JPH02112764A - 確認アッセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、確認アッセイ法に関する。さらに詳しくは、
同族のリガンドまたは交差反応性の生物体により引き起
こされる偽陽性ならびに非特異的なアッセイ人工産物（
ａｒｔｉｆａｃｔｓ）により引き起こされる偽陽性から
真の陽性を区別することのできる確認アッセイ法に関す
る。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）確認
アッセイは技術分野においてよく知られており、一般に
、試験試料中のリガンド、抗原または生物体の存在を検
出した最初のアッセイを少し変えて繰り返すことが含ま
れる。知られた確認アッセイでは確認結合タンパク質も
しくは試薬（以下、ｒｃＢＰＪという）、通常は抗体、
を用いる。確認結合タンパク質は、検出アッセイのデテ
クター結合タンパク質らしくは試薬（以下、ｒＤＢＰＪ
という）と同じ特異性を有しているが、シグナルを生成
することはできない。ＤＢＰの前にＣＢＰを加えろこと
により、通常はＤＢＰにより占められる結合部位がブロ
ッキングされ、それに伴ってシグナルは減少することに
なる。たとえば、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の存
在を確認するための市販の（アボット・ラボラトリーズ
、アボット・パーク、ＩＬから）アッセイでは、試料中
の抗原上の利用できる部位をブロッキングするためのＣ
ｌ５Ｐとしてヒト抗ＨＢｓＡｇを用いている。ついでア
ッセイを繰り返して５０％のシグナルの減少によりＨＢ
ｓＡｇの存在が確認される。

これらのアッセイでは、ＤＢＰが種々のアッセイ成分と
非特異的に結合して偽陽性シグナルを生成することによ
り外来性のシグナルが生成することを排除している。そ
のようなりＢＰがアッセイ成分に結合することにより引
き起こされる（すなわち、アッセイ成分の検出）偽陽性
シグナルは、ここでは［アッセイ人工産物Ｊということ
にする。

これとは対照的に、偽陽性シグナルはまた、標的リガン
ドまたは生物体に極めて類似した、すなわちそれらに交
差反応性であるリガンドまたは生物体にＤＢＰが結合す
ることによっても生成され得る。ＤＢＰとＣＢＰとの特
異性が同じであるため、従来の確認アッセイではアッセ
イ人工産物による偽陽性を排除することはできたが、試
験試料中に存在する密接に関連したまたは交差反応性の
リガンドまたは生物体により生じる偽陽性は排除するこ
とができない。この欠点は、本発明により初めて解決さ
れる。

（課題を解決するための手段） 本発明は、リガンドの第一の部位に結合して測定可能な
シグナルを生成する標識第一デテクター結合試薬（ＤＢ
Ｐ）を用いた第一のアッセイにより検出された所定のリ
ガンドの試料中の存在を確認するためのアッセイ法に関
し、該リガンドの第二の部位に結合する確認結合試薬（
ＣＢＰ）を用い、該確認結合試薬（ＣＢＰ）の該リガン
ドの該第二の部位への結合により該デテクター結合試薬
（ＤＢＰ）の該リガンドの第一の部位への結合を妨害さ
せることにより該シグナルの検出可能な減少をもたらす
ことを特徴とする方法である。

本発明の所定のリガンドの試料中の存在を確認する方法
はまた、 （ｉ）該リガンドの第二の部位に結合する確認結合試薬
（ＣＢ、Ｐ）からなる試薬手段に試料を接触させ、その
際、該試薬手段の該第二の部位への結合はデテクター結
合試薬（ＤＢＰ）の該第一の部位への結合を妨害するも
のであり、ついで （ｉ　ｉ）デテクター結合試薬（ＤＢＰ）を含む試薬手
段に試料を接触させて第二のシグナルを測定し、該第一
のシグナルに比べて再決定した減少により試料中のリガ
ンドの存在を確認する ことを特徴とする方法である。

