状癌の診断において有用な診断用試薬の製造法を提
供し、該方法は、 (1) 固体状もしくは粒状の支持体を、環装乳頭腫ウ
ィルスピリオン又はその抗原抽出物と接触させる工程; (11) 該ピリオン又は抽出物を有する該支持体を、
該ピリオンの蛋白質又は抽出物が該支持体に固着するの
に適切な一定時間及び一定温度で湯煮する工程;並びに +1iil 該湯煮支持体に固着しなかった過剰のピリ
オンを除去する]二程 からなる。
さらにもう一つの面において、本発明は肛門位のいぼ、
頚部−1−皮細胞内の新生腫瘍(CIN)及び子宮ガ1
部侵蝕鯖状癌の診断方法を提供し、該方法は、 (1)環装乳頭腫ウィルスピリオンの蛋白質又はその抗
原抽出物を塗布した固体状もしくは粒状の支持体を用意
する工程; (2)該塗布支持体を一定量の体液と、該ピリオンの蛋
白質又はその抗h:c抽出物と該一定量の体液中の抗体
との間で複合体を形成するのに適切な条件下で接触させ
る二[程;並びに(3)該複合体の存在を定量的に又は
定性的に検出する工程 からなる。
頚部−1−皮細胞内の新生腫瘍(CIN)及び子宮ガ1
部侵蝕鯖状癌の診断方法を提供し、該方法は、 (1)環装乳頭腫ウィルスピリオンの蛋白質又はその抗
原抽出物を塗布した固体状もしくは粒状の支持体を用意
する工程; (2)該塗布支持体を一定量の体液と、該ピリオンの蛋
白質又はその抗h:c抽出物と該一定量の体液中の抗体
との間で複合体を形成するのに適切な条件下で接触させ
る二[程;並びに(3)該複合体の存在を定量的に又は
定性的に検出する工程 からなる。
本発明は又、−ヒ述の試験において有用なキットをも提
供し、該キットは、 (1) ここに述べた診断用試薬;並びに(ii+ 1
又はそれ以上の一定量の抗■gG及び/又は抗IgMか
らなる。
供し、該キットは、 (1) ここに述べた診断用試薬;並びに(ii+ 1
又はそれ以上の一定量の抗■gG及び/又は抗IgMか
らなる。
好ましくは、ピリオンは、仔ウシ乳頭腫ウィルス2型(
BPV−2)ピリオンのようなヒト又は仔ウシのピリオ
ンである。本発明の別の態様においては、この乳頭腫ウ
ィルスピリオンの代りに、それから精製した乳頭腫ウィ
ルス抗原抽出物を用いてもよい。
BPV−2)ピリオンのようなヒト又は仔ウシのピリオ
ンである。本発明の別の態様においては、この乳頭腫ウ
ィルスピリオンの代りに、それから精製した乳頭腫ウィ
ルス抗原抽出物を用いてもよい。
ヒト乳頭腫ウィルス(HPV)は、形態学的には類似し
ているが、それらのDNAの、制限酵素による開裂様式
及びそれらのカプシド(capsid)i白質の抗原性
が明らかに異なるウィルスの異種群よりなることか認め
られている。更に、各)IPVサブ型は一般に解剖学的
及び組織学的変異種により特徴づけられ、例えば、HP
V−1と足底のいぼ、 HPV−8と尖形コンジローム
(cnndyloma acuminatum)である
。用語「乳頭1挿ウイルス」は各サブ−型又は1もしく
は2以]二のサブ−,1(ljの混合物を包含するが、
これは、サブ型の各々は本発明の方法において有用なも
のと考えられているためである。
ているが、それらのDNAの、制限酵素による開裂様式
及びそれらのカプシド(capsid)i白質の抗原性
が明らかに異なるウィルスの異種群よりなることか認め
られている。更に、各)IPVサブ型は一般に解剖学的
及び組織学的変異種により特徴づけられ、例えば、HP
V−1と足底のいぼ、 HPV−8と尖形コンジローム
(cnndyloma acuminatum)である
。用語「乳頭1挿ウイルス」は各サブ−型又は1もしく
は2以]二のサブ−,1(ljの混合物を包含するが、
これは、サブ型の各々は本発明の方法において有用なも
のと考えられているためである。
本発明の好ましい一実施態様においては、ピリオンは仔
ウシの乳頭腫ウィルス2型(BPV−2)ピリオンであ
る。これらのピリオンは、当業者に公知の操作により、
仔ウシの首の線維乳頭腫から調製することかに了ましい
。しかしながら、例えば、ヒI・、ラヒット又はウマか
らの他の乳頭腫もウィルス粒子源として用いてもよい。
ウシの乳頭腫ウィルス2型(BPV−2)ピリオンであ
る。これらのピリオンは、当業者に公知の操作により、
仔ウシの首の線維乳頭腫から調製することかに了ましい
。しかしながら、例えば、ヒI・、ラヒット又はウマか
らの他の乳頭腫もウィルス粒子源として用いてもよい。
好ましい方法は、La Porta R,F、及びTa
ichman L、 B、により1982年Proc、
Nat、 Acad、 5cienceアメリ力合衆
国、793.3393−3397頁にしi(べられてい
るものである。ピリオンは、好ま1.〈は機械的方法に
より又は界面活性剤、洗n1剤もしくはドデシル硫酸ナ
トリウムのようなものの高濃度塩と接触させることによ
り環装Xせる。好ましくはピリオンは、Jenson
A、 B、等、1980年;J、 Nat Cance
r In5tit。
ichman L、 B、により1982年Proc、
Nat、 Acad、 5cienceアメリ力合衆
国、793.3393−3397頁にしi(べられてい
るものである。ピリオンは、好ま1.〈は機械的方法に
より又は界面活性剤、洗n1剤もしくはドデシル硫酸ナ
トリウムのようなものの高濃度塩と接触させることによ
り環装Xせる。好ましくはピリオンは、Jenson
A、 B、等、1980年;J、 Nat Cance
r In5tit。
64巻、 495−500頁に述べられている方法によ
り環装させる。環装ピリオンは洗浄剤及びメルカプトエ
タノール等と接触させて、その蛋白質を「、開鎖」配列
(open configuration)に維持する
ことが好ましい。
り環装させる。環装ピリオンは洗浄剤及びメルカプトエ
タノール等と接触させて、その蛋白質を「、開鎖」配列
(open configuration)に維持する
ことが好ましい。
望ましければ、例えば、調製用PAGE又は庶11!!
