DK158246B - Sandwichfremgangsmaade til bestemmelse af carcinoembryonalt antigen og oploesning til brug ved denne fremgangsmaade - Google Patents
Sandwichfremgangsmaade til bestemmelse af carcinoembryonalt antigen og oploesning til brug ved denne fremgangsmaade Download PDFInfo
- Publication number
- DK158246B DK158246B DK373182A DK373182A DK158246B DK 158246 B DK158246 B DK 158246B DK 373182 A DK373182 A DK 373182A DK 373182 A DK373182 A DK 373182A DK 158246 B DK158246 B DK 158246B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- cea
- antibody
- peroxidase
- liter
- mol
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57473—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving carcinoembryonic antigen, i.e. CEA
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/963—Methods of stopping an enzyme reaction or stabilizing the test materials
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
- Y10S436/813—Cancer
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/826—Additives, e.g. buffers, diluents, preservatives
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
DK 158246 B
i
Opfindelsen angår en fastfasesandwichfremgangsmåde til bestemmelse af carcinoembryonalt antigen (CEA) og en opløsning til brug ved denne fremgangsmåde.
Fra Clin. Chem. 26/12, 1718-1722 (1980) kendes en enzymimmunfrem-5 gangsmåde til bestemmelse af carcinoembryonalt antigen (CEA). Ved denne fremgangsmåde inkuberes forudbehandlede serum- eller plasmaprøver i et første trin i 2 timer ved 45°C med kugler, der er sensibiliseret med marsvin-anti-CEA. Efter ét vasketrin inkuberes kuglerne i 2 timer ved 45°C med et konjugat af gede-anti-CEA og peberrods-10 peroxidase. Efter fjernelse af overskydende konjugat ved vask bestemmes enzymaktiviteten i den faste fase ved kendte metoder. Ved sammenligning af denne værdi med en på analog måde fremstillet standardkurve fastsættes indholdet af CEA i prøven.
Inden for rammerne af den foreliggende opfindelse har det nu over-15 raskende vist sig, at det er muligt at udføre denne fremgangsmåde uden tab af sensitivitet på den samme tid også uden det tids- og arbejdskrævende vasketrin mellem den første og den anden immunologiske reaktion. Denne forenkling bliver mulig, når man udfører inkubationen af den prøve, der skal undersøges, med et første CEA-20 antistof, der er bundet til den vanduopløselige bærer, og det andet antistof, til hvilket der er bundet peroxidase, i nærværelse af 0,4- 1,0 mol/liter phosphationer eller 0,2-0,4 mol/liter sulfationer.
Det har endvidere vist sig, at totrinsmetoden ifølge Clin. Chem.
(loc. cit.) kan forkortes tidsmæssigt ved anvendelse af de ovennævnte 25 ioner, idet den anden inkubation kan udføres på den halve tid uden sensitivitetstab, dvs. også på 1 time.
Den ovennævnte enzymimmunfremgangsmåde til bestemmelse af antigener, i det foreliggende tilfælde af CEA, er almindelig kendt som den såkaldte fastfase-sandwichfremgangsmåde. Ved denne fremgangsmåde kan 30 enzymet, især peroxidasen, bindes direkte eller via en biotin/avidin-bro til antistoffet.
Den foreliggende opfindelse angår således en fastfase-sandwichfremgangsmåde til hurtig bestemmelse af carcinoembryonalt antigen (CEA) 2
DK'! 58246 B
ved inkubation af den prøve, som skal undersøges, med et første CEA-antistof, der er bundet eller bliver bundet til en vanduopløselig bærer, og et andet CEA-antistof, til hvilket peroxidase er bundet enten direkte eller via en biotin/avidinbro, adskillelse af den faste 5 og flydende fase, måling af peroxidaseaktiviteten enten i den faste eller den flydende fase som mål for det forhåndenværende CEA, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at inkubationen udføres i nærværelse af 0,4-1,0 mol/liter phosphationer eller 0,2-0,4 mol/liter sulfationer.
10 Som ovenfor anført kan den prøve, som skal undersøges, ved fastfase-sandwichfremgangsmåden ifølge opfindelsen først inkuberes med det ene CEA-antistof, der er bundet til en vanduopløselig bærer, og derefter efter et vasketrin inkuberes med det andet CEA-antistof, der er mærket med peroxidase. Da den aktiverende virkning af 0,4-1,0 mol/-15 liter phosphationer eller 0,2-0,4 mol/liter sulfationer påvirker den anden inkubation, udføres denne anden inkubation derfor i nærværelse af disse ioner.
