JPS60143772A - モノクロ−ナル抗体によるｂ型肝炎診断キツト - Google Patents
モノクロ−ナル抗体によるｂ型肝炎診断キツトInfo
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- JPS60143772A JPS60143772A JP24812883A JP24812883A JPS60143772A JP S60143772 A JPS60143772 A JP S60143772A JP 24812883 A JP24812883 A JP 24812883A JP 24812883 A JP24812883 A JP 24812883A JP S60143772 A JPS60143772 A JP S60143772A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5761—Hepatitis B
- G01N33/5762—Hepatitis B core antigen
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ａ、産業上の利用分野
本発明はＢ型肝炎ウィルスに対するモノクローナル抗体
を使用したＢ型肝炎診断キットに関する。
を使用したＢ型肝炎診断キットに関する。
ｂ、従来技術
Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ ）については現在３種の抗
原抗体系が知られている。すなわちまず第１は、Ｂｌｕ
ｍ’ｔ）ｅｒｇら（１９６５’）によって発見され、オ
ーストラリア抗原と呼ばれている表面抗原（ＨＢ８Ａｇ
）であり、ＣＪｏｕ、ｒｎａｌ ｏｆｔｈｅ Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ
（１９６５）１９１、５４１−５４６ ’］］第 Ｆｉ
Ｄａｎｅ粒子と称せられたＨＢＶ内部のコア抗原［（１
９７１）、 Ｌａｎｃｅｔｌ、 １２２５−１２２７
］であり、第３はＭａｇｎｉｕ８及びｉｃａｐｍａｒｋ
（１９７２） ＣＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ１０９、１０１７−１０２１ ’）によって
血清中に認められ、コア粒子内部に含まれているとされ
るＣ Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９７９） ］ ａＢｅ
抗原である。
原抗体系が知られている。すなわちまず第１は、Ｂｌｕ
ｍ’ｔ）ｅｒｇら（１９６５’）によって発見され、オ
ーストラリア抗原と呼ばれている表面抗原（ＨＢ８Ａｇ
）であり、ＣＪｏｕ、ｒｎａｌ ｏｆｔｈｅ Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ
（１９６５）１９１、５４１−５４６ ’］］第 Ｆｉ
Ｄａｎｅ粒子と称せられたＨＢＶ内部のコア抗原［（１
９７１）、 Ｌａｎｃｅｔｌ、 １２２５−１２２７
］であり、第３はＭａｇｎｉｕ８及びｉｃａｐｍａｒｋ
（１９７２） ＣＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ１０９、１０１７−１０２１ ’）によって
血清中に認められ、コア粒子内部に含まれているとされ
るＣ Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９７９） ］ ａＢｅ
抗原である。
［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ工ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２２
．２７５ ２７９ 〕。
．２７５ ２７９ 〕。
これらＨＢＶの３種の抗原について人由来の血清および
免疫血清を用いて抗原性の解析がなされている。
免疫血清を用いて抗原性の解析がなされている。
しかし、ＨＢＢ抗原のサブタイプは４稗に大別されてい
るが、他の抗原については不明な点が多い。