密度勾配、遠心分19 (5−15%wt/マ)によっ
て精製して種々の抗原性分画を得、次いで適切な抗原分
画を同定しかつ使用してもよい。
密度勾配、遠心分19 (5−15%wt/マ)によっ
て精製して種々の抗原性分画を得、次いで適切な抗原分
画を同定しかつ使用してもよい。
未発明の好ましい実施態様においては、支持体は固体状
支持体であり、好ましくは、ポリプロピレン、ポリスチ
レン、ポリカーボネート、ポリエチレン又1オボリアミ
ドのような水に不溶な品分Y−材料である。支持体の表
面は、結合又は吸収を促進するために変性されてもよい
。又、支持体はカラスであってもよυく、ガラス表面へ
のピリオンの吸着を促進するために適切に処理されたガ
ラスが好ましい。又、支持体はセファロース又はラテッ
クス粒子のような粒状支持体であってもよい。環装ピリ
オンは、それらを支持体上に吸着させるか又は支持体と
結合させるために十分な時間、好ましくは約1゛2ない
し24時間、約4°Cで支持体と共に湿部yれる。塗布
支持体を、次に洗浄して過剰のヒリオンを洗い落す。
支持体であり、好ましくは、ポリプロピレン、ポリスチ
レン、ポリカーボネート、ポリエチレン又1オボリアミ
ドのような水に不溶な品分Y−材料である。支持体の表
面は、結合又は吸収を促進するために変性されてもよい
。又、支持体はカラスであってもよυく、ガラス表面へ
のピリオンの吸着を促進するために適切に処理されたガ
ラスが好ましい。又、支持体はセファロース又はラテッ
クス粒子のような粒状支持体であってもよい。環装ピリ
オンは、それらを支持体上に吸着させるか又は支持体と
結合させるために十分な時間、好ましくは約1゛2ない
し24時間、約4°Cで支持体と共に湿部yれる。塗布
支持体を、次に洗浄して過剰のヒリオンを洗い落す。
この洗浄された塗布支持体は、次に、全血清又は血清分
画のような一定品の体液と接触させるが、この全血清又
は血清分画は希釈されていてもよい。この体液を塗布支
持体と共に、■ないし20時間というような適切な時間
、4°Cないし45℃、&fましくは25ないし35°
Cの温度範囲で湿部し、該支持体1−の乳頭腫ウィルス
(pv)抗原と、もし存在するならば前記体液中の抗体
との間の複合体を形成させる。
画のような一定品の体液と接触させるが、この全血清又
は血清分画は希釈されていてもよい。この体液を塗布支
持体と共に、■ないし20時間というような適切な時間
、4°Cないし45℃、&fましくは25ないし35°
Cの温度範囲で湿部し、該支持体1−の乳頭腫ウィルス
(pv)抗原と、もし存在するならば前記体液中の抗体
との間の複合体を形成させる。
複合体は多くの方法により検出されることは明らかであ
るが、複合体を酵素連結免疫吸着試験(ELISA)に
より検出することが最も好ましい。例えば、複合体を、
ベルオギシダーゼ接合化ラビット抗ヒトIgGのような
ペルオキシダーゼ接合化抗ヒトrgGと接触させ、つい
で該抗rgGが該複合体に結合するように、十分な時間
適切な条件ドでそれらと共に温置する。ベルオキシダー
ゼ接合化抗ヒトIgGの結合程度を。−フェニレン・レ
アミンを用いて4!]Onmにおいて分光光度計で測定
することができる。
るが、複合体を酵素連結免疫吸着試験(ELISA)に
より検出することが最も好ましい。例えば、複合体を、
ベルオギシダーゼ接合化ラビット抗ヒトIgGのような
ペルオキシダーゼ接合化抗ヒトrgGと接触させ、つい
で該抗rgGが該複合体に結合するように、十分な時間
適切な条件ドでそれらと共に温置する。ベルオキシダー
ゼ接合化抗ヒトIgGの結合程度を。−フェニレン・レ
アミンを用いて4!]Onmにおいて分光光度計で測定
することができる。
又、複合体に対して特異的な、放射性標識化試薬、例え
ば、 l12s4%識化モノクローン性又はポリクロー
ン性抗体を用いる放射性同位元素法により検出してもよ
い。
ば、 l12s4%識化モノクローン性又はポリクロー
ン性抗体を用いる放射性同位元素法により検出してもよ
い。
診断法の一実施態様においては、体液は、 IgG免疫
グロブリンが除去された血清分画を含む。全血清を適切
な分離カラム(rsolab、 0hioがらのQui
k−9eP)に通すことによってこれを得ることができ
る。
グロブリンが除去された血清分画を含む。全血清を適切
な分離カラム(rsolab、 0hioがらのQui
k−9eP)に通すことによってこれを得ることができ
る。
IgGを含まない血清分画の塗布支持体との温置時間は
、tgc免疫グロブリンを含有する血清のための約2時
間の好ましい温置時間と比較して、約16時間まで線長
する。PV抗原−抗体複合体を検出するための試薬はt
17ましくは抗1gM抗体、又は抗IgA抗体であり、
最も好ましくはペルオキシダーゼと接合しているもので
ある。
、tgc免疫グロブリンを含有する血清のための約2時
間の好ましい温置時間と比較して、約16時間まで線長
する。PV抗原−抗体複合体を検出するための試薬はt
17ましくは抗1gM抗体、又は抗IgA抗体であり、
最も好ましくはペルオキシダーゼと接合しているもので
ある。
IgG免疫グロブリンを含有する体液を試験し、その後
IgG複合体を検出す色試験から得られる定j11的
結果と、 IgG不合血清分画を試験し、その後IgM
又はrga複合体のようなIgG不合複合体を検出する
試験から得られる定量的結果との差異が有用な結果をも
たらすことがl’l明している。前癌状%及びいぼの症
状をもつ患者の両方の癌が高いTgGレベルを有するこ
とが判明している。IgGに基づく試験は癌患者につい
て識別しない。しかしなから、fgH試験によれば、い
ぼの症状又は頚部の前癌症状の患者の場合と比較して、
癌の患者の場合は高いrgMレベルが小される。例えば
、対照グループの・ビー均値プラス標準偏差の3倍のカ
ットオフレベルを用いると、いぼを有する患者の55%
か陽性、前癌患者の29%が陽性、及び癌患者の80%
が陽性である。しかしながら、もし、このべも偏差の2
倍であるならば、従って陽性率はいぼ患者グループ及び
前癌患者グループについては0%となり、癌患者グルー
プについては67%となるであろう。IgGの結果とr
g)Iの結果を組合せると頚部癌の診断に役立つことに
なるであろう。これは又、治療後の患者を試験して症状
の再発があるかどうかを決定するのに有用であろう。
IgG複合体を検出す色試験から得られる定j11的
結果と、 IgG不合血清分画を試験し、その後IgM
又はrga複合体のようなIgG不合複合体を検出する
試験から得られる定量的結果との差異が有用な結果をも
たらすことがl’l明している。前癌状%及びいぼの症
状をもつ患者の両方の癌が高いTgGレベルを有するこ
とが判明している。IgGに基づく試験は癌患者につい