本発明は、試料中のリガンドまたは生物体の存在を確認
するための確認アッセイ法であって、該リガンドまたは
生物体は、該リガンドまたは生物体上の第一の部位への
デテクター結合試薬またはタンパク質（ＤＢＰ）の結合
により前以て検出しであるものである。本発明の確認結
合試薬またはタンパク質（ＣＢＰ）はＤＢＰとは区別さ
れる特異性を何するものであり、ＤＢＰを加える前また
はそれと同時に用いる。ＣＢＰはリガンドまたは生物体
の第二の部位に結合することによりＤＢＰの第一の部位
への結合を妨害し、シグナルの減少を弓き起こす。標的
リガンドまたは生物体を、密接に関連したリガンドまた
は生物体からＣＢＰが識別し得る限り、本発明の確認ア
ッセイは、両タイプの偽陽性シグナル（すなわちアッセ
イ人工産物から生じる偽陽性シグナルおよび密接に関連
するリガンドおよび生物体から生じる偽陽性シグナル）
から真のシグナルを識別することができる。

他の態様において、本発明は、車面の試験により陽性と
された試験試料中のリガンドまたは生物体の存在を確認
する方法を提供する。本発明の方法は、試験試料を、Ｄ
ＢＰの前にまたはそれを同時にＣＢＰ（リガンドまたは
生物体の第二の部位に結合する）と接触させることを含
む。この第二の部位は、関連するリガンドまたは生物体
ともアッセイ成分とも共有されないことが好ましい。Ｄ
ＢＰは、ＣＢＰが前以てまたは競合的に存在することに
よって、標的リガンドまたは生物体上の第一の部位に結
合するのが妨害されるが、密接に関連するリガンドまた
は生物体上の同様の部位には結合することができるし、
種々のアッセイ成分へも非特異的に結合する。ＣＢＰの
結果として減少したシグナルの量を測定することにより
、試料中の標的リガンドまたは生物体の真の存在を、ア
ッセイ人工産物および関連するリガンドまたは生物体と
は識別されるものとして確認することができる。

本発明の確認アッセイは、数多くの異なる分析対象物を
検出するために用いることができる。たとえば、分析対
象物は、リガンド、抗原、ハブテン、微生物またはその
成分、または他の生物学的成分であってよい。本明細書
を通じて「リガンド」および「分析対象物」なる語は、
上記分析対象物またはそれらと同等なしのを示すものと
して互換的に用いられる。ただ一つ要求されることは、
第二の部位へのＣＢＰの結合がＤＢＰの第一の部位への
結合を妨害することに関連して、少なくとも２つの結合
部位を有していなければならないことである。言い替え
ると、ＣＢＰとＤＢＰとは、異なる部位またはエピトー
プに対して特異的でなければならない。

ＤＢＰは、リガンド上の第一の部位に結合することので
きる結合試薬からなり、結合後にレセプターに結合した
リガンドの量に比例したシグナルを生成する。ＤＢＰは
通常はタンパク質であるが、本発明に用いるｒＤＢＰＪ
は、非タンパク質またはタンパク質−非タンパク質混合
結合試薬をも含む。

一般に、ＤＲＰは抗体、またはリガンドを検出・シグナ
ル表示することのできる標識抗体からなる。

抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル
抗体であってもよい。これら両抗体の調製技術は技術分
野でよく知られており、ここでは詳しく述べろ必要はな
いであろう（コーラ−およびミルンユテイン（Ｋｏｈｌ
ｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）のＮａｔｕｒｅ。

ｖ、２５６．４９５頁（１９７５年８月７日）参照）。

同様にＣＢＰも、リガンド上の第二の部位に結合するこ
とのできるいかなる結合試薬からなっていてもよい。Ｃ
ＢＰは抗体（ポリクローナル抗体かまたはモノクローナ
ル抗体）からなっているのが好ましいか、他のＣＢＰ、
たとえばビオチン、アビジン、レクチンまたはプロティ
ンＡも用いることができる。上記レセプターの組合わ仕
からなるＣＢＰを用いることもできる。いくらかの特定
のＣＢＰの例は、以下の実施例中に記載しである。

ＣＢＰがＤＢＰとは異なる特異性を有することは、本発
明の重要な側面である。このことは、ＣＢＰが、分析対
象物上において、ＤＢＰが結合する結合部位（通常は抗
原決定基またはエピトープ）とは識別される結合部位に
結合することを意味する。言い替えると、分析対象物は
、２つまたはそれ以上の区別される結合領域を有し、少
なくとら２価でなければならない。