るが、他の抗原については不明な点が多い。
最近、Ｋ６ｈｌｅ ｒおよびＭｉｌＳｔｅｉｎ （１９
７５）ＣＮａｔｕｒｅ ２５６．４９５−４９７’）は
細胞融合の技術によって、モノクローナル抗体を分泌す
るノ・イブリドーマを作製し、免疫学の分野に太きな影
響をもたらした。ＨＢＶではＨＢｓはすでにモノクロー
ナル抗体が作製され、サブタイプ特異的な抗体が得られ
ているＣ （１９８０）医学の歩み１１３．１６−１８
． （１９８０）、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＶｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ ＭｅｔｈＯｄ８．１．２５７−２７３．
（１９８１）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０
．２２５−２３２参照］。まだ、ＨＢｅ抗原に対しても
モノクローナル抗体が作られ、これを用いて抗原決定基
の解析がされているＣ （１９８２）、 Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ 工ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１２８、６９−７２
） 。
７５）ＣＮａｔｕｒｅ ２５６．４９５−４９７’）は
細胞融合の技術によって、モノクローナル抗体を分泌す
るノ・イブリドーマを作製し、免疫学の分野に太きな影
響をもたらした。ＨＢＶではＨＢｓはすでにモノクロー
ナル抗体が作製され、サブタイプ特異的な抗体が得られ
ているＣ （１９８０）医学の歩み１１３．１６−１８
． （１９８０）、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＶｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ ＭｅｔｈＯｄ８．１．２５７−２７３．
（１９８１）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０
．２２５−２３２参照］。まだ、ＨＢｅ抗原に対しても
モノクローナル抗体が作られ、これを用いて抗原決定基
の解析がされているＣ （１９８２）、 Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ 工ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１２８、６９−７２
） 。
Ｃ９発明の目的および構成
本発明は従来、解決されていないＨＢＣ抗原に対するモ
ノクローナル抗体を作製し、それを使用することにより
Ｂ型肝炎診断キットを完成したものであシ、Ｂ型肝炎コ
ア抗原（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｃｏｒｅ Ａｎｔｉ
ｇｅｎ ）に対するモノクローナル抗体を結合させたガ
ラスピーズ、プレートなどの担持体とＢ型肝炎コア抗原
に対するモノクローナル抗体−酵素結合体とを含有して
なるＢ型肝炎診断キットを提供するｄ９発明の詳細な説
明 （１） ＨＢＣ抗原の精製 ＨＢＣ抗原の精製はＴａｋａｈａｓｈｉら（１９７６）
〔（１９７６）、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ工ｍｍｕｎｏ
１０ｇｙ １１７゜１３９２−１３９７ 〕の方法に準
じて行う。無症候性ＨＢＳ抗原陽性抑奨（ＲＰＨＡ価１
．（３２４倍以上）についてＨＢＣ抗原陽性のものを２
．６ を集め、これを粗遠心（８，０００ｒｐｍ、 ２
ｎ分）し、その上清を１９．０００ｒｌ）ｍ、１６時間
遠心してベレツトを得る。このベレットを］、ｌ’Ｙ’
Ｍゾロナーゼ（科研化学■製）を含む０．０１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液、ｐＨ７，２で再懸濁し、３ 、０（＋Ｏ
ｒｐｍ、２０分間遠心した。上清を蔗糖密度勾配（５ｕ