て識別しない。しかしなから、fgH試験によれば、い
ぼの症状又は頚部の前癌症状の患者の場合と比較して、
癌の患者の場合は高いrgMレベルが小される。例えば
、対照グループの・ビー均値プラス標準偏差の3倍のカ
ットオフレベルを用いると、いぼを有する患者の55%
か陽性、前癌患者の29%が陽性、及び癌患者の80%
が陽性である。しかしながら、もし、このべも偏差の2
倍であるならば、従って陽性率はいぼ患者グループ及び
前癌患者グループについては0%となり、癌患者グルー
プについては67%となるであろう。IgGの結果とr
g)Iの結果を組合せると頚部癌の診断に役立つことに
なるであろう。これは又、治療後の患者を試験して症状
の再発があるかどうかを決定するのに有用であろう。
したがって、本発明、の−っの可能な用途は、治療後の
患者を監視して、第二段階の治療を開始することができ
るように腫瘍の再発を早期に検出することであり、又、
本発明は、ある種の治療により冶瘉した患者を選び出し
て、彼らがそれ以上の外科的及び/又は放射線治療を受
けなくてすむようにするのに用いることもでSる。
患者を監視して、第二段階の治療を開始することができ
るように腫瘍の再発を早期に検出することであり、又、
本発明は、ある種の治療により冶瘉した患者を選び出し
て、彼らがそれ以上の外科的及び/又は放射線治療を受
けなくてすむようにするのに用いることもでSる。
ここで未発明の好ましい実施態様を次の実施例及び図面
(第1図ないし第6図は実施例において得られた結果を
グラフとして示したもの)を参照して述べ、かつそれら
と関連づけて述べる。
(第1図ないし第6図は実施例において得られた結果を
グラフとして示したもの)を参照して述べ、かつそれら
と関連づけて述べる。
及亙刻」
10 mJJを採取した。」fu I+1fを分Ml、
、−20℃テ貯蔵した。試験グループは肛門位のいぼを
有する患者(60)、CIHの患者(92) 、及び頚
部癌の患者(4G)であった。CIN又は癌の患者のす
べては、パンチ生検材料の日常的な組織病理的検査によ
り、それらの診断が確定されていた。対l!((グルー
プは、 (1)6ないし18ケ月令の乳児16人、6オ
の小児16人及び12才の子供16人、 (2) 20
−80才の病状のない、病院通いをしていない女性 1
08人:性的伝染病診療所に来ていた+5−40才の女
性6o人;並びに非頚部に部生殖路癌の女性40人より
なる。
、−20℃テ貯蔵した。試験グループは肛門位のいぼを
有する患者(60)、CIHの患者(92) 、及び頚
部癌の患者(4G)であった。CIN又は癌の患者のす
べては、パンチ生検材料の日常的な組織病理的検査によ
り、それらの診断が確定されていた。対l!((グルー
プは、 (1)6ないし18ケ月令の乳児16人、6オ
の小児16人及び12才の子供16人、 (2) 20
−80才の病状のない、病院通いをしていない女性 1
08人:性的伝染病診療所に来ていた+5−40才の女
性6o人;並びに非頚部に部生殖路癌の女性40人より
なる。
人羨立孟lユ
仔ウシの乳頭腫ウィルス2型(BPV−2)ピリオンを
仔ウシの首のkQ m乳頭腫から調製した。ケラチンを
障害部分から削り落し、乳鉢及び乳棒を用いて粉砕し、
ついでトリクロロトリフルオロエタンによる脂質抽出を
含む示差超遠心に付した。最終的ペレフトは、塩化セシ
ウム成分上に見られるウィルスパントから調製した。ピ
リオンは、リン酸紅什1化食113水(pH7,e)で
看、釈した、1%Fデシ゛ル硫酸ナトリウム塩及び2%
メルカプトエタノール中で環装させ、ついで最終蛋白質
濃度を1.25mg/m文になるように調整した。環装
ピリオンをポリスチレン板上に塗布し、ついで−晩4°
Cで温石した。緩衝液又は生理的食塩水で洗浄して使用
に供する用意をした。
仔ウシの首のkQ m乳頭腫から調製した。ケラチンを
障害部分から削り落し、乳鉢及び乳棒を用いて粉砕し、
ついでトリクロロトリフルオロエタンによる脂質抽出を
含む示差超遠心に付した。最終的ペレフトは、塩化セシ
ウム成分上に見られるウィルスパントから調製した。ピ
リオンは、リン酸紅什1化食113水(pH7,e)で
看、釈した、1%Fデシ゛ル硫酸ナトリウム塩及び2%
メルカプトエタノール中で環装させ、ついで最終蛋白質
濃度を1.25mg/m文になるように調整した。環装
ピリオンをポリスチレン板上に塗布し、ついで−晩4°
Cで温石した。緩衝液又は生理的食塩水で洗浄して使用
に供する用意をした。
左亀謀1
1:100に希釈した全血清+00.文を各支持体板に
添加し、2時間37℃で温置した。数回更に洗節した後
、I:500のペルオキシダーゼ接合化うヒット抗−ヒ
トIgG 100p lを添加し、2時間37℃で温置
した。次に、0−フェニレンジアミン 100μすを添
加し、ついで5mol/立硫酸500に文を酷加するこ
とにより反応を停止した。色の強さをグイナテック(口
ynatech)分光光度計を用いて490nmにおい
て測定した。すべての血清について2絹の試験を行い、
10%以」−の相違がある場合には再試験を行った。
添加し、2時間37℃で温置した。数回更に洗節した後
、I:500のペルオキシダーゼ接合化うヒット抗−ヒ
トIgG 100p lを添加し、2時間37℃で温置
した。次に、0−フェニレンジアミン 100μすを添
加し、ついで5mol/立硫酸500に文を酷加するこ
とにより反応を停止した。色の強さをグイナテック(口
ynatech)分光光度計を用いて490nmにおい
て測定した。すべての血清について2絹の試験を行い、
10%以」−の相違がある場合には再試験を行った。
級」
この試験の特異性を、数個の試薬ブランク、6−12才
の子供からの陰性の血lh及び全どリオン(抗原は陰性
のもの)を用いて試験した。陽性の対照血1,′iは、
予め環装ピリオンを注射しておいたラビットから得た。
の子供からの陰性の血lh及び全どリオン(抗原は陰性
のもの)を用いて試験した。陽性の対照血1,′iは、
予め環装ピリオンを注射しておいたラビットから得た。
すべての陰性の対照実験からは、試薬ブランクのそれよ
り少ない又は同等の読取り値を得た。
り少ない又は同等の読取り値を得た。
試験の感度は、種々の間隔に夏って、抗原及び抗体の希
釈を変化させてAlll定した。−晩生湯煮すると読取
り値は最高となった。t : teooの血清希釈でも
なお、バックグラウンドの読取り値以上の飴を示し,検
出可能であった。lウェル当り0.15pLgの抗原を
含む低い、−スミ!希釈度(1:100)の陽性対照血
清でもパックグラウンドの読取り値以上の値を示し、検
出可能であった。試験の再現性は,各試験内の変動係数
及び各試験間の変動係数により測定した。0ないし0.
