JPS63141595A - 抗ヒトフエリチンｈ型サブユニツト単クロ−ン性抗体及びこれを産生するハイブリド−マ並びにこれを利用するヒトフエリチンｈ型サブユニツト量の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒトフェリチンＨ型サブユニットに対する単
クローン性抗体、これを産生ずるハイプリドーマ及びこ
れを利用するヒトフェリチンＨ型サブユニット量の免疫
学的測定法に関する。

〔従来の技術及びその問題点〕

フェリチンは、２４個のサブユニットからなる分子量約
４５万の鉄を含むタンパクであり、血清中にも微量存在
し、その変動が貯蔵鉄量を反映することから、鉄欠乏性
貧血や鉄過剰症の指標として有用である。近年、白血病
、膵癌、肝癌などの悪性腫瘍で血清フェリチン値が高値
となることから、これらの指標としても有用であること
が報告されてきている（漆崎一部編「血清フェリチン」
東洋書店参照）。

ところで最近、フェリチンは存在する臓器によシ性質が
異なり、電気泳動などの結果から、イソフェリチンとし
て存在していることが、見出されている。

そして、フェリチンの不均一性は、フエリチンを構成す
るサブユニットにはＨ型とＬｆｆｉの２桟が存在し、そ
の２ａ［の組み合わせの違いによって生じることが明ら
かにされてきておシ、ヒトフェリチンの各臓器における
Ｈ及びＬ型サブユニットの割合についても報告が、なさ
れている（Ａｄｅｌｍａｎ。

Ｔ、　Ｇ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅ
ｓ、　Ｃｏｍｍ、、６３　：　１０５６゜１９７５、及
び渡辺直樹、新津洋司部；札幌医誌。

４８：３８５，１９７９参照）。

特に、悪性腫瘍では、良性疾患に比べてＨ型テプユニッ
トの割合が高いインフェリチンが増加することが明らか
にされており、従って悪性腫瘍の診断にはＨ型サブユニ
ット量の増減を鋭敏に反映する、Ｈ型サブユニットと特
異的に反応する抗体を用い九測定が有用とされている。

しかしながらフェリチン分子は前に述べた様に撫々の割
合に組合わされた２４個のＨ型及びＬ型サブユニットで
構成されている丸め、Ｈ型サブユニットに特異的な抗血
清を得ることは困難であった。又細胞融合法により得ら
れる単クローン性抗体の場合でもＨ型サブユニットの抗
原性が弱いためＬ型サブユニットや他の夾雑抗原の影響
を大きく受け、Ｈ型サブユニットに特異的な単クローン
性抗体を産生ずるハイプリドーマを選択することが困難
であったことから、抗ヒトフェリチンＨ型すブユニット
単りローン性抗体は得られていなかった。従って、Ｈ型
サブユニットを特異的に捕らえることのできる抗体を用
いた測定が有用であると言われながら、実際には実施不
可能であった。

ｃ問題を解決するための手段〕 斯る実状において、本発明者らは、ＨＷサブユニットを
特異的に捕える抗体を得べく鋭意研究をおこなった結果
、抗原としてＨ型サブユニットを多く含むフェリチンの
高度精製物を用い、細胞融合の手段によって調製したハ
イプリドーマはフェリチンＨ型サブユニットに特異的な
単クローン性抗体を産生ずることを見出し、本発ＥｉＡ
ｔ−完成した。

すなわち、本発明はヒトフェリチンＨ型サブユニットに
対する単クローン性抗体、これを産生ずるハイプリドー
マ及びこれを用いるヒトフェリチンＨ型サブユニットの
免疫学的測定法を提供するものである。

本発明のハイプリドーマ及び単クローン性抗体は、抗原
（免疫原）としてＨ型サブユニットを多く含むフェリチ
ンの高度ｎ実物（以下「フェリチン精製物」と略称する
）を用いる以外は、公知の方法（たとえば、Ｎａｔｕｒ
ｅ　２５６　、４９５（１９７５）、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　３９　２８５（１９８０）など
）を利用し、調製することができる。よシ具体的には、
通常以下の工程により調製される。

（１）　　免疫−細胞融合用抗体産生細胞の調製ｅ）細
胞融合−ハイプリドーマの作成 （３）　　ハイプリドーマの選択及び単クローン化（４
）単クローン性抗体の作成 工程（１）において抗原として用いられるフェリチン精
製物は、Ｈ型サブユニットを２０％以上、好ましくは４
０％以上含むフェリチン、例えばＨｅＬａ細胞や心臓由
来の７エリチ／又はサブユニット再構成によって得られ
たフェリチンを７フイニテイー・クロマトグラフィーに
より精製することによって得られる。そして、このフェ
リチン精製物の調製に当っては、前処理として必要に応
じ、■超音波処理、■酸性処理、■熱処理、■硫安分画
、■ゲルろ過楕製、■調製用電気泳動ｎ裂等の手段を単
独若しくは組み合せて用いることも可能である。