ＣＢＰが第二の部位に結合すると、そのことによりＤＢ
Ｐが第一の部位に結合することが妨害される。結合の妨
害は、数多くの仕方で達成される。

たとえば、リガンドまたは生物体上の結合部位は隣接す
るかまたは一部重なっていてよい。従って、ＣＢＰの第
二の部位への結合はＤＢＰの第一の部位への結合を物理
的にブロッキングすることになる。上述したように抗原
性部位は同じ近傍に位置しているのが好ましいが、ＣＢ
Ｐの第二の部位への結合が遠隔の第一の結合部位の三次
構造を変えることによってＤＢＰの結合を妨害すること
もまた可能であり、本発明に含まれる。ここで１結合を
妨害する」とは、上記のように物理的なブロッキングま
たは立体障害および三次構造の修飾であり、また当該技
術分野で知られたあらゆる等価な妨害手段を含む。

関連する技術には、本発明に使用することのできるシグ
ナル生成系の例が豊富にある。その−例として、これに
限られるものではないが、シグナル生成系は、色生成化
合物、放射性化合物、蛍光化合物、電気的活性（ｅｌｅ
ｃｔｒｏａｃｔ　１ｖｅ）化合物であってよい。シグナ
ル生成系は、ＤＢＰに結合したまたは他の仕方で連合し
た酵素標識の作用に基づく色生成化合物であることが好
ましい。そのような酵素イムノアッセイ（Ｅ　Ｉ　Ａｓ
）の機構は当該技術分野でよく知られているのでここで
は詳細に記載する必要はないであろう。

Ｅ　Ｉ　Ａｓにおいても幾つかの要因により偽陽性シグ
ナルが起こり得ることもまた当該技術分野でよく知られ
ている。シグナルは、色生成化合物とアッセイ成分との
間の相互反応の結果として、酵素がアッセイ成分に非特
異的に結合する結果として、標識Ｄ　１３　Ｐがアッセ
イ成分に非特異的に結合する結果として、およびＤＢＰ
が非標的抗原に結合する結果として（この場合、該抗原
は標的抗原との充分な構造類似性を有しており認識およ
び結合を引き起こす）生じ得る。これら偽陽性ソゲナル
のうち最初の３つは、ここでは［−アッセイ人工産物」
シグナルまたは「アッセイ人工産物」偽陽性と呼ばれる
乙のである。これらのシグナルの発生は、従来のブロッ
キング確認アッセイにより減少させるかまたは除くこと
ができる。

しかしながら、構造的に関連した非標的リガンドまたは
抗原に引き起こされる第四のタイプの偽陽性は、当該技
術分野で以前から知られている確認アッセイによっては
解決することができていない。この最後のタイプの偽陽
性シグナルは、ここでは「−関連リガント」シグナルま
たは［関連リガンドＪ偽陽性と呼ばれる。検出すべきリ
ガンドが生物体またはその一部であるときは、関連生物
体偽陽性シグナルは、交差反応を示す生物体によりしば
しば引き起こされる。

標的リガンドまたは分析対象物の存在は、ＣＢＰの使用
により生じるシグナルが所定ｍ減少するときに本発明ｊ
こより確認される。アッセイではまずＤＢＰを使用し、
これが標的リガンドの第一の部位に結合して、検出すべ
きリガンドの量に比例した第一のシグナルを生じさせる
。しがしながら、検出したシグナルが、関連リガンド偽
陽性および／マタハアッセイ人工産物偽陽性の結果のも
のであることがしばしば起こり得る。本発明により標的
リガンドの存在を確認するために、ＣＢＰを含有する試
薬に試料を接触させる。ＣＢＰは標的リガンドの第二の
部位に結合するが、関連非標的リガンドまたはアッセイ
成分そのものには結合しない。

標的リガンドに結合した確認レセプターは、ＤＢＰがこ
のリガンドに結合するのを妨害する。従って、生じたシ
グナルが所定ｍ減少したときは、もとらと得られたシグ
ナルが主として真の標的リガンドによるものであって関
連リガンド偽陽性またはアッセイ人工産物偽陽性による
ものではないためである。逆に確認で生じたシグナルが
所定量減少しなかったときは、最初に得られたシグナル
は、密接に関連したリガンドングナルかまたはアッセイ
人工産物シグナルによるものである。リガンドの存在を
確認するために減少するシグナルの所定量は、約５０％
であるのが好ましい。

ＣＢＰの試料への添加は、ＤＢＰの而または同時に行っ
てよい。前に添加する場合は、ＣＢＰは第二の部位に結
合してそれを占領し、ＤＢＰが第一の部位に結合するの
を妨害する。ＣＢＰおよびＤＢＰを同時に添加する場合
は、２つの結合タンパク質が共通する部位について競合
する場合とほとんど同じ仕方で、この２つの結合タンパ
ク質はそれぞれの部位について競合するものと思われる
。