40の範囲の吸光度読取り仙を示す血7i’740個を
使用した。各試験内の変動係数は 4.1%であり、谷
試験間の変動係数は48%であった。
釈を変化させてAlll定した。−晩生湯煮すると読取
り値は最高となった。t : teooの血清希釈でも
なお、バックグラウンドの読取り値以上の飴を示し,検
出可能であった。lウェル当り0.15pLgの抗原を
含む低い、−スミ!希釈度(1:100)の陽性対照血
清でもパックグラウンドの読取り値以上の値を示し、検
出可能であった。試験の再現性は,各試験内の変動係数
及び各試験間の変動係数により測定した。0ないし0.
40の範囲の吸光度読取り仙を示す血7i’740個を
使用した。各試験内の変動係数は 4.1%であり、谷
試験間の変動係数は48%であった。
次に,肛門位のいぼ、 CIN及び頚部癌の疾患を有す
る患者から採取した血mの分析に,この試験を応用した
。すべての試験は一定の抗原濃度(0.4p−giミラ
エル及び一定の血清希釈(1:100)で行った。この
実験においては、上記子供の血lr5のW均値プラス標
準偏差値の3倍を、陽性結果についてのカットオフレベ
ル(99%、信頼度)とされた。
る患者から採取した血mの分析に,この試験を応用した
。すべての試験は一定の抗原濃度(0.4p−giミラ
エル及び一定の血清希釈(1:100)で行った。この
実験においては、上記子供の血lr5のW均値プラス標
準偏差値の3倍を、陽性結果についてのカットオフレベ
ル(99%、信頼度)とされた。
従って、症状のない、20−80才の女性の8.3%が
群特異的抗原に対する抗体を有しており、皮1x7又は
肛門位のいぼを有する患者の 100%が抗体を有して
いた。しかしながら癌データの分析のためには、非選択
・的な症状のない大人の対照(症状のない大人の無作為
抽出対照グループ)(グループ2)の平均値プラス標準
偏差値の3倍は陰性又は陽性結果についてのカットオフ
点とされた。性的に活性な母集団(対照グループ3)の
6.6%が陽性であり、非頚部癌のグループの15%が
陽性であった。しかしながら、肛門位のいぼ、GIN及
び頚部癌の疾患を右する患者では、陽性結果の割合は第
1表に示したように1それぞれ95%、60%及び93
%であった・ 歳−上一表 列(1(1及び試験グループからの1f吋、IIについ
ての陽性百分率夕、1 jjjj lrll −0,5−12480(0)2人人 38f
15 20−60 108 0(0)3 、 t’l
I内診療所のrBg5 :n±+o 20−45 GO
a(e、e)4ノ1頚部癌 55±12 35−GO4
0,8(15,0)Ill門1&ノl+’ぼ 31f:
11 17−70 [tO57(95)XlflMl:
皮細胞内の新生Bu10 28t 7 +9−52 9
2 55(Go)頚部癌 52±18 29−8348
43(93)第1図に示したように、定tIX的に考
察すると、1:X、Iiミグループ抗体レベルは、肛門
位のいぼを有する患者(0,01< p < 0.02
)以外のすべての他のグループの抗体レベルと極めて著
しく異る( p(0,001)。同様に、肛門位のいぼ
のグループ及びCIHのグループについての値は、すべ
ての対照グループにおける伯と極めて著しく異った(
p < o、ool)。
群特異的抗原に対する抗体を有しており、皮1x7又は
肛門位のいぼを有する患者の 100%が抗体を有して
いた。しかしながら癌データの分析のためには、非選択
・的な症状のない大人の対照(症状のない大人の無作為
抽出対照グループ)(グループ2)の平均値プラス標準
偏差値の3倍は陰性又は陽性結果についてのカットオフ
点とされた。性的に活性な母集団(対照グループ3)の
6.6%が陽性であり、非頚部癌のグループの15%が
陽性であった。しかしながら、肛門位のいぼ、GIN及
び頚部癌の疾患を右する患者では、陽性結果の割合は第
1表に示したように1それぞれ95%、60%及び93
%であった・ 歳−上一表 列(1(1及び試験グループからの1f吋、IIについ
ての陽性百分率夕、1 jjjj lrll −0,5−12480(0)2人人 38f
15 20−60 108 0(0)3 、 t’l
I内診療所のrBg5 :n±+o 20−45 GO
a(e、e)4ノ1頚部癌 55±12 35−GO4
0,8(15,0)Ill門1&ノl+’ぼ 31f:
11 17−70 [tO57(95)XlflMl:
皮細胞内の新生Bu10 28t 7 +9−52 9
2 55(Go)頚部癌 52±18 29−8348
43(93)第1図に示したように、定tIX的に考
察すると、1:X、Iiミグループ抗体レベルは、肛門
位のいぼを有する患者(0,01< p < 0.02
)以外のすべての他のグループの抗体レベルと極めて著
しく異る( p(0,001)。同様に、肛門位のいぼ
のグループ及びCIHのグループについての値は、すべ
ての対照グループにおける伯と極めて著しく異った(
p < o、ool)。
災」U緩ヱ
匹諸
試験゛グループは、肛門位のいぼ(51人)、 GIN
(61人)及び頚部癌(54人)の疾患を有するju
、lljであった。すべてのGIN及び癌の場合には、
[1常的な組織病理学及びパンチ生検材料により、その
診断が確定しているものであった。対照グループは、 1、症状のない病院通いをしていない、年令20−60
才の大人の女性(40人) 2、 非頚部上部生タハ路癌の女性(10人)からなる
。
(61人)及び頚部癌(54人)の疾患を有するju
、lljであった。すべてのGIN及び癌の場合には、
[1常的な組織病理学及びパンチ生検材料により、その
