JPS6358260A

JPS6358260A - ＩｇＭ型抗体の測定法

Info

Publication number: JPS6358260A
Application number: JP20396386A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiro Yamauchi; 芳裕山内; Takayuki Imamura; 隆幸今村; Toshihiro Nakajima; 敏博中島; Ichiro Tsuji; 一郎辻; Masanori Unoki; 宇野木　正憲
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1986-08-29
Filing date: 1986-08-29
Publication date: 1988-03-14

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】光Ｊトゲ机刊うＬ野本発明は特定抗原に対するＩｇＭ型免疫グロブリンの検
出及び／又は定員法に関する。

ｂし米Ｊえ術−Ｕびその１】−点免疫グロブリンには、Ｉ　ｇＧ、　　ｌ　ｇＡ、　　［
ｇＭ、［ｇＤおよびＩｇＥの５種のクラスに分けられ、
Ｊ、ｉ　／／の免疫グロブリンクラスの抗体は、ウィル
ス感染に対する免疫応答中に、多種多様な反応を示すこ
とが１口られているが、通常永続する免疫を残すウィル
スでは一次応答で規則的に恒常的なＩｇＭ免疫応答を誘
発することが知られている。これらのＩｇＭクラスの抗
体：よ比較的早開に消退し、その後は持続性のＩｇＧク
ラスの抗体に代わることが知られている。このように、
血清中のＩｇＭ抗体の存在は新しい感染（ｒｅｓｅｎｔ
　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ）を示す指標であり、その検出は
疾病の早１１１１に採取する個々の血清検体によって有
用な診断情報を提１％するものである。すなわち、　Ｉ
ｇＭクラスの抗体測定は、所しいウィルス感染を最も早
く知ることのできる指標として臨床的にも非常にエサな
意義を侍っている。

このようなＩｇＭ！！２抗体を測定するため、既に教団
のウィルス抗原に対するＩｇＭ型抗体測定キットが市販
されている。現行のＩｇＭ型抗体測定キットでは、一般
にポリクローナル抗体を用いているために、特定抗原と
その特定抗原に対するモノクローナルを同時に添加する
ことにより測定時間を短縮することは、測定感度の低下
や精度を低下させる原因となり技術的に難しい問題があ
る。

その−例として、ヒトがＢ型肝炎ウィルスに感染したこ
とを最も早く知る場合に必要となる抗ＨＤｃ−ＩｇＭ抗
体の測定の場合を例にとって説明する。

Ｂ型肝炎はＢ型肝炎ウィルス（以下ＨＢＶと称する）に
より起こされる疾病であり、臨床的にも疫学的にも非常
に重大な問題を含むが、いまだ有効な治療対策が見いだ
されておらず、適切な対策の確立が要望されている。

Ｈ１３Ｖは直径４２ｎｍの球型ウィルスであり、それぞ
れ別の抗原性をもつ外被（５ｕｒｆａｃｅ）と芯（ＣＯ
「ｅ）からなり、それぞれＨＢ　ｓ抗原およびＩＩ　Ｂ
　ｃ抗ＪＣ（と呼はれている。さらにＩ−Ｉ　Ｂ　Ｖに
関連した抗原としてＭａｇｎｉｕｓらが明らかにしたＨ
　Ｂ　ｅ抗原〔ジャーナル、イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ）　１００，１０１７（＋９７２））が
知られている。ＨＩ３　Ｖに関連した抗原・抗体系とし
ては、ＨＢ　ｓ抗原・抗体系、）ＩＤＣ抗原・抗体系、
ＨＢ　ｅ抗原・抗体系がある。

Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢ　Ｖ）感染においても、ＨＩ３
　ｃ抗原に対するＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭクラスの
抗体が産生される。特にＨＢｃ抗体はＨ［３Ｖ感染の最
も信頼性の高い指標となる抗体であり、その中でも特異
的なＩｇＭ型ＨＢｃ抗体の測定は、ＩＩ　Ｂ　Ｖの一過
性感染の診断および初感染と持続感染との鑑別を行うう
えて大きな何周性が認められている。

このようなＨＢｃ抗原に対するＩｇＭ抗体測定用のキッ
トもすてに開発、市販されており広く臨床検査に用いら
れているが、現行の抗ＨＢｃ−１ｇＮ１測定キットにお
いては、−次反応（抗ヒ）ＩｇＭ抗体に検体を添加）、
二次反応（抗原添加）および三次反応（標識抗体添加）
とそれぞれ別々に反応を行うために反応終了までに約２
５時間を必要としており、これに代わって短時間で測定
可能なキットの開発が望まれている。

ル訃夏ｌ力本発明は、このようなＩｇＭ型抗体の測定における短時
間での抗体測定法を提供するものである。

これまでのＩｇＭ型抗体測定法において、二次反応での
抗原添加後、三次反応として標識抗体を添加していたの
にスＪ　Ｌ、て、本発明者らはこの標識抗体にモノクロ
ーナル抗体を用いろことによって、従来の二次反応と三
次反応を同時に反応させることを可能にした。すなわち
本発明は、この結果に基づく、正確な測定が短時間で可
能なＩｇＭ型抗体測定法を提供するものである。

発亙立１ｕＸＪｉユ（μ」１社本発明に従えば、固十〇に固定した抗ＩｇＭ抗体と検体
を反応さぜることによって抗ＩｇＭ抗体・ＩｇＭ抗体複
合体を形成させ、改にこれに特定抗原す３よび標識モノ
クローナル抗体を同時に反応させた後、標識剤の活性を
測定することによって特定抗原に対するＩｇＭ型抗体の
検出または定量が可能となる。

さらに詳述すれば、本発明は、二重サンドイツチ法に基
づいた、固相免疫測定法を原理とし、その反応ステップ
としては、第一次反応として、抗＋ｇＭ型抗体コートビ
ーズと検体との反応、第二次反応として、この抗ＩｇＭ
抗体・ＩｇＭ抗体複合体と、目的のＩｇＭ型抗体と抗原
抗体反応を示す特定抗原との反応、及びこの特定抗原に
文、ｊする標識モノクローナル抗体との反応を同時に行
い、その後標識剤の活性測定を行うことによりＩ！ｆ定
抗原に対するＩｇＮＩ型抗体を測定するステップより構
成される。

これらの各反応ステップの基本的な原理として、まず−
次反応で、検１４：中にＩｇＭ型抗体が存在゛ｒれは、
これらすべてのＩｇＭ型抗体が、同社１ビーズに結合し
た抗ＩｇＭ抗体と結合する。その１応二改反応で、これ
らの中で特定抗原に対するＩｇへ１型抗体のみが、添加
された特定抗原と結合し、さらにこれに標識モノクロー
ナル抗体が結合し、抗原・抗体決合体を形成する。さら
にこの複合体の標識剤を測定することにより、検体中の
特定抗原に対するＩｇＭ型抗体を検出することができる
。

このような測定系の標識剤としては、酵素標識のものと
放射性同位元素標識のものが一般に使用されているが、
放ｎ・１性向位元素を用いた測定キットは、使用の際に
法的なル１限があり、使用する施設や、法的な手続きが
必要となるために、誰でも手軽に使用するという点ては
問題がある。これに較へて酵素標識の測定系では、その
ような制限がないことから、特別な施設も必要とせず、
しかも安全に使用することが可能である。本発明では、
短時間でのより手軽なＴｇＭ型抗体測定法を提供するこ
とにおいて、標識剤として酵素を用いることが望ましい
。

本発明によれば、これを応用した一例として、Ｂ型肝炎
ウィルスに感染した場合の抗ＨＢｃ−ＩｇＭ抗体の測定
において、特異性の高い抗ＨＢｃモノクローナル抗体を
標識抗体として用いることにヨッテ抗ＩＩ　ＩＪ　ｃ　
−１ｚ　％１抗体ノ測定カ月時間−Ｃｉｉｆ　ｒＩＵと
なる。またＩｔ　ｒ３　ｃ抗体の測定においては、ＩＩ
　［３Ｃ抗体を測定するために必要となるＨ　［３ｃ抗
原が流血中には存在せずにＨＢ　Ｖに感染したヒト肝臓
からしか得られないために、ＨＴ３　ｃ抗原採取の「７
には常に危険性を伴うとともに、その安定供給にも問題
があった。その影響とじてこのような抗１１Ｂｃ−Ｉｇ
Ｍ抗体測定キットが高価になる結果となっていたが、本
発明の技術に紺換え技術を用いて、ＩＩ　Ｂ　ｃ抗原を
多量に安定的にしかも低コストで供給し、さらにこれを
用いてマウスを免疫して得られたモノクローナル抗体を
用いることによって、その結果従来の抗ＨＢ　ｃ　−［
ｇ　Ｍ抗体の測定法と比較して大幅な測定時間の短縮と
低コストでの測定を可能にする抗ＨＢ　ｃ　−１ｇ　Ｍ
抗体の測定が可能となる。