ｃｒｏｓｅ ｄｉ日ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｇｒａｄｕｅ
ｎｔ ）（１０〜５０ ％ ｗ／ｗ ）に重層して、２
３，０００ｒＩ）ｍで１６時間遠心した。ＨＢＣ抗原活
性の認められる分画を３０．ＯＯＯｒｐｍ、 ３時間遠
心して蔗糖を除き、メトリザマイド密度勾配（Ｍｅｔｒ
ｉ−ｚａｍｉｄｅ ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｇｒ
ａｄｕｅｎｔ ） （１，１１９７ｍ１−１．．２６
ｆ ／ｍｌ ）に重層して、４０，０００ｒｐｍ、５時
間遠心した。さらにＨＢＣ抗原活性分画に比重１．３０
ｒ／ｗｅにメトリザマイドを加え、その上に１．２７
ｆ ７ｍ１３−１．１ ｆ７ｍｌのメトリザマイド溶液
を重層して４ｔ１．＋１１００ｒｌ）、１６時間の浮上
遠心を行って精製ＨＢＶを得だ。
ノクローナル抗体を作製し、それを使用することにより
Ｂ型肝炎診断キットを完成したものであシ、Ｂ型肝炎コ
ア抗原（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｃｏｒｅ Ａｎｔｉ
ｇｅｎ ）に対するモノクローナル抗体を結合させたガ
ラスピーズ、プレートなどの担持体とＢ型肝炎コア抗原
に対するモノクローナル抗体−酵素結合体とを含有して
なるＢ型肝炎診断キットを提供するｄ９発明の詳細な説
明 （１） ＨＢＣ抗原の精製 ＨＢＣ抗原の精製はＴａｋａｈａｓｈｉら（１９７６）
〔（１９７６）、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ工ｍｍｕｎｏ
１０ｇｙ １１７゜１３９２−１３９７ 〕の方法に準
じて行う。無症候性ＨＢＳ抗原陽性抑奨（ＲＰＨＡ価１
．（３２４倍以上）についてＨＢＣ抗原陽性のものを２
．６ を集め、これを粗遠心（８，０００ｒｐｍ、 ２
ｎ分）し、その上清を１９．０００ｒｌ）ｍ、１６時間
遠心してベレツトを得る。このベレットを］、ｌ’Ｙ’
Ｍゾロナーゼ（科研化学■製）を含む０．０１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液、ｐＨ７，２で再懸濁し、３ 、０（＋Ｏ
ｒｐｍ、２０分間遠心した。上清を蔗糖密度勾配（５ｕ
ｃｒｏｓｅ ｄｉ日ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｇｒａｄｕｅ
ｎｔ ）（１０〜５０ ％ ｗ／ｗ ）に重層して、２
３，０００ｒＩ）ｍで１６時間遠心した。ＨＢＣ抗原活
性の認められる分画を３０．ＯＯＯｒｐｍ、 ３時間遠
心して蔗糖を除き、メトリザマイド密度勾配（Ｍｅｔｒ
ｉ−ｚａｍｉｄｅ ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｇｒ
ａｄｕｅｎｔ ） （１，１１９７ｍ１−１．．２６
ｆ ／ｍｌ ）に重層して、４０，０００ｒｐｍ、５時
間遠心した。さらにＨＢＣ抗原活性分画に比重１．３０
ｒ／ｗｅにメトリザマイドを加え、その上に１．２７
ｆ ７ｍ１３−１．１ ｆ７ｍｌのメトリザマイド溶液
を重層して４ｔ１．＋１１００ｒｌ）、１６時間の浮上
遠心を行って精製ＨＢＶを得だ。
精製ＨＢＶは２チノニデント（Ｎｏｎ１ｄｅｔ ）Ｐ２
Ｏと０．２ ％ ２−メルカプトエタノールを含む０．
’０１Ｍ ） ＩＪス塩酸緩衝液を等量加え、３７℃で
２時間反応させてＷＢＣ粒子を露出した。
Ｏと０．２ ％ ２−メルカプトエタノールを含む０．
’０１Ｍ ） ＩＪス塩酸緩衝液を等量加え、３７℃で
２時間反応させてＷＢＣ粒子を露出した。
この試料をメトリザマイド密度勾配（Ｍｅｔ−ｒｉｚａ
ｍｉｄｅ ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｇｒａｄｕｅ
ｎｔ ） （１，１３り／ｍｌ −１，２９ｙ ／ｍＪ
）に重層して４０ 、 ＱＱＱｒｐｍ 。
ｍｉｄｅ ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｇｒａｄｕｅ
ｎｔ ） （１，１３り／ｍｌ −１，２９ｙ ／ｍＪ