診断が確定しているものであった。対照グループは、 1、症状のない病院通いをしていない、年令20−60
才の大人の女性(40人) 2、 非頚部上部生タハ路癌の女性(10人)からなる
。
杭」L文で](験
抗原は実施例1において述べたものと同一であった。試
験も又、患者の血清を1:50に希釈し、25°Cで1
6時間抗原と共に温置した以外は同様であった。この工
程に先立って、全血清拭ネ1は、Quik−3ep I
gM単敲カラム(アイソ・ラポラ)・リーズ、オハイオ
、アメリカ合衆国(rso−Lab、 0hio。
験も又、患者の血清を1:50に希釈し、25°Cで1
6時間抗原と共に温置した以外は同様であった。この工
程に先立って、全血清拭ネ1は、Quik−3ep I
gM単敲カラム(アイソ・ラポラ)・リーズ、オハイオ
、アメリカ合衆国(rso−Lab、 0hio。
U、S、A、))を通して、 ■gG分画を除去してあ
った。
った。
ヒト血清分画を抗原と共に温置した後、抗−ヒト+gc
の代りに、1:500のペルオキシダーゼ接合化うヒ、
ト抗−ヒトIgM IOQ7LMを添加した。
の代りに、1:500のペルオキシダーゼ接合化うヒ、
ト抗−ヒトIgM IOQ7LMを添加した。
糊課
各グループの平均の光学的密度(0,0,)を第31:
Aに示したように比較した。 IgM単雌の実験(n=
12)は41均して回収率76%を示した。試験を行
った試料の80%において、IgGは比濁法によりTg
M分画中に検出されなかった。Quik−9ep単敲カ
ラムを用いて、又、血清中のリウマチ様因子との交叉反
応のof能性を排除した。
Aに示したように比較した。 IgM単雌の実験(n=
12)は41均して回収率76%を示した。試験を行
った試料の80%において、IgGは比濁法によりTg
M分画中に検出されなかった。Quik−9ep単敲カ
ラムを用いて、又、血清中のリウマチ様因子との交叉反
応のof能性を排除した。
試験1寸、次に、対照グループ及び試験グループの両名
中の IgM濃度についての実験に応用された。第2図
は実施例1 (IgG)の試験結果についてのo、n、
読取りと実施例2 (TgM)の試験結果についての読
取りを比較したものである。陽性又は陰性の結果につい
てのカッI・オフレベルは、対照グループの平均4fi
より1−の、平均値プラス3XSD(標へ6偏差)から
算出した。第2図及び第3図に示したように、対照グル
ープは試薬ブランク読取りと一致する極めて低いレベル
を示した。
中の IgM濃度についての実験に応用された。第2図
は実施例1 (IgG)の試験結果についてのo、n、
読取りと実施例2 (TgM)の試験結果についての読
取りを比較したものである。陽性又は陰性の結果につい
てのカッI・オフレベルは、対照グループの平均4fi
より1−の、平均値プラス3XSD(標へ6偏差)から
算出した。第2図及び第3図に示したように、対照グル
ープは試薬ブランク読取りと一致する極めて低いレベル
を示した。
しかしながら、肛門位のいぼをイ1する患者の54%、
GIHの患者の29%及び侵蝕頚部癌 (invasi
vecervical carcinoma)の患者の
95%は高濃度の、群特異的Pv抗原に対するTg)!
について陽性であった(第2表)。第3図に示したよう
に、定lii的に考察すると、癌グループは対照グルー
プ及び他の試験グループと比較して、極めて有意性のあ
るIgM レベル(p < 0.001)を有した。い
ぼグループと CINグループとの間には有意の相違1
士なかった。しかしながら、これらは対照グループ(p
< 0.001)とは有意に異なっていた。
GIHの患者の29%及び侵蝕頚部癌 (invasi
vecervical carcinoma)の患者の
95%は高濃度の、群特異的Pv抗原に対するTg)!
について陽性であった(第2表)。第3図に示したよう
に、定lii的に考察すると、癌グループは対照グルー
プ及び他の試験グループと比較して、極めて有意性のあ
るIgM レベル(p < 0.001)を有した。い
ぼグループと CINグループとの間には有意の相違1
士なかった。しかしながら、これらは対照グループ(p
< 0.001)とは有意に異なっていた。
箸−2−表
対11【(グループ及び試験グループからの11111
/Iについての陽性百分率対 [障 1大人のkff 38±15 2O−GOto 0(0
)2卵栄癌 55±12 45− IQ 0(0)n1
閂位のいぼ 34士I+ 17−70 52 28(5
4)コ・口部に皮1lIIl胞内の新生腫四 29±7
19−52 GI l1l(29)頚部癌 52±1
629−8358 55(85)尖1(肌] 151市ウィルス丸J←盈−グー抗−血コし乳頭腫ウィ
ルスピリオンを新鮮な、仔ウシの皮1+−Jの線維乳頭
腫から血j製しかつ精製した。ドデシル(Jt酸すI・
リウム及びβ−メルカプトエタノールをぞれそれ1%W
ハ及び2%Vハになるよう比添加して、このウィルス性
粒子を環装し、ウイスル+’l懸l蜀液を1分間煮沸し
た。抗原(BPV−3[lS)の牛白質含j11−はロ
ーリ−法(Lowry’s method)(1951
年)により測定すると 1.5B/muであった。抗n
++清は、完全及び不完全フロイント番アジュバントの
両者に溶解した抗原で免疫化されたラビットから調製し
た。このラビット血清のIgG分画をDEA E参アフ
ィニティーゲル・ブルー・クロマトグラフィ (へイオ
ーランド・ラボラトリーズ(Bio−RadLabor
atories))により単離した。平底ウェル・ポリ
スチレン板(グイナテック(Dynatech) )を
、二回ノに留を行った水で洗浄した。このウェルに0.