本発明で用いる精製フェリチンの特に好ましいｙ４梨方
法としては、ＨｅＬａ細胞を通常動物細胞の培養に用い
る方法、例えばＢ、　Ｍ、　Ｊｏｎｅｓら（Ｃ１１ｎｉ
ｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ、　１０６　（１９８
０）２０３　）などの方法によって培養し、これから例
えば超音波処理などにより細胞を破砕しその可溶成分を
例えば熱処理や酸処理あるいはゲル濾過法やイオン交換
クロマトグラフィー法などによシ粗ｎＩ製した後、アフ
ィニティー精製する方法が挙げられる。

このようにして得られる精製フェリチンは、電気泳動法
などの分析により９８％以上の純度をもつことが確認さ
れ、Ｈ型とＬ型サブユニットの比率が約９　：　１　、
Ｈ型サブユニットの分子量約２１．０００．Ｌｕサブユ
ニットの分子量約１へＯＯＯであった。

また免疫動物としてはラット、マウスが用いられるが、
ミエローマ細胞がそろっている点から、たとえば、ＢＡ
ＬＢ／Ｃマウスが好ましい。また、免疫は、上で得られ
た抗原をたとえば、アジュバントとして、７０インドア
ジユバント結核死菌、核酸、ミョーバンなどを用い、た
とえば腹腔内投与または皮下投与することによりおこな
われる。

抗原の投与は、１回のみでも良いし、必要なら３〜３０
日間隔で２回以上投与しても良い。このように免疫した
免疫動物から最終免疫後、たとえば３日〜１０日間経過
したのち牌臓を取シ出して、これを細胞融合用抗体産生
細胞として用いる。

工程（２）において用いるミエローマ（骨髄腫）細胞と
しては種々のものが知られているが、免疫グロブリン非
産生株である、たとえばＳＰ２１０−Ａｇ１４　、Ｐ３
−ＮＳＩ／１−Ａｇ４．１　、ＰｕＢｕｌ−Ｏｕ。

Ｐ９−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ　＋　Ｘ６３−Ａｇ＆６５
３　＊などを用いることが好ましく、これを上記工程（
１）で得た抗体産生細胞とを適当な割合及び個数、たと
えば１　：　１０−１　：　ｌテｌ　ＸＩＯ’個＃　ｌ
　Ｘ　１０”個で混合し、適当な細胞融合用培地、たと
えばＲＰＭｌｌ　６４０−？ＭＥＭ培地及び約５０％ポ
リエチレングリコール（分子量１０００〜６０００程匿
）を用いて公知の方法（Ｎａｔｕｒｅ　２５６４９５（
１９７５））によシ細胞融合が実施される。

融合した細胞は、ハイブリドーマのみを生育させる培地
、たとえばミエローマとして、ｓＰ２／。

−Ａｇ１４を用いた場合には、ＨＡＴ培地（ヒポキサン
チン、アミノプテリン及びチミジンを含有する培地）で
培養することによりハイブリドーマのみを選択的に得る
ことができる。

工程（３）におけるハイブリドーマの選択には、一般に
酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ　）、ラジオイムノア
ッセイ法（ＲＩ　Ａ　）、凝集反応法、プラーク法など
が、用いられるが、たとえば、マイクロプレートを用い
たｇＬＩｓＡ法によって行う場合であれば、前記のハイ
ブリドーマをＨＡＴ培地中で培養した培養上清（ハイブ
リドーマ由来の抗体を含む）とＨｅＬａ由来のフェリチ
ンをマイクロプレート内で反応させ、生理食塩水などで
洗浄後、適当に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標
識抗マウスＩｇｃ抗体を反応させ、さらに洗浄後、適当
な基質を加え、反応させることによＦ）　ＨｅＬａ由来
フェリチンと反応する抗体を産生ずるハイブリドーマを
選択することができる。また、選択したハイブリドーマ
を単クローン化する方法としては、ＦＡＣ８（Ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｔ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　５ｏ
ｒｔｅｒ　）を用いる方法、５ＯＦＴ　Ａｇａｒによる
方法などがあるがたとえばフィーダー細胞にマウス胸腺
細胞を用いて、限界希釈法に数度かけることによシ、単
クローン化することが好ましい。

工程（４）の単クローン性抗体の作成は、単クローン化
したハイブリドーマをマウス腹腔内で培養するか又は適
当な培地中で培養することによシ、実施される。たとえ
ば、マウス腹腔内で培養する場合であれば、あらかじめ
ブリスタン（２，６゜１０．１４−テトラメチルペンタ
デカン）を腹腔内に注射した、たとえばＢＡＬＢ／Ｃの
腹腔内にハイブリドーマを投与したマウスを適当な時間
、たとえば１〜４週間程度飼育する。ハイブリドーマ投
与によりマウス体内にハイブリドーマによる腫瘍が形成
され、それに伴い腹水中に高濃度に抗体が生成してくる
のでこのマウスの腹水を採取し、単クローン性抗体を得
る。採取した腹水や培養液中の抗体は、そのままでも使
用可能であるが、たとえば硫安分画法、イオン交換クロ
マトグラフィー法、ゲル濾過法、プロティンＡ−結合担
体を用いたアフィニティークロマトグラフィー等などに
よシ、高度に精製して用いた方がよシ好ましい。