）に重層して４０ 、 ＱＱＱｒｐｍ 。
６時間遠心した。明瞭な活性バンドが認められるコア粒
子（ＨＢＣ抗原）１罰が得られ、その免疫粘着赤血球凝
集（ＩＡＨＡ ）価は１６，０００倍であった。
子（ＨＢＣ抗原）１罰が得られ、その免疫粘着赤血球凝
集（ＩＡＨＡ ）価は１６，０００倍であった。
（２） ＨＢｃ抗原に対するウサギ（ｒａｂｂｉｔ ）
抗体の作製 精製ＨＢＣ抗原１ｄに等量のフロイント完全アジュバン
ト（Ｆｒｅｕｎｄ’６ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖ
ａｎｔ）を混ぜ、ウサギの皮下および筋肉に注射した。
抗体の作製 精製ＨＢＣ抗原１ｄに等量のフロイント完全アジュバン
ト（Ｆｒｅｕｎｄ’６ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖ
ａｎｔ）を混ぜ、ウサギの皮下および筋肉に注射した。
免疫は１週間間隔で３回行った。最終免疫１０日後に採
血して免疫血清を得た。この抗ウサギ血清の力価は、Ｉ
ＡＨＡ法で１２，８００倍あった。
血して免疫血清を得た。この抗ウサギ血清の力価は、Ｉ
ＡＨＡ法で１２，８００倍あった。
（３） マウスの免疫
ＢＡＬＢ ／ Ｃマウス（４週令）の腹腔内に精製ＨＢ
Ｃ抗原０．２ｒｎｌとフロイント完全アジュバントを１
：１に混合して注射した。
Ｃ抗原０．２ｒｎｌとフロイント完全アジュバントを１
：１に混合して注射した。
約２ケ月後に同量の抗原を静脈に注射し、３日後の牌細
胞を細胞融合に用いるだめに摘出した。
胞を細胞融合に用いるだめに摘出した。
（４） ハイブリドーマセルラインの作製細胞融合はＷ
ａｔａｎａｂｅら（１９７８） ［： Ｗａｔａ−ｎａ
ｂｅ、 Ｔ、、 Ｋｉｍｏｔｏ、 Ｍ、、 Ｍａｒｕｙ
ａｍａ、 Ｓ、。
ａｔａｎａｂｅら（１９７８） ［： Ｗａｔａ−ｎａ
ｂｅ、 Ｔ、、 Ｋｉｍｏｔｏ、 Ｍ、、 Ｍａｒｕｙ
ａｍａ、 Ｓ、。
Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ、 ’ｒ、 、＆ Ｙａｍａｍｕｒ
ａ、 Ｙ、 （１９７８）。
ａ、 Ｙ、 （１９７８）。
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ工ｍｍｕｎ０１０ｇ３’ １２１
．２１１３−２１１７］およびＩｎｏｕｅら（１９８１
） ［Ｉｎｏｕｅ、 Ｍ、 、 ｐｕｒｕｙａ。
．２１１３−２１１７］およびＩｎｏｕｅら（１９８１
） ［Ｉｎｏｕｅ、 Ｍ、 、 ｐｕｒｕｙａ。
Ｙ、、ｙｏｓｈｉｈａｒａ、Ｎ、、Ｔａｎａｋａ、Ｓ、
、Ｙａｎｏｍａ。
、Ｙａｎｏｍａ。
Ｓ、＆ ’ｒａｌ（ａａａ、Ｍ、（１９８］ ）、Ｃ］
、１ｎｉｃａ、Ｉ Ｉｍｍｕ−ｎ０１０ｇ７１３．９２
９−９３６１に草じて行った。土に述べたごとく免疫さ
れたマウスのｌ（１”個の牌臓細胞に対してｌｆｌ’個
のＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ］（Ｐ３Ｕ１）ミエローマ細胞を
混合して３７°Ｃで１時間インキュベートした。混合細
胞を遠心（１，，０００ｒｐｍ、 ｔｏ分）したのち、
上清を除き、沈殿物に０．５ｍ／のポリエチレングリコ
ール溶液（１５％ジメチルスルホキシド含有ＲＰＭＩ
１６４０中ＰＥＧ １．．０００４２．５係）を静かに
加えて融合させた。融合細胞を遠心し７、沈殿物に１０
チ、ウシ胎児血清（Ｆｅ２ ）を含むＲＰＭＩメディウ
ムを加え希釈した。この細胞を１×ｌＯ５，５Ｘ１０’
および２Ｘ１（１’／ウエルでマイクロプレートに１２
０μｔずつ分注した。
、１ｎｉｃａ、Ｉ Ｉｍｍｕ−ｎ０１０ｇ７１３．９２
９−９３６１に草じて行った。土に述べたごとく免疫さ
れたマウスのｌ（１”個の牌臓細胞に対してｌｆｌ’個
のＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ］（Ｐ３Ｕ１）ミエローマ細胞を
混合して３７°Ｃで１時間インキュベートした。混合細
胞を遠心（１，，０００ｒｐｍ、 ｔｏ分）したのち、
上清を除き、沈殿物に０．５ｍ／のポリエチレングリコ