06M炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液(p)18.6)で希
釈したBPV−9O3抗原(0,5ルg/ウェル)10
0ル文を塗布した。ボリスチ1/ン板を湿潤綿を有する
密閉プラスチック袋内に入れ、4℃で16時間温湿した
。次に、0.05%Tween−20(PBS−720
)を含有するり’7酸1u Hli?化食塩水(pH7
,4)を用いてポリスチレン板を3回洗節した。
/Iについての陽性百分率対 [障 1大人のkff 38±15 2O−GOto 0(0
)2卵栄癌 55±12 45− IQ 0(0)n1
閂位のいぼ 34士I+ 17−70 52 28(5
4)コ・口部に皮1lIIl胞内の新生腫四 29±7
19−52 GI l1l(29)頚部癌 52±1
629−8358 55(85)尖1(肌] 151市ウィルス丸J←盈−グー抗−血コし乳頭腫ウィ
ルスピリオンを新鮮な、仔ウシの皮1+−Jの線維乳頭
腫から血j製しかつ精製した。ドデシル(Jt酸すI・
リウム及びβ−メルカプトエタノールをぞれそれ1%W
ハ及び2%Vハになるよう比添加して、このウィルス性
粒子を環装し、ウイスル+’l懸l蜀液を1分間煮沸し
た。抗原(BPV−3[lS)の牛白質含j11−はロ
ーリ−法(Lowry’s method)(1951
年)により測定すると 1.5B/muであった。抗n
++清は、完全及び不完全フロイント番アジュバントの
両者に溶解した抗原で免疫化されたラビットから調製し
た。このラビット血清のIgG分画をDEA E参アフ
ィニティーゲル・ブルー・クロマトグラフィ (へイオ
ーランド・ラボラトリーズ(Bio−RadLabor
atories))により単離した。平底ウェル・ポリ
スチレン板(グイナテック(Dynatech) )を
、二回ノに留を行った水で洗浄した。このウェルに0.
06M炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液(p)18.6)で希
釈したBPV−9O3抗原(0,5ルg/ウェル)10
0ル文を塗布した。ボリスチ1/ン板を湿潤綿を有する
密閉プラスチック袋内に入れ、4℃で16時間温湿した
。次に、0.05%Tween−20(PBS−720
)を含有するり’7酸1u Hli?化食塩水(pH7
,4)を用いてポリスチレン板を3回洗節した。
玄工皇溝ユ
6l月から12才までの乳児16人及び小児31人、臨
床的に明らかないぼの疾患を有しない大人 108人、
並びに皮瘤のいぼ及び肛門位のいぼの疾患をイーする患
者60人からヒト血清を採集した。溶血及びバクテリア
汚染を避けるように注意を払った。
床的に明らかないぼの疾患を有しない大人 108人、
並びに皮瘤のいぼ及び肛門位のいぼの疾患をイーする患
者60人からヒト血清を採集した。溶血及びバクテリア
汚染を避けるように注意を払った。
すへての血清は使用するまで一20℃で貯蔵した。
試」虻ユ
pH7,4(7)希釈緩衝液(0,05M Tris−
HCJlj、 1.0IIIMにgc:n 、0.15
M NaCu、0.05% T2O及び1%仔ウシアル
ブミンW/V)でl:100に希釈したヒト血清(又は
ラビット抗−BPV−9l)S IgGの二倍希釈物)
100pLJLを1次にウェルに添加し、ついで37℃
で2時間温性した。PBS−720で更に3回洗浄した
後、ベルオキシターゼ接合化うビット抗−ヒトIgGを
希釈緩衝液で1:800に希釈したもの(又はペルオキ
シダーゼ接合化ブタ抗−ラビットIgG、ダコ、コペン
ハーゲン、デンマーク (OAKOCopenhage
n、Denmark)) 100 u、 lを各ウェル
に添加した。ポリスチレン板をIIfび37℃で2時間
温性した。更に洗浄した後、0−フェニレンジアミン(
OPD)(メ’) / −jlz中(r) 1 %貯蔵
OPD imlを、30%H2Q 2 40 JLQを
含有するO、15Mクエン酸リン酸塩緩衝液(pH’
5.0)98 m文に加えたもの)100終りを各ウェ
ルに添加した。室温、暗所で40分間の湯煮後、5N硫
酸30IL文を添加して反応を停止にさせた。
HCJlj、 1.0IIIMにgc:n 、0.15
M NaCu、0.05% T2O及び1%仔ウシアル
ブミンW/V)でl:100に希釈したヒト血清(又は
ラビット抗−BPV−9l)S IgGの二倍希釈物)
100pLJLを1次にウェルに添加し、ついで37℃
で2時間温性した。PBS−720で更に3回洗浄した
後、ベルオキシターゼ接合化うビット抗−ヒトIgGを
希釈緩衝液で1:800に希釈したもの(又はペルオキ
シダーゼ接合化ブタ抗−ラビットIgG、ダコ、コペン
ハーゲン、デンマーク (OAKOCopenhage
n、Denmark)) 100 u、 lを各ウェル
に添加した。ポリスチレン板をIIfび37℃で2時間
温性した。更に洗浄した後、0−フェニレンジアミン(
OPD)(メ’) / −jlz中(r) 1 %貯蔵
OPD imlを、30%H2Q 2 40 JLQを
含有するO、15Mクエン酸リン酸塩緩衝液(pH’
5.0)98 m文に加えたもの)100終りを各ウェ
ルに添加した。室温、暗所で40分間の湯煮後、5N硫
酸30IL文を添加して反応を停止にさせた。
色の強度を、グイナテック(口ynatech)分光光
度計を用いて490r+mにおいて測定した。試験に用
いられたすべての試薬は滅菌し、かっ孔径0.45nm
の膜フィルターによりろ過した。
度計を用いて490r+mにおいて測定した。試験に用
いられたすべての試薬は滅菌し、かっ孔径0.45nm
の膜フィルターによりろ過した。
種// (7) e度(7) RPV−9O3抗原(0
,15−2,OOg g)又は非処理BPVピリオンを
ポリスチレン板のウェルトニ塗布し、ラビット抗−BP