Som ovenfor anført kan der som første CEA-antistof, der er bundet til en vanduopløselig bærer, anvendes et marsvin-CEA-antistof. Som det 20 andet CEA-antistof, til hvilket der er bundet peroxidase, kan der anvendes gede-anti-CEA.
Som første og andet CEA-antistof kan der dog også anvendes to forskellige monoklonale muse-CEA-antistoffer, der begge er rettet mod CEA, men mod forskellige epitoper af CEA.' 25 Det er endvidere også muligt som første antistof at anvende et mono-klonalt muse-CEA-antistof og som andet antistof at anvende et poly-klonalt antistof fra et antiserum fra et dyr, fx geden.
Peroxidasen kan bindes til antistoffet på i og for sig kendt måde, fx den af Wilson og Nakane i "Immunfluorescence and Related Staining 30 Techniques", 1978, side 215 beskrevne metode. Hvad angår de monoklonale muse-CEA-antistoffer, har det vist sig, at deres immunologiske egenskaber i visse tilfælde forringes ved disse kendte metoder.
I sådanne tilfælde er det en fordel at biotinylere de monoklonale
DK 158246 B
3 muse-CEA-antistoffer og derefter omsætte dem med et avidin-peroxi-dasecomplex. Fremstillingen af avidin-peroxidasecomplexet udfores analogt med den ovennævnte af Wilson og Nakane beskrevne metode. Hvad angår polyklonale antistoffer, dvs. antistoffer fra dyresera, fore-5 trækkes den direkte binding af peroxidasen til antistoffet.
Som vanduopløselig bærere til det første antistof kommer følgende i betragtning: organiske og uorganiske polymerer (amylase, dextran, naturlig eller modificeret cellulose, polyacrylamid, agarose, magne-tit, porøst glaspulver, polyvinylidenfluorid (Kynar) og latex), 10 indersiden af testbeholdere (testrør, titrerplader eller kuvetter af glas eller kunststof) samt overfladen af faste legemer (stave, kugler eller andre legemer af glas eller kunststof). Særlig egnede bærere til fremgangsmåden ifølge opfindelsen er glas- og kunststofkugler.
Antistoffet kan være bundet fysisk (adsorptivt) eller kemisk til den 15 vanduopløselige bærer eller kan bindes under eller efter reaktionen ved hjælp af en yderligere reaktionsdeltager, der på sin side er bundet til en bærer.
De immunologiske reaktioner udføres fortrinsvis ved en temperatur på mellem 0 og 55°C. Sædvanligvis forøges den immunologiske reaktions-20 hastighed ved højere temperaturer, hvorved der under i øvrigt ens testbetingelser hurtigere opnås ligevægt.
Den hidtil ukendte fremgangsmåde ifølge opfindelsen er overordentlig følsom og udmærker sig især ved sin korte reaktionstid.
Opfindelsen angår også en vandig opløsning til brug ved 25 fremgangsmåden med en pH-værdi på 4-9 indeholdende CEA-antistof, hvortil der er bundet peroxidase, som indeholder 0,4-1,0 mol/liter phosphationer eller 0,2-0,4 mol/liter sulfationer.
Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler.
EKSEMPEL 1 4
DK 158246 B
Kvantitativ bestemmelse af CEA i patientplasma med et monoklonalt CEA-antistof og et sædvanligt CEA.-antistof (fra geder) I hvert af det nødvendige antal testrør (10 x 75 mm) pipetteres 0,2 5 ml testopløsning (0,8 mol/liter NaH2P04/Na2HP04, pH-værdi 6,5, med 2 g/liter bovint serumalbumin, 20% normalt gedeserum, 0,2 g/liter 4-amino-antipyrin og 0,2 pg/ml gede-anti-CEA-peroxidasekonjugat), 0,050 ml af det patientplasma, der skal analyseres, henholdsvis CEA-standarden (0 ng/ml CEA, 2,5 ng/ml CEA, 10 ng/ml CEA og 20 ng/ml CEA) og 10 CEA-kontrolserummet (10,2 ng/ml CEA ±1,0 ng/ml) blandes i, i hvert rør tilsættes en med monoklonalt muse-anti-CEA-sensibiliseret polystyrenkugle1 (diameter =6,5 mm), og der inkuberes ved 45°C i 4 timer. Derefter vaskes polystyrenkuglerne tre gange med hver gang 2-5 ml destilleret vand, overføres hver især til 0,5 ml substratpuffer 15 til aktivitetsbestemmelse af peroxidase (0,1 mol/liter kaliumcitrat-puffer med en pH-værdi på 5,0 med 6 millimol/liter hydrogenperoxid og 40 millimol/liter o-phenylendiamin) og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur (22eC). For at standse peroxidaseaktiviteten og for at forhøje farveintensiteten iblandes 2,0 ml 1 mol/liter HCl, og absorp-20 tionen måles fotometrisk ved bølgelængden 492 nm i løbet af 30 minutter. Tabel 1 viser værdierne for en CEA-bestemmelse sammenlignet med på den ene side de værdier, der fås med Roche-radioimmunoassay (sammenligningsværdi) og på den anden side med de værdier, der fås ved en modificeret (anvendelse af gede-anti-CEA-peroxidasekonjugat i 0,2M 25 phosphatpuffer i stedet for tris-puffer) metode ifølge Clin. Chem.
