JPS6327658B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は液体試料特に血清や尿のような生物学
的流体の熱凝集免疫グロブリン当量を定めるため
の液体試料分析方法に関するものである。本明細
書においては、記号Ag、AbおよびＡ：Agはそ
れぞれ抗原（このことばにはハプテンやその他の
抗体または同様な結合たん白質によつて結合され
うる物質を含む）、抗体（同様な結合たん白質を
含む）および抗体：抗原複合体を意味するものと
して使われる。

よく知られているように、液体特に生物学的液
体中のAb、AgまたはAb：Agの存在を知るため
にその液体を分析できるということは重要であ
る。例えば多くの病気はAb：Agの存在により特
徴づけられる。したがつてそれを検出し特性づけ
ることができれば、その病気を診断に価置ある情
報を提供することができる。Ag、Abおよび
Ab：Agを検出しそして定量する技術および特に
存在するAgの性質を決定し、その量を定量する
数多くの技術が知られている。これらの定量技術
は“免疫学的分析方法”と呼ばれている。

驚くべきことには、マウスの血清全体中には活
性な画分が含まれており、それはAb、Agおよび
Ab：Agの分析に非常に有用な試薬となり、そし
てそれを使えばこの免疫学的分析方法を簡単に
し、より精確なものにすることが本発明者らによ
り発見された。特にマウスの血清には、Ab：Ag
とは結合するが、遊離のAbまたはAgとは結合し
ない画分が含まれていることが発見された。

さらにこの画分は熱凝集した免疫グロブリンを
ラテツクスに結合した免疫グロブリンよりも優先
的に凝着させる。

従つて本発明は試料液体に(i)マウスの全血清の
活性画分、すなわち上記の性質をもつ画分、およ
び(ii)ラテツクスに結合した免疫グロブリンを混合
し、前記活性画分によりラテツクス結合免疫グロ
ブリンが凝着するのを試料が阻害する度合を測定
し、 測定の結果を、等量の前記活性画分およびラテ
ツクス結合免疫グロブリンと混合したときに同じ
度合の凝集阻害を与える熱凝集免疫グロブリンの
量で表わす、液体試料分析方法を提供する。

本発明に使われるマウス血清活性画分は真性グ
ロブリン（euglobulin）である。その性質のある
ものは、人間のC1qに近似している。例えばそれ
はAb：Agと結合するが、遊離のAbまたはAgと
は結合しない。それはIOSの沈降定数をもつてい
る。それは選択的にIgGおよびIgMと結合するが
IgAとはしない。それはIgGまたはIgMでコーチ
ングされたラテツクス粒子と凝着する。そしてそ
れはIgGのFc鎖の人間のC1qが付着するのと同じ
部分に付着する。しかしその他の点ではそれは人
間のC1qとは全く異なる性質をもつている。例え
ばそれは高いPH値例えば８以上、特に9.2以上で
も活性を残している。（このようなPH値では人間
のC1qは不活性である）。その活性は0.1Mプトレ
シンまたは0.1Mヒドラジンによつても失われな
い。

マウスの活性画分は当業界で普通に使われる分
離技術、例えば人間の血清から人間のC1qが得ら
れるのと同様な方法によつて得られる。すなわち
例えばマウスの全血清を、（グルタールアルデヒ
ドによつて）それに結合した人間のIgGをもつア
ミノ化されたアガローズ（agarose）のクロマト
グラフカラムを通すことによつて、マウス血清の
活性画分が吸着されている。次いでその画分を
1M塩化ナトリウム溶液によつて溶離することが
できる。溶離物から塩化ナトリウムを透析によつ
て分離し、そして最後に活性画分をGBS（0.1Mグ
リシン−塩酸緩衝液、PH9.2）中に溶解すること
ができる。