V−3DS rgGノ1:100昂釈物と共に湯煮した
。第4図は、ラビット抗−RPV−3DS IgGがB
PV−SDS抗原と反応し、ソノ吸光度がウェルトに塗
布された抗原の徒に比例することを示している。更に、
第4図はO,15gg/ウェルの低濃度の抗原が尚ラビ
ッ) IgGと反応することを示している。この結果は
、本試験が高度に特異的であり、かつ高い感度を有する
ことを立証している。
,15−2,OOg g)又は非処理BPVピリオンを
ポリスチレン板のウェルトニ塗布し、ラビット抗−BP
V−3DS rgGノ1:100昂釈物と共に湯煮した
。第4図は、ラビット抗−RPV−3DS IgGがB
PV−SDS抗原と反応し、ソノ吸光度がウェルトに塗
布された抗原の徒に比例することを示している。更に、
第4図はO,15gg/ウェルの低濃度の抗原が尚ラビ
ッ) IgGと反応することを示している。この結果は
、本試験が高度に特異的であり、かつ高い感度を有する
ことを立証している。
本試験の感度を、ポリスチレン板のウェル上に塗71i
サレタ一定Q (7) IIPV−3DS抗歓(0,5
p−g) ニ、種々の希釈度のラビットIgGを添加す
ることにより測定した。1:IGOOの低い希釈度のラ
ビット−抗BPV−SDS IgGは尚、バックグラウ
ンドより上の読取り値を示した。(第51須)。
サレタ一定Q (7) IIPV−3DS抗歓(0,5
p−g) ニ、種々の希釈度のラビットIgGを添加す
ることにより測定した。1:IGOOの低い希釈度のラ
ビット−抗BPV−SDS IgGは尚、バックグラウ
ンドより上の読取り値を示した。(第51須)。
BPV−9O9抗原に対する特異的ラビットIgGの反
応速度を試験した(第6図)。RPV−9Ds抗原0、
−5ggをポリスチレン板のウェル上に塗布し、1:1
00 ニXi 釈L タラヒラl抗−BPV−9O3I
gG ト共に種々の時間フL1置した。反応速度は湯煮
期間1−1θ時間に亘って、はぼ線状であった。より長
い湯煮は最高の0.D、読取り値を示した。種々の湯煮
温度の影響も又検討したが、37°Cがよりよい結果を
もたらした。対照実験が、ELISA法における非特異
的反応性を検出するために確翫γされた。各一連の試験
において、対照として既知の陽性及び陰性の血清が用い
られた。又、ウィルス性抗原を含有しない陽性血清のみ
を試験して、ウェルへ吸着するために吸収された際、ペ
ルオキシダーゼ接合化抗−血清又は基質と反応するかど
うか調べた。更に、抗原のみを第二抗体及び基質に対し
て試験した。
応速度を試験した(第6図)。RPV−9Ds抗原0、
−5ggをポリスチレン板のウェル上に塗布し、1:1
00 ニXi 釈L タラヒラl抗−BPV−9O3I
gG ト共に種々の時間フL1置した。反応速度は湯煮
期間1−1θ時間に亘って、はぼ線状であった。より長
い湯煮は最高の0.D、読取り値を示した。種々の湯煮
温度の影響も又検討したが、37°Cがよりよい結果を
もたらした。対照実験が、ELISA法における非特異
的反応性を検出するために確翫γされた。各一連の試験
において、対照として既知の陽性及び陰性の血清が用い
られた。又、ウィルス性抗原を含有しない陽性血清のみ
を試験して、ウェルへ吸着するために吸収された際、ペ
ルオキシダーゼ接合化抗−血清又は基質と反応するかど
うか調べた。更に、抗原のみを第二抗体及び基質に対し
て試験した。
最後に、特異的ラビットIgGを非処理BPVピリオン
に対して試験した。すべての−ヒ記対照物の場合は、パ
ックグラウンドの反応レベルと同等の陰性結果の読取り
値を示した。
に対して試験した。すべての−ヒ記対照物の場合は、パ
ックグラウンドの反応レベルと同等の陰性結果の読取り
値を示した。
第1図は対照グループ、並びにljN 、肛門位のいぼ
、及び頚部癌の疾患を有する患者についての抗体レベル
(幾何平均値+標準偏差)をグラフに示したものである
。 第2図は、 IgG又はIgMを用いた場合の、対照グ
ループ、並びに肛門位のいぼ、GIN及び頚部癌の疾患
を有する患者についての抗体レベルを吸光度で示し、比
較したものである。 第3図は、対照グループ、並びに肛門位のいぼ、 CI
N及び頚部癌の疾患を有する患者についての IgM抗
体レベルを吸光度で示したものである(対開:大人の女
性1人、卵巣癌の患者2人)。 第4図は、焉弧度1:l00(1)ラビット抗−BPV
−9IISIgG (4))及び非免疫化ラビットIg
G (0)を用いた場合の吸光度を、ポリスチレン板の
ウエル−ヒニ塗布シタ、種// (7)濃度(7) R
PV−3O9抗原(0,15−2,0gg)に対してプ
ロットしたものである(点線は陽性及び陰性のカットオ
フ点を表わしている)。 第5図は、種々の希釈度のラビット抗−BPV−3O5
(6)をポリスチレン板のウェル上にfl、 7it
したBPV−9OS抗原(0,5p、g)ニ対シテ用イ
タ場合ノ、X、弧度に対する吸光度をプロットしたもの
である(点線は陽性及び陰性のカットオフ点を表わして
いる)。 第6図は、ポリスチレン板のウェル上に塗布しりBPV
−9O5抗原0.5#L[ニ対シテ希釈度1:100
(i’)ラビット抗−BPV−5O3IgGを用いた場
合の、温置時間に対する吸光度をプロットしたものであ
る。 対E、 いは゛ CIN ll矛魚 第3図 BPV−5DS才+JF、t> lUi C)Jg/ウ
ェル)第4図 ヲビ、ソトa−BPV−5DS $n肴力υ1第5図 汲置時間 (時till) 第6図
、及び頚部癌の疾患を有する患者についての抗体レベル
(幾何平均値+標準偏差)をグラフに示したものである
。 第2図は、 IgG又はIgMを用いた場合の、対照グ
ループ、並びに肛門位のいぼ、GIN及び頚部癌の疾患
を有する患者についての抗体レベルを吸光度で示し、比
較したものである。 第3図は、対照グループ、並びに肛門位のいぼ、 CI