26/12, 1718-1722 (1980).
Fremstillingen af monoklonalt muse-anti-CEA sker analogt med den i Journal of Immunological Methods, 32 (1980, side 297-304, beskrevne metode, idet der som udgangscellelinje til fusionen anvendes myelom-30 linjen Sp 2/01-AG, som den 25. maj 1979 er deponeret hos ATCC under deponeringsnr. CRL 8006, og som blev gjort almindelig tilgængelig den 24. november 1981. Fusionen udføres med miltceller fra mus, der er immuniseret med CEA. Immuniseringen af musene er udført analogt med tabel 1 i den ovennævnte publikation, idet de første to immuniserin-35 ger hver især udførtes med 50 /ig CEA, immunisering nr. 3 og 4 blev
DK 158246 B
5 udeladt, og immunisering nr. 5 blev udført med 50 /xg CEA og immuniseringerne nr. 6-8 med hver 200 /xg CEA.
Tabel 1 ΔΑ
Prøvemateriale 492 nm/RT/30 minutter 5 _ CEA-standard 0 ng/ml CEA 0,105 2,5 ng/ml CEA 0,330 5,0 ng/ml CEA 0,490 10 10,0 ng/ml CEA 0,755 20,0 ng/ml CEA 1,220 CEA-kontrolserum 10,2 ng/ml CEA 0,770 15 _
Patientplasma ROCHE-RIA Modificeret Fremgangsmåde test metode ifølge ifølge opfindel- (CEA-indhold) Clin.Chem. sen (CEA-ind- (loc.cit.) hold) 20 (CEA-indhold) ng/ml ng/ml ng/ml nr. Pool 1 0,8 0,7 0,7 nr. Pool 2 1,4 1,0 1,0 25 nr. Pool 3 2,3 2,5 2,4 nr. 3155 25,0 20,0 22,0 nr. 3157 3,3 4,1 3,7 nr. 3368 7,1 6,7 6,9 nr. 3395 14,8 15,0 14,7 30 nr. 3401 9,0 8,8 9,2 nr. 3410 23,0 21,0 24,0 nr. 3419 4,2 4,5 4,4 nr. 3416 4,1 5,3 5,2 nr. 3646 5,5 5,2 5,3 35 nr. 3657 5,2 5,5 5,5 nr. 3679 5,7 5,9 6,0
DK 158246B
6 Værdier på tinder 2,5 ng/ml CEA ligger i normalområdet, hvorimod værdier over 2,5 ng/ml ligger i det patologiske område. Af tabel 1 fremgår det, at de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen vundne værdier korrelerer godt med de værdier, der fås ved den modificerede 5 metode ifølge Clin. Chem. (loc. cit.) eller ved ROCHE-RIA-testen.
EKSEMPEL 2
Sensitivitetsforøgelse af den enzymimmunologiske CEA-bestemmelse med et monoklonalt muse-anti-CEA og et gede-anti-CEA-peroxidasekonjugat ved tilsætning af 0,8 mol/liter phosphationer 10 I hvert af det nødvendige antal testrør (10 x 75 mm) pipetteres 0,5 ml testopløsning (2 g/liter bovint serumalbumin, 20% gedeserum, 0,2 g/liter 4-amino-antipyrin og 0,2 Mg/ml gede-anti-CEA-peroxidasekon-jugat én gang i 0,2 mol/liter natriumphosphatpuffer og én gang i 0,8 mol/liter natriumphosphatpuffer med en pH-værdi på 6,5), 0,050 ml 15 CEA-standard (0 ng/ml CEA, 2,5 ng/ml CEA, 5,0 ng/ml CEA, 10,0 ng/ml CEA og 20,0 ng/ml CEA) og CEA-kontrolserum (10,2 ng/ml CEA ±1,0 ng/ml) blandes i, til hvert rør sættes en med monoklonalt muse-CEA-antistof sensibiliseret polystyrenkugle (diameter - 6,5 mm), og der inkuberes ved 456C i 4 timer. Derefter vaskes polystyrenkuglerne tre 20 gange med hver gang 2-5 ml destilleret vand, overføres hver især til 0,5 ml substratpuffer til aktivitetsbestemmelse af peroxidase (0,1 mol/liter kaliumcitrat med en pH-værdi på 5,0 med 6 millimol/liter' hydrogenperoxid og 40 millimol/liter o-phenylendiamin) og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur (22eC). For at standse peroxidaseakti-25 viteten samt for at forøge farveintensiteten tilsættes 2,0 ml 1 mol/liter HC1, og absorptionen måles fotometrisk ved bølgelængden 492 nm i løbet af 30 minutter. I tabel 2 er der anført de værdier, der fås med 0,2 mol/liter og 0,8 mol/liter natriumphosphatpuffer.