ール溶液（１５％ジメチルスルホキシド含有ＲＰＭＩ
１６４０中ＰＥＧ １．．０００４２．５係）を静かに
加えて融合させた。融合細胞を遠心し７、沈殿物に１０
チ、ウシ胎児血清（Ｆｅ２ ）を含むＲＰＭＩメディウ
ムを加え希釈した。この細胞を１×ｌＯ５，５Ｘ１０’
および２Ｘ１（１’／ウエルでマイクロプレートに１２
０μｔずつ分注した。
冴時間後にＨＡＴ撰択培地（１０−’ Ｍヒポキサンチ
ン、４Ｘ１０−７Ｍアミノプテリン、１．６×１０−５
Ｍチミジン、１０％Ｆ’Ｃ８を含むＲＰＭＩメディウム
）を１２０μを加えた。
ン、４Ｘ１０−７Ｍアミノプテリン、１．６×１０−５
Ｍチミジン、１０％Ｆ’Ｃ８を含むＲＰＭＩメディウム
）を１２０μを加えた。
ハイプリドーマの増殖が認められたウェルのメディウム
中の抗体活性の有無は細胞融合後７〜１０日目に、ＩＡ
ＨＡ、逆受身赤血球蓼集抑制（ＲＰＨ工）によって検索
した。高力価の抗体の認められたウェルのハイブリドー
マは４週令マウスの胸腺細胞をフィーダーレイヤー（ｆ
ｅｅｄｅｒ １ａｙｅｒ ）に用いて、シングルセルマ
ニプレーション（Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｍａｎｉｐｕ
ｌａｔｉｏｎ ）法によってクローニングを行う。
中の抗体活性の有無は細胞融合後７〜１０日目に、ＩＡ
ＨＡ、逆受身赤血球蓼集抑制（ＲＰＨ工）によって検索
した。高力価の抗体の認められたウェルのハイブリドー
マは４週令マウスの胸腺細胞をフィーダーレイヤー（ｆ
ｅｅｄｅｒ １ａｙｅｒ ）に用いて、シングルセルマ
ニプレーション（Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｍａｎｉｐｕ
ｌａｔｉｏｎ ）法によってクローニングを行う。
（５）腹水の作製
８週令以上のＢＡＬＢ ／ ｃマウスにプリスタン（２
・６・１０・１４テトラメチルペンタデカン）０．５罰
を腹腔内に注射した。クローニングされたハイブリドー
マは大量培養され、１週間前にプリスタン処理されタマ
ウス１頭当シｌＯ″個の細胞を接種した。１０〜１４日
後に高力価のモノクローナル抗体を含む腹水３２種が得
られた。
・６・１０・１４テトラメチルペンタデカン）０．５罰
を腹腔内に注射した。クローニングされたハイブリドー
マは大量培養され、１週間前にプリスタン処理されタマ
ウス１頭当シｌＯ″個の細胞を接種した。１０〜１４日
後に高力価のモノクローナル抗体を含む腹水３２種が得
られた。
ｅ、実施例
（１）抗ＨＢｃモノクー ナル抗体を結合させたガラス
ピーズの製法 直径６．８〜７．０ ｍｍの粗面ガラスピーズ１００個
に、２チ３−アミノプロピルトリエトキシシランのアセ
トン溶液１５ｍ１を加え、加分間かく拌する。アセトン
を除去し、リン酸緩衝液で３回洗浄する。これに１０１
グルタルアルデヒドを含むリン酸緩衝液１５ｍ６を加え
、３時間反応させる。反応後、リン酸緩衝液で３回洗う
。かくして得たガラスピーズに３２種のうちで最もＨＢ
ｃ抗原に対する抗体価の高いモノクローナル抗体３Ｄ５
（ＩＡＨＡ法による） （１２，５ｉｔｇ／ｍｌ ）
１．５ｍｌを加え、４℃で１夜、反応させる。
ピーズの製法 直径６．８〜７．０ ｍｍの粗面ガラスピーズ１００個
に、２チ３−アミノプロピルトリエトキシシランのアセ
トン溶液１５ｍ１を加え、加分間かく拌する。アセトン
を除去し、リン酸緩衝液で３回洗浄する。これに１０１
グルタルアルデヒドを含むリン酸緩衝液１５ｍ６を加え
、３時間反応させる。反応後、リン酸緩衝液で３回洗う
。かくして得たガラスピーズに３２種のうちで最もＨＢ
ｃ抗原に対する抗体価の高いモノクローナル抗体３Ｄ５
（ＩＡＨＡ法による） （１２，５ｉｔｇ／ｍｌ ）
１．５ｍｌを加え、４℃で１夜、反応させる。
リン酸緩衝液で３回洗浄し、１チエタノールアミンを含
むリン酸緩衝液１５ ｍｌを加える。室温で１時間放置
後、リン酸緩衝液で３回洗浄して、抗ＨＥ＋ｃモノクロ
ーナル抗体を結合させたガラスピーズを得た。
むリン酸緩衝液１５ ｍｌを加える。室温で１時間放置
後、リン酸緩衝液で３回洗浄して、抗ＨＥ＋ｃモノクロ
ーナル抗体を結合させたガラスピーズを得た。