N及び頚部癌の疾患を有する患者についての IgM抗
体レベルを吸光度で示したものである(対開:大人の女
性1人、卵巣癌の患者2人)。 第4図は、焉弧度1:l00(1)ラビット抗−BPV
−9IISIgG (4))及び非免疫化ラビットIg
G (0)を用いた場合の吸光度を、ポリスチレン板の
ウエル−ヒニ塗布シタ、種// (7)濃度(7) R
PV−3O9抗原(0,15−2,0gg)に対してプ
ロットしたものである(点線は陽性及び陰性のカットオ
フ点を表わしている)。 第5図は、種々の希釈度のラビット抗−BPV−3O5
(6)をポリスチレン板のウェル上にfl、 7it
したBPV−9OS抗原(0,5p、g)ニ対シテ用イ
タ場合ノ、X、弧度に対する吸光度をプロットしたもの
である(点線は陽性及び陰性のカットオフ点を表わして
いる)。 第6図は、ポリスチレン板のウェル上に塗布しりBPV
−9O5抗原0.5#L[ニ対シテ希釈度1:100
(i’)ラビット抗−BPV−5O3IgGを用いた場
合の、温置時間に対する吸光度をプロットしたものであ
る。 対E、 いは゛ CIN ll矛魚 第3図 BPV−5DS才+JF、t> lUi C)Jg/ウ
ェル)第4図 ヲビ、ソトa−BPV−5DS $n肴力υ1第5図 汲置時間 (時till) 第6図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、肛門位のいぼ、頚部ト―皮細胞内の新生腫筋(GI
N)及び頚部鯖状癌の診断において有用な試薬であって
、該試薬が、環装乳頭腫ウィルスピリオンの蛋白質、又
はそれらの抗原抽出物を塗布した固体状又は粒状支持体
からなることを特徴とする試薬。 2 該支持体が、ポリエチレン、カラス、ポリスチレン
、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアミド又は
ポリアクリル酸かならる群より選択されたものである4
If、i’l請求の範囲第1項記載の試薬。 3、該乳頭腫ウィルスピリオンが仔ウシ、ヒト。 ラヒッI・又はウマの乳頭腫ウィルスピリオン又はそれ
らの抗原抽出物である特許請求の範囲第1項又は第2イ
1記載の試薬。 4、該ピリオンが、乳頭腫の粉砕、ウィルス粒子の単離
及び該粒子を界面活性剤又は高濃度の塩溶液を用いて処
理して該粒子を環装することにより調製されたものであ
る特許請求の範囲第1項ないし第3項のいずれかに記載
の試薬。 5、該界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムである特許
請求の範囲第4項記載の試薬。 6、該ピリオンがドデシル硫酸ナトリウJ1及び/又は
メルカプトエタノールを用いて処理されたものである特
許請求の範囲第4項記載の試薬。 7、肛門位のいぼ、 GIN及び頚部鯖状癌の診断にお
いて有用な診断用試薬の製造法であって、該方法が、 (1)固体状もしくは粒状の支持体を、環装乳頭腫ウィ
ルスピリオン又はその抗原抽出物と接触させる工程; (2)該ピリオン又は抽出物を有する該支持体を、該ピ
リオンの蛋白質又は抽出物が該支持体に吸収又は結合す
る9に適切な一定時間及び一定温度で装置する”工程;
並びに (3)該装置支持体に固着しなかった過剰のピリオンを
除去する工程 からなることを特徴とする製造法。 8、該固体状又は粒状支持体が、ポリエチレン、カラス
、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、
ポリアミド又はポリアクリル酸からなる特許請求の範囲
第7項記載の製造法。 8、該環装乳頭腫ウィルスピリオンが仔ウシ乳頭腫細胞
から得られたものである特許請求の範囲第7項又は第8
項記載の製造法。 10、該ピリオンが、乳頭腫細胞から抽出され、かつ界
面活性剤、洗浄剤又は高濃度の塩溶液と接触させること
により環装されたものである特許請求の範囲第7項、第
8項又は第9項のいずれかに記・1&、の製造法。 11、該細胞からの該ピリオンの抽出が示差超遠心分離
によって行われたものである特許請求の範囲第10項記
載の製造法。 12、肛門位のいぼ、頚部」−皮細胞内の新生腫瘍(G
IN)及びイ宮頚部侵蝕鯖状細胞癌の診断法であって、
該方法が、 (1)環装乳頭腫ウィルスピリオンの蛋白質又はその抗
原抽出物を塗布した固体状もしくは粒状の支持体を用意
する工程: (2)該塗布支持体を一定量の体液と、該ピリオンの蛋
白質又はその抗原抽出物と該一定ル1の体液中の抗体と
の間で複合体伊形成するのに適切な条件下で接触させる
工程;並びに(3)該複合体の存在を定量的に検出する
工程からなることを特徴とする診断法。 13、該工程(3)が。 (i)該塗布支持体を洗浄して過剰な体液を除去する二
[程: (i)洗浄後、該塗布支持体を、工程(2)で形成され
た該複合体と結合可能な酵素接合化抗体と接触させる工
程; (市)該接合化第二抗体を有する該塗布支持体を、該第
二抗体が該複合体と結合するのに適切な十分な時間及び
温度で装置する二[稈:(iv)過剰の結合しなかった
第二抗体を除去するように該塗布支持体を洗浄する工程
:並びに (V)該酵素の存在を定コー1的に又は定性的に検出す
る工程 からなる特許請求の範囲f312項記載の診断法。 14、該接合化第二抗体がペルオキシダーゼ接合化抗−
ヒl−1gGである特許請求の範囲第13項記載の診断
法。 15、該体液の該試薬との接触に先立ち、 IgGが該
体液より除去される特許請求の範囲第13項記載の診断
法。 16、該第二抗体がペルオキシダーゼ接合化抗−ヒトI
gMである特許請求の範囲第13項記載の診断法。 +7.該試薬が特許請求の範囲第1項ないし第6項のい
ずれかの試薬である特許請求の範囲第12項ないし第1
8項のいずれかに記載の診断法。
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