7
DK 15 8 2 4 6 B
Tabel 2 AA
492 nm/RT/30 minutter CEA-standard med 0,2 mol/liter med 0,8 mol/liter ng/ml CEA phosphationer phosphationer 5 ___ 0 0,050 0,130 2,5 0,125 0,290 5,0 0,230 0,450 10,0 0,400 0,770 10 20,0 0,780 1,400 CEA- kon tro 1serum 10,2 0,430 0,800 15 Af tabel 2 fremgår det tydeligt, at følsomheden forøges betydeligt under anvendelse af 0,8 mol/liter phosphationer i forhold til 0,2 mol/liter phosphationer.
EKSEMPEL 3
Sensitivitetsforøgelse af den enzymimmunologiske CEA-bestemmelse med 20 et monoklonalt muse-anti-CEA og et gede-anti-CEA-peroxidasekonjugat ved tilsætning af 0,4 mol/liter sulfationer I hvert af det nødvendige antal testrør (10 x 75 mm) pipetteres 0,5 ml testopløsning (2 g/liter bovint serumalbumin, 20% gedeserum, 0,2 g/liter 4-amino-antipyrin og 0,2 /tg/ml gede-anti-CEA-peroxidasekon-25 jugat i 0,2 mol/liter natriumphosphatpuffer én gang uden sulfationer og én gang med 0,4 mol/liter sulfationer (natriumsulfat) med en pH-værdi på 6,5), 0,050 ml CEA-standard (0 ng/ml CEA, 2,5 ng/ml CEA, 5,0 ng/ml CEA, 10,0 ng/ml CEA og 20,0 ng/ml CEA) og CEA-kontrolserum (10,2 ng/ml CEA ±1,0 ng/ml) blandes i, til hvert testrør sættes en 30 med monoklonalt muse-CEA-antistof sensibiliseret polystyrenkugle (diameter - 6,5 mm), og der inkuberes ved 45°C i 4 timer. Derefter
DK 158246 B
8 vaskes polystyrenkuglerne tre gange med hver gang 2-5 ml destilleret vand, overføres hver isar til 0,5 ml substratpuffer til aktivitetsbe-stemmelse af peroxidase (0,1 mol/liter kaliumcitrat med en pH-værdi på 5,0 med 6 millimol/liter hydrogenperoxid og 40 millimol/liter o-5 phenylendiamin) og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur (22°C).
For at standse peroxidaseaktiviteten og for at forøge farveintensite-ten tilsættes 2,0 ml 1 mol/liter HC1, og absorptionen måles fotometrisk ved bølgelængden 492 nm i løbet af 30 minutter. I tabel 3 er der anført de værdier, der fås med 0,2 mol/liter natriumphosphat-10 puffer én gang uden sulfationer og én gang med 0,4 mol/liter sulfationer .
Tabel 3 ΔΑ 492 nm/RT/30 minutter CEA-standard uden med 0,4 mol/liter 15 ng/ml CEA sulfationer sulfationer 0 0,050 0,135 2,5 0,125 0,350 5,0 0,230 0,520 20 10,0 0,400 0,890 20,0 0,780 1,620 CEA-kontrolserum 10,2 0,430 0,930 25 __
Af tabel 3 fremgår det tydeligt, at sensiviteten forøges betydeligt ved tilstedeværelsen af sulfationer.