以下、本発明の構成を、さらに詳細に説明する。

（１）抗ＩｇＭ抗体固定化固相の調製血清から分離、精製したＩｇＭ抗体をヤギ等に免疫して
得られた抗ＩｇＭ抗体（商業的にも人手可能）を、通常
の抗体精製法、たとえば塩析やイオン交換クロマトグラ
フィー等を用いて出来るだけ高純度に精製する。

次にポリスチレンビーズを常法により、グルタルアルデ
ヒド処理し、適当な緩衝）αたとえばＰＢＳ等で希釈し
た溶液中で、この抗ヒＭｇＭ抗体をポリスチレンビーズ
にコーティングする。

（２）２次反応用特定抗原の調製２次反応に用いろ、測定したいＴｇＭ抗体に対する抗原
は、ウィルスおよびウィルスに感染している組織から分
離された抗原や、遺伝子組換え技術を利用して合成され
たウィルスの抗原を、通常の精製法たとえばイオン交換
クロマトグラフィー、各種のろ過、密度勾配遠心等を用
いてできるだけ高純度に精製することが必要である。ま
たこの精製された抗原を用いてモノクローナル抗体を調
製するために均一な抗原に調製することが必要である。

たとえば抗［（１３ｃｍＩｇＭ抗体の測定に用いる抗原
としてＩ−（Ｂ　ｃ抗原を調製する場合には、Ｈ１３１
／に感染したヒトの肝臓からＩｆ　Ｂ　ｃ抗原を抽出し
ＨＦ２　ｃ抗原を精製することも出来ろが、その場合、
前に述べたように作業に危険性を１￥い、更に１１ＢＣ
抗原の供給に量的な制約があることから、遺伝子Ｚ（Ｉ
換え技術を利用して１１　Ｂ　ｃ抗原を調製することが
望ましい。遺伝子組換え技術を利用することに上って、
これまでのような量的な制約を受けず、均一なＨＢ　ｃ
抗原を安定に供給することが可能となり、しかも従来の
ような危険性を伴うこともなく安全に低コストてＨＢｃ
抗原を調製することができる。その場合、ＩＩ　Ｂ　ｃ
抗原発現プラスミドの構築において、ＨＢ　ｃ抗原をコ
ードするＤＮＡ断片のみを用いることによって、組換え
体中に池の）［Ｂ　Ｖ構成成分を含まないＨＢ　ｃ抗原
産生能を持つ切換え体を１１；ることかてさ、その後の
ＩＩ　Ｂ　（抗原の精製が容易になる。このことは下記
に述べるモノクローナル抗体の調製においても、特異性
の高いモノクローナル抗体を１：＃るのに有ｆすである
。

（３）特定抗原に対するモノクローナル抗体の調製・ν
本発明の測定系で使用する、１＋１定抗原に対ノ゛ろモ
ノクローナル抗体は、上述した２次反応用特定抗原を用
いて、通常のモノクローナル抗体の調製法に従って作製
する。すなわちこの抗原をマウスに免疫して得たマウス
牌臓細胞とマウスミエローマ細胞を融合し、さらにクロ
ーニングして１１；られたハイブリドーマについて抗原
に対する特異性を調べ、目的の抗原に対して特異性の高
いものを選択する。さらにその選択したハイブリドーマ
を人工培地あるいはマウス腹腔内で増殖させることによ
って目的の抗原に対するモノクローナル抗体を得る。

このモノクローナル抗体に酵素を結合させコンジュゲー
トとし・、本測定系の標識モノクロナール抗体として使
用する。結合させる酵素としてはアルカリフォスファタ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよ
びβガラクトシダーゼ等がその例としてあげられる。

（・１）目的の特定抗原に対するＩｇＭ型抗体の測定あ
らかしめ生理食塩水で適当な１度になるように希釈した
検体を試験管に入れ、これに上述した抗ＩｇＭ抗体結合
ビーズを１個加えて３７℃前後で１時間振盪保ｆＷする
。保温後、溶液を吸引除去後、蒸留水で３回程度洗浄し
、上述の抗Ｊグ液を添加する。さらにこの抗原に対する
標識モノクローナル抗体を同時に添加し３７℃前後−Ｃ
２時間はと振盪保温する。その後反応溶液を吸引除去し
、蒸留水で再び３回程度洗浄した後、別の試９管に固相
ビーズを移し変える。さらに標識した酵素にあう基質ｍ
液を添加し、暗所で３７℃前後で約３０分間反応させ２
Ｎの硫酸水溶１α等で反応を停止させる。各検体中の基
質の変化を、用いた基質の吸光度にあった波長で測定す
る。判定は同時に測定する陰性コントロールの平均値を
求め、　〔陰性コントロールの平均吸光度十標準偏差×
３〕を陰性、陽性の判定境界値とする。

以下、本発明をＨＢ　ｃ　−Ｉ　ｇ　Ｍ型抗体の測定法
：こおけるシｉｌ　８１例および実施例を例にとって更
に詳細に説明するが、本発明は、他のウィルス感染時に
生しるＩｇＭ型抗体の測定にも同様に適用できる。

匠Ｍｌ（１）抗ヒ）ＩｇＭ抗体コートビーズの調製ヒトＩｇＭ
抗体をヤギに免疫して得られた抗ヒ１−ＩｇＭ抗体を含
むヤギ血清を３３％飽和硫安で塩析し、これを遠心分前
（９０００ｒｐｍ、２０分）して得られた沈澱物をリン
酸ナトリウム緩衝１α（０，０＋？５Ｍ、　１１１１０
．３）に溶解後、同緩衝液にス１し４℃−夜透析した。

透析後これを遠心分ｉｔ　（３０００ｒｐｍ　、　１０
分）して不溶解物を除去したのち、同緩衝液とＤＥ−５
２ゲルを用いてイオン交換クロマトグラフィーを行い、
素通り画分を回収することによって抗ヒトＩｇＭ抗体を
精製した。このようにして得られた抗ＩｇＭ抗体ヲＰ　
Ｂ　Ｓ　（０，１５Ｍ）　テ希釈Ｌ１０μｓ／ｍ１に調
製した。

ポリスチレンビーズ（直径０．２５インチ）を常法によ
りグルタルアルデヒド処理した後、これに上記のように
して調製した抗ヒトＩｇＭ抗体を１％ＢＳＡを含むＰＢ
Ｓで・１℃、４８時間処理することにより結合させた。

（２）■換えＨＢ　ｃ抗原の調製Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ら著ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　
ＣｌｏｎｉｎｇＪ　ＣＯＩ（１Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒ
ｂｏｒ　Ｌａｂ、　＋９８２記載の技術に１ｆい、ＩＩ
ＢＶのＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＨＢＶ　（特願昭
５７−１４５０９３号を参照）を制限酵素Ｒｓａｌおよ
びＸｈｏｌで消化し、ＨＢｃ遺伝子を含むＤＮＡ断片を
得た。さらにこれを５ａｌｌで消化し約６００ｂｐのブ
レＣ領域が除かれたＨ　Ｂ　Ｃ遺伝子断片を得た。これ
を酵母由来のプロモーターを含む大腸菌−酵母シャトル
ヘクターのプロモーター下流に正しい方向で組み込み、
Ｉ−Ｉ　Ｂ　ｃ発現用プラスミドを構築した。これを酵
母菌サツカロミセス・セレビシェＡ　Ｈ２２［ａ　Ｉｃ
ｕ２　ｈｉｓ４　ｃａｎｔ（Ｃｉｒ１）］（黴工研条寄
第３１２号）に上記の特許出願に記載の方法と同様にし
て形質転換させることによりＩＩ　Ｂ　ｃ抗原産生能を
有する形質転換酵母を得た。

この形質転換酵母を常法により培養した後、遠心分離に
より菌体６００ｇを分離し、これに５０ｍＭリン酸緩ｆ
４ｉ　ｉｌｌ　３Ｕ　（ｐＨ７，２）を加えて、ＧＯＯ
Ｋｇ／ｃｍ’の圧力で約３時間マントンゴーリン破砕機
にかけ、菌体を破砕した。この菌体破砕液に酢酸をｐ　
ＩＩ　５　、４になるように添加し、４°Ｃ９３０分間
処理し遠心分シ１により沈澱を除いた。さらに終濃度２
．５Ｍになるように硫安を添加し一夜放置後、遠心分離
により沈澱を回収した。これを１０ｍＭリン酸緩衝液、
５０ｍＭＪ、ｇ化カリウム（ｐｌ＋７．３）に対して透
析を行った後、ＤＥＡＥセルロースカラムに吸着させ、
塩化カリウム濃度勾配緩衝液を用いてＨＢｃ抗原抗原ク
ラクシコンめた。これをさらに限外ろ過、しよ糖密度勾
配遠心、塩化セシウム超遠心を行い、濃縮、精製された
Ｈｔ３ｃ抗原を得た。

（３）標識抗ＨＢ　ｃモノクローナル抗体の調製上記の
ように精製した絹換え酵母由来ＨＢｃ抗原をＰ　Ｂ　Ｓ
　（０，０５Ｍ）で透析した。この組換えＨＢＣ抗原１
００μｍにフロイント完全アジュバント（ディフコ社製
）を添加しｌ０１１ｇ／ｍｌに調製し、曲中水滴型とし
たものを、ＢＡＬＢ／Ｃマウス（１！！、４〜５週令）
に接種し、基礎免疫を行った。その１０日後、紐換えＨ
Ｂ　ｃ抗原１００μｍにフロイントの不完全アジュバン
ト（ディフコ社製）を添加し同様に調製した抗原を接種
し、追加免疫を行った。その２週間後、同抗原を再び接
種し、さらに追加免疫を行った。

上述のごとく免疫して得たマウスの牌臓細胞を以下、通
常の方法、例えは渡辺武監１：）「ハイブリドーマ法と
モノクローナル抗体ｊ　ｐ２０〜ｐ２９　　Ｒ＆Ｄプラ
ンニング社　１９８２　　に記載の方法によりマウスミ
ｆｆ、　Ｄ−マ細胞（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−ＩＪＩ）
と融合させ、これをクローニングして組換えＩＩ　Ｂ　
ｃ抗原に対する特異性モノクローナル抗体を産生ずるハ
イブリトーマを得た。これをマウス腹腔内で増殖させろ
ことによって抗ＨＢ　ｃ抗原モノクローナル抗体な肖た
。

このモノクローナル抗体に標識剤となる酵素をＰ、　Ｋ
、　Ｎａｋａｎｅ、　Ａ、　Ｋａｗａａｉ、　Ｊ、　Ｈ
ｉａｔｏｃｌ＋ｅｍ、Ｃｙｔｏｃｌ＋、２２（１２）、
１９７４．１０８４−１０！ｊｌの方法に従って調製し
た。

すなわちワサビペルオキシダーゼ（ｌ（ＲＰ）Ｉ（ｌｎ
ｇを　０．３Ｍ　ＮａｌｌＣ０３２ｍｌに溶解し、２ｚ
フルオロジニトロヘンゼンのエタノールｌ　ｉ夜０．１
ｍｌを加え、室温で１時間反応させた。次に０．３Ｍ過
ヨーソ酸（ｄ液を加え、４℃で３０分反応させた後、０
．３２Ｍエチレングリコール溶？＆１．Ｏ＋ａｌを加え
、０℃でさらに１〜；３時間反応さすた。その後、０　
、０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）で平衡化したセファ
デックスＧ−２５を用いて分画を行い、アルデヒド化Ｈ
ＲＰを得た。このアルデヒド化ＨＲＰＭ液に上記で調製
したＨＢｃ抗原特異性モノクローナル抗体１０ｍｇ／ｍ
ｌを１１加え、４℃で一夜反応させ、Ｎ　ａ　Ｂ　ｔｌ
　ａで還元処理し、ＰＢＳて透析した。透析後セファデ
ックスＧ−２００でゲルろ過し、ＩＩ　ＲＰ標識モノク
ローナル抗体を得た。なおフラクションの確認は吸光光
度計を用い、２８０ｎｍでタンパク質を、４０３ｎｍて
ペルオキシダーゼ量を測定した。

幻ｌ（り抗ＨＢ　ｃ　−１ｇ　Ｍ抗体の測定生理食塩水で５
０１８に希釈した検体１０μｍと検体希釈液２００μｍ
を試験管に入れ、これに前にｆＡ製した抗ヒトＩｇＭ抗
体コートビーズを１個加え、３７℃で１時間＋１［して
検体中のＩｇＭ抗体をビーズに吸着させた。；容ｉαを
吸引除去後、蒸留水で３回洗浄し、上述のＨ１３ｃ抗原
液２００μｍとペルオキシダーゼ環識抗ＨＢ　ｃモノク
ローナル抗体２００７１１を加え、さら；こ３７℃で２
時間賑盪した。反応後、溶）αを再び吸引除去し、蒸留
水で３同法７９シた後、別の試験管に固相ビーズを移し
付え、これに０．０１％１１２０２を含む０−フェニレ
ンジアミン２ＨＣＩｉ液１ｍｌを加え、暗所で３７℃、
３０分間放置し、その後２Ｎ硫酸水溶液１ｍｌを加えて
反応を停止させた。

各試験管の４９２ｎｍにおける吸光度を分光光度計によ
り測定した。

測定における陽性コントロールとなる抗ＩＩ　Ｂ　（用
ｇＭ抗体陽性検体として、Ｉ３　！！：！肝炎初感染患
者から採取した血清を使用した。一方、陰性コントロー
ルとなる抗ＨＢｃ−ＩｇＭ抗体陰性（検体は（ｌＩ常人
から得られた血清を使用した。本発明の測定法に従い、
コントロール血清と検体について測定を行った場合と、
従来の市販品の抗ＨＢｃ司ｇ　％ｉ抗体測定キットを用
い、従来の３ステツプ（二次反応て）［Ｂ　ｃ抗原を加
えた後、三次反応てＩｒ１ｓ　Ｘａ抗体を添加する方法
）で同じ検体を測定した場合の吸光度および１．１定結
果を第１表、第２表に示し、た。

第１表コントロール血清測定値（吸光度）陽性対照　　陰性対照　　　　判定境界値本測定法　　
　　　１．０８６　　　０．０４６　　　　　０．３１
？従来法（市販品）　　　０．９１２　　　０．０８４
　　　　　０．３１２備考：判定境界値は陰性対照、陰
性対照より算出したもの第２表検体の測定結果（吸光度および判定）臨床検体　　　　　　本測定法　　　　　　従来法（市
販品）に０．　　　　　吸光度　判定結果　　　　吸光
度　　判定結果１　　　　　　１．３４７　　　　（１
）　　　　　　１．２４３　　　　（１）２　　　　　
　０．０５１５　　　（−）　　　　　　０．０７４　
　　　（−’１３　　　　　　１．４８２　　　　（１
）　　　　　　１．１３６　　　　（１）４　　　　　
　１．４２５　　　　（１）　　　　　　１．４１２　
　　　（１）５　　　　　　０．０６４　　　　（−）
０．０９３　　　　（・−）備考：（１）は陽性、（−
）は陰性の判定結果を示すさらに抗１（Ｂｃ−ＩｇＭ抗
体陽性検体２２例、陰性検体・１１例の計６３例の臨床
検体の測定において、現在市販されている抗＋＋１３ｃ
ｍＩｇＭ抗体測定キットと本発明の測定法を用いて測定
した結果を第３表に示した。

第　　３　　表測定結果（検体数）本発明による測定法は、現在市販されている；３ステツ
プの抗ＨＢｃ−［ｇＭ抗体測定試葉による測定法に比べ
て、ＨＩ３ｃ抗原添加および酵素標識抗体の添加を同時
に行い反応ステップを１スデップ減らすことに加え、さ
らに各反応時間の短縮も行っており、その結果として大
幅に測定時間を＞ＩＪ縮している。しかもこれらの表が
ら判るように、本測定法による結果は、従来の測定法に
よる場合と比較して各検体の吸光度およびそのｔ＋＋定
において；ｉ何ら労る結果はなく、本測定法が短時間で
かつ有効な抗＋１　Ｂｃ　−１ｇ　Ｍ抗体ｉＵ’ｌ定法
であることが確認された。

このように本発明によれば、抗！ｌＢｃｉｇＭ抗ＩＩ：
　；ｆｉｌｌ定法の場合に確認されたように、曲のウィ
ルス感染１１テにおけるＩｇＭ型抗体の測定においても
同（玉に、短時間で正「αなＩｇＭ型抗体を測定するこ
とができる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）特定抗原に対するＩｇＭ型抗体の検出または定量
を行うにあたり、固相に固定した抗ＩｇＭ抗体と検体を
反応させて抗ＩｇＭ抗体・ＩｇＭ抗体複合体を形成させ
、次にこの抗ＩｇＭ抗体・ＩｇＭ抗体複合体に特定抗原
及び特定抗原に対する標識モノクローナル抗体を同時に
反応させた後、標識剤を検出または定量するＩｇＭ型抗
体の測定法。
（２）標識モノクローナル抗体が酵素で標識されている
前記第（１）項記載のＩｇＭ型抗体の測定法。
（３）特定抗原がＢ型肝炎ウィルスコア抗原（ＨＢｃ抗
原）である前記第（１）項記載のＩｇＭ型抗体の測定法
。
（４）Ｂ型肝炎ウィルスコア抗原（ＨＢｃ抗原）が遺伝
子組換え技術を用いて調製されたものである前記第（３
）項記載のＩｇＭ型抗体の測定法。