JPS63191960A - リガンドのアッセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、生物学的試料中の種々のリガンドの存在を確
認するのに用いるアッセイ法に関する。

本発明はさらに、生物学的試料中のリガンドの存在の確
認に用いることのできる微粒子リガンドアッセイ法に関
する。

［従来技術］ 今日、試料中に存在するリガンドを検出もしくは確認す
るための種々の診断学的アッセイ法が用いられている。

そのようなアッセイ法の例とじては、抗原や抗体のよう
なリガンド特異的結合物質を固体用」二にコーティング
し、当該リガンドを含有すると思われる生物学的試料と
接触させることによる直接サンドイッチイムノアッセイ
法が挙げられる。固体用はついで酵素、蛍光標識もしく
は放射性同位元素のような適当な標識で標識したリガン
ド特異的結合物質と接触させる。ついで標識を検出して
試料中のリガンドの存在または量を決定する。直接サン
ドイッチアッセイの一つの例は、Ｂ型肝炎表面抗原検出
のためのアウスザイム（Ａｕｓｚｙｍｅ　　）イムノア
ッセイであり、これはアボット・ラボラトリーズから利
用可能である。

アッセイの別の例は、固体用もしくは標識試薬」二のリ
ガンド特異的結合部位にリガンド試薬が結合するのをリ
ガンドが競合らしくは阻止する能力を測定して生物学的
試料中のリガンドを検出する競合的もしくは阻止イムノ
アッセイ法である。そのような競合的イムノアッセイ法
の一つの例は、Ｂ型肝炎コア抗原に対する抗体のアッセ
イのためのクラブ（Ｃｏｒａｂ　　）イムノアッセイ法
であり、これもアボット・ラボラトリーズから利用可能
である。

試料中のリガンドを検出するためのアッセイ法のさらに
別の例は、トウヒン（Ｔｏｗｂｉｎ）およびゴートン（
Ｇｏｒｄｏｎ）（Ｊ　、　　Ｉ　ｍｍｕｎ、　Ｍｅｔｈ
、　、７２　：３１３−３４０、ｌ　９８４　’）によ
り記、戟されたウェスタンブロッティング法である。こ
の方法は、ドデンル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド
ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上での抗原や抗体のような知
られたりガン自゛特異的結合物質の電気泳動を含む。

リガンド特異的結合分子はゲル上に特徴的なバンドパタ
ーンを生じる。このバンドパターンを電流を流しながら
５ＤＳ−ＰＡＧＥからニトロセルロースフィルター紙に
移す。ついでニトロセルロースフィルター紙を、当該リ
ガンドを含有する生物学的試料ととらにインキュへ−１
・する。試料中に存在するリガンドで既知のリガンド特
異的結合物質に対し特異的なものはすべてニトロセルロ
ースフィルター紙に結合し、抗原−抗体複合体のような
複合体を形成する。特徴的なバンドパターンとの抗原−
抗体複合体は、標識したリガント特異的結合物質を該抗
原−抗体複合体に対して用いることにより視覚化するこ
とができる。しかしながら、ウェスタンブロッティング
法は非常に長時間を要するとともに技術的に難しい方法
であり、高価な装置と高度に訓練された熟練者を必要と
する。それゆえ、この方法は多くの工場で実行できる方
法ではない。

さらに別のアッセイ法は、当該リガントに対し陽性と思
われる試料を確認するための中和法である。リガンド特
異的結合物質（通常は抗体乙しくは抗原）を中和試薬と
して用い、これを別のアッセイ法で陽性と前以て試験さ
れた生物学的試料に加える。真に陽性の試料では、中和
試薬は当該リガンドと結合し、当該リガンドが他のいか
なる試薬とら結合するのを妨害する。中和試薬を含有す
る生物学的試料は、ついで上述したようなイムノアッセ
イ法でアッセイする。市販て検出したリガンドにおける
場合上りら減少したときは、試料が中和され真に陽性で
あることが示される。この中相法は、ある種のアッセイ
法、たとえばアウスザイム■確認中和アッセイ（アボッ
ト・ラボラトリーズ）のようなり型肝炎表面抗原アッセ
イを確認するのに非ｆに役立つものである。しかしなが
ら、そのようなアッセイ法の一つの問題点は、中和試薬
がイムノアッセイに用いた固体相と非特異的に反応して
アッセイ結果が不確かとなることである。

［発明の構成および効果］ まず発明の理解を容易にするために、本明細書に使用す
る用語につき説明する。

本発明において「リガンド」なる語は、抗原、抗体、ハ
プテン、ホルモンおよびその受容体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、
および特異的結合物質を有し得る他の有機物質を指す。

本発明のアッセイ法により決定し得る代表的なリガンド
は、ウィルス性抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、リケッ
チア性抗原、腫帛に関連する抗原、およびそれら抗原に
対応する抗体、およびＤＮＡらしくはＲＮＡである。