EKSEMPEL 4
Forøgelse af testfølsomhed som følge af forhøjet phosphatkoncentra-30 tion ved brug af monoklonalt, biotinyleret anti-CEA og avidin-peroxi-dasecomplexet
DK 158246 B
9 I hvert af det nødvendige antal testrør (10 x 75 mm) pipetteres 0,2 ml testopløsning (0,2 mol/liter henholdsvis 0,8 mol/liter natrium-phosphatpuffer med en pH-værdi på 6,5 med 2 g/liter bovint serumalbumin, 20% gedeserum, 0,1 g/liter 4-amino-antipyrin og 480 ng/ml mono-5 klonalt muse-anti-CEA-(C-3)-biotin/avidinperoxidase). I denne forud givne testopløsning blandes 0,050 ml CEA-standard (0 ng/ml CEA, 2,5 ng/ml CEA, 5,0 ng/ml CEA, 10,0 ng/ml CEA og 20 ng/ml CEA), til hvert testrør sættes en med monoklonalt muse-anti-CEA-(C-19) sensibiliseret polystyrenkugle (diameter - 6,5 mm), og der inkuberes ved 37°C i 16 10 timer. Derefter vaskes polystyrenkuglerne tre gange med hver gang 2-5 ml destilleret vand, kuglerne overføres hver især til 0,5 ml substratpuffer (0,1 mol/liter kaliumcitrat med en pH-værdi på 5,0 med 6 millimol/liter hydrogenperoxid og 40 millimol/liter o-phenylendiamin) til aktivitetsbestemmelse af den til kuglerne immunologisk bundne 15 peroxidase, og der inkuberes i 30 minutter ved 18-26eC. For at standse peroxidaseaktiviteten og for at forøge farveintensiteten tilsættes 2,0 ml 1M saltsyre, og ekstinktionen måles fotometrisk ved bølgelængden 492 nm i løbet af 30 minutter. I tabel 4 er der anført værdierne for CEA-standarderne.
20 Tabel 4 ^492 nm/20°C/30 minutter CEA-standard 0,2 mol/liter 0,8 mol/liter ng/ml CEA phosphatpuffer phosphatpuffer 25 0 0,080/0,080 0,090/0,095 2,5 0,160/0,170 0,310/0,315 5,0 0,230/0,235 0,450/0,460 10 0,425/0,435 0,830/0,850 20 0,810/0,825 1,700/1,650 30 _
Det fremgår tydeligt af tabel 4, at sensiviteten forøges væsentligt ved en forhøjet phosphatkoncentration.
De i dette eksempel anvendte monoklonale muse-anti-CEA-antistoffer fås analogt med den i Journal of Immunological Methods, 32 (1980),
DK 1S8246 B
ίο side 297-304, beskrevne metode, idet der dog som udgangscellelinje til fusionen anvendes det omtalte myelomlinje Sp 2/01-AG.
Fusionen udføres med miltceller fra mus, der er immuniseret med CEA. Immunisering af musene udførtes analogt med tabel 1 i den ovennævnte 5 publikation, idet de to første immuniseringer hver især udførtes med 50 μg CEA, immunisering nr. 3 og 4 blev udeladt, immunisering nr. 5 udførtes med 50 øg CEA, og immunisering nr. 6-8 hver især udførtes med 200 /tg CEA. Der anvendes to forskellige egnede monoklonale antistoffer, der er rettet mod forskellige epitoper af CEA-antigenet, og 10 som betegnes som henholdsvis anti-CEA (C-3) og anti-CEA (C-19).
IgG-Fraktionen af anti-CEA (C-3)-antistofferne dialyseres natten over ved 2-8eC mod 0,1 mol/liter natriumhydrogencarbonatopløsning (pH-værdi 8,2-8,5) og indstilles til en proteinkoncentration på 1 mg/ml.
Til hver ml proteinopløsning sættes 120 μΐ af en helt frisk frem-15 stillet biotin-succinimidesteropløsning (1 mg/ml i dimethylsulfoxid), og der inkuberes i 4 timer ved stuetemperatur. Derefter dialyseres biotin-antistofkonjugatet ved 2-8eC mod phosphatpufret, fysiologisk saltopløsning med 0,66 mg/liter Herfen®. Som proteinstabilisator tilsættes 10 mg/ml bovint serumalbumin.