シグナルの減少はＤＢＰを前置て添加することにより期
待できるが、プロトコールに余分の工程が必要であると
いうことは不利である。従って、ＣＢＰおよびＤＢＰを
混合試薬中で同時に加えることが好ましい。

本発明のＣＢＰｓは、診断アッセイにおいて特に行用で
ある。ＤＢＰの前または同時に使用したときに、ＣＢＰ
ｓは交差反応偽陽性を除くことによりアッセイの特異性
を高めることができる。

以下の実施例は、多数のＣＢＰｓが比較的容易に得られ
ることを示している。ＣＢＰｓは、マウスおよびラット
の両方において、ＬＶＧおよび血清型Ｅ株の両方から、
複数の手順に従い完全な細胞および細胞の界面活性剤抽
出物の両方を用いて調製することができた。以下の実施
例は本発明の特定の態様を示すものであるが、本発明は
これらに限られるものではない。

実施例１ クラミノアザイム（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｚｙｍｅ）Ｅ　
ＩΔ（アボット・ラボラトリーズ、アボット・パーク、
■Ｌ）は、市販の酵素結合イムノアッセイ法であり、ク
ラミジアのリボ糖類（１、ＰＳ）をヒト生殖試料中で直
接検出するものである。本実験においてはパッケージの
折り込み説明書に従って行い、生殖腺にて綿棒で集めた
物質を試料希釈バッファー（ＳＤＢ）中に溶出し、処理
したポリスチレンビーズに加える。クラミジアＬＰＳ（
ＳＤＢにより可溶化しである）はビーズに付着する。洗
浄して未付着物質を除いた後、ウサギ抗りラミジアＬＰ
Ｓ抗体をビーズとともにインキュベート４−る。ビーズ
を洗浄し、結合したウサギ免疫グロブリン（Ｉ　ｇ）を
ベルオキンダーゼ：ヤギ抗つサギＩｇ結合体と反応させ
る。ビーズを洗浄し、付着した結合体を、０フエニレン
ジアミン（ＯＰＤ）基質とインキュベートして発色生成
物を生じさせることにより決定する。分光光度計での４
９２ｎｍにおける発色生成物の吸光度として測定可能な
シグナルが得られる。

クラミノアザイムＥＲＡは、クラミジア種とリボ糖類（
ＬＰＳ）を共有する幾つかのグラム陽性細菌とも反応す
ることが報告されている。本発明の確認アッセイは、も
しクラミジアについてアッセイしようとする臨床試料中
にこれらの交差反応性の生物体が存在していたなら生じ
たであろう偽陽性を除くために用いることができる。

実施例２ クラミジアＬ　Ｉ）　Ｓに対するマウスモノクローナル
抗体の産生 クラミジア・トラコマチス（Ｃ、ｔｒａｃｈｏｍａｔｉ
ｓ）株ＬＶＧ４３４（Ａ’［’ＣＣＶＲ９０２）をマツ
コイ（Ｍｃ　Ｃｏｙ）細胞中で増殖させ、レッグラフイ
ン（Ｒｅｎ。

ｇｒａｒｉｎ）密度勾配で精製した。８．０ＸＩＯ”ク
ラミジア細胞を０．６７％デオキシコール酸ナトリウム
（ＮａＤ　ＯＣ８７、５ｉ＆）中、４５℃で２時間イン
キュベートすることにより、精製クラミジアの抽出物を
調製した。懸濁液を１８，０００Ｘ４にて３０分間、３
５℃て遠心分離にかけた。上清液をＰ　１３Ｓに対して
３日間透析した。生成した沈澱を遠心分離によりベレッ
ト化し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（５ＲＩ２）中に
再懸濁し、細胞粉砕器（ヒート・システムズーウルトラ
ソニックス（１−Ｔｅａｔ　Ｓｙｓｔａｍｓ　−Ｕ　１
ｔｒａｓｏｎｉｃｓ、　［ｎｃ、　、）、ファーミング
デール、ＮＹ）のカップホーン（ｃｕｐ　ｈｏｒｎ）中
にて３０分間最大出力で超音波処理して大きな凝集物を
分散させた。調製物を一２０℃で貯蔵した。

Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスをＬＧＶ細胞または上記
で調製したＮａＤＯＣ抽出物で免疫することにより、マ
ウスモノクローナル抗体１−１−５、Ｈ−２１０および
Ｈ−３５を得た。各マウスにおいて免疫投与量はＩ　ｘ
　ｌ　Ｏ’ＬＧＶ細胞であり、またはＮａＤＯＣ抽出物
で免疫したときはクラシミアザイムアッセイ中での反応
性に基づきｌＸｌ０９細胞に等価であった。脇の下２箇
所およびそけい部２箇所に皮下注射した。完全なＬＧＶ
細胞の前融合（ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ）ブースターは、融
合２日および３日前に静脈内投与した。特定の免疫手順
を以下に示す。

牌臓を除き、ゴーディング（Ｇ　ｏｄｉｎｇ、　Ｊ　、
　Ｍ　、）のモノクローナル・アンチボディーズ（Ｍｏ
ｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）：プリンシプ
ルズ・アンド・プラクテイス（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　
ａｎｄ　ＰｒａｃｔｉｃｅＸアカデミツクプレス、ロン
ドン、＋９８３）に記載のようにして細胞を５Ｐ２１０
細胞（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ１５８１）と融合させた。

ハイブリドーマ細胞の上清液をＥＩＡ中で以下のように
してスクリーニングした。クラミジアザイムキットと同
様のビーズを用い、クラミジアザイムＳＤＲバッファー
中でＬＧＶ株４３をインキュベートした。ハイブリドー
マ液を１／１０の希釈で試験し、結合したマウスＩｇを
ペルオキシダーゼ−標識ヤギ抗マウスＩｇとともにイン
キュベートすることにより検出した。適当な標識！ｇ結
合体は、ケミコン・インターナショナル（Ｃｈｅｎｉｃ
ｏｎ　Ｉ　ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　Ｉ　ｎｃ、：
エルセグンド、ＣＡ）およびキルケガード・アンド・ベ
リー・ラボラトリーズ（Ｋ　ｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎ
ｄＰｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉ　ｎｃ
、、；ゲイサーバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ）、Ｍ
Ｄ）を含む数多くの販売元から市販されている。基質は
０−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）であった。ＯＤシグ
ナルが任意の所定の大きさであったときは、ハイブリッ
ドはクラジミア抗原について「陽性とスクリーニングさ
れた」。

ついで陽性のハイブリッドを限界希釈法によりクローニ
ングした。選択したクローンについて、クラシミアザイ
ムアッセイ中でＤＢＰ試薬をブロッキングする能力を試
験した。シグナルの減少が５０％またはそれ以上であっ
た場合は、クローンは首尾よく「ブロッキングした」。

再現性の成功比は、下記各実験で与えられる。ついで、
約Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｏ’ハイブリドーマ細胞を腹腔内注射す
ることにより、ブリスタン初回抗原刺激を受けたマウス
で腹水を産生させた。

マウス＃ｌ： 不完全フロインドアジュバントを混合した完全なＬＧＶ
でマウスを免疫することにより、Ｍ　ａ　ｂ　［（５、
ＩｇＧ１を得た。この免疫原は、４箇所で皮下注射した
。１１週間後にアジュバントを含まないＮａＤＯＣをマ
ウスに腹水的注射した。４週間後に完全なＬＧＶを含む
前融合ブースターをマウスに静脈内投与し、牌臓細胞を
除き融合した。

成育を示した３９のウェルのうち、３つがクラミジアに
ついて陽性とスクリーニングされた。これらのうちの１
つ（＋−＋−５）をＣＢＰとしてブロッキングについて
試験したところブロッキングが確かめられた。同じ手順
で免疫した他の２つのマウスからは９０のハイブリッド
が得られ、そのうち４つは陽性とスクリーニングされた
。これらは、ブロッキングについて試験しなかった。

マウス＃２： 完全フロインドアジュバントを混合した完全なＬＧＶ細
胞を４箇所皮下投与してマウスを免疫することにより、
ＭａｂＨ−２１０、ＩｇＧ２ｂを得た。

６週間後に、完全アジュバントの代わりに不完全フロイ
ンドアジュバントを用いてこの免疫を繰り返した。８週
間後に静脈内投与にてマウスに前融合ブースター投与し
、牌臓細胞を融合した。２６２のハイブリッドのうち、
５６が陽性とスクリーニングされた。これらのうちの６
つをブロッキングについて試験したところ４つについて
ブロッキングが確かめられた（Ｈ−２１０は１つであっ
た）。