人間の血清や馬、山羊および家兎のような他の
動物の血清はそのような画分をもつているとは思
われないから、マウスの血清が人間のC1qとは異
なる性質をもつ活性画分を含んでいることは予期
できないことである。マウス血清の活性画分と人
間のC1qとの間の性質の差違は人間の血清の分析
（後出）に実質的な利点を与えてくれる。

マウスの血清の活性画分が人間のC1qに似てい
るかぎりにおいて、人間のC1qと同様な方法で分
析に使うことができる。人間のC1qを分析に使用
することは本発明者らの英国特許出願第21619／
75号明細書に記載されており、これをさらに詳し
く参照すべきである。

人間のC1qの代りにマウス血清の活性画分を分
析に使うことの重要な利点はマウスの血清全体を
使うことができるということである。活性画分を
分離して取出すことは必須ではないし、通常その
必要さえない。対照的に人間のC1qを試薬として
使う大抵の分析では人間の血清全体を使うことは
不可能である。C1qは分離して取出さねばならな
い。このような分離工程を避けられることは非常
に有利である。さらにまたマウス血清は人間の
C1qよりもはるかに使い易い。それゆえにそれは
より経済的な試薬を提供する。

本発明の好ましい実施態様の中には次のものが
含まれる。

免疫グロブリンIgGもしくはIgMでコーチング
されたラテツクス粒子の既知量を試料液体に加
え、そしてまたある量の活性画分をも液体に加
え、こうしてできた混合物をインキユベートし、
そして凝着しない粒子の数を計数し、そしてそれ
によつて試料液体中の熱凝集免疫グロブリン当量
を計算することから成る、液体試料分析方法。こ
こで液体試料中に分析されるべきAbまたはAgに
対するAgまたはAbを加えて免疫グロブリンを生
成させ、分析を行うことにより、被験Abまたは
Agの量を熱凝集免疫グロブリン当量から導くこ
ともできる。

ラテツクス粒子の大きさは好ましくは0.8〜1.1
ミクロンである。

人間のC1qを使つての人の血清試料の分析にお
いては、血清そのものが人間の補体C1を含む事
実を考慮しなければならない。添加される試薬と
して人間のC1qを使う血清分析においては、血清
試料中のC1qによる妨害を避けるために、先ず試
料中のC1qの不活性化処理をしなければならな
い。このための１つの技術は血清を約56℃に加熱
しそしてその温度に約30分間保つことである。し
かしながらこの処理は自然本来のC1qを不活性に
するけれども、次に行なう分析の精度を低下させ
るというマイナスの作用を及ぼす。

本発明によれば、試薬としてマウスの血清（も
しくは分離された活性画分）を使うことによつ
て、そして例えば9.2というような高いPHで分析
を行なうことによつて人間の血清を分析するとき
にこの加熱工程の必要性を避けることができる。
高いPHでは被験血清中の人間のC1qは不活性であ
る。しかしマウス血清の試薬は活性を保つ。一
方、分析を0.1Mヒドラジンまたは0.1Mプトレシ
ン（テトラメチレンジアミン）の存在下に行なう
ことができる。この条件下では人のC1qは不活性
であるがマウス血清は活性である。マウス血清の
これらの性質により自然のC1qによる妨害を避け
ることができる。

人間の血清の分析においてマウス血清（または
その活性画分）を使うことは従つて大いに有利で
ある。

本発明の方法は当業界で知られている連続流れ
式技術によつて有利に行なうことができる。連続
流れ式分析においては、マウス血清は人間のC1q
よりも便利に試薬として使うことができる。人間
のリウマトイド因子に使うマニホルドおよびイン
キユベーシヨン系は、マウス血清にも使えるが人
間のC1qには使えないからである。BALBCまた
はDBA2株のマウスからの血清を使うことが好ま
しい。マウス血清は使用時に通常約1/25ないし約
１／７５に希釈される（しかし精確な希釈は意図する
特殊な用途によつて定まる）。この希釈には溶媒
として、例えば苛性ソーダでPH9.2に調整したそ
して0.15M MaClを含む、0.1Mグリシン緩衝液
を使う。