本明細書において使用する「生物学的試料」なる語は生
物学的流体を指し、これにはヒト血清、血清、唾液、尿
または組織培養流体のようなヒトの生物学的流体を含む
。

「試薬」なる語は、イムノアッセイの工程で添加する成
分を指す。そのような試薬には、たとえば中和試薬が含
まれる。

「アッセイ」なる語は、リガンドの検出に用いるあらゆ
る試験システムを指す。

本発明は、中和微粒子を用いて生物学的試料中のリガン
ドの存在を確認するためのアッセイ法に関するものであ
る。すなわち本発明は、（ａ）生物学的試料を、アッセ
イしようとするリガンドに特異的な結合物質をコーティ
ングした中和微粒子と接触させ、 （ｂ）生物学的試料から該中和微粒子を取り除き、つい
で （ｃ）該中和微粒子によってリガンドが取り除かれたか
どうか決定するために、リガンドか存在するかどうかに
ついて生物学的試料を再び試験することを特徴とする、
該リガンドに特異的な結合物質を用いたアッセイ法によ
り前以て試験して該リガンドに対し陽性であると認めら
れた生物学的試料中のリガンドの存在を確認するための
中和アッセイ法に関するものであり、また、（ａ）生物
学的試料を、Ｂ型肝炎コア抗原をコーティングした中和
微粒子と接触させ、 （ｂ）生物学的試料から該中和微粒子を取り除き、つい
で （ｃ）該中和微粒子によってＢ型肝炎コア抗原に対する
抗体（抗トＩＢｃ）が取り除かれたかどうか決定するた
めに、抗ＨＢ　ｃが存在するかどうかについて生物学的
試料を再び試験する ことを特徴とする、抗ＨＢ　ｃに特異的な結合物質を用
いたアッセイ法により前以て試験して抗ＨＢｃに対し陽
性であると認められた生物学的試料中の抗ＨＢｃの存在
を確認するための中和アッセイ法に関する乙のである。

本発明の方法では、リガンド特異的結合物質を、大きさ
が０，１〜ｌＯミクロンのラテックス、プラスチック、
磁性物質らしくはポリマー物質、または当業者によく知
られた他の顕微鏡的粒子のような微粒子（以下、中和微
粒子という）に共有結合的または非共有結合的に結合さ
せる。中和物質は、前以て行ったアッセイ（原アッセイ
）で当該リガンドにつき陽性と前以て認められた生物学
的試料ととらにインキュベートする。リガンドは、もし
生物学的試料中に真に存在するならば中和微粒子と結合
するであろう。リガンドの結合した中和物質は、ついで
遠心分離、重力、磁場または鐸過のような方法により試
料から取り除く。ついで試料を原アッセイにて再び試験
する。このときリガンドは、試料中に存在していたなら
ば中和微粒子によって取り除かれているので陰性を示す
はずである。

微粒子を用いる本発明のアッセイ法は、生物学的試料中
のＢ型肝炎コア抗原に対する抗体（抗１−ＩＩ３ｃ）の
存在を確認するのに特に有用である。微粒子を用いる本
発明の中和アッセイ法はまた、他の多くのリガンドの検
出アッセイにも応用することができる。

つぎに本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限定される乙のではない。

実施例１ この実施例は抗ＨＢ　ｃの存在を確認するだめの中和ア
ッセイに係わる乙のである。このアッセイでは、まず微
粒子に中和試薬としてのＢ型肝炎コア抗原をコーティン
グする。微粒子にコーティングするＢ型肝炎コア抗原は
、原アッセイに使用したＢ型肝炎コア抗原とは異なる乙
のであるか採取源の異なる乙のであることが好ましい。

たとえば、原アッセイに組換えＤＮＡ法に由来するＢ型
肝炎コア抗原を自存する固体用を使用したときは、中和
アッセイ法の微粒子にコーティングするものにはヒトか
ら採取した天然のＢ型肝炎コア抗原を用いるのが好まし
い。中和試薬は、コルザイムもしくはコラブイムノアッ
セイ（アボット・ラボラトリーズ、アボット・パーク、
イリノイから利用可能）のようなイムノアッセイで抗Ｈ
Ｂｃに対し陽性と示された生物学的試料とともにインキ
ュベートする。４〜５０℃で１〜２４時間インキュベー
トした後、抗）−Ｉ　Ｂ　ｃの結合した中和試薬は遠心
分離により試料から取り除く。ついで試料を原抗ＨＢｃ
イムノアッセイで再試験する。試料の再試験で否定的な
結果が得られることにより、原アッセイの結果が肯定的
であったことが確認できる。