20 Til kobling af peroxidase til avidin opløses 5 mg avidin i 2,5 ml af en 0,1 mol/liter natriumhydrogencarbonatopløsning (pH-værdi 9,5) og dialyseres natten over ved 2-8eC mod den samme opløsning. 10 mg peroxidase fra peberrod opløses i 3,0 ml destilleret vand, lades henstå i 1 time ved stuetemperatur, blandes derefter med 0,5 ml af en 25 vandig, frisk fremstillet 0,1 mol/liter natriumperiodatopløsning og inkuberes i nøjagtig 20 minutter ved stuetemperatur. Derefter befries peroxidasen ved ultrafiltrering for overskydende natriumperiodat og koncentreres til det oprindelige volumen. Efter ultrafiltreringen sættes peroxidaseopløsningen til avidinopløsningen, hvorefter der 30 inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur. Til reduktion af de Schiff'-ske baser og dermed til stabilisering af den kovalente binding sættes 0,5 ml af en frisk fremstillet, vandig, 0,1 mol/liter natriumborhy-dridopløsning til avidin-peroxidaseopløsningen, hvorefter der Inkuberes mindst 2 timer ved 2-8°C. Derefter dialyseres avidin-peroxida-35 sekonjugatet mod en phosphatpufret, fysiologisk saltopløsning med
Claims (10)
1, Fastfase-sandwichfremgangsmåde til hurtig bestemmelse af carcino-embryonalt antigen (CEA) ved inkubation af den prøve, der skal undersøges, med et første CEA-antistof, der er eller bliver bundet til en vanduopløselig bærer, og et andet CEA-antistof, hvortil der direkte 15 eller via en biotin/avidinbro er bundet peroxidase, adskillelse af den faste og flydende fase, måling af peroxidaseaktiviteten enten i den faste eller i den flydende fase som mål for det forhåndenværende CEA, kendetegnet ved, at inkubationen udføres i nærværelse af 20 0,4-1,0 mol/liter phosphationer eller 0,2-0,4 mol/liter sulfationer.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at prøven først inkuberes med det første CEA-antistof, der er eller bliver bundet til en vanduopløselig bærer, og derpå efter et vasketrin inkuberes med det andet CEA-antistof, til 25 hvilket der direkte eller via en biotin/avidinbro er bundet peroxidase, idet den anden inkubation udføres i nærværelse af 0,4-1,0 mol/-liter phosphationer eller 0,2-0,4 mol/liter sulfationer.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at der for ét antistofs vedkommende er 30 bundet peroxidase direkte til antistoffet. DK 158246 B
4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at begge CEA-antistofferne fås fra antisera fra forskellige dyrearter, og at der for ét antistofs vedkommende er bundet peroxidase direkte til antistoffet.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, . kendetegnet ved, at der anvendes CEA-antistof fra geder og marsvin, og at der for gede-antistoffets vedkommende er bundet peroxidase direkte til antistoffet.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, 10 kendetegnet ved, at der anvendes to forskellige monoklo-nåle muse-CEA.-antistof fer, og at der for det ene monoklonale muse-CEA-antistofs vedkommende er bundet peroxidase til antistoffet via en biotin/avidinbro.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 3, 15 kendetegnet ved, at der anvendes et CEA.-antistof, der fås fra et antiserum fra et dyr, samt et monoklonalt muse-CEA-antistof, og at der for det fra et antiserum vundne antistofs vedkommende er bundet peroxidase direkte til antistoffet.
8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, 20 kendetegnet ved, at der som CEA-antistof anvendes gede-CEA-antistof og monoklonalt muse-CEA-antistof, og at der for gede-CEA-antistoffets vedkommende er bundet peroxidase direkte til antistoffet.
9. Vandig opløsning med en pH-værdi på 4-9 indeholdende CEA-antistof, 25 til hvilket der direkte eller via en biotin/avidinbro er koblet peroxidase, kendetegnet ved, at opløsningen indeholder 0,4-1,0 mol/li-ter phosphationer eller 0,2-0,4 mol/liter sulfationer.
10. Vandig opløsning ifølge krav 9, 30 kendetegnet ved, at peroxidasen er koblet direkte til antistoffet.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH540381 | 1981-08-21 | ||
| CH540381 | 1981-08-21 | ||
| CH725881 | 1981-11-11 | ||
| CH725881 | 1981-11-11 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK373182A DK373182A (da) | 1983-02-22 |
| DK158246B true DK158246B (da) | 1990-04-16 |
| DK158246C DK158246C (da) | 1990-09-24 |