以下本発明をその実施例につきさらに説明す
る。

例 １ マウス血清はIgGでコーチングされたラテツク
ス粒子および熱凝集したIgGの凝集を起こさせる
が、マウス血清の活性画分は熱凝集したIgGと優
先的に反応する。

すなわち、ある量のマウス血清をIgGでコーチ
ングされたラテツクス（ラテツクス−IgG）粒子
と混合すると、粒子の凝着が起こる。もし熱凝集
したIgGをここで加えると、マウス血清からの活
性画分は熱凝集IgGを凝着するのに取られ、結局
ラテツクス−IgGの凝着は残らなくなる。マウス
血清の活性度はラテツクス−IgGの凝集を防ぐた
めに必要な熱凝集IgGの量によつて表わされる。
従つて人間の血清試料によりマウス血清によるラ
テツクス−IgGの凝着を同じ程度まで防ぐことが
できればその試料の活性度を相当する熱凝集IgG
当量によつて表わすことができる。50人の健康な
供血者からの血清について試験を行なつたとこ
ろ、この活性度は最高10μｇ／ml熱凝集IgG当量
（EHA IgG）であることがわかつた。

75人の多発生硬化症患者からと58人の甲状腺障
害の患者からの人間の血清の活性度も測定された
が、多発生硬化症患者では30％が血清の活性度
10μｇ／ml（EHA IgG）以上を示し、そして甲
状腺障害患者では65.5％が血清活性度10μｇ／ml
（EHA IgG）以上を示した。このような比較的
高い活性は免疫複合体が血清中に存在することを
示す。（この免疫複合体は健康な患者の血清中に
は存在しないかあるいは実質的に存在しない。） マウス血清は免疫複合体のあるものに対しては
他のものに対するよりも貧欲性をもつている。
RFも同様に免疫複合体に対して種々の貧欲性を
もつている。従つて免疫複合体の存在を定めるた
めの人間の血清の試験では、マウス血清とRFの
両方の試験を平行して行なうことが望ましい。
（RFの使用に関する情報については本発明者らの
英国特許出願第21619／75号明細書を参照された
い。） 例 ２ (1) マウス血清の調製 マウス血清はGBS（0.1Mグリシン−HCl緩衝
液、PH9.2、0.17M NaCl含有）中で希釈され
る。希釈範囲はマウス血清のバツチによるが、
１／５０〜1/80の範囲である。

(2) 分析前の患者の血清の調製 50mM EDTAを含むGBS（PH9.2）170μに
血清50μを加え、次いで1.5mMジチオトレイ
トール（15μ）で37℃で15分間還元する。次
に試料を0.2％H₂O₂15μで再び酸化する。

この血清試料の還元は阻止過程に干渉するこ
とのある凝着要因を取除く目的で行なう。再酸
化はマウス血清の凝着要素を破壊することのあ
る残留ジチオトレイトールを不活性にするため
に必要である。この処理は血清中の内因のC1q
を限られた範囲までは不活性にするが、その主
目的はRFのような他の凝着要素を不活性にす
ることである。C1qを完全に不活性にすること
はPH9.2で分析を行なうことによつて達成され
る。

(3) ラテツクスの調製 ダウケミカル社製品のポリスチレン粒子
（0.794μ）を人間のIgGで次のようにしてコー
チングする。５倍に希釈したGBS 400μに
IgGの１％（重量／容量）溶液25μ、人間の
血清アルブミン（西独ベーリングベルゲ社製
品）１％（重量／容量）溶液150μおよびラ
テツクスの10％（重量／容量）懸濁液50μを
加える。数秒間のかきまぜと室温で45分間イン
キユベーシヨンの後懸濁液を10000回転／分の
遠心分離器に５分間かけ、粒子を希釈した
GBS1mlで１回洗い、そして最後に牛の血清ア
ルブミン１％（重量／容量）を含むGBS 10ml
中に再懸濁する。