上記抗ＨＢ　ｃの中和アッセイでは２種の試薬が必要で
ある。すなわち、（１）中和試薬・Ｂ型１汗炎コア抗原
でコーティングされた微粒子、および（２）対照として
働くＢ型肝炎コア抗原以外のタンパク質でコーティング
しｒこ微粒子（対照微粒子）である。そのようなタンパ
ク質の例としては、ウノ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）
、オバルブミンおよび大腸菌タンパク質などを挙げるこ
とができる。上記２種のコーティング微粒子の調製の概
略を以下に述べる。

（１）微粒子のイオン交換 ポリスチレンカルボキシル化微粒子（０，４９８ミクロ
ン、セラガン、インディアナポリス、インディアナ）を
、蒸留水で固体濃度ｌＯ％となるよウニ希釈スル。ｌＯ
％固体溶液１５ｍ（１，＝ＡＧ　５０ｌ−Ｘ８イオン交
換樹脂（バイオ−ラド・ラボラトリーズ、リッチモンド
、カリフォルニア）９．０９を加える。得られた溶液を
シェーカーらしくはエンドオーバーエンドローチーター
（ｅｎｄ　−ｏｖｅｒ　−ｅｎｄ　　ｒｏｔａｔｏｒ）
上に室温で２時間置く。荒く磨いた焼結ガラス漏斗を通
して溶液を吸引することにより微粒子を分離する。微粒
子を含有する１液を取って置き、１液か清澄になるまで
樹脂を蒸留水で洗浄し、洗浄液はすべて取って置く。１
液を合わせ、４０００ｍｇで３０分間遠心分離してすべ
ての微粒子をペレット化する。上澄み液を静かに取り除
き捨てる。ペレットを最終容量が６０１１＆（固体２５
％に相当）になるように蒸留水中に再び懸濁する。

（２）タンパク質による微粒子のコーティング上記（１
）のイオン交換した微粒子に、ＥＤＡＣ［ｌ−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピルカルポジイミド）］
　（０、２１７９７ｍ（ｌ蒸留水溶液）、１５ｍＭ　　
ＭＥＳ［２−（ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］（
ｐＨ４，７５）１７．５ｍ（７、およびタンパク質溶液
（Ｂ型肝炎コア抗原、または対照微粒子としての大腸菌
タンパク質）２．５．ｖＣを加える。微粒子溶液をエン
ドオーバーエンドローチーターに４５℃で１時間置＜。

インキュベーション後、コーティングした微粒子を４０
００ｍｇで３０分間遠心分離する。上澄み液を取り除く
。ベレｙト化した微粒子をリン酸緩衝食塩溶液（ｐｉ−
Ｉ　７　、２　）および０．１％ツイーン２０の２５．
０ｘ＋７中に再懸濁して洗浄し、上記（１）と同様にし
て遠心分離する。上澄み液を取り除き、洗浄工程をらう
２回繰り返す。

３回目の遠心分離の後、微粒子ペレットを５０ｍＭトリ
スバッファー、１．５０　ｍＭ　　ＮａＣ＋（１）Ｈ８
，０）および防腐剤の２，０酎中に再懸濁し、２〜８℃
で保存する。

（３）抗ＨＢ　ｃ中和アッセイの手順 抗１−Ｉ　Ｂ　ｃ中和アッセイの手順は第１図に図式化
しである。

第１図に示すように、該抗１−Ｉ　Ｂ　ｃ中和アッセイ
は、コルザイムおよびコルブイムノアッセイを含む抗Ｈ
Ｂ　ｃアッセイと併用して行なわれるように設定される
。そのアッセイは下記手順で行なわれ（イ）抗ＨＢ　ｃ
アッセイにて前以て陽性とされた試料をＢ型肝炎コア抗
原（ＨＢｃＡｇ）でコーティングした微粒子とインキュ
ベートする。もし試料中に抗ＨＢ　ｃか存在しておれば
、それは中和微粒子に結合する。

（ロ）該中和微粒子を遠心分離にて溶液から除く。

（ハ）その上澄み液を抗）［Ｂｅアッセイにて試験する
。

対照として、中和微粒子の代わりに牛血清アルブミン（
Ｂ　Ｓ　Ａ）でコーティングした微粒子を用いる。

以下にこの手順について具体的に示す。

抗Ｉ−Ｉ　Ｂ　ｃアッセイにて陽性と認められたヒト血
清らしくは面質試料０．２５ｘ＆を、面性の中和試薬１
０μぐとともに２時間インキュベートする。

別の試料０．２５ｘＱ、を対照微粒子ｌＯμＱとともに
２時間インキュベートする。インキュベーションは室温
で行う。インキュベーション後、試料を高スピード、た
とえば１０，０００Ｘｇで３時間遠心分離して試料から
中和微粒子を取り除く。ついて上澄み試料を取り除き、
原抗ＨＢ　ｃアッセイで再びアッセイする。抗Ｉ−ｔ　
Ｂ　ｃの有意の中和（たとえば２０％より大きい）によ
り真の抗ＨＢ　ｃ反応性が確認される。中和が認められ
ないことは、試料が陽性であることは間違いであるかま
たは原アッセイで間違いの起こったことを意味する。