この様にして得られた単クローン性抗体は、ＥＬＩＳＡ
ウエスタンプロッテ／グ法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃｏｄ　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７６．３１１６（１９７９
））により、特異性を確認した結果ヒトフェリチンに対
する結合能を持ち、さらにヒトフェリチンでも、Ｈ型サ
ブユニットと特異的に結合することができるものである
。

更に本発明の単クローン性抗体は、次のような特性を有
する。

（１）　　ヒト７エリチ／と結合し、その他の血清成分
とは交叉反応しない。

（２）　ヒトフェリチンのＨ型サブユニットと特異的に
結合する。

（３）抗体のクラスはＧである。

（４）各種臓器由来フェリチンとの反応性はＨｅＬａ　
＞心〉牌 で’）、り、Ｈサブユニット量を反映する。

斯くして得られた本発明の単クローン性抗体を用いる免
疫学的測定法としては、公知の原理に基づく、どの様な
方法でも利用することができる。

従って、抗原抗体沈降反応に基づく、免疫学的定量方法
を用いることもできるが、より高感度で特異性、定量性
に優れた方法、例えば （１）抗体結合不溶化担体を用いた凝集反応に基づく免
疫学的定量方法 （２）酵素を標識物質として用いる酵素免疫定量法（Ｅ
ＩＡ） （３）　　放射性物質を標識物質として用いるＲＩＡ（
４）螢光物質を標識物質として用いる螢光免疫定量法（
ＦＩＡ） などがより好適である。

以下、代表的な方法である上記（１）及び（２）の方法
を例にとシ、本発明のヒトフェリチンの免疫学的測定法
を更に詳しく説明する。

方法（１）で用いる不溶化担体としては、ポリスチレン
など有機高分子よシなるラテックス菌体、赤血球、シリ
カ、アルミナ、金属ゾルなどがあシ、抗体を不溶化する
方法としては、周知の方法、例えば、物理的吸着による
もの又は、例えばグルタルアルデヒドやカルボジイミド
などの架橋剤を用いた化学的結合方法などを用いれば艮
い。この場合、抗体はそのまま用いても良いが、各方法
に適した状態、たとえば、ペプシン、パパイン等の酵素
を作用させ、Ｆ（ａｂ’）１　、　Ｆａｂ’　、　Ｆａ
ｂ　などに消化後ｎ製して用いても良い。

また、凝集の度合いを検出し、定量する方法としては分
光学的方法、たとえばイムノケミスｌ−１ｊ−（Ｉｍｍ
ｕｎｏｒｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　１２　、３４９　（
１９７５）に記述する方法、粒子数の変化を検出する方
法メソツヅインエンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇ）’）　７４　、１０６　（１９
８１）などの公知の方法を用いることができる。

方法（２）の酵素免疫測定法については、底置「酵素免
疫測定法」石川栄治ら編、医学誉院などに詳しいが、測
定系については競合法、非競合法のいづれかも使用する
ことができる。酵素としては、ペルオキシダーゼ、β−
ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコー
スオキシターゼ、グルコアミラーゼ及びその誘導体など
が代表的であるが、アビジン−ビオチン系抗ペルオキシ
ダーゼ抗体−ベルオキシダーゼ複合体を用いる系も使用
することができる。酵素と抗体又は酵素と抗原の架橋方
法としては、グルタルアルデヒド法、過ヨーソ酸法、マ
レイミド法−ピリジル・ジスルフィド法、ｐ−ベンゾキ
ノンを用いる方法、モノヨードアセテート誘導体を用い
る方法などが利用できる。この場合も、抗体はそのまま
用いても良いが各方法に適した状態、たとえばＦ（ａｂ
’）ｘｓＦａｂ’、Ｆａｂなどにパパイ／、ペプシンな
どの酵素によシ消化後ｎＩ製して用いても良い。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。

実施例ｌ ＨｅＬａ細胞よりフェリチンの精製： 本発明に使用したＨｅＬａ由来フェリチンの精製物は、
以下の方法により調製した。

■　超音波処理 約１０凰０個のＨｅＬａ細胞を生食に懸濁し、水冷下超
音波処理（５０Ｗ、５分）を行った後、処理液を遠心し
上清的２０−を得た。

■　酸性処理 ■で得た上清にＩＮ＝酢酸を添加し、ｐＨを４．５に調
整した。生じた不溶物を遠心除去し、上清２０−を得た
。

■　熱処理 ■で得た上清を７０℃で５分間熱処理し、速やかに冷却
後、不溶物を遠心除去し、上清２〇−を得た。

■　硫安分画 ■で得た上清に硫安を加え５０％飽和とし、沈殿物を遠
心により得る。この沈殿を少量の精製水で溶解し、約１
１ｎｌとした。

■　ゲル濾過 ■で得た液を、トリス−ＨＣｌ　（ｐｕ　６．８　）で
平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘＧ　２００　（ファルマシ
ア社）を用いるゲル濾過に付した。流速は約１０ｄ／ｈ
ｒとし、各７ラクシヨン３．５　Ｍｔずつ分取した。