同じ手順で免疫した他の２匹のマウスからは２８のハイ
ブリッドが得られ、そのうちのどれら陽性とはスクリー
ニングされなかった。

マウス＃３： 不完全フロインドアジュバントを混合したＬＧ■細胞を
４箇所皮下投与してマウスを免疫することにより、Ｍａ
ｂＨ−３５を得た。４週間後に、マウスをＬＧＶで免疫
した。融合１週間前に、マウスにＬＧＶをさらに３回腹
腔内注射した。静脈内投与にてマウスに前融合ブースタ
ーを投与し、免疫開始２３週間後に牌臓細胞を融合した
。得られた４６のハイブリッドのうち、１つ（Ｈ−３５
）が陽性とスクリーニングされ、好結果のブロッカ−で
あった。同じ手順で免疫した他の１匹のマウスからは１
７０のハイブリッドが得られ、そのうち１６は陽性とス
クリーニングされた。１６のうち３つをブロッキングに
ついて試験し、ブロッキングが確認された。

実施例３ ＬＧＶによるラットの免疫： ＭａｂＨ−９８を産生ずるクローンは、完全フロインド
アツユバントを混合したＬＧＶ細胞で４箇所皮下注射し
て免疫したラットから得た。５週間後に不完全アジュバ
ントを用いたほかは同様にして免疫を繰り返した。３週
間後、マウスについて記載したのと同様にしてラットに
ＬＧＶを２回静脈内注射し、実施例２と同様にして牌臓
細胞を融合した。産生じた＋３１のハイブリッドのうち
、７２が陽性とスクリーニングされた。これらのうち２
つ（Ｈ−９８は１つであった）をブロッキングについて
試験したところ、両方ともブロッキングが確認された。

実施例４ 血清型Ｅクラミジアによるマウスの免疫：Ｍａｂ　Ｈ−
６９，１ｇＧ３は、卵の卵黄嚢中で成育させておいたク
ラミジア・トラコマデスの血清型Ｅを注射したマウスか
ら得、レッグラフイン密度勾配で精製した。完全フロイ
ンドアジュバントを混合しておいた２Ｘ１０’粒子をマ
ウスに注射した（脇の下およびそけい部に腹腔内および
皮下注射）。４週間後に不完全フロインドアジュバント
を混合した同じ投与量で免疫を繰り返し、腹腔内注射し
６箇所で皮下注射した。４週間後および８週間後に、各
注射においてｌＸｌ０’細胞を静脈内でブースター投与
した。最後の静脈内注射をした３日後、胛臓細胞を集め
、実施例２に記載のようにして融合した。産生じた＋１
５のハイブリッドのうち、２つが陽性とスクリーニング
された。

これらの、うち１つ（Ｈ−６９）をブロッキングについ
て試験し、ブロッキングが確認された。

実施例５ （Ａ）特異的なウサギ抗血清： クラミジアＬＰＳの交差反応性かまたは独自のエピトー
プに反応するウサギ抗血清を製造することができる［プ
レイド（Ｂｒａｄｅ）らのアンチジェニック・プロパテ
ィーズ・オブ・クラミジア・トラコマデス・リボポリサ
ブカライド（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　Ｐｒ。

ｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｒ　Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｔｒａｃ
ｈｏｍａｔｉｓ　Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄ
ｅ）、Ｉ　ｎｆｅｃｔ、　Ｉ　ｍｌｌ１ｕｎ、４８　：
５６９〜５７２（１９８５）参照］。ウサギ１ｇ調製物
の特異性を示すため、吸着実験を行った。交差反応性の
ＬＰＳエピトープとは反応するが独自のエピトープとの
反応性は欠けているウサギＩｇがＳ、ミネソタ（Ｓ、ｍ
１ｎｎｅｓｏｔａ）Ｒｅ５９５に吸着されたときは、ク
ラミジアＬＰＳに対する反応性は残留していない。

逆に、独自のクラミジアＬＰＳエピトープに対してのみ
反応性を有するウサギＩｇでは、Ｓ、ミネソタＲｅ５９
５で吸着させた後にクラミジアＬＰＳとの反応性は変わ
らない。