抗１−Ｉ　Ｂ　ｃアッセイ（コルザイムイムノアソセイ
、アボット・ラボラトリーズ、アボット・パーク、イリ
ノイ）を用いた中和を決定する／−めの可能な計算法を
第を表に示す。２０％より大きな％中和を示す試料は陽
性と認められる。２０％未満の％中和を示す試料は陰性
と認められる。第２表には抗１−Ｉ　Ｂ　ｃ陰性および
陽性の一群の試料を試験したときの結果を示す。抗１−
（Ｂｅアッセイ（コルザイムイムノアッセイ）で陽性で
あったすべての試料は抗１（Ｂ　ｃ中和アッセイで中和
された。抗Ｉ−（Ｂ　ｃアッセイで反応しなかった試料
は抗Ｉ（Ｂ　ｃ中和アッセイでは陰性であった。

第１表　％中和の計算法 抗ＨＢ　ｃ陰性（４８）　　ｌ　　　４７　　　１　　
４７抗ＨＢｃ陽性（３３）３２　　１　　　３２　　１
陽性：％中和が２０％より大きい 微粒子中和アッセイには有利な点か多くある。

第１に微粒子を結合物質でコーティングすることによっ
て中和試薬を試料から分離するのが容易になり特異性を
高める。従来の確認中和アッセイにおけるようにリガン
ド特異的結合物質が取り除かれないと、それは再試験の
ときに固体相に結合し得る。このことは抗ＨＢ　ｃに対
するコルザイムイムノアッセイのような幾つかのアッセ
イにおいて不確かな結果を生じることになる。第２に微
粒子は取り扱いが容易である。微粒子は短時間の遠心分
離で溶液から取り除くことができる。第３に中和アッセ
イは室温でも高温でら冷却温度で６行うことができる。

第４に中和アッセイは陽性試料を疑う余地なく確認する
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の抗■（Ｂ　ｃ中和アッセイの手順を示
す略図である。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）生物学的試料を、アッセイしようとするリ
   ガンドに特異的な結合物質をコーティングした中和微粒
   子と接触させ、 （ｂ）生物学的試料から該中和微粒子を取り除き、つい
   で （ｃ）該中和微粒子によってリガンドが取り除かれたか
   どうか決定するために、リガンドが存在するかどうかに
   ついて生物学的試料を再び試験することを特徴とする、
   該リガンドに特異的な結合物質を用いたアッセイ法によ
   り前以て試験して該リガンドに対し陽性であると認めら
   れた生物学的試料中のリガンドの存在を確認するための
   中和アッセイ法。
2. （２）該リガンドがＢ型肝炎コア抗原に対する抗体であ
   る特許請求の範囲第（１）項記載の中和アッセイ法。
3. （３）該中和微粒子が遠心分離により取り除かれる特許
   請求の範囲第（１）項記載の中和アッセイ法。
4. （４）該中和微粒子上の該結合物質が、事前試験に用い
   た結合物質とは異なるものであるがまたは異なる採取源
   から得られたものである特許請求の範囲第（１）項記載
   の中和アッセイ法。
5. （５）該生物学的試料が、中和微粒子とともに対照微粒
   子を用いてアッセイされる特許請求の範囲第（１）項記
   載の中和アッセイ法。
6. （６）（ａ）生物学的試料を、Ｂ型肝炎コア抗原をコー
   ティングした中和微粒子と接触させ、 （ｂ）生物学的試料から該中和微粒子を取り除き、つい
   で （ｃ）該中和微粒子によってＢ型肝炎コア抗原に対する
   抗体（抗ＨＢｃ）が取り除かれたかどうか決定するため
   に、抗ＨＢｃが存在するかどうかについて生物学的試料
   を再び試験する ことを特徴とする、抗ＨＢｃに特異的な結合物質を用い
   たアッセイ法により前以て試験して抗ＨＢｃに対し陽性
   であると認められた生物学的試料中の抗ＨＢｃの存在を
   確認するための中和アッセイ法。
7. （７）該中和微粒子が遠心分離により取り除かれる特許
   請求の範囲第（１）項記載の中和アッセイ法。
8. （８）該中和微粒子上のＢ型肝炎コア抗原が、事前試験
   に用いた抗ＨＢｃに特異的な結合物質とは異なるもので
   あるかまたは異なる採取源から得られたものである特許
   請求の範囲第（１）項記載の中和アッセイ法。