フェリチン分画を集め、コロジオンバックによシ濃縮し
、部分精製フェリチン溶液的３１ｆｔ−得た。

■　調製用電気泳動 ■で得られた部分精製フェリチン以下の条件で水冷下電
気泳動し、フェリチンの泳動ゾーンである褐色のゾーン
を切り取シ、０．００９９Ｍトリス−０，０７６７Ｍグ
リシン緩衝液（ｐＨ８，４）で抽出した。約２１Ｒ１の
粗精製フェリチン溶液を得な。

濃縮用ゲル　　３，２チ　　０．２６Ｍ　トリス−ＨＣ
ｔ（ｐＨ６，８）分離用ゲル　　５．５％　　０．３７
Ｍ　トリス−Ｈｅ２（ｐＨ８，９）泳動用緩衝液　０．
００９９Ｍ　）リス−０，０７６７Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎ（
ｐＨ８，４） ■　アフィニティー精製 ■で得られた粗ｎ製フェリチンを２０ｍＭ）リス−ＨＣ
１（ｐＨａｏ）緩衝液に対し透析後、あらかじめ作成し
た抗ヒトフェリチン抗体結合セファロース４Ｂゲルをつ
めたカラム（１ｍｘｌＯｃｒｎ）を通過させた。流速１
　ａｔ　／　ｍ　ｉ　ｎで同緩衝液ｔ　２８０　ｎｍ吸
光度がほぼＯとなるまで流し、次に緩衝液を３Ｍ　　Ｎ
ａＳＣＮ−２０ｍＭ　）リス−ＨＣｔ（ｐＨ８，０）に
変え、溶出した。各フラクショｙｌ　ｍｌづつ分取し、
２８Ｑｎｍの吸収のあるフラクションを集めた。このも
のを濃縮し、免疫用梢ｆｉＨｅＬａフェリチンとじ九。

収量は１０１０個のＨｅＬａ細胞から約１．２■であっ
た。

実施例２ 単クローン抗体とそれを産生ずるハイプリドーマの製法
： （１）　　免疫 オスのＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に完全７０インドア
ジユバント（ＣＦＡ）中１０μ２のＨｅＬａ由来精製フ
ェリチンを注射した。さらに１４日及び２８日目に同一
マウスの腹腔内に不完全アロイ／ドアシュバンド（ＩＦ
Ａ）中ｘｏｐｔのＨｅＬａ由来フェリチンを注射した。

そして４２日目、リン酸緩衝化生理食塩液（ＰＢＳ）中
、５０μｔのＨｅＬａ由来フェリチンを同マウスの尾静
脈に注射し、４５日目に牌臓を摘出し融合に供した。

（２）細胞融合 最終免疫より３日後のマウスの牌臓２匹分を摘出し、Ｒ
ＰＭ１１６４０培地中でよくほぐして肺細胞を浮遊させ
た。１５００　ｒｐｍで５分間遠心して細胞を集め、Ｒ
ＰＭＩ　１６４０で２回洗浄した後、同培地２−を加え
１０８個の肺細胞浮遊液を得た。これにＲＰＭ１１６４
０で２回洗浄した８−アザグアニン耐性マウス骨髄肺細
胞（Ｓｐ２１０−Ａｇ１４）１０’個を加えよく混合し
た後、１５００ｒｐｍで５分間遠心した。

遠沈した細胞をよくときほぐした後、３７℃で保温した
５０％（Ｗ／Ｖ　）のポリエチレングリコ−＃１５４０
（平均分子′Ｍｋ１５００．和光紬薬工業■）を含むＲ
ＰＭＩ−１６４００，５１ｎｌをゆっくりと滴下し、静
かに遠沈管を動かして１分間処理した。続いてＲＰＭＩ
　１６４０　１０ｍを徐々に加えて融合反応を停止し、
１５００ｒｐｍで５分間遠心して細胞を集め、さらにＲ
ＰＭ１１６４０で１回洗浄後、１０％牛脂児血清（Ｆｅ
２　）含むＲＰＭ１１６４０　３０−に浮遊し、９６穴
マイクロカルチヤープレート（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）　３枚に１ウエルろ
たＣ　０．１−ずつ分注して３７℃、７チ炭酸ガス培養
器中で培養した。１日、２日、３日後にそれぞれ０．１
ｄ１７）ＨＡＴ培ｍ（１０−’Ｍヒポキサンチン、４Ｘ
１０Ｍ　　アミノプテリン、１．６Ｘ１０Ｍチミジン及
び１０％ＦＣ３を含むＲＰＭＩ　１６４０　）を追加し
、１ｏ日後はとんどすべてのウェルで融合細胞の増殖を
観察した。