Family
ID=25697628
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK373182A DK158246C (da) | 1981-08-21 | 1982-08-19 | Sandwichfremgangsmaade til bestemmelse af carcinoembryonalt antigen og oploesning til brug ved denne fremgangsmaade |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4467031A (da) |
| EP (1) | EP0072902B1 (da) |
| AU (1) | AU554304B2 (da) |
| CA (1) | CA1185526A (da) |
| DE (1) | DE3263249D1 (da) |
| DK (1) | DK158246C (da) |
| ES (1) | ES8400147A1 (da) |
| FI (1) | FI73322C (da) |
| NO (1) | NO159754C (da) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4578349A (en) * | 1982-04-08 | 1986-03-25 | Abbott Laboratories | Immunoassay for carcinoembryonic antigen (CEA) |
| US4631254A (en) * | 1982-12-06 | 1986-12-23 | Hoffmann-La Roche Inc. | Carcinoembryonic antigen determination |
| GB8317022D0 (en) * | 1983-06-23 | 1983-07-27 | Erba Farmitalia | Adenocarcinoma related new antigenic determinants |
| JPS6015559A (ja) * | 1983-07-06 | 1985-01-26 | Shiraimatsu Shinyaku Kk | アポリポ蛋白−ｂの酵素免疫測定試薬 |
| EP0158291A3 (en) * | 1984-04-10 | 1988-07-27 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | A method for purifying carcinoembryonic antigen and a method for producing a carcinoembryonic antigen-reactive monoclonal antibody |
| US4686180A (en) * | 1984-11-21 | 1987-08-11 | South Alabama Medical Science Foundation | Onco-fetal specific monoclonal antibodies, methods of preparation and use |
| US4873313A (en) * | 1985-01-18 | 1989-10-10 | Beckman Research Institute Of City Of Hope | Specific hybridoma cell line and monocolonal antibodies produced from such specific hybridoma cell line and method of using such monoclonal antibodies to detect carcinoembryonic antigens |
| US4722889A (en) * | 1985-04-02 | 1988-02-02 | Leeco Diagnostics, Inc. | Immunoassays using multiple monoclonal antibodies and scavenger antibodies |
| DE3609217A1 (de) * | 1986-03-19 | 1987-09-24 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur bestimmung eines reaktionspartners einer immunologischen reaktion |
| US5190864A (en) * | 1986-04-15 | 1993-03-02 | Northeastern University | Enzyme amplification by using free enzyme to release enzyme from an immobilized enzyme material |
| US4937188A (en) * | 1986-04-15 | 1990-06-26 | Northeastern University | Enzyme activity amplification method for increasing assay sensitivity |
| DE3781841T2 (de) * | 1986-07-14 | 1993-04-15 | Abbott Lab | Diagnostisches immuntest-verfahren mittels festphasenabscheidung. |
| US6013772A (en) * | 1986-08-13 | 2000-01-11 | Bayer Corporation | Antibody preparations specifically binding to unique determinants of CEA antigens or fragments thereof and use of the antibody preparations in immunoassays |
| EP0390910B1 (en) | 1988-10-17 | 1995-12-13 | Molecular Devices Corporation | Hapten derivatized capture membran and assays using such membrane |
| US5888728A (en) | 1988-10-17 | 1999-03-30 | Molecular Devices Corporation | Hapten derivatized capture membrane and diagnostic assays using such membrane |
| JP2619549B2 (ja) * | 1989-06-29 | 1997-06-11 | 日本商事株式会社 | 抗原の定量法およびそれに用いる固相 |
| US5180828A (en) * | 1990-02-09 | 1993-01-19 | Molecular Devices Corporation | Chromophoric reagents for incorporation of biotin or other haptens into macromolecules |
| US5200316A (en) * | 1990-02-15 | 1993-04-06 | Miles Inc. | Immunoassay methods using noncross reactive cea gene family members antibodies |
| NZ511705A (en) * | 2001-05-14 | 2004-03-26 | Horticulture & Food Res Inst | Methods and rapid immunoassay device for detecting progesterone and other steroids |
| AU2003210274A1 (en) * | 2002-02-14 | 2003-09-04 | Schebo Biotech Aktiengesellschaft | Method for the detection of tumor markers cea, ca19.9, or ca72.4 in the stool, allowing diagnosis of gastrointestinal tumors |
| NZ528323A (en) * | 2003-09-18 | 2006-05-26 | Horticulture & Food Res Inst | Immunoassay |
| US20050214882A1 (en) * | 2004-03-25 | 2005-09-29 | Ez Bio Inc. | Reagents, methods and kits for the universal rapid immuno-detection |
| US20060084184A1 (en) * | 2004-10-19 | 2006-04-20 | Renovar Incorporated | Reagents for urine-based immunological assays |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1549069A (en) * | 1976-12-10 | 1979-08-01 | Erba Farmitalia | Enzyme linked immunoassay |