独自のまたは交差反応性のエピトープに対して反応性を
有する２つのウサギ抗血清の特異性は、２つの抗血清調
製物をそれぞれＳ、ミネソタの２６Ｘ１０”細胞ととも
にインキュベートすることにより示した。抗血清の吸着
は、ｒｇのｌｘρ当たり０．１〜１．０μ９または抗血
清の１１５００希釈でなされた。抗原抗体混合物を３７
℃で２時間インキュベートし、８，０００ｘ９で１０分
間遠心分離にかけた。ついて吸着血清を含有する一ト清
液を、通常のＥＩＡにより試験した。クラミジアＣＰＳ
をポリスヂレンビーズに吸着させ、未吸着および吸着ウ
サギＩｇとともにＬＰＳ抗原をインキュベートした。付
着したウサギｒｇはベルオキンダーゼ標識ヤギ抗ウサギ
Ｉｇにより検出し、色はＯＦＤ基質とともにインキュベ
ートした後に測定した。

その結果を第１表に示す。

（以下余白） 第１表 サルモネラＲｅ５９５による吸着前および後における、
交差反応性または種特異的ＬＰＳエピトープに対するウ
サギ抗血清を用いたＥＩＡにおける交差反応性のエピト
ープに対するウサギＩｇがＳ。ミネソタＲｅ５９５に吸
着されたときは、抗原としてＬＧＶを用いたアッセイに
おける吸光度は０７７から００１に減少した。一方、独
自のエピトープに対して向けられたウサギＩｇを試験し
たときは、吸着後において吸光度に有為の変化は見られ
なかった。このことは、２つの抗血清調製物が異なるタ
ラミノアＬＰＳエピトープに対する反応性を有ケること
を示していた。

（Ｂ）交差反応性エピトープのブロッキングエクラミジ
アＬＰＳの交差反応性エピトープに対して向けられたウ
サギ抗体の反応をブロッキングする能力について、Ｍａ
ｂＨ−５を試験した。ブロッキング抗体（Ｍａｂ　Ｈ−
５）を種々の濃度でウサギ抗血清溶液に加え、ブロッキ
ングしていないコントロールも用いた。通常のＥＩＡ手
順においてＬ　Ｇ　Ｖ株を１．６Ｘ１０’細胞／Ｉｆ２
で試験した。

最終濃度０　、５１１９／Ｍ（ｌでＭａｂ　Ｈ−５はＥ
ＩＡの吸光度を６０．１％ブロッキングした（第２表）
。

５．０および１０　、０　μ９／ｍＱｃＭａｂ　Ｈ−５
）の濃度で、ＥＩＡの吸光度は９４％またはそれ以−Ｌ
減少した。

（Ｃ）独自のエピトープのプロツキング：クラミジア・
トラコマチスの独自のＬＰＳエピトープと反応するウサ
ギ抗血清を用い、ブロッキング実験を繰り返した。上記
実験と同様に、種々の濃度のブロッキング抗体（Ｍａｂ
　Ｈ−５）を、ＥＩＡに用いるウサギデテクター抗体に
加えた。ブロッキングしないコントロールも試験に含め
た。

１．６ｘｌＯ’細胞／ｍ細胞層度でＬＧＶを試験した。

最終濃度０．５ｕｇ／ｍＱでＭａｂはＥＩＡの吸光度を
５４％ブロッキングした。５．０および１Ｏ１０μ９／
Ｒ（ｌの濃度では、吸光度はそれぞれ９１％および９５
％減少した（第３表）。

ｌａ　ｍ１ｎｎｅｓｏｔａ）ＲＥ　５９５およびｒ、　
ｃ　ｖ株４３４との反応のブロッキングについて、実施
例２および実施例４のマウスＭａｂｓを試験した。腹水
の１１５００希釈液において、マウスＭａｂＨ−５、Ｈ
６９、Ｈ−３５およびＨ−２１０は、それぞれクラミノ
アザイム試薬とＬＧＶとの反応をブロッキングした。２
つの交差反応性のダラム陰性細菌であるアシネトバクタ
ーおよびＳ　ミネソタＲｅ５９５はブロッキングしなか
った。その結果を第４表に示す。