（２）モノクローナル抗体−酵素結合体の製法ＨＢｃ抗
原に対するモノクローナル抗体（３Ｄ５ ） （１０ｙ
／ｍｌ）のｌ ｍｌを０．０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐｉ（９
゜５）で透析する。別に４ ｍｇの西洋ワサビパーオキ
シダーゼ（Ｓｉｇｍａ社製ｔｙｐｅ Ｖｌ ）を１ ｔ
ｕｌの蒸留水に溶かしておき、これに０．１ Ｍ過ヨウ
素酸ソーダ６０ｍを加えた後、室温で、加分間かく拌す
る。この液を１ ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，４）で−晩
透析する。
原に対するモノクローナル抗体（３Ｄ５ ） （１０ｙ
／ｍｌ）のｌ ｍｌを０．０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐｉ（９
゜５）で透析する。別に４ ｍｇの西洋ワサビパーオキ
シダーゼ（Ｓｉｇｍａ社製ｔｙｐｅ Ｖｌ ）を１ ｔ
ｕｌの蒸留水に溶かしておき、これに０．１ Ｍ過ヨウ
素酸ソーダ６０ｍを加えた後、室温で、加分間かく拌す
る。この液を１ ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，４）で−晩
透析する。
透析後、０．２Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）を２０μｌ
加え、ｐＨを９．０〜９．５に保つ。この液に透析した
モノクローナル抗体を加えて混合し、室温で２時間静か
にかく拌する。さらに４ ｔａｇ ／ ｔｕｇの水素化
ホウ素ナトリウムｌＯμｌ を加え、氷水中で２時間反
応させる。
加え、ｐＨを９．０〜９．５に保つ。この液に透析した
モノクローナル抗体を加えて混合し、室温で２時間静か
にかく拌する。さらに４ ｔａｇ ／ ｔｕｇの水素化
ホウ素ナトリウムｌＯμｌ を加え、氷水中で２時間反
応させる。
反応後、反応液をリン酸緩衝液で一晩透析し、透析液を
セファクリルＳ −２００でグル濾過して抗ＨＢｃモノ
クローナル抗体−西洋ワサビパーオキシダーゼ結合体を
得た。
セファクリルＳ −２００でグル濾過して抗ＨＢｃモノ
クローナル抗体−西洋ワサビパーオキシダーゼ結合体を
得た。
（３）中和試薬の製法
抗ＨＩＪｃ モアクローナル抗体−カラスビーズ結合体
（１個）にＨＢｃ抗原（６４０倍からＩＯ，２４０倍に
希釈）の２００μｌを加え、室温に一夜放置する。
（１個）にＨＢｃ抗原（６４０倍からＩＯ，２４０倍に
希釈）の２００μｌを加え、室温に一夜放置する。
０．１係ツイーン２０を含むリン酸緩衝液で３回洗浄す
る。抗ＨＢｃモノクローナル抗体−・ξ−オキシダーゼ
結合体２００μｌを加え、１時間、４０℃で反応させる
。０．１係ソイ−７ｍを含むリン酸緩衝液で３回洗浄す
る。
る。抗ＨＢｃモノクローナル抗体−・ξ−オキシダーゼ
結合体２００μｌを加え、１時間、４０℃で反応させる
。０．１係ソイ−７ｍを含むリン酸緩衝液で３回洗浄す
る。
これにＯＰＤ （オルトフェニレンジアミン）基質液３
００μｌを加え室温で加分間反応させる。
００μｌを加え室温で加分間反応させる。
１規定硫酸］ ｍｌで反応を停止させ、４９２ｎＩＴＩ
で吸光度を測定する。２，５６０倍希釈のＨＢｃ抗原を
中和試薬とする。
で吸光度を測定する。２，５６０倍希釈のＨＢｃ抗原を
中和試薬とする。
（４）抗体測定
検体（血清）１００μｌに中和試薬２００μｌを加え、
３７℃で１時間放置し、これに抗ＨＢｃモノクローナル
抗体を結合したがラスビーズを加え反応させる。４０℃
で２時間反応させ、０．１チツイーンを含むリン酸緩衝
液で３回洗う。抗ＨＢｃモノクローナル抗体−パーオキ
シダーゼ結合体２００μｌを加え、４０°Ｃで１時間反
応させる。０．１チツイーン２０を含むリン酸緩衝液で
３回洗う。ＯＰＤ基質溶液３００μｌを加えＩ分間室温
で反応させる。
３７℃で１時間放置し、これに抗ＨＢｃモノクローナル
抗体を結合したがラスビーズを加え反応させる。４０℃
で２時間反応させ、０．１チツイーンを含むリン酸緩衝
液で３回洗う。抗ＨＢｃモノクローナル抗体−パーオキ
シダーゼ結合体２００μｌを加え、４０°Ｃで１時間反
応させる。０．１チツイーン２０を含むリン酸緩衝液で
３回洗う。ＯＰＤ基質溶液３００μｌを加えＩ分間室温
で反応させる。
１規定硫酸１１ｎｌで反応を停止させ、４９２ｎｍで吸
光度を測定し、次式により阻止率を計算する。
光度を測定し、次式により阻止率を計算する。
判定 ＋：≧７０係
±：〈７０−≧Ｉ
−：＜３０係
結果は次表に示す。
Ｎｏ 血清番号 阻止率（＠ 判定
３ ７２０２ １００．３ ＋
２ ７２１１ １００．１ ＋
３ ７２６１ １００．３ ＋
４ ７３０９ １００．５ ＋
５７３４５ ９９．８ ＋
６ ’７３５０ ９９．９ ＋
７ ７３６７ ９９．４ ＋
８ ７３６９ １００．５ ＋
９ ７３７３ １００．３ ＋
１０ ７４６５ １００．４ ＋
ＩＩ ７４７６ １００．１ ＋
１２ ７４７９ １００．５ ＋
１３ ７４９７ １００．８ ＋
Ｍ ７５０９ １００．４ ＋
１５ ７５６０ １００．６ ＋
１６ ７５７１ １００．１ ＋
１７ ７６２２ ９９．８ ＋
１８ ７７１２ ９９．１ ＋
１９ ７７９３ １００．３ ＋
２０ ７８００ １００．６ ＋
２１ ７８２５ １００．２ ＋
２２ ７５０７ ７．８ −
２３７５１７ ５．２ 一
本発明に係るモノクローナル抗体によるＢ型肝炎診断キ
ットは、高感度、高精度の結果が得られるので、従来技
術に比較して、極めて優れたものである。
ットは、高感度、高精度の結果が得られるので、従来技
術に比較して、極めて優れたものである。
従来法のＩＡ）］Ａ価、ポリクローナル抗体によるＲＰ
）Ｉ Ｉ価とモノクローナル抗体によるＲＰＨＩ価を比
較すると次表のとおりであり、極めて高感度であること
が判る。
）Ｉ Ｉ価とモノクローナル抗体によるＲＰＨＩ価を比
較すると次表のとおりであり、極めて高感度であること
が判る。
ポリクローナル抗体モノクローナル抗体Ｎｏ 血ｉ’Ｆ
？番号ＩＡＨＡ価ＫｊルＲＰＨ１ＫヨルＲＰ）１１（ｌ
ｌｌ１１ ７２０２ ２４３’２” ２１５ ２ ７２１１ ２” ２１０２Ｘ３ ３ ７２６］ ２１０２１０２１１ ４ ７３０９ ２ ２５２８ ５ ７３４５ ２１０２１１２］５ ６ ７３５０ ２’ ２’ ２７ ７ ７３６７ ２ ２’ ２” ８ ７３６９ ２” ２１０２１３ ９ ７３７３ ２” ２” ２１５ １０ ７４６５ ２° ２１０ ２１！ＩＩＩ ７４７
６ ２° ２１０ ２１１１２ ７４７９ ２１３２”
２」５ １３ ’１４９７ ２’ ２” ２” １４ ７５０９ ２’ ２’ ２’ １５ ７５６０ ２’ ２’ ２８ １６ ７５７１ ２１３２１１２１５ １７ ７６２２ ２１３２１１２１５ １８ ７７１２ ２” ２１２２” １９ ７７９３ ２１３２” ２１５ ２０ ７８００ ２１０２” ２１２ ２１ ７８２５ ２” ２８２１０ ２２ ７５０７ ＜２ ＜２ ＜２ ２３ ７５１７ ＜２ （２（２
？番号ＩＡＨＡ価ＫｊルＲＰＨ１ＫヨルＲＰ）１１（ｌ
ｌｌ１１ ７２０２ ２４３’２” ２１５ ２ ７２１１ ２” ２１０２Ｘ３ ３ ７２６］ ２１０２１０２１１ ４ ７３０９ ２ ２５２８ ５ ７３４５ ２１０２１１２］５ ６ ７３５０ ２’ ２’ ２７ ７ ７３６７ ２ ２’ ２” ８ ７３６９ ２” ２１０２１３ ９ ７３７３ ２” ２” ２１５ １０ ７４６５ ２° ２１０ ２１！ＩＩＩ ７４７
６ ２° ２１０ ２１１１２ ７４７９ ２１３２”
２」５ １３ ’１４９７ ２’ ２” ２” １４ ７５０９ ２’ ２’ ２’ １５ ７５６０ ２’ ２’ ２８ １６ ７５７１ ２１３２１１２１５ １７ ７６２２ ２１３２１１２１５ １８ ７７１２ ２” ２１２２” １９ ７７９３ ２１３２” ２１５ ２０ ７８００ ２１０２” ２１２ ２１ ７８２５ ２” ２８２１０ ２２ ７５０７ ＜２ ＜２ ＜２ ２３ ７５１７ ＜２ （２（２
Claims (1)
- Ｂ型肝炎コア抗原（ＨｅｐａｔｉｔｉＳＢ Ｃｏｒｅ
Ａｎｔｉｇｅｎ ）に対するモノクローナル抗体を結合
させた担持体と、Ｂ型肝炎コア抗原に対するモノクロー