（３）抗ＨｅＬａフェリチン抗体産生細胞の選択とクロ
ーン化 抗ＨｅＬａフェリチン単りローン性抗体産生細胞の選択
のため、ＥＬＩＳＡ法によシ、培養上清中の抗体活性を
測定した。すなわち、ＰＢＳ中２μＶＩｔのＨｅ　Ｌａ
由来高度精製フェリチンを９６穴マイクロタイタープレ
ー）　（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ。

Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）に１ウエルあたり５０μｔずつ分
注し、４℃で１昼夜インキユベートした。１ウエルあた
り１００μｔの１％牛血清アルブミン、０．０５％ツイ
ーン２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７，２（以下１％ＢＳＡ−
ＰＢＳ）で３回洗浄した後、各ウェルの培養上清５０μ
ｔを加えて３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ
で３回洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍に希釈
したペルオキシダーゼ標識抗マウスＦｃフラグメント抗
体（ヤギ）（Ｂｉｂ−Ｙｅｄａ、ｌ５ｒａｅｌ　）をｓ
　ｏ　ｐｔ加えて、３７℃で１時間インキュベートした
。ＰＢＳで３回洗浄後、０．２％オルトフェニレンジア
ミン、０．０２％過酸化水素を含むクエン酸−リン酸緩
衝液（ｐＨ５，０）を５０μを加え、室温で３０分反応
後、４．５Ｍ硫酸５０μｔを加えて反応を停止した。強
く赤褐色を呈したウェルを陽性とし、２８８ウエル中１
０ウエルを選択した。

単クローン化は、限界希釈法によシ行りた。すなわち、
フィーダ一層としてＢＡＬＢ／Ｃマウスの胸腺細胞を１
ウエルあた＃）１０’個１０．２−ずつ分注した９６穴
マイクロカルチヤープレートに、特異抗体陽性ウェル中
のハイプリドーマを１０個／ｄとなるように希釈したも
のを０．１　ａｊずつ分注した。培地は、初回はＨＴ培
地（ＩＯＭ　　ヒポキサンチン、１．６ＸｌＯＭチミジ
ンおよび１０％ＦＣ８を含むＲＰＭ１１６４０）を２回
目以降は、１０チＦＣ８を含むＲＰＭ１１６４０ｔ−用
いた３７℃、７％炭酸ガス培養器中で１０日間培養後、
多数の特異抗体産生ハイプリドーマの増殖を認めた。そ
の後、前述のＥＬＩＳＡ法による特異抗体陽性ウェルの
選択および限界希釈法による単クローン化の操作を各３
回繰り返した。以上の様にして、最終的に４株の抗Ｈｅ
Ｌａフエリチ／単りローン性抗体産生ハイプリドーマ株
が確立された。そして、それぞれのハイブリドーマ及び
それが産生ずる単クローン性抗体をＦＨ−１、ＦＨ−２
、ＰＨ−３及びＦＨ−４と命名した。

（４）単クローン性抗体の分離及び精製前処理として、
８週令のＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に０．５−のプリ
スタン（Ａｌｄｒｉｃｈ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）を注
射した。２週間後、０．５ｄのＲＰＭＩ　１６４０に浮
遊した単クローン化ハイプリドーマ５　Ｘ　１０’個を
腹腔内に注射した。１０〜１４日後から貯留した腹水を
１８Ｇの注射針を用いて繰シ返し採取した。得られた腹
水は３０００　ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行い、細
胞その他の不溶成分を除去して澄明な液体とした。この
腹水に等容量の飽和硫酸アンモニウム溶液を攪拌しなか
ら徐々に加えることにより粗免疫グロブリン画分を沈殿
せしめ、３０００ｒｐｍ、３０分遠心分離を行い沈殿物
を集めた。次に１０ｍＭのトリス−ＨＣｔ緩衝液（ｐＨ
８，０）で溶解し、同緩衝液に対して透析した。続いて
ＤＥＡＥ−セファセルカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ。

Ｓｗｅｄｅｎ　）を通過せしめた後、ＯＭから０．２５
　Ｍの塩化ナトリウムによる直線濃度勾配により溶出し
てａＳ抗体を得た。各クローンの腹水及び精製抗体の収
量を後記衣１に示した。

（５）抗体のクラス、サブクラスの決定９　ａｌの単ク
ローン性抗体について、モノＡｂ−ＩＤ　　ＥＩＡキ７
ト（ＺＹＭＥＤ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳＩｎｃ、　
Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）を用いてクラス、サブクラスを決
定した。結果を表１に示した。