実施例６ クラミジアザイムのブロッキング （Ａ）マウスＭａｂｓ　ＣＢ　Ｐ　ｓ クラミノアザイム試薬とアシネトバクタ−（Ａｃｉｎｅ
ｔｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ・ミネソタ（Ｓ　ａｌ
ｍｏｎｅｌ（Ｂ）ラッｔ−Ｍａｂｓ　ＣＢ　Ｐ ラットＭａｂＨ−９８はクラミノアザイム試薬とＬＧＶ
との反応をブロッキングしたが、アシネトバクターおよ
びサルモネラＲｅ５９５との反応はブロッキングしなか
った。ラットＭａｂは組織培養液のｌ／Ｉ　Ｏ希釈とし
て試験し、その中でラットハイブリドーマを成育させた
。その結果を第５表に示す。

（Ｃ）ポリクローナルＣＢＰ： 本発明の確認アッセイは、ＣＢＰ試薬としてポリクロー
ナル抗血清を用いても行うことができ、クラミノアザイ
ムＤＥＰの結合をブロッキングさせることができる。ポ
リクローナル抗血ｌｎを用いるときは、抗血清は独自の
クラミジアＬＰＳエピトープに対して反応性を有してい
なければならない。抗血清には、交差反応性のエピトー
プに対する反応性かあってはならない。そのような交差
反応性が存在するときには、実施例５に記載したように
サルモネラＲｅ５９５での吸着により交差反応性の抗体
を除くことができる。フロイントの完全アジュバントを
混合したＬＧＶ株４３４でモルモットを免疫することに
より産生されたポリクローナル抗血清が、ＣＢＰ試薬と
して適している。

抗血清は１１５００希択で用いるか、または上記（Ａ）
または（Ｂ）のＣＢＰ試薬に匹敵する強さで用いる。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）リガンドの第一の部位に結合して測定可能なシグ
   ナルを生成する標識第一デテクター結合試薬（ＤＢＰ）
   を用いた第一のアッセイにより検出された所定のリガン
   ドの試料中の存在を確認するためのアッセイ法において
   、該リガンドの第二の部位に結合する確認結合試薬（Ｃ
   ＢＰ）を用い、該確認結合試薬（ＣＢＰ）の該リガンド
   の該第二の部位への結合により該デテクター結合試薬（
   ＤＢＰ）の該リガンドの第一の部位への結合を妨害させ
   ることにより該シグナルの検出可能な減少をもたらすこ
   とを特徴とするアッセイ法。
2. （２）確認結合試薬（ＣＢＰ）が第二の部位に結合する
   ときに第一の部位を物理的にブロッキングすることによ
   り、デテクター結合試薬（ＤＢＰ）の第一の部位への結
   合を妨害する請求項（１）記載のアッセイ法。
3. （３）確認結合試薬（ＣＢＰ）が抗体からなる請求項（
   １）記載のアッセイ法。
4. （４）確認結合試薬（ＣＢＰ）がモノクローナル抗体か
   らなる請求項（１）記載のアッセイ法。
5. （５）所定のリガンドの試料中の存在を確認する方法で
   あって、該リガンドがデテクター結合試薬（ＤＢＰ）の
   該リガンドの第一の部位への結合により第一の測定可能
   なシグナルを生成させることにより最初に検出したもの
   である方法において、（ｉ）該リガンドの第二の部位に
   結合する確認結合試薬（ＣＢＰ）からなる試薬手段に試
   料を接触させ、その際、該試薬手段の該第二の部位への
   結合はデテクター結合試薬（ＤＢＰ）の該第一の部位へ
   の結合を妨害するものであり、ついで （ｉｉ）デテクター結合試薬（ＤＢＰ）を含む試薬手段
   に試料を接触させて第二のシグナルを測定し、該第一の
   シグナルに比べて再決定した第二のシグナルの減少によ
   り試料中のリガンドの存在を確認する ことを特徴とする方法。
6. （６）確認結合試薬（ＣＢＰ）が第二の部位に結合する
   ときに、デテクター結合試薬（ＤＢＰ）の第一の部位へ
   の結合を立体障害により妨害する請求項（５）記載の方
   法。
7. （７）確認結合試薬（ＣＢＰ）が抗体からなる請求項（
   ５）記載の方法。
8. （８）確認結合試薬（ＣＢＰ）がモノクローナル抗体か
   らなる請求項（５）記載の方法。
9. （９）接触工程を同時に行う請求項（５）記載の方法。
10. （１０）確認結合試薬（ＣＢＰ）を含む試薬手段および
    デテクター結合試薬（ＤＢＰ）を含む試薬手段を、試料
    に接触させる前に一緒に混合する請求項（９）記載の方
    法。