ナル抗体−酵素結合体とを含有してなるＢ型肝炎診断キ
ット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24812883A JPS60143772A (ja) | 1983-12-30 | 1983-12-30 | モノクロ−ナル抗体によるｂ型肝炎診断キツト |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24812883A JPS60143772A (ja) | 1983-12-30 | 1983-12-30 | モノクロ−ナル抗体によるｂ型肝炎診断キツト |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60143772A true JPS60143772A (ja) | 1985-07-30 |
Family
ID=17173643
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24812883A Pending JPS60143772A (ja) | 1983-12-30 | 1983-12-30 | モノクロ−ナル抗体によるｂ型肝炎診断キツト |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60143772A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6358260A (ja) * | 1986-08-29 | 1988-03-14 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ＩｇＭ型抗体の測定法 |
| EP0276719A2 (en) * | 1987-01-21 | 1988-08-03 | Abbott Laboratories | Immunoassay utilizing microparticle neutralization |
| CN109212201A (zh) * | 2017-07-03 | 2019-01-15 | 杭州霆科生物科技有限公司 | 一种用于血清中乙肝病毒五项检测的离心式微流控芯片 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5667757A (en) * | 1979-10-26 | 1981-06-08 | Dynasciences Corp | Method of detecting and determining hapten and antigen |
-
1983
- 1983-12-30 JP JP24812883A patent/JPS60143772A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5667757A (en) * | 1979-10-26 | 1981-06-08 | Dynasciences Corp | Method of detecting and determining hapten and antigen |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6358260A (ja) * | 1986-08-29 | 1988-03-14 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ＩｇＭ型抗体の測定法 |
| EP0276719A2 (en) * | 1987-01-21 | 1988-08-03 | Abbott Laboratories | Immunoassay utilizing microparticle neutralization |
| CN109212201A (zh) * | 2017-07-03 | 2019-01-15 | 杭州霆科生物科技有限公司 | 一种用于血清中乙肝病毒五项检测的离心式微流控芯片 |
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