(4) 自動化分析 上記した血清試料マウス血清およびラテツク
ス懸濁液の同量（70μ）をいつしよにマニホ
ルドに吸入する。インキユベーシヨン時間は10
分間である。インキユベーシヨン後混合物はト
ウイーン20（Tween 20）0.1％を含むGBSで自
動的に2000倍に希釈され、そして凝着しないラ
テツクス粒子は上方および下方の入口をもつ光
学的自動計数器中で数えられる。この計数器は
テクニコン社製の差動セル計数器（商品名：
PACIA）であり、操作条件は37℃、PH9.2（差
動PH範囲は７〜9.2、最適値9.2）である。ま
た、この操作には計数を4000粒／秒の最高に制
限するためにラテツクス懸濁液を2000倍に希釈
することが必要である。

(5) 試験結果 マウス血清を連続的に２倍にうすめて行く試
験結果では第１図の凝着曲線が得られた。縦座
標は記録計におけるピークの高さを表わし、こ
の高さは遊離（凝着しない）の粒子の数に直接
比例する。

標準曲線（第２図）はGBS中の熱凝集IgGの
濃度にある範囲のもので定められた。これらの
結果は熱凝集した人間のIgG当量のμｇ／mlで
表わされている。この熱凝集IgGは人間の血清
プールからDEAE−セルロースクロマトグラフ
イによつて作られ、そして30分間63℃に加熱し
て凝集された。第３図は健康な供血者、乳ガン
患者および全身紅斑性狼瘡患者の血清によつて
マウス血清によるラテツクス−IgGの凝着が阻
害される結果を表わしている。標準値の上限は
7μｇ／ml熱凝集IgG当量である。

【図面の簡単な説明】

第１図はマウス血清を連続的に２倍にうすめて
行くときの希釈度と、遊離粒子の数に比例する記
録計におけるピークの高さとの関係を示す線図で
あり、第２図はGBS中の熱凝集IgGの濃度とピー
クの高さとの関係を示す線図であり、そして第３
図は健康人および患者の血清によるラテツクス−
IgG凝着阻害の結果を示す分布図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 試料液体に(i)マウスの全血清の活性画分、す
   なわち遊離の抗体（Ab）または抗原（Ag）とは
   結合しないが、抗体：抗原複合体（Ab：Ag）と
   は結合する性質および熱凝集した免疫グロブリン
   をラテツクスに結合した免疫グロブリンよりも優
   先的に凝着させる性質をもつ画分、および(ii)ラテ
   ツクスに結合した免疫グロブリンを混合し、 前記活性画分によりラテツクス結合免疫グロブ
   リンが凝着するのを試料が阻害する度合を測定
   し、 測定の結果を、等量の前記活性画分およびラテ
   ツクス結合免疫グロブリンと混合したときに同じ
   度合の凝着阻害を与える熱凝集免疫グロブリンの
   量で表わす、液体試料分析方法。 ２ 活性画分をマウスの全血清の形で添加する前
   項１に記載の方法。 ３ 試料液体がヒトの生物学的流体である、前項
   １に記載の方法。 ４ 分析を0.1Mプトレシンまたは0.1Mヒドラジ
   ンの存在下に行なう前項１に記載の方法。 ５ 連続流れ方式で行なう、前項１に記載の方
   法。 ６ ラテツクスとして粒子サイズが約0.8〜1.1ミ
   クロンのものを使う、前項１に記載の方法。 ７ 凝着阻害の度合を、凝着しなかつたラテツク
   ス粒子の数を光学的に計数することによつて計測
   する、前項１に記載の方法。 ８ 分析を少なくともPH８で行なう、前項１に記
   載の方法。 ９ 分析を少なくともPH9.2で行なう、前項８に
   記載の方法。