表１ 実施例３ 各種臓器由来フェリチンとの反応： 由来の異なる３種の７エリテン、すなわちＨｅＬａフェ
リチン（実施例１）、ヒト心臓フェリチン（Ｕ　ＣＢ　
−Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｓ、　Ａ、　Ｂｅｌｇｉｕ
ｍ　）およびヒト牌鷹フェリチン（ＲＡＤ　Ｉ　ＯＩＭ
ＭＵＮＯＡＳＳＡＹＩｎｃ、　Ｃａｎａｄａ　）をＰＢ
Ｓで１．７ｐｔ／−に希釈したものを、それぞれ９６穴
マイクロタイタープレートに１ウエルあたυ５０μｔず
つ分注し、４℃で一昼夜インキユペートした。各ウェル
を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３回洗浄した後、これに１％Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳで１０ｍ０Ｄ　、　１ｍ０Ｄ　、　０．１
ｍ０Ｄ　、　０．０１ｍ０Ｄ　、０．００１ｍ０Ｄとな
るように希釈した楕製抗ＨｅＬａ　７工リチン単クロー
ン性抗体を５０μｔずつｎ＝２で添加し、３７℃で２時
間インキユベートシた。次にＰＢＳで３回洗浄後、１％
ＢｓＡ−ＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシダー
ゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体くヤギ）　（ＴＡＧＯＩｎｃ
。

Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）を５０　ｐＬ加えて３７℃で１時
間インキュベートした。これをＰＢＳで３回洗浄後、０
．２チオルトフエニレンジアミン、０．０２％過酸化水
素を含むクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５，０）を５０
μを加え、室温で１５分反応後４．５Ｍ硫酸５０μｔを
加えて反応を停止した。５０００−６６０ｎにおける吸
光度をコロナ２波長マイクロプレート光度計（ＭＴＰ−
１２型　コロナ電気■）で測定した。この結果を表２に
示した。

表２ 実施例４ 抗Ｈサブユニット抗体であることの確認＝０．５岬／ｄ
の濃度のＨｅＬａフェリチンおよびヒト牌［フェリチン
をそれぞれ等容量のＳＤＳ化バッファー（４０％（ｗ／
ｖ）グリセロール、４．３％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナ
トリウム、１０チ（ｗ／ｖ）２−メルカプトエタノール
、０．１２５Ｍ　　トリス−ＨＣｌ　（りＨ６，８）　
）と混合し、９０℃で１０分間加熱処理した後、４〜２
０％ポリアクリルアミドグラジェントゲル（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧプレート４／２０、第一化学薬品＠）を用いて、６
０ｍＡの定電流で１時間泳動した。泳動された蛋白は直
ちに、ゲルメンプラン転写装置（ＫＳ−８４４０ＧＭＴ
型、マリツル産業■）を用いて、ニトロセルロースメン
プラン（Ｔｒａｓ　−Ｂｌｏｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｍ
ｅｄｉｕｍＢｉＯ−Ｒａｄ、Ｕ、Ｓ−Ａ、）に４０Ｖの
定電圧で２時間転写された。本操作は、２枚のニトロセ
ルロースメンブランについて行い、１枚はＣＢ　Ｂ　（
ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ　Ｇ
−２５０）による直接蛋白染色に、１枚は本単クローン
性抗体による酵素抗体染色に供した。すなわち、ＣＢＢ
染色は転写の終了したメンプランを直ちに染色液（０，
１％（Ｗ／Ｖ）ＣＢＢ、２５％（Ｗ／Ｖ）エタノール、
　８　％　（ｗ／ｖ）酢酸）につけ５分間処理後、脱色
液（９０％（Ｗ／Ｖ）メタノール、２％（ｗ／ｖ）酢ｒ
１りで脱色し九。

酵素抗体染色は転写の終了したメンプランを２％（ｗ／
ｖ　）　Ｂ　Ｓ　Ａ及び０．９　％　（ｗ／ｖ　）塩化
ナトリウムを含む０．０５Ｍ）リス−ＨＣ４緩衝液、　
ｐＨ８，０（以下ＢＳＡＴＢＳ　）中につけ室温で２時
間振盪した後、Ｂ　Ｓ　ＡＴ　Ｂ　Ｓ中７μｆ　／ｍｌ
の本単クローン性抗体を含む抗体液につけ、室温で１時
間振盪した。

ＴＢＳで５回洗浄後、ＢＳＡＴＢＳで５０００倍に希釈
したペルオキシダーゼ標識抗マウスＦｃ７ラグメント抗
体（ヤギ）液につけ、室温で１時間振盪し喪。さらにＴ
ＢＳで５回洗浄後、基質液（０，２５”ｉ　／　ｍｌ　
３　、３°−ジアミノペンチジン。

０、０２　％過酸化水素、２５ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＨ７，
０）につけ室温で１５分反応し、楕裂水で洗浄して反応
を停止した。以上の様にして得た２枚のメンプラン（Ｃ
ＢＢ染色と酵素抗体染色）を対比させることにより本単
クローン性抗体はすべてＨサブユニットとのみ反応する
ことが確認できた。例としてＦＨ−１の結果を図１に示
した。

実施例５ β−ガラクトシダーゼを用いた酵素免疫測定法： （１）抗フェリチンＨサブユニット単りローン性抗体不
溶化 （１）　　ポリスチレンボールの製造 ポリスチレンボール（φ６．４　ｍｓ　）　１０００個
を、マウス腹水より精製したＩｇＧ分画（実施例参照）
を０．１５　Ｍ　ＮａＣ１−０，０１Ｍ　　リン酸緩衝
液に１μｆ／ｄとなるように溶解した溶液８００ｄｌｃ
浸し、４℃で２４時間放置した。その後緩衝液を除去し
、１チ牛血清アルブミン、０．０５チツイーン２０を含
む０．１５Ｍ　ＮａＣＬ−０，０１Ｍ　　ＩＪン酸緩衝
液で洗浄し、同緩衝液に保存した。

（２）酵素標識抗体の製造 石川らの方法（石川栄治ら、「酵素免疫測定法」第２版
１９８２医学書院）によシ行った。

（１）　　ＩｇＧよ＃）Ｆ（ａｂ’）ｓの調製実施例１
の方法によシ精製したＩｇＧ　５０■を０．１Ｍ酢酸緩
衝液（ｐ）Ｉ　４．２　）に溶解し、重量％で４％のペ
プシンを加え、３７℃で８〜１８時間放置した後、ｐＨ
を＆Ｏとして、消化を停止した。次にウルトロゲルＡｃ
Ａ４４　（ＬＫＢ　）を用いたゲル濾過を行いＦ（ａｂ
’）ｘ画分を集めた。

（１）　　β−ガラクトシダーゼ標識−Ｆａｂ’の調製
Ｆ（ａｂ’）ｘを８　ｘｑ　／　ａｒｔとし、その２−
を０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６−１ｍＭＥＤＴＡに一夜
透析し、０．２Ｍメルカプトエチルアミン２００μｔを
添加した３７℃で９０分還元反応しセファデックスＧ２
５のカラム（φ１．２　Ｘ　８０備）でゲル濾過し、Ｆ
ａｂ’を得た。濃縮して２ｄとし、５０９／ｓｆのＮ、
Ｎ−０−フェニレンジマレイミドのＤＭＦ溶液２０μｔ
を加え、３０℃３０分反応させＦａｂ’−マレイミドと
した。これをセファデックスＧ２５でゲル濾過し、未反
応試薬を除きＦａｂ’−マレイミドのｐＨを６．３とし
た。１０１９のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（べ一リンガ
ー社製）ｔ−加えてから２ｄに液量を調整し４℃で４０
０時間反応せた。１０ｍＭ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ６，５
）（０，１Ｍ塩化ナトリウム１ｍＭ塩化マグネシウム−
０，１％牛血清アルブミン−０，１％窒化ソーダ）で平
衡化した、セファクリルＳ−４００の力２ム（φ１．５
Ｘ１００ｍ）によシβ−Ｄ−ガラクトシダーゼーＦａｂ
’結合物を未反応Ｆ　ａ　ｂ’から分離した。

（３）酵素免疫測定−Ｆａｂ’−β−ガラクトシダーゼ
と抗体不溶化ポリスチレンボールを用いた方法試験管（
φ１２　ｒｕ　Ｘ　８０　ＭＪＭ）に５０μｔの検体（
血清）または標準液を取る。次に１４ＢＳＡ。

０．０５％ツイー７２０を含む０．１５　Ｍ　ＮａＣ１
−０、ＯＩ　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，８）を用い、（
２）で製造した酵素標識抗体を１００倍に希釈したもの
を０．５コ加え、更に（１）で製造した不溶化抗体ボー
ル１個を加え、３７℃１時間保温した。保温終了後、反
応液を吸引除去し生理食塩水２ＩＲｔを加え洗浄する。

この操作を２回行った。洗浄終了後あらかじめ準備した
５　００　ｐｔの基質液（１０ｍＭ　−ｏ　−ニトロフ
ェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドと１００ｍＭ−β
−メルカプトエタノールを含むｐＨ７，２の５０ｍＭの
リン酸緩衝液）の入った試験管に移し、３７℃で１時間
反応させ、２ゴの０．１Ｍ炭酸ナトリウム液を加え、反
応を停止した。

吸光度を測定し縦鵬に、フェリチンの製置を横軸に取り
、片対数グラフを用い、標準曲線を作成し検体の吸光度
を内挿してフェリチンの量を換算した。この結果を表３
に示す。

実施例６ ベルオキシダーゼを用いた酵素免疫測定法：（１）抗フ
ェリチンＨサブユニット単りローン性抗体不沼化マイク
ロタイタープレートの製造抗フェリチンＨサブユニット
単りローン性抗体（Ｉ　ｇＧ　）を１０ｍＭＩＪン酸緩
衝化生理食塩水（以下ＰＢＳ）で希釈し、１μｔ　／　
ｍｌとした。この５０μｔを各ウェルに分注し、４℃で
一夜放置した後未反応液を吸引除去し、各ウェルを２５
０ｐｔづつ３回１チＢ　Ｓ　Ａ　−０，０５％ツイーン
２０を含むＰＢ８で洗浄した。洗浄後は、水分を振シ切
シ表面が乾燥しないように憶い低温室に保存した。

（２）酵素標識抗体の製造 酵素としてペルオキシダーゼ（西洋ワサビ）を用い１中
根ら（Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｃｙｌｏｃｈｅｍ、、
　２２巻。

１０８４頁、１９７４年）による方法にて以下の様にし
て製造した。

ペルオキシダーゼ（東洋紡）４岬を１−の水に溶解し、
０．１　Ｍ　ＮａＩＯ４０，２ｙｄを加え、室温で２０
分反応する。反応終了後１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に
透析し０．２　Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液にてｐＨを９〜
９．５に調製した後、５′ＩＱのＦａｂ’を添加し室温
で２時間反応した。更に４１１９／−のＮａＢＨ４０，
１−を加え、４℃２時間放置後、ウロトログルＡｃＡ４
４　（ＬＫＢ　）を用いたゲル濾過を行い、２８０ｎｍ
及び４０５　ｎｍの吸光度よシ酵素標識抗体のピークを
集め濃縮保存した。

（３）フェリチンの測定 （４）ペルオキシダーゼ標識抗体と抗体不溶化ポリスチ
レンボールを用いた方法： 試験管（φ１２　ｍ　ｘ　８０　ｍ　）に５ｏｐｔの検
体（血清）又は標準液を取る。次に１％Ｂ　Ｓ　Ａ。

０、０５　％ツイーン２０を含む０．１５　Ｍ　ＮａＣ
１−０、０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）　ｌ用い、
２で製造した酵素標識抗体を１０００倍に希釈したもの
をα５ｄ加え、更に実施例５で製造し九抗体不溶化ポリ
スチレンボール１個を加え、３７℃３０分保温した。保
温終了後、反応液を吸引除去し生理食塩水２−を加え洗
浄する。この操作を２回行った。洗浄終了後あらかじめ
準備したＱ、　２　％　ｏ−フェニレンジアミン・２塩
酸塩（Ｈ！０鵞含むリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５，
０））０．５−中にボールを移し、室温で１５分間反応
させた。Ｉ　Ｎ　−Ｈ＊ＳＯａ　２　ｙｄを加え反応を
停止させたのち、酵素反応によシ生成した赤かっ色の色
素を４９２　ｎｍで測定した。この結果を表４に示す。

表４ （Ｂ）　　ペルオキシダーゼ標識抗体と抗体結合マイク
ロタイタープレートを用いた方法： （１）で製造したマイクロタイタープレートに２０μｔ
の検体（血清）ｔたは標準液を取る。次に１％ＢＳＡ、
０．０５％ツイーン２０を含む０．１５Ｍ　ＮａＣ２−
０，０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）を用い、（２）
で製造した酵素標識抗体を１０００倍に希釈したものを
１００　ｐｔ加え、３７℃、　１　ｈｒ保温した。アス
ピレータ−で反応液を吸引除去した後裔ウェルは２００
μｔづつ２回の生理食塩水で洗浄した。洗浄終了後、あ
らかじめ準備した０、２％ｏ−７二二レンジアミン・２
塩酸塩０．０２％過酸化水素水を含むクエン酸−リン酸
緩衝液（ｐＨ５，０）を５０　ｐＬ加え、室温で３０分
反応させた。ＩＮ硫酸５０μｔを加え、反応を停止させ
６００　ｎｍを対照に５００　ｎｍの吸光度を測定した
。この結果を表５に示す。

表５ｍｏＤ

【図面の簡単な説明】

図１は、ＨｅＬａフェリチンとヒト牌臓フェリチン中の
電気泳動法によるＨ型サブユニットの検出を、ＣＢＢ染
色方法と本発明方法の比較で示した図面である。 以上 ＣＢＢ染色

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトフェリチンＨ型サブユニットに対する単クロー
   ン性抗体。 ２、Ｈ型サブユニットを多く含むフェリチンの高度精製
   物で免疫された免疫動物の抗体産生細胞と、骨髄腫細胞
   の細胞融合により得られる、ヒトフェリチンＨ型サブユ
   ニットに対する単クローン性抗体を産生するハイブリド
   ーマ。 ３、被検体にヒトフェリチンＨ型サブユニットに対する
   単クローン性抗体又はその消化断片を加え、生じたヒト
   フェリチンＨ型サブユニット−抗体複合物量を測定する
   ことを特徴とするヒトフェリチンＨ型サブユニット量の
   測定法。