| US4180556A (en) * | 1977-03-09 | 1979-12-25 | Abbott Laboratories | Pretreatment method for carcinoembryonic antigen assay |
| JPS5510590A (en) * | 1978-05-04 | 1980-01-25 | Wellcome Found | Enzyme immunity quantity analysis |
| US4272504A (en) * | 1978-12-14 | 1981-06-09 | Abbott Laboratories | Antibody adsorbed support method for carcinoembryonic antigen assay |
| US4349528A (en) * | 1979-11-21 | 1982-09-14 | The Wistar Institute | Monocolonal hybridoma antibody specific for high molecular weight carcinoembryonic antigen |
| US4299815A (en) * | 1980-02-08 | 1981-11-10 | Hoffmann-La Roche Inc. | Carcinoembryonic antigen determination |
| US4376110A (en) * | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
| US4466687A (en) * | 1982-05-20 | 1984-08-21 | Amp Incorporated | Low profile connector providing high density application |
-
1982
- 1982-06-26 EP EP82105693A patent/EP0072902B1/de not_active Expired
- 1982-06-26 DE DE8282105693T patent/DE3263249D1/de not_active Expired
- 1982-07-06 CA CA000406742A patent/CA1185526A/en not_active Expired
- 1982-08-11 FI FI822800A patent/FI73322C/fi not_active IP Right Cessation
- 1982-08-11 AU AU87058/82A patent/AU554304B2/en not_active Ceased
- 1982-08-16 US US06/408,388 patent/US4467031A/en not_active Expired - Fee Related
- 1982-08-19 DK DK373182A patent/DK158246C/da not_active IP Right Cessation
- 1982-08-20 NO NO822853A patent/NO159754C/no unknown
- 1982-08-20 ES ES515132A patent/ES8400147A1/es not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK373182A (da) | 1983-02-22 |
| FI822800A0 (fi) | 1982-08-11 |
| NO159754C (no) | 1989-02-01 |
| AU8705882A (en) | 1983-05-12 |
| AU554304B2 (en) | 1986-08-14 |
| NO822853L (no) | 1983-02-22 |
| ES515132A0 (es) | 1983-10-16 |
| FI73322C (fi) | 1987-09-10 |
| ES8400147A1 (es) | 1983-10-16 |
| FI73322B (fi) | 1987-05-29 |
| NO159754B (no) | 1988-10-24 |
| CA1185526A (en) | 1985-04-16 |
| EP0072902A1 (de) | 1983-03-02 |
| DE3263249D1 (en) | 1985-05-30 |
| DK158246C (da) | 1990-09-24 |
| US4467031A (en) | 1984-08-21 |
| FI822800L (fi) | 1983-02-22 |
| EP0072902B1 (de) | 1985-04-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK158246B (da) | Sandwichfremgangsmaade til bestemmelse af carcinoembryonalt antigen og oploesning til brug ved denne fremgangsmaade | |
| AU695419B2 (en) | Method for detecting antibodies | |
| NO159620B (no) | Immunologisk bestemmelsesmetode. | |
| JPH0239747B2 (da) | ||
| CN112679605B (zh) | 针对新型冠状病毒核衣壳蛋白的抗体或其抗原结合片段及其应用 | |
| US4912033A (en) | Creatine kinase MB determination method | |
| JPH07508411A (ja) | Ｃｋｓ融合タンパク質の使用方法 | |
| EP0062892B1 (en) | Single incubation immunochemical assay for creatin phosphokinase mb | |
| US20080254440A1 (en) | Anti-Sars Virus Antibody, Hybridoma Producing the Antibody and Immunoassay Reagent Using the Antibody | |
| US5614394A (en) | Method and monoclonal antibodies for vitamin B12 determination | |
| Have et al. | An Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for the primary diagnosis of foot-and-mouth disease characterization and comparison with complement fixation | |
| EP0288179B1 (en) | Ckmb assay, monoclonal antibodies for use therein and hybrid cell lines | |
| Kitajima et al. | Production of antibodies to calmodulin in rabbits and enzyme immunoassays for calmodulin and anti-calmodulin | |
| EP0228174B1 (en) | Creatine kinase mb determination method | |
| US5137807A (en) | Method for determining beta-subunit of human prolyl 4-hydroxylase by immunoassay to detect hepatic disease | |
| US4812395A (en) | Method for detecting enzymatic activity using particle agglutination | |
| JPS6358260A (ja) | ＩｇＭ型抗体の測定法 | |
| EP0193935A2 (en) | Method for determining human prolyl 4-hydroxylase by immunoassay | |
| JPH10160735A (ja) | サンドイッチ測定法 | |
| JPH07117535B2 (ja) | ヒトプロテインｓに免疫学的測定方法、それに用いる測定試薬及びキット | |
| JP2821850B2 (ja) | ウィルソン病の検出試薬及び検出方法 | |
| EP0181762A2 (en) | Method for detecting enzymatic activity using particle agglutination | |
| Sobiech et al. | Enzyme immunoassay for alpha-amylase | |
| JP2000290300A (ja) | 抗プラスミノーゲン抗体、プラスミノーゲン測定方法及び測定試薬 | |
| JPS63141595A (ja) | 抗ヒトフエリチンｈ型サブユニツト単クロ−ン性抗体及びこれを産生するハイブリド−マ並びにこれを利用するヒトフエリチンｈ型サブユニツト量の測定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |