KR20100107466A - 항 오플록사신 모노클로날 항체, 이것을 이용한 오플록사신의 면역학적 측정 방법 - Google Patents
항 오플록사신 모노클로날 항체, 이것을 이용한 오플록사신의 면역학적 측정 방법 Download PDFInfo
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Abstract
<과제>
본 발명은 인간 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물을 정확하며 간편하게 검출하는 방법을 제공한다.
<해결 수단>
화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하고, 그의 대사물인 화학식 I로 표시되는 화합물의 N-옥시드체 및 레보플록사신 탈메틸체와 교차 반응하지 않는 항체를 제조하기 위해서, 화학식 I로 표시되는 화합물의 6 위치의 카르복시기에 소혈청 알부민을 결합시킨 항원을 이용하였다. 또한, 대사되지 않은 화학식 I로 표시되는 화합물을 측정하는 면역 분석법을 구축하기 위해서 상기 항체를 이용하였다.
<화학식 I>
본 발명은 인간 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물을 정확하며 간편하게 검출하는 방법을 제공한다.
<해결 수단>
화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하고, 그의 대사물인 화학식 I로 표시되는 화합물의 N-옥시드체 및 레보플록사신 탈메틸체와 교차 반응하지 않는 항체를 제조하기 위해서, 화학식 I로 표시되는 화합물의 6 위치의 카르복시기에 소혈청 알부민을 결합시킨 항원을 이용하였다. 또한, 대사되지 않은 화학식 I로 표시되는 화합물을 측정하는 면역 분석법을 구축하기 위해서 상기 항체를 이용하였다.
<화학식 I>
Description
본 발명은 항균 화합물인 오플록사신 및/또는 이것을 구성하는 각 광학 활성체에 반응하는 항체로서, 이들의 주요한 대사물과는 반응하지 않는 항체에 관한 것이다.
뉴퀴놀론(new quinolone)계 항균제는 에녹사신이나 노르플록사신 등의 피리돈카르복실산계 항균제의 항균 스펙트럼과 항균력이 비약적으로 높아진 약제이며, 세균의 DNA 자이레이스(gyrase)를 저해함으로써 높은 선택 독성을 나타낸다. 지금까지 오플록사신, 레보플록사신, 노르플록사신, 시프로플록사신 등이 각종 감염증이나 화농성 질환 등의 치료 목적으로 임상에서 사용되고, 우수한 치료 효과를 나타내고 있다.
오플록사신은 하기 화학식 I
<화학식 I>
로 표시되고, 그의 화학 구조 중에 1개의 비대칭 탄소를 가지고, 2종류의 광학 활성체 S-(-)체 및 R-(+)체를 1:1의 조성비로 포함하는 라세미체이다. 이 라세미체 중, 항균 활성 본체는 S-(-)체인 레보플록사신이다. 레보플록사신은 오플록사신의 거의 2배의 항균력을 나타내고, 호흡기 감염증, 뇨로 감염증을 비롯한 각종 감염증에 널리 효과를 발휘하고, 높은 유효성을 나타내는 것으로 알려져 있다.
항균제가 효과를 충분히 발휘하기 위해서는, 유효 성분의 적절한 양이 체 내에 존재하고 있는 것이 중요하다. 따라서, 항균 활성의 감약(減弱) 또는 상실한 대사물 등의 화합물(이하, 「항균 활성을 잃은 화합물」 등이라는 표현을 하는 경우가 있음)을 측정하지 않고, 체 내에 존재하는 항균 활성을 갖는 화합물만을 정량하는 측정계는 항균제를 가장 유효하게 처방하기 위해서 빠질 수 없다. 항균 활성을 갖는 화합물만을 측정하는 방법으로서는, 피검 항균제를 특이적으로 인식하는 항체를 이용하는 면역 분석법, 피검 항균제의 분자량이나 극성에 기초하여 HPLC에서 분리ㆍ분석하는 방법, 균과의 배양에 의해서 직접 항균 활성을 측정하는 방법 등이 범용되고 있다. 이 중, 면역 분석법은 고가의 기기를 이용할 필요가 없고, 단시간에 측정이 가능할 뿐 아니라 감도가 우수하고, 다수의 시료 측정에 대응할 수 있기 때문에 유리하다.
또한, 많은 약물은 각종 경로로 투여되면 생체 유래 성분, 예를 들면 알부민 등의 혈청 단백질, 당 단백질, 리포 단백질(이하, 총칭하여 혈청 단백질류라 하는 경우가 있음)과 가역적인 결합을 하는 것으로 알려져 있다. 즉, 혈 중에 존재하는 약물의 농도는 혈청 단백질류와 결합한 결합형 약물 농도와 혈청 단백질류와 결합하지 않은 유리형(비결합형) 약물 농도의 합에 상당한다. 항체를 이용한 면역 분석법에서 혈 중의 약물을 정확하게 측정하기 위해서는, 사용하는 항체가 결합형 약물과 유리형 약물 모두에 동등하게 반응할 필요가 있지만, 약물에 결합한 혈청 단백질류가 장해가 되어 항체가 약물의 항원 결정기에 결합할 수 없어, 정확한 혈 중 약물 농도를 측정할 수 없는 경우가 있다.
뉴퀴놀론계 항균제의 면역 분석법에 의한 검출 방법으로서는, 이환성 뉴퀴놀론계 항균제를 인식하지만, 오플록사신 등의 삼환성 뉴퀴놀론을 인식하지 않는 모노클로날 항체를 이용한 면역학적 측정 방법이 공개되어 있다(특허문헌 1). 그러나, 상기 발명은 가축이나 양식 어개류의 감염증 예방에 이용되는 이환성 뉴퀴놀론의 잔류량을 검출하는 것을 목적으로 하고 있어, 오플록사신을 검출할 수 없다. 또한, 본 문헌 발명은 다종류의 뉴퀴놀론계 항균제를 동시에 검출할 수 있는 항체(다시 말해서 다종류의 뉴퀴놀론계 항균제와 교차 반응하는 항체)의 취득을 목적으로 한다.
한편, 특허문헌 2에서는, 화학식 I로 표시되는 화합물의 S체인 레보플록사신의 항체 및 면역학적 측정 방법이 공개되어 있다. 상기 항체는 항균 활성을 잃은 대사물(레보플록사신 N-옥시드, 데스메틸레보플록사신)과도 교차 반응성이 있는 폴리클로날 항체이다. 그 때문에, 항균 활성을 잃지 않은 레보플록사신만을 정확하게 검출할 수 없다고 하는 문제가 있었다.
오플록사신을 비롯한 뉴퀴놀론계 항균 화합물의 항원성은 매우 낮고, 이들 화합물 자체를 항체를 제조하기 위해서 이용되는 항원(면역용 항원)으로서 직접 면역에 이용하더라도, 뉴퀴놀론계 항균 화합물을 인식하는 항체를 양호한 효율로 제조하는 것은 곤란하다. 따라서, 뉴퀴놀론계 항균 화합물을 인식하는 항체를 제조하기 위한 면역용 항원으로서는, 이들 화합물에 캐리어로서의 단백질(캐리어 단백질)을 결합시킨 것을 이용하는 것이 적당하다. 뉴퀴놀론계 항균 화합물과 캐리어 단백질의 결합에 대해서 종래에는, 항원성에 영향을 주는 관능기, 예를 들면 퀴놀론 골격 4 위치의 케톤(카르보닐)기나 3 위치의 카르복시기, 또는 불소 원자 등을 손상시키지 않고 뉴퀴놀론계 항균 화합물과 단백질을 결합시키는 것이 필요하다고 생각되었다. 그 때문에 특허문헌 2에 있어서는, 레보플록사신의 10 위치 치환기인 4-메틸-피페라지닐기를 4-카르복시메틸피페라지닐기로 변환시킨 화합물을 캐리어로서의 소혈청 알부민(BSA)과 결합시켜 면역용 항원으로서 이용하고 있다.
그러나, 특허문헌 2의 방법에서 얻어진 항체는 레보플록사신의 대사물(N-옥시드체, 탈메틸체)과도 교차 반응을 나타내어, 레보플록사신에만 반응을 나타내는 항체는 얻어지지 않았다.
본 발명은 화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하고, 그의 대사물인 N-옥시드체 및 탈메틸체를 인식하지 않는(교차 반응하지 않는) 항체 및 그의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 이들 항체를 이용한 면역 분석법, 예를 들면 방사 면역 분석법, 효소 면역 분석법, 담체(입자) 응집 저해 면역 분석법 및 면역 크로마토법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은 상기 항체의 제조를 위해서 유용한 면역용 항원을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자는 레보플록사신[(-)-(S)-9-플루오로-2,3-디히드로-3-메틸-10-(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-7H-피리도[1,2,3-데][1,4]벤족사진-6-카르복실산]의 6 위치 치환기인 카르복시기에 소혈청 알부민 등의 캐리어 단백질을 결합시킴으로써 상기 목적을 달성할 수 있는 우수한 면역용 항원을 제조하는 것에 성공하였다.
또한, 상기 면역용 항원을 이용함으로써, 화학식 I로 표시되는 화합물과 반응하고, 그의 대사물인 N-옥시드체 및 탈메틸체를 인식하지 않는 유용한 항체를 제공할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 상기 면역용 항원을 이용함으로써, 화학식 I로 표시되는 화합물의 S체인 레보플록사신을 인식하고, 그의 대사물인 레보플록사신 N-옥시드체 및 레보플록사신 탈메틸체를 인식하지 않는 유용한 항체를 제공할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한 추가로, 상기 면역용 항원을 이용함으로써, 화학식 I로 표시되는 화합물의 R체를 인식하고, 그의 대사물인 N-옥시드체 및 탈메틸체를 인식하지 않는 유용한 항체를 제공할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 상기 항체를 이용하여 대사ㆍ분해되지 않은 화학식 I로 표시되는 화합물을 측정하는 면역 분석법을 완성시켰다. 본 발명은 상기 발견에 기초하여 완성된 것이다.
따라서, 본 발명은 화학식 I로 표시되는 화합물과 반응하고, 그의 대사물인 N-옥시드체 및 탈메틸체를 인식하지 않는 항체를 제공한다. 본 발명의 일 양태에 따르면, 화학식 I로 표시되는 화합물의 S체인 레보플록사신과 캐리어 단백질의 결합물인 면역용 항원을 제공한다. 본 발명의 일 양태에 따르면, 레보플록사신의 6 위치 치환기인 카르복시기에 캐리어 단백질을 결합시킨 면역용 항원을 제공한다. 또한, 이들 항원을 이용하여 동물을 면역시킴으로써, 화학식 I로 표시되는 화합물의 R체 및 S체, 또는 화학식 I로 표시되는 화합물의 S체인 레보플록사신만 또는 화학식 I로 표시되는 화합물의 R체만을 각각 인식하고, 그의 대사물인 N-옥시드체 및 탈메틸체를 인식하지 않는 항체를 제조하는 방법, 및 상기 방법에 의해 제조된 항체를 제공하는 것이다. 또한, 이들 항체를 이용하는 면역 분석법에 의해 시료 중에서의 화학식 I로 표시되는 화합물의 농도를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
즉, 본 발명은 이하의 구성을 갖는다.
(1) 하기 화학식 I로 표시되는 화합물과 반응하고, 그의 대사물인 N-옥시드체 및/또는 탈메틸체와 교차 반응하지 않는 항체.
<화학식 I>
(2) 화학식 I로 표시되는 화합물의 S체에 강하게 반응하는 항체인, 상기 (1)에 기재된 항체.
(3) 화학식 I로 표시되는 화합물의 R체에 강하게 반응하는 항체인, 상기 (1)에 기재된 항체.
(4) 화학식 I로 표시되는 화합물의 라세미체와 강하게 반응하는 항체인, 상기 (1)에 기재된 항체.
(5) 디클로페낙나트륨, 나부메톤, 플루르비프로펜, 케토프로펜, 록소프로펜나트륨, 옥사프로진, 나프록센, 이부프로펜, 카르보시스테인, 살리실아미드, 아세트아미노펜, 무수 카페인, 메틸렌디살리실산, 프로메타진 및 테오필린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과 교차 반응하지 않는, 상기 (1)에 기재된 항체.
(6) 화학식 I로 표시되는 화합물을 제외한 뉴퀴놀론계 항균제와 교차 반응하지 않거나 또는 교차 반응성이 약한, 상기 (1)에 기재된 항체.
(7) 화학식 I로 표시되는 화합물과의 반응성이 생물 시료 유래 성분의 공존에 의해 변화되지 않는, 상기 (1) 내지 상기 (6) 중 어느 한 항에 기재된 항체.
(8) 생물 시료 유래 성분이 혈청 성분, 혈장 성분 또는 타액 성분인, 상기 (1) 내지 상기 (7) 중 어느 한 항에 기재된 항체.
(9) 화학식 I로 표시되는 화합물과의 반응성이 화학식 I로 표시되는 화합물과 혈청 성분의 결합에 의해 변화되지 않는, 상기 (1) 내지 상기 (6) 중 어느 한 항에 기재된 항체.
(10) 모노클로날 항체인 상기 (1) 내지 상기 (9) 중 어느 한 항에 기재된 항체.
(11) 화학식 I로 표시되는 화합물에 특이적인 모노클로날 항체이며, 고상에 고정화된 상기 화합물과 상기 항체와의 면역 반응이 저해되도록 시료 중의 상기 화합물 및 시료 중의 상기 화합물의 N-옥시드체 및/또는 탈메틸체가 존재하는 반응계에서, 상기 시료 중의 상기 화합물에 의한 면역 반응의 50 ％ 저해 활성이, 시료 중의 상기 화합물의 N-옥시드체 및/또는 탈메틸체에 의한 상기 면역 반응의 50 ％ 저해 활성과 비교하여 커지는 반응 조건을 만족하는, 상기 (10)에 기재된 모노클로날 항체.
(12) 상기 (10) 또는 상기 (11)에 기재된 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
(13) 화학식 I로 표시되는 화합물의 6 위치의 카르복시기를 통해 캐리어 단백질과 결합시킨, 상기 (1)에 기재된 항체를 제조하기 위한 항원.
(14) 캐리어 단백질이 BSA 또는 트랜스페린인, 상기 (13)에 기재된 항원.
(15) 화학식 I로 표시되는 화합물이 캐리어 단백질 1 분자당 12 내지 14 분자 결합되어 있는, 상기 (13) 또는 상기 (14)에 기재된 항원.
(16) 상기 (13) 내지 상기 (15) 중 어느 한 항에 기재된 항원을 동물에 면역시키는 것을 특징으로 하는 면역 방법.
(17) 상기 (13) 내지 상기 (15) 중 어느 한 항에 기재된 항원을 동물에 면역시켜 얻어진 항체를, 교차 반응성을 확인하고자 하는 화합물의 존재하에서 고상에 고정화된 화학식 I로 표시되는 화합물과 반응시켜, 교차 반응성을 확인하고자 하는 화합물의 비존재하에서의 반응성과 비교함으로써 원하는 항체를 선발하는 항체의 스크리닝 방법.
(18) 상기 (13) 내지 상기 (15) 중 어느 한 항에 기재된 항원을 동물에 면역시켜 얻어진 항체를, 생물 시료 유래 성분의 존재하에서 고상에 고정화된 화학식 I로 표시되는 화합물과 반응시켜, 생물 시료 유래 성분의 비존재하에서의 반응성과 비교함으로써 원하는 항체를 선발하는 항체의 스크리닝 방법.
(19) 상기 (1) 내지 상기 (11) 중 어느 한 항에 기재된 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물의 면역학적 측정 방법.
(20) 고상에 고정화된 상기 (1) 내지 상기 (11) 중 어느 한 항에 기재된 항체에 대하여, 합성 다가 항원 및 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물을 경합적으로 반응시키는 것을 특징으로 하는, 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물의 면역학적 측정 방법.
(21) 상기 (1) 내지 상기 (11) 중 어느 한 항에 기재된 항체에 대하여, 고상화 합성 다가 항원 및 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물을 경합적으로 반응시키는 것을 특징으로 하는, 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물의 면역학적 측정 방법.
(22) 고상에 고정화된 상기 (1) 내지 상기 (11) 중 어느 한 항에 기재된 항체에 대하여, 고상화 합성 다가 항원 및 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물을 경합적으로 반응시키는 것을 특징으로 하는, 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물의 면역학적 측정 방법.
(23) 고상이 라텍스 입자인, 상기 (19) 내지 상기 (22) 중 어느 한 항에 기재된 면역학적 측정 방법.
(24) 경합 반응을 응집 저해법에 의해서 측정하는 것을 특징으로 하는, 상기 (19) 내지 상기 (23) 중 어느 한 항에 기재된 면역학적 측정 방법.
(25) 시료가 생물 유래의 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 타액, 객담(sputum), 눈물, 이루(otorrhea) 또는 전립선액인, 상기 (19) 내지 상기 (24) 중 어느 한 항에 기재된 면역학적 측정 방법.
(26) 시료가 화학식 I로 표시되는 화합물을 투여한 환자의 시료인, 상기 (25)에 기재된 면역학적 측정 방법.
(27) 하기 (a) 및 (b)로 구성되는 것을 특징으로 하는, 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물의 면역학적 측정용 시약.
(a) 상기 (1) 내지 상기 (11) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 고상에 고정화된 (1) 내지 (11) 중 어느 한 항에 기재된 항체
(b) 합성 다가 항원 또는 고상화 합성 다가 항원
본 발명에 의해 제공되는 항체는 화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하는 유용한 항체이고, 상기 항체를 이용한 면역 분석법에 의해 각종 시료, 예를 들면 생체 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물의 농도를 고감도로 측정할 수 있다.
본 발명의 항체는 화학식 I로 표시되는 화합물과 반응하고, 그의 대사물인 N-옥시드체 및/또는 탈메틸체와 교차 반응하지 않는 항체인 것을 요한다. 화학식 I로 표시되는 화합물과 반응하고, 그의 대사물과는 반응하지 않기 때문에, 본 발명의 항체를 면역 분석에 이용하면, 혈 중에 항균제로서 유효하게 존재하는 화학식 I로 표시되는 화합물만을 특이적으로 측정할 수 있어 매우 유용하다.
또한, 본 발명의 항체의 다른 양태는 화학식 I로 표시되는 화합물의 S체인 레보플록사신에 강하게 반응하는 항체, 또는 화학식 I로 표시되는 화합물의 R체에 강하게 반응하는 항체, R체와 S체의 둘다에 반응하는 항체이다.
또한, 추가로 본 발명의 항체의 다른 양태는 화학식 I로 표시되는 화합물의 병용약 또는 화학식 I로 표시되는 화합물의 유사 화합물인 뉴퀴놀론계 항균제에 반응하지 않거나 또는 반응성이 약한 항체이다.
본 발명의 항체로서는, 면역시킨 동물의 혈청(항 혈청)으로부터 얻어지는 폴리클로날 항체일 수도 있고, 또한 면역시킨 동물의 항체 생산 세포를 이용하여 제조한 하이브리도마로부터 생산되는 모노클로날 항체일 수도 있다.
또한, 「교차 반응한다」, 「강하게 반응한다」, 「반응하지 않는다」, 「반응성이 약하다」라는 용어의 의미에 대해서는 후술한다.
본 발명에 의해 화학식 I로 표시되는 화합물의 S체 및/또는 R체를 인식하는 항체를 제조하기 위해서 이용되는 항원(면역용 항원)으로서는, 화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하고, 그의 대사물인 N-옥시드체 및 탈메틸체를 인식하지 않는 항체를 생산시키는 것과 같은 항원이면 어떤 것이어도 좋고, 그 중에서도 화학식 I로 표시되는 화합물의 6 위치 치환기인 카르복시기에 단백질 등의 캐리어(이하, 「캐리어」라고 하는 경우가 있음)를 결합시킴으로써 제조된 항원을 이용하는 것이 적당하다.
면역용 항원의 캐리어로서 이용하는 단백질(「캐리어 단백질」)은 일반적으로 저분자 항원(하프텐)에 대한 항체 생산에 유용하다고 알려져 있는 각종 단백질로부터 적절하게 선택하여 사용할 수 있고, 또한 캐리어 단백질과 항원의 결합은 그 자체에 공지된 방법으로 행할 수 있다. 예를 들면, 캐리어 단백질로서 소혈청 알부민, 트랜스페린을 사용할 수 있고, 캐리어 단백질과 항원의 결합에는 디시클로헥실카르보디이미드를 사용한 축합 반응이나 활성 에스테르법을 이용할 수 있지만, 캐리어로서 이용하는 단백질의 종류나 캐리어 단백질과 항원의 결합 방법이 이들 구체예로 한정되는 것은 아니다.
또한, 캐리어 단백질 1 분자당 결합하는 화학식 I로 표시되는 화합물의 분자수(결합수)는, 면역시키는 동물에서 항원으로서 인식될 수 있는 수라면 어떤 수이어도 좋다. 항체 생산의 효율을 고려하면, 예를 들어 캐리어 단백질 1 분자당 12 내지 14 분자의 화학식 I로 표시되는 화합물이 결합되어 있는 항원이 바람직하게 이용되지만, 상기 결합수가 이 범위로 한정되는 것은 아니다. 면역용 항원의 제조 방법은 상세하게 후술하지만, 제조시에 원료로서 반응에 사용하는 화학식 I로 표시되는 화합물의 캐리어 단백질에 대한 양을 증감시킴으로써, 원하는 수의 화학식 I로 표시되는 화합물을 결합시키는 것이 가능하다. 즉, 원료로서 첨가하는 상기 화합물량을 증가시키면 결합수는 커지고, 원료로서 첨가하는 상기 화합물량을 감소시키면 결합수는 작아진다. 또한, 본 명세서에 있어서는 「결합수」와 동일한 의미로 「결합비」, 「결합량」이라고 표현하는 경우가 있다.
또한, 상기 방법으로 제조한 본 발명의 면역용 항원은 하이브리도마 또는 항체의 스크리닝용 항원, 또한 후술하는 면역학적 측정 방법을 위한 항원(경합 반응용 항원)으로서도 사용할 수 있다. 스크리닝용 항원이나 면역학적 측정 방법을 위한 항원으로서 사용할 때는, 불용성 담체 등의 고체(고상) 상에 고정(고상화)하여 사용하거나, 후술하는 당업자에게 주지관용되는 표지 물질로 표지한 표지 항원으로서 사용할 수 있다. 이러한 고정(고상)화 항원이나 표지 항원은 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들면, 불용성 담체에 상기 항원을 물리적으로 흡착시키거나 또는 화학적으로 결합시킴으로써 고정(고상)화 항원을 제조할 수 있다. 화학적으로 결합시키는 경우에는, 적당한 스페이서를 개재할 수도 있다.
상기 불용성 담체로서는, 폴리스티렌 수지 등의 고분자 기재, 유리 등의 무기 기재, 셀룰로오스나 아가로오스 등의 다당류 기재 등을 포함하는 불용성 담체를 사용할 수 있고, 그의 형상은 특별히 한정되지 않고, 판상(예를 들면, 마이크로플레이트나 멤브레인), 비드 또는 입자상(예를 들면, 라텍스 입자), 튜브상(예를 들면, 시험관) 등 임의의 형상을 선택할 수 있는 스크리닝용 항원으로서 고정화하는 경우의 고상으로서는 마이크로플레이트, 면역학적 측정 방법을 위한 항원으로서 고정화하는 경우의 고상으로서는, 마이크로플레이트나 라텍스 입자를 바람직한 예로서 들 수 있다.
본 발명의 항체는 상기 항원을 인산 완충 생리 식염수(PBS) 등의 용매에 용해시키고, 이 용액을 동물에게 투여하여 면역시킴으로써 용이하게 제조할 수 있다. 필요에 따라서 상기 용액에 적절한 아쥬반트(adjvant)를 첨가한 후, 에멀전을 이용하여 면역을 행할 수도 있다. 아쥬반트로서는, 유중수형 유제, 수중유중수형 유제, 수중유형 유제, 리포솜, 수산화알루미늄 겔 등의 범용되는 아쥬반트 외에, 생체 성분 유래의 단백질이나 펩티드성 물질 등을 이용할 수도 있다. 예를 들면, 프로인트의 불완전 아쥬반트 또는 프로인트의 완전 아쥬반트 등을 바람직하게 사용할 수 있다. 아쥬반트의 투여 경로, 투여량, 투여 시기는 특별히 한정되지 않지만, 항원을 면역시키는 동물에서 원하는 면역 응답을 증강시킬 수 있도록 적절하게 선택하는 것이 바람직하다.
면역에 이용되는 동물의 종류도 특별히 한정되지 않지만, 포유 동물이 바람직하고, 예를 들면 마우스, 래트, 소, 토끼, 염소, 양 등을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 마우스를 사용할 수 있다. 동물의 면역은 당업계에서 이용 가능한 방법에 의해 행할 수 있고, 예를 들면 항원의 용액, 바람직하게는 아쥬반트와의 혼합물을 동물의 피하, 피내(皮內), 정맥 또는 복강내에 주사함으로써 면역을 행할 수 있다. 면역 응답은 일반적으로 면역되는 동물의 종류 및 계통에 따라서 다르기 때문에, 면역 스케줄은 사용되는 동물에 따라서 적절하게 설정하는 것이 바람직하다. 항원 투여는 최초의 면역 후에 몇회 정도 반복하여 행하는 것이 바람직하다.
폴리클로날 항체를 얻는 경우에는, 면역된 동물의 혈청(항 혈청)으로부터 본 발명의 항체를 취득할 수 있지만, 그 방법은 특별히 한정되지 않으며 당업자에게 이용 가능한 방법이라면 어떤 방법을 이용하여도 좋다. 항체의 정제는, 예를 들면 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피, 프로틴(protein) A 등을 이용하는 친화성 크로마토그래피, 황산암모늄 분획법, PEG 분획법, 에탄올 분획법 등을 적절하게 조합하여 행할 수 있다. 얻어진 항체가 본 발명의 항체인가 아닌가, 즉 목적으로 하는 화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하고, 그 이외의 뉴퀴놀론계 항균제 또는 레보플록사신의 병용약(예를 들면, 항생 물질, 소염 진통제, 종합 감기제, 기도 점막 조절제ㆍ점막 정상화제, 기관지 확장제 등)에 대해서는 반응성이 낮거나, 실질적으로 이들을 인식하지 않는 항체인 것은, 당업자에게 주지된 방법을 이용하여 쉽게 확인하는 것이 가능하다. 본 명세서의 실시예에는 본 발명의 항체의 제조 방법에 대하여, 동물의 면역 방법, 항체의 정제 방법 및 항체 특성의 확인 방법이 구체적으로 설명되어 있기 때문에, 당업자는 상기 일반적인 설명 및 실시예의 구체적 방법을 참조하면서, 필요에 따라서 이들 방법에 적절한 수식 내지 개변을 부가함으로써, 본 발명의 항체를 용이하게 제조하는 것이 가능하다.
화학식 I로 표시되는 화합물 이외의 뉴퀴놀론계 항균제로서는, 화학식 I로 표시되는 화합물의 유사 화합물을 들 수 있고, 구체적으로는 시프로플록사신, 토수플록사신, 가티플록사신, 스파르플록사신, 플레록사신, 로메플록사신, 에녹사신, 목시플록사신, 파주플록사신 등을 들 수 있다.
화학식 I로 표시되는 화합물의 병용약으로서는, 디클로페낙나트륨, 나부메톤, 플루르비프로펜, 케토프로펜, 록소프로펜나트륨, 옥사프로진, 나프록센, 이부프로펜, 카르보시스테인, 살리실아미드, 아세트아미노펜, 무수 카페인, 메틸렌디살리실산, 프로메타진, 테오필린을 들 수 있다.
본 발명의 항체의 일 양태로서, 이들 화합물 중 어느 하나 이상과 교차 반응하지 않거나 교차 반응성이 약한 항체를 들 수 있고, 본 항체를 화학식 I로 표시되는 화합물의 측정에 이용한 경우에는, 상기 화합물이 시료 중에 존재하더라도 화학식 I로 표시되는 화합물을 특이적으로 측정할 수 있다.
모노클로날 항체를 얻는 경우, 계속해서 이하의 조작이 행해지지만 그것으로 한정되는 것은 아니고, 모노클로날 항체 그 자체의 제조 방법에 대해서는 당업계에 주지되어 있으며 범용되고 있기 때문에, 당업자는 상기 항원을 이용함으로써 본 발명의 항체를 용이하게 제조하는 것이 가능하다(예를 들면 문헌[Antibodies, A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988) 제6장] 등을 참조할 것).
최종 면역 후, 면역시킨 동물로부터 항체 생산 세포인 비장 세포 또는 림프절 세포를 적출하여 높은 증식능을 갖는 골수종 유래의 세포주와 세포 융합시킴으로써 하이브리도마를 제조할 수 있다. 세포 융합에는 항체 생산능(질ㆍ양)이 높은 세포를 이용하는 것이 바람직하고, 또한 골수종 유래의 세포주는 융합시키는 항체 생산 세포가 유래하는 동물과 적합성이 있는 것이 바람직하다. 세포 융합은 당해 분야에서 공지된 방법에 따라서 행할 수 있지만, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜법, 센다이 바이러스를 이용한 방법, 전류를 이용하는 방법 등을 채용할 수 있다. 얻어진 하이브리도마는 당업계에서 범용되는 조건에 따라서 증식시킬 수 있고, 생산되는 항체의 성질을 확인하면서 원하는 하이브리도마를 선택할 수 있다. 하이브리도마의 클로닝은, 예를 들면 한계 희석법이나 연한천법 등의 주지된 방법에 의해 행하는 것이 가능하다.
하이브리도마의 선택은 생산되는 항체가 실제 측정에 이용되는 조건을 고려하여 선택 단계에서 효율적으로 행할 수도 있다. 예를 들면, 동물에 면역시켜 얻어진 항체를, 교차 반응성을 확인하고자 하는 화합물의 존재하에서 고상에 고정화된 화학식 I로 표시되는 화합물과 반응시켜, 교차 반응성을 확인하고자 하는 화합물의 비존재하에서의 반응성과 비교함으로써 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 보다 효율적으로 선발할 수 있다. 또한, 동물에 면역시켜 얻어진 항체를 생물 시료 유래 성분의 존재하에서 고상에 고정화된 화학식 I로 표시되는 화합물과 반응시켜, 생물 시료 유래 성분의 비존재하에서의 반응성과 비교함으로써 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 보다 효율적으로 선택할 수도 있다.
클로닝 공정 후, 생산되는 항체와 화학식 I로 표시되는 화합물의 결합능을 ELISA법, RIA법, 형광 항체법 등의 방법을 이용하여 분석함으로써, 선택된 하이브리도마가 원하는 성질을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는가 아닌가를 확인할 수 있다. 여기서, 화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하고, 그의 대사물을 인식하지 않는 항체를 양호한 효율로 얻기 위해서, 하이브리도마의 스크리닝에 이용하는 항원으로서, 화학식 I로 표시되는 화합물을 단백질에 결합시킨 것을 이용하는 것이 바람직하고, 상기 단백질의 종류를 면역용 항원의 단백질과 다른 종류의 것을 이용하는 방법이 보다 바람직하다.
상기와 같이 하여 선별된 하이브리도마를 대량 배양함으로써 원하는 특성을 갖는 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 대량 배양의 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 하이브리도마를 적절한 배지 중에서 배양하여 모노클로날 항체를 배지 중에 생산시키는 방법이나, 포유 동물의 복강내에 하이브리도마를 주사하여 증식시키고, 복수 중에 항체를 생산시키는 방법 등을 들 수 있다. 모노클로날 항체의 정제는 상술한 항 혈청으로부터의 항체 정제법, 예를 들면 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 황산암모늄 분획법, PEG 분획법, 에탄올 분획법 등을 적절하게 조합하여 행할 수 있다.
본 발명의 항체로서는, 항체 분자 전체의 이외에 항원 항체 반응 활성을 갖는 항체의 단편을 사용하는 것도 가능하고, 상기와 같이 동물에의 면역 공정을 거쳐 얻어진 것 외에, 유전자 조합 기술을 사용하여 얻어지는 것이나 키메라 항체를 이용하는 것도 가능하다. 항체의 단편으로서는 기능성 단편인 것이 바람직하고, 예를 들면 F(ab')2, Fab' 등을 들 수 있고, 이들 단편은 상기와 같이 하여 얻어지는 항체를 단백질 분해 효소(예를 들면, 펩신이나 파파인 등)로 처리함으로써 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 모노클로날 항체는 불용성 담체 상에 고정된 고정(고상)화 항체로서 사용하거나, 후술하는 당업자에게 주지관용되는 표지 물질로 표지한 표지 항체로서 사용할 수 있다. 이러한 고정화 항체나 표지 항체는 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들면, 불용성 담체에 모노클로날 항체를 물리적으로 흡착시키거나 또는 화학적으로 결합(적당한 스페이서를 개재할 수도 있음)시킴으로써 고정화 항체를 제조할 수 있다. 불용성 담체로서는, 폴리스티렌 수지 등의 고분자 기재, 유리 등의 무기 기재, 셀룰로오스나 아가로오스 등의 다당류 기재 등을 포함하는 불용성 담체를 사용할 수 있고, 그의 형상은 특별히 한정되지 않으며, 판상(예를 들면, 마이크로플레이트나 멤브레인), 비드 또는 입자상(예를 들면, 라텍스 입자), 튜브상(예를 들면, 시험관) 등 임의의 형상을 선택할 수 있다.
본 발명의 항체와 결합 가능한 표지 항체(이차 항체)를 이용함으로써, 화학식 I로 표시되는 화합물에 결합한 본 발명의 항체량을 측정할 수 있고, 그에 의해 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물을 검출할 수 있다. 표지 항체를 제조하기 위한 표지 물질로서는, 예를 들면 효소, 형광 물질, 화학 발광 물질, 비오틴, 아비딘, 또는 방사성 동위체, 금 콜로이드 입자, 착색 라텍스 등을 들 수 있다. 표지 물질과 항체의 결합법으로서는, 당업자가 이용 가능한 글루타르알데히드법, 말레이미드법, 피리딜디술피드법 또는 과요오드산법 등의 방법을 사용할 수 있지만, 고정화 항체나 표지 항체의 종류 및 이들의 제조 방법은 상기 예로 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 호스라디쉬 퍼옥시다아제(HRP)나 알칼리 포스파타제(ALP) 등의 효소를 표지 물질로서 이용하는 경우에는 그 효소의 특이적 기질(효소가 HRP인 경우에는, 예를 들면 O-페닐렌디아민(OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB), ALP의 경우에는 p-니트로페닐ㆍ포스페이트 등)을 이용하여 효소 활성을 측정할 수 있고, 비오틴을 표지 물질로서 이용하는 경우에는 적어도 아비딘 또는 효소 수식 아비딘을 반응시키는 것이 일반적이다.
본 발명의 항체를 이용하여, 예를 들면 시료 중에 존재하는 화학식 I로 표시되는 화합물을 검출할 수 있다. 본 명세서에 있어서 단순히 「화학식 I로 표시되는 화합물」이라 하는 경우, 화학식 I로 표시되는 화합물 중 2종류의 광학 활성체인 S체, R체 및 S체와 R체의 1:1 혼합물인 라세미체를 모두 포함하는 개념으로 이용된다. 따라서, 「화학식 I로 표시되는 화합물에 반응하는 항체」란, 화학식 I로 표시되는 화합물의 R체에 반응하는 항체, 화학식 I로 표시되는 화합물의 S체에 반응하는 항체, 및 화학식 I로 표시되는 화합물의 S체 및 R체 모두에 반응하는 항체를 포함하는 개념으로 이용된다.
또한, 「라세미체」와 「오플록사신」은 동일한 의미로 이용되고, 또한 「화학식 I로 표시되는 화합물의 S체」와 「레보플록사신」은 동일한 의미로 이용된다.
본 명세서에 있어서 「불용성 담체」를 「고상」, 항원이나 항체를 불용성 담체에 물리적 또는 화학적으로 담지시키는 것 또는 담지시킨 상태를 「고정」, 「고정화」, 「고상화」라고 표현하는 경우가 있다. 또한, 「검출」 또는 「측정」이라고 하는 용어는, 화학식 I로 표시되는 화합물 존재의 증명 및/또는 정량 등을 포함하여 가장 넓은 의미에서 해석할 필요가 있고, 어떤 의미에서도 한정적으로 해석해서는 안된다.
본 발명의 항체를 이용하는 측정 방법에서의 검출 대상의 「시료」로서는, 주로 생체(생물) 유래의 체액을 들 수 있고, 구체적으로는 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 타액, 객담, 눈물, 이루 또는 전립선액을 들 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 가축이나 어개류의 조직으로부터 추출한 것이나 가축의 사육, 어개류의 양식 과정에서 사용되는 사료나 물 등도, 당연히 본 발명의 시료일 수 있다. 이들 시료 중에서도, 오플록사신을 투여한 환자의 체액이 치료와의 관계 등에서 특히 바람직히 이용된다.
본 명세서에 있어서 「생물 시료 유래 성분」이란, 상기 시료를 구성하고 있는 성분을 말하고, 예를 들면 생물 시료가 혈청인 경우의 혈청 성분으로서 알부민이나 글로불린 등의 혈청 단백질, 당 단백질, 리포 단백질 등의 혈청 단백질류를, 생물 시료가 혈장인 경우의 혈장 성분으로서 혈장 단백질(혈청에는 포함되지 않는 혈액 응고 인자 등 포함함), 생물 시료가 타액인 경우의 타액 성분으로서 리소자임 등의 효소나 뮤코 다당 등을 말한다. 이들은 투여된 오플록사신과 결합하거나 하는 경우가 있고, 항체에 의한 항원 결정기의 인식에 장해를 줄 가능성이 있는 것은 본 명세서의 다른 부분에서도 언급하고 있다.
또한, 본 명세서에 있어서 「항균 활성을 잃은」이란, 일반적으로 「대사물」이나 「분해물」 등의 명칭으로 불리는, 항균 화합물이 변화체가 된 것을 가리키고, 미변화체 화합물이 갖는 항균 스펙트럼 또는 항균 활성의 일부가 상실되거나 약해진 것을 말한다. 또한 「결합형」이란, 측정계 내에서 항원이 시료 유래의 단백질과 가역적 또는 불가역적으로 결합되어 있는 것 및 인위적으로 각종 캐리어에 결합되어 있는 것을 나타내고, 「유리형」이란 시료 유래 단백질이나 각종 캐리어와 결합되지 않은 것을 나타낸다.
추가로 또한, 본 명세서 내에서 본 발명의 항체가 항원을 「인식한다」는 것은 항원과 「반응한다」, 「교차 반응한다」는 것과 동일한 의미이며, 항원과 「결합한다」는 것과 동일한 의미이지만, 이것으로 한정되는 것은 아니고, 가장 넓은 의미로 해석할 필요가 있다.
본 발명의 항체와 어떤 화합물이 「교차 반응하지 않는다」는 것은, 어떤 화합물과 전혀 반응하지 않는 것을 말하고, 정량적으로는 실시예 1의 경합 ELISA법에서의 반응 판정 기준에 따라서 교차 반응성이 1 ％ 미만인 경우를 말한다.
또한, 본 발명의 항체와 어떤 화합물의 「교차 반응성이 약하다」는 것은, 어떤 화합물과 반응하지만 그의 교차 반응성이 다른 화합물과의 교차 반응성에 비해 낮고, 다른 화합물을 충분히 구별하여 인식할 수 있는 경우를 말하며, 정량적으로는 실시예 1의 경합 ELISA법에서의 교차 반응성의 판정에 따라서, 교차 반응성이 1 ％ 이상 40 ％ 미만인 경우를 말한다.
「S체에 강하게 반응한다」는 것은, 화학식 I로 표시되는 화합물의 R체보다 S체에 강하게 반응하는 것을 말하고, 정량적으로는 실시예 1의 경합 ELISA법에서의 오플록사신과 항체의 교차 반응성의 판정에 따라서 교차 반응성이 100 ％ 미만인 경우를 말한다. 「R체에 강하게 반응한다」는 것은, 동일한 판정에 따라서 교차 반응성이 100 ％보다 큰 경우를 말한다.
「화학식 I로 표시되는 화합물과의 반응성이 생물 유래 시료 성분의 공존에 의해 변화되지 않는다」는 것은, 본 발명의 항체와 유리형의 화학식 I로 표시되는 화합물과의 반응을, 생물 유래 시료 성분의 존재 및 비존재하에 행하여, 양자(兩者)의 반응성을 비교한 경우에 실질적으로 변화가 없는 것을 말한다. 공존에 의해 반응성이 변화되는 경우로서는, 약물 동태학에서 말하는 약물과의 결합 이외에, 예를 들면 타액 중의 뮤코 다당 등 점성이 높은 물질이 화학식 I로 표시되는 화합물 중의 항원 결정기에의 항체의 결합을 방해하도록 한 경우를 들 수 있다.
「화학식 I로 표시되는 화합물과의 반응성이 화학식 I로 표시되는 화합물과 혈청 성분의 결합에 의해 변화되지 않는다」는 것은, 본 발명의 항체를 혈청 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물을 측정하기 위해서 이용하는 데에 필요한 성질이고, 혈청 알부민 등의 혈청 성분과 화학식 I로 표시되는 화합물이 결합하거나 하여 항체와 화학식 I로 표시되는 화합물의 반응성이 없어지거나 또는 약해지지 않는 상태를 말한다. 정량적으로는, 실시예 3의 경합 ELISA법에 의해, 화학식 I로 표시되는 화합물을 인간 혈청과 인큐베이션하는 것에 의한 영향을 보는 시험에 있어서, 인큐베이션 시간 0 분일 때와 인큐베이션 시간 15 분일 때의 반응성을 비교하여 그 차이가 5 ％ 미만을 말한다.
또한, 경합 ELISA법에서 본 발명의 항체와 유리형의 화학식 I로 표시되는 화합물과의 반응성을 측정할 때에, 유리형의 화학식 I로 표시되는 화합물을, 혈청을 이용하여 제조한 경우와 혈청을 이용하지 않고 제조한 경우를 비교하고, 그 차가 5 ％ 미만인 경우에도, 「화학식 I로 표시되는 화합물과의 반응성이 상기 화합물과 혈청 성분의 결합에 의해 변화되지 않는다」라고 말할 수 있다.
본 발명의 항체를 이용한 생물 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물의 검출은 공지된 방법(예를 들면, 문헌[일본 임상 병리학회편 「임상 병리 임시 증간 특집 제53호 임상 검사를 위한 면역 분석 기술과 응용」, 임상 병리 간행회, 1983년, 이시까와 에이지 등 편저 「효소 면역 측정법」, 제3판, 의학 서원, 1987년, 키타가와 츠네히로 등 편저 「단백질 핵산 효소 별책 No.31 효소 면역 측정법」, 고리쯔 슈판, 1987년] 등에 기재된 방법)에 따라서 행할 수 있다. 무엇보다, 본 발명의 항체를 이용한 화학식 I로 표시되는 화합물의 검출 방법이 상기에 예시한 것으로 한정되는 것은 아니고, 당업자가 목적에 따라서 적절하게 선택 가능한 것은 물론이다. 본 명세서의 실시예에는 구체적 측정 방법이 개시되어 있기 때문에, 당업자는 실시예의 방법을 참조하면서, 필요에 따라서 상기 방법에 적절한 수식 내지 개변을 부가함으로써, 생물 시료에 포함되는 화학식 I로 표시되는 화합물을 간편하며 확실하게 검출할 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 측정용 시약(키트)의 양태로서는, (1) 화학식 I로 표시되는 화합물이 고상화되어 있는 경우, (2) 화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하는 항체(본 발명의 항체)가 고상화되어 있는 경우, (3) 화학식 I로 표시되는 화합물 및 화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하는 항체가 둘다 고상화되어 있는 경우로 크게 구별할 수 있다. 이하, 대표적인 표지 면역 분석법인 ELISA와 대표적인 입자 응집 저해 면역 분석법인 라텍스 응집 저해법을 예로 각각을 설명한다. 또한 모두 시료 중의 오플록사신과의 경합 반응을 이용한 것이다.
<표지 면역 분석법: 특히 ELISA법을 예로서>
(1) 화학식 I로 표시되는 화합물이 고상화되어 있는 경우에는, 적어도 이하의 요소: (a) 화학식 I로 표시되는 화합물이 고상화된 불용성 담체; 및 (b) 화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하는 항체에 의해 측정용 시약(키트)을 구성할 수 있다. 여기서 (a) 화학식 I로 표시되는 화합물이 고상화된 불용성 담체는, 캐리어를 통해 화학식 I로 표시되는 화합물을 고상화하거나, 불용성 담체와 화학식 I로 표시되는 화합물에 상호 결합성 관능기를 도입한 후에 화학 반응을 행하여 고상화하거나 함으로써 얻을 수 있다. 또한, 여기서 말하는 캐리어는 화학식 I로 표시되는 화합물을 불용성 담체에 고정하기 위해서 개재시키는 것을 가리키고, 단백질도 사용될 수 있지만, 상술한 면역용 항원에서의 캐리어와 같이, 저분자 항원(하프텐)에 대한 항체 생산에 기여할 수 있는 것은 필요로 하지 않는다. 따라서, 면역용 항원을 캐리어를 포함하는 화학식 I로 표시되는 화합물로서 사용하는 것도 가능하고, 면역원성을 갖지 않는 단백질이나 합성 고분자를 캐리어로서 사용하는 것도 가능하다. 다음에 (b) 화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하는 항체는, 검출 가능한 표지가 되어 있을 수도 없을 수도 있다. 검출 가능한 표지가 되지 않은 경우에는, 검출 가능한 표지가 된 이차 항체 등을 사용하고, 검출 가능한 표지가 되어 있는 경우에는, 상기 표지에 적합한 검출 방법으로 검출을 행할 수 있다. 검출 가능한 표지가 효소인 경우에는, 효소 반응 기질을 측정용 시약(키트)에 추가로 포함시킨 형태를 취할 수도 있다. 효소나 기질의 바람직한 조합 등은 상술하였다.
(2) 화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하는 항체가 고상화되어 있는 경우에는, 적어도 이하의 요소: (a) 화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하는 항체가 고상화된 불용성 담체; 및 (b) 표지된 화학식 I로 표시되는 화합물에 의해 측정용 시약(키트)을 구성할 수 있다. 여기서 (a) 화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하는 항체가 고상화된 불용성 담체는, 항체를 물리적, 화학적으로 고상화함으로써 얻을 수 있다. 또한, (b) 표지된 화학식 I로 표시되는 화합물은 당업자에게 주지관용되는 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 검출 가능한 표지가 되어 있는 경우에는, 상기 표지에 적합한 검출 방법으로 검출을 행할 수 있다. 검출 가능한 표지가 효소인 경우에는, 효소 반응 기질을 측정용 시약(키트)에 추가로 포함시킨 형태를 취할 수도 있다. 이들은 상기 (1)의 경우와 동일하다.
(3) 화학식 I로 표시되는 화합물 및 화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하는 항체가 둘다 고상화되어 있는 경우에는, 적어도 이하의 요소: (a) 화학식 I로 표시되는 화합물이 고상화된 불용성 담체; 및 (b) 화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하는 항체가 고상화된 불용성 담체에 의해 측정용 시약(키트)을 구성할 수 있다. (a) 화학식 I로 표시되는 화합물이 고상화된 불용성 담체는 상기 (1)의 경우와 동일하고, (b) 화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하는 항체가 고상화된 불용성 담체는 상기 (2)의 경우와 동일하다.
<입자 응집 저해 면역 분석법: 특히 라텍스 응집 저해법을 예로서>
상기 표지 면역 분석법과는 다른, 시료 중에 존재하는 화학식 I로 표시되는 화합물을 검출하기 위한 측정용 시약(키트)의 양태로서, 적어도 이하의 요소:
(1A) (a) 화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하는 항체 및 (b) 고상화 합성 다가 항원,
(2A) (a) 화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하는 항체를 고정화한 라텍스 입자 및 (b) 합성 다가 항원,
(3A) (a) 화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하는 항체를 고상화한 라텍스 입자 및 (b) 고상화 합성 다가 항원
에 의해 구성된 측정용 시약(키트)을 예시할 수 있다. 또한, 「합성 다가 항원」 및 「고상화 합성 다가 항원」의 정의는 후술한다.
이들 측정용 시약(키트)는 라텍스 응집 저해법에 바람직하게 사용할 수 있다. (a), (b)에 사용하는 라텍스 입자는 감도 향상 등의 원하는 성능을 얻기 위해서 입경이나 종류를 적절하게 선택할 수 있다. 라텍스의 재질로서는, 항원 또는 항체의 담지에 적합한 것이면 되고, 일반적으로 이용되는 폴리스티렌을 주성분으로 하는 라텍스 외에, 스티렌-부타디엔 공중합체, (메트)아크릴산에스테르류 중합체 등을 들 수 있다. 또한, 금속 콜로이드, 젤라틴, 리포솜, 마이크로캡슐, 실리카, 알루미나, 카본 블랙, 금속 화합물, 금속, 세라믹 또는 자성체 등의 재질로 이루어지는 입자를 라텍스 입자 대신에 사용할 수도 있다.
또한 상기와는 다른 시료 중에 존재하는 화학식 I로 표시되는 화합물을 검출하기 위한 측정용 시약(키트)의 양태로서, 적어도 이하의 요소:
(a) 화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하는 항체를 고상화한 불용성 담체; 및 (b) 표지된 화학식 I로 표시되는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 측정용 시약(키트):
(b) 표지된 화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하는 항체; 및 (b) 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 합성 다가 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 측정용 시약(키트)
이며, 면역 크로마토법을 측정 원리로 하는 측정용 시약(키트)을 예시할 수 있다.
상기 「합성 다가 항원」은 저분자 항원(하프텐)의 면역 분석법, 특히 입자 응집 면역 분석법에서 응집 정도를 향상시키기 위해서, 하프텐을 다량체화시켜 다가 항원을 구성하여 응집소로 한 것으로, 폴리하프텐 등이라 불리는 것과 동일한 것이다. 합성 다가 항원은 오플록사신을 다량체화한 후, 응집소로서의 기능을 발휘할 수 있는 것을 한도로 하며 제조 방법이나 구성은 제한되지 않는다. 오플록사신을 적당한 단백질, 폴리아미노산, 펩티드, 당의 중합물(저분자 다당이나 고분자 다당 등), 수용성 합성 중합체, 스페이서 화합물 등의 캐리어를 통해 다량체화 한 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 면역용 항원이나 스크리닝용 항원도 합성 다가 항원에 해당한다. 캐리어 1 분자당 결합하는 화학식 I로 표시되는 화합물의 분자수(결합비)는 면역용 항원이나 스크리닝용 항원의 제조 방법과 동일하게 조정하여 제조할 수 있다. 상기 결합비는 다가 항원으로서 인식될 수 있는 2 이상이면 아무래도 좋고, 응집소로서 원하는 성능을 얻을 수 있도록 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면 후술하는 실시예((a) 화학식 I로 표시되는 화합물을 인식하는 항체를 고상화한 라텍스 입자; 및 (b) 합성 다가 항원(캐리어로서 소혈청 알부민을 이용함)에 의해 구성된 측정용 시약(키트)을 이용하는 라텍스 응집 저해법)에서의 상기 결합비는, 8 이상인 것이 바람직하고, 15 이상인 것이 더욱 바람직한 값이다. 이 결합비는 캐리어종나 측정 시약 및 측정 방법의 설계에 의존하여 최적인 수치가 변동되는 값이다. 당업자는 원하는 캐리어를 선택하여 각 캐리어에 대하여 최적인 결합비를 결정한 후에 상기 측정 시약을 구축할 수 있다.
상기 「고상화 합성 다가 항원」은 그의 목적이나 기능이 상기 「합성 다가 항원」과 동일하다. 고상화 합성 다가 항원은 오플록사신을 2 분자 이상 불용성 담체(라텍스 입자 등)에 화학적 또는 물리적으로 결합시킨 것(이 경우, 캐리어나 스페이서를 개재할 수도 있음)이나 상기 합성 다가 항원을 불용성 담체(라텍스 입자 등)에 화학적 또는 물리적으로 결합시킨 것이 해당한다.
<실시예>
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위가 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 하이브리도마의 제조과 항체의 획득
(I) 재료와 방법
(1) 면역용 항원 및 스크리닝용 항원의 제조
(i) 화학식 I로 표시되는 화합물의 S체(이하, 단순히 레보플록사신 또는 LVFX라 표기하는 경우가 있음) 10 mg을 2 mL의 용해액(0.1 mol/L 인산 완충액 0.4 mL, DMSO 0.2 mL, 정제수 1.4 mL)에 용해시켜 LVFX 용액을 얻었다. 또한, 화학식 I로 표시되는 화합물의 S체로서, 본원의 실시예에서는 모두 레보플록사신의 1/2 수화물([(-)-(S)-9-플루오로-2,3-디히드로-3-메틸-10-(4-메틸-1-피페라지닐)-7-옥소-7H-피리도[1,2,3-데][1,4]벤족사진-6-카르복실산 헤미히드레이트])를 이용하였다.
(ii) 상기 LVFX 용액에 대하여, 2 mg의 BSA 분말 또는 2 mg의 트랜스페린 분말을 첨가하고, 각각 서서히 회전시키면서 용해시킨 후, 5 분간 얼음 중에 정치하여 2종류의 LVFX 단백질 혼합액을 얻었다.
(iii) 이어서, 각 LVFX 단백질 혼합액에 대하여, 가교제로서 수용성 카르보디이미드(WSC) 160 mg을 첨가하여 용해시킨 후, 차광하에 4 ℃에서 서서히 회전시키면서 70 시간 인큐베이션하였다.
(iv) 그 후, 4 ℃에서 2 일간 PBS(pH 7.2) 중에서 투석을 행하였다.
(v) 투석 후의 액을 회수하여 330 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 LVFX의 농도를 구하고, 커플링률(LVFX-단백질 결합비)을 확인하였다.
(2) 면역과 시험 채혈
상기 LVFX와 BSA의 커플링물(LVFX-BSA)을 PBS에 용해시키고, 아쥬반트와 1:1로 혼합 후, 연결 실린지를 이용하여 혼화하여 에멀전을 제조하고, 상기 에멀전을 면역용 항원으로서 이용하였다.
3 마리의 암컷 BALB/c 마우스(ML-1, ML-2: 모두 7 주령, ML-3: 11 주령) 각각에 대하여, 면역용 항원을 1 마리당 1회 투여량으로서 10 μg(ML-1), 20 μg(ML-2), 40 μg(ML-3)씩을 피하 투여하였다. 1 주간 후, 동일한 투여량으로 재차 피하 투여하였다.
면역 개시 14 일 후에 각 마우스의 안저(眼底)로부터 마우스 항 혈청을 채취하고, 후술하는 항원 고상화 ELISA법으로 상기 항 혈청 중의 항체가를 확인하였다. 또한, 유리형 레보플록사신에 대한 항 혈청 중의 항체 반응성을 확인하기 위해서, 후술하는 경합 ELISA법으로 반응계에 유리형 레보플록사신을 2 μmol/L, 10 μmol/L, 50 μmol/L 공존시킨 조건하에서의 각 항 혈청의 반응성을 조사하였다.
또한, 모든 ELISA법에 있어서, 면역시키지 않은 마우스의 안저로부터 채취한 정상 혈청을 대조군으로서 이용하였다.
(3) 세포 융합
시험 채혈 5 일 후, 마우스 ML-1에 대하여 10 μgLVFX-BSA를 정맥 주사하여 최종 면역시켰다. 상기 최종 면역의 3 일 후에 비장을 적출하고, 폴리에틸렌글리콜을 이용한 통상법에 의해 세포 융합을 행하였다. 골수종 세포는 SP2/O를 이용하였다. 얻어진 융합 세포는 비장 세포로서 2.5×106/mL가 되도록 히포크산틴아미노프테린-티미딘(HAT) 및 15 ％ 소태아 혈청을 포함하는 RPMI1640 배지에 현탁시키고, 96웰 배양 플레이트에 0.2 mL씩 분주하였다. 이것을 5 ％ CO2 인큐베이터 중에서 37 ℃에서 배양하였다.
(4) 스크리닝
세포 융합 11 일 후에 1차 스크리닝으로서, 배양 상청을 이용하여 항원 고상화 ELISA법을 행하고, LVFX와 트랜스페린의 커플링물(LVFX-트랜스페린)에 대하여 높은 반응성을 나타낸 웰을 1차 양성 웰로서 선별하였다. 상기 1차 양성 웰 중의 세포는 48웰 플레이트에서 계대하였다.
계대 2 일 후에 2차 스크리닝으로서, 배양 상청을 이용하여 경합 ELISA법을 행하고, 유리형 레보플록사신에 대하여 높은 반응성을 나타낸 웰을 2차 양성 웰로서 선택하였다.
2차 스크리닝으로 선택된 세포주는 3차 스크리닝으로서 레보플록사신의 병용약, 유사 화합물 및 대사물과의 경합 ELISA법을 행하였다. 또한 3차 스크리닝에 의해서 선택된 세포주의 배양 상청을 이용하여, 유리형 레보플록사신과의 경합 ELISA법의 반응계에 인간 혈청이 공존한 경우 및 미리 레보플록사신을 혈청과 인큐베이션한 경우에, 혈청이 항체의 반응성에 영향을 주는지 조사하였다.
(5) 클로닝 및 면역 글로불린(항체) 채취
3차 스크리닝으로 선별한 10주의 하이브리도마를 한계 희석법으로 클로닝하였다. 이어서 각 하이브리도마가 생산하는 면역 글로불린(항체)을 채취하기 위해서, 2 주간 전에 프리스탄 0.5 mL를 복강내에 주사해 둔 12 주령의 암컷 BALB/c 마우스에, 하이브리도마를 세포수 0.5×106개의 양으로 복강내에 투여하였다. 14 일 후에 복수를 채취하고, 원심 처리하여 상청을 얻었다. 상청을 등량의 흡착용 완충액(3 mol/L NaCl, 1.5 mol/L 글리신-NaOH 완충액, pH 8.5)과 혼화 후, 여과하였다. 상기 여과액을 흡착용 완충액으로 평형화한 프로틴 A 칼럼에 통과시키고, 여과액 중의 항체를 칼럼에 흡착시킨 후, 0.1 mol/L 시트르산 완충액(pH 3.0)으로 용출시켰다. 상기 용출액을 1 mol/L 트리스-HCl 완충액(pH 8.0)으로 중화 후, PBS로 투석을 행하고, 항체를 채취하였다.
(6) 서브클래스의 확인
채취한 10종류의 면역 글로불린(항체)에 대하여 서브클래스 판정 키트(ZYMED사 제조)를 이용하여 서브클래스의 확인을 행하였다.
(7) ELISA용 플레이트의 제조
PBS에 용해시켜 1 μg/mL의 농도로 제조한 LVFX-트랜스페린을 스크리닝용 항원으로서 50 μL/웰씩 96웰 플레이트에 고상화하고, 4 ℃에서 밤새 정치하였다. PBST(0.05 ％ 트윈(Tween)20-PBS)로 3회 세정 후(400 μL/웰), 블로킹액(3 ％ 스킴 밀크-PBST)을 100 μL/웰씩 분주하고, 실온에서 1 시간 정치하여 블로킹을 행하고, ELISA용 플레이트를 제조하였다. 상기 ELISA용 플레이트는 PBST로 3회 세정 후, 각 시약을 첨가하여 실시예에 기재된 각 ELISA법 시험에 이용하였다.
(8) 항원 고상화 ELISA법
(i) ELISA용 플레이트에 1 ％ BSA-PBST에 의해 100배 내지 5배씩 8 단계로 희석한 각 마우스 항 혈청 또는 융합 세포의 배양 상청을 50 μL/웰씩 분주하여 실온에서 1 시간 정치하였다.
(ii) PBST로 3회 세정 후, HRP-GtF(ab')2-항-마우스 Ig's(바이오소스(Biosource), AMI4404)를 1 ％ BSA-PBST로 5000배 희석한 용액을 50 μL/웰씩 분주하여 실온에서 1 시간 정치하였다.
(iii) PBST로 3회 세정 후, OPD 발색액(OPD를 2 mg/mL, 과산화수소를 0.02 ％의 농도로 pH 5.0 시트르산 완충액에 용해)을 분주하고(50 μL/웰), 실온에서 10 분간 정치하였다.
(iv) 0.75 mol/L 황산을 50 μL/웰씩 분주하여 반응을 정지시킨 후, 플레이트 리더로 492 nm의 흡광도를 측정하였다.
(9) 경합 ELISA법에 이용하는 화합물 용액의 제조
경합 ELISA법에 이용하는 화합물로서, 레보플록사신, 후술하는 레보플록사신의 병용약, 레보플록사신의 유사 화합물인 뉴퀴놀론계 항균제, 레보플록사신의 대사물 및 오플록사신(라세미체)을 선택하였다. 이들 화합물을 쉽게 용해 가능한 용해액을 정제수, PBST, DMSO, 메탄올, 0.1 mol/L HCl 또는 0.1 mol/L NaOH 중에서 각각 선택하였다. 용해액으로서 0.1 mol/L HCl 또는 0.1 mol/L NaOH를 선택한 경우에는, 이들에 화합물을 용해시킨 후, 즉시 1 ％ BSA-PBST로 50배 희석하여 pH 시험지로 중성 부근의 pH임을 확인하였다. 용해시킨 화합물은 화합물의 농도가 0.01 μmol/L, 0.1 μmol/L, 1 μmol/L, 10 μmol/L, 100 μmol/L가 되도록 1 ％ BSA-PBST로 단계적으로 희석하여, 경합 ELISA법에 사용하였다. 예를 들면, 레보플록사신은 정제수로 1 mmol/L에 용해시키고, 이어서 1 ％ BSA-PBST로 단계 희석하여 경합 ELISA법에 사용하였다.
<교차 반응성을 시험한 레보플록사신의 병용약>
디클로페낙나트륨, 나부메톤, 플루르비프로펜, 케토프로펜, 록소프로펜나트륨, 옥사프로진, 나프록센, 이부프로펜, 카르보시스테인, 살리실아미드, 아세트아미노펜, 무수 카페인, 메틸렌디살리실산, 프로메타진 및 테오필린
<교차 반응성을 시험한 레보플록사신의 유사 화합물>
시프로플록사신, 토수플록사신, 가티플록사신, 스파르플록사신, 플레록사신, 로메플록사신, 노르플록사신, 에녹사신, 목시플록사신 및 파주플록사신
<교차 반응성을 시험한 레보플록사신의 대사물>
N-옥시드체 및 탈메틸체
<오플록사신>
화학식 I로 표시되는 화합물의 S체 및 R체 혼재물(조성비 1:1)
(10) 경합 ELISA법
(i) ELISA용 플레이트에 상기 (9) 경합 ELISA법에 이용하는 화합물 용액의 제조에서 제조한 각 화합물 용액을 25 μL/웰씩 분주하였다.
(ii) 이어서, 1 ％ BSA-PBST로 1000배 희석한 각 마우스 항 혈청 또는 융합 세포의 배양 상청을 25 μL/웰씩 분주하여 실온에서 1 시간 정치하였다.
이후의 조작은 상기 (8) 항원 고상화 ELISA법의 공정(ii) 내지 (iv)와 동일하게 행하였다.
(11) 본 발명 항체를 이용한 경합 ELISA법에서의 혈청 영향의 평가
(i) 1 ％ BSA-PBST에 의해 인간 혈청을 희석하여 5 ％ 인간 혈청을 제조하였다. 또한, 본 발명의 각 실시예에서 사용한 인간 혈청, 혈장은 모두 동의를 얻어 채취한 지원자의 혈액에서 유래하는 것이다.
(ii) 5 ％ 인간 혈청을 이용하여 2.0 μmol/L, 0.2 μmol/L, 0.02 μmol/L 레보플록사신을 제조하여 인간 혈청 시약 a라 하였다. 대조군 시약으로서, 1 ％ BSA-PBST를 이용하여 2.0 μmol/L, 0.2 μmol/L, 0.02 μmol/L 레보플록사신을 제조하였다.
(iii) ELISA용 플레이트에 인간 혈청 시약 a 또는 대조군 시약을 25 μL/웰씩 분주하였다.
(iv) 이어서, 융합 세포의 배양 상청을 25 μL/웰 분주하여 실온에서 1 시간 정치하였다.
이후의 조작은 상기 (8) 항원 고상화 ELISA법의 공정(ii) 내지 (iv)와 동일하게 행하였다.
(12) 미리 유리형 레보플록사신과 인간 혈청을 인큐베이션한 시료를 경합 ELISA법으로 측정한 경우의 영향 평가
(i) 정제수로 용해시킨 레보플록사신 용액을 인간 혈청으로 100배 희석하여 30 μmol/L 레보플록사신 용액을 제조하고, 37 ℃에서 0, 15, 60 분간 인큐베이션하였다.
(ii) 각 시간의 인큐베이션 후, 상기 30 μmol/L 레보플록사신 용액을 1 ％ BSAPBST로 15배, 150배, 1500배로 희석하여 인간 혈청 시약 b라 하였다.
(iii) ELISA용 플레이트에 인간 혈청 시약 b를 25 μL/웰씩 분주하였다.
(iv) 이어서, 융합 세포의 배양 상청을 25 μL/웰씩 분주하여 실온에서 1 시간 정치하였다.
이후의 조작은 상기 (8) 항원 고상화 ELISA법의 공정(ii) 내지 (iv)와 동일하게 행하였다.
(13) 반응의 수치화
(i) 측정된 흡광도로부터, 우선 각 화합물의 각 첨가 농도에서의 반응성(％)을 이하의 수학식 1을 이용하여 산출하였다.
<수학식 1>
반응성(％)=[Abs.(x)]/[Abs.(0)]×100
Abs.(x):
(화합물 농도 x μmol/L에서의 흡광도)-(항체 0 μg/mL에서의 흡광도)
Abs.(0):
(화합물 농도 0 μmol/L에서의 흡광도)-(항체 0 μg/mL에서의 흡광도)
(ii) 다음에, 각 화합물에 대하여 첨가 농도와 반응성의 관계를 플롯한 그래프를 작성하고, 반응성이 50 ％가 될 때의 각 화합물의 첨가 농도를 구하였다. 이 농도를 50 ％ 저해 농도(IC50)라 하였다.
(iii) IC50으로부터 이하의 식으로 각 항체의 각 화합물에 대한 교차율(％)을 구하였다. 구한 교차율을 바탕으로 각 항체의 각 화합물에 대한 교차 반응성 강도의 판정 기준을 설정하였다.
<수학식 2>
교차율(％)=[레보플록사신의 IC50]/[각 화합물의 IC50]×100
교차 반응성 강: 교차율 80 ％ 이상 내지 100 ％
교차 반응성 중: 교차율 40 ％ 이상 내지 80 ％ 미만
교차 반응성 약: 교차율 1 ％ 이상 내지 40 ％ 미만
교차 반응하지 않음: 교차율 0 ％ 이상 내지 1 ％ 미만
또한, 각 항체의 오플록사신에 대한 교차 반응성 강도의 판정 기준은 다음과 같이 설정하였다.
S체와 강하게 반응: 교차율이 100 ％ 미만
S체와 R체 등가로 반응: 교차율이 100 ％
R체와 강하게 반응: 교차율이 100 ％ 초과
(II) 결과
(1) 면역용 항원 및 스크리닝용 항원의 제조
제조한 면역용 항원 및 스크리닝용 항원의 LVFX-단백질 결합비는, LVFX-BSA가 12.0, LVFX-트랜스페린이 13.9로 모두 높은 값을 나타내었다. 또한, 결합비의 값은 투석 후의 LVFX 농도를 투석 전의 BSA 또는 트랜스페린 농도로 나눔으로써 산출한 것으로, BSA 또는 트랜스페린 1 분자당 결합한 LVFX의 분자수를 나타낸다.
(2) 시험 채혈에서의 항원 고상화 ELISA법 시험의 결과
시험 채혈을 행하여 항원 고상화 ELISA법에 의해 각 마우스 항 혈청 중의 항체가를 조사한 결과, 3종의 마우스 항 혈청 모두에서 높은 항체가가 확인되었다(도 1). ELISA용 플레이트에 고상화한 스크리닝용 항원과 면역용 항원에서는 커플링시킨 단백질이 다르기 때문에, 각 항체가 고상화된 스크리닝용 항원의 단백질 부분(다시 말하면 캐리어)에 비특이적으로 반응할 가능성은 배제되었다. 따라서, 본 실시예에서 얻어진 각 마우스 항 혈청은 면역용, 스크리닝용 항원 중 공통 부분인 레보플록사신을 특이적으로 인식하는 항체를 포함한다고 생각되었다.
(3) 시험 채혈에서의 경합 ELISA법 시험 결과
단백질과 결합하지 않은 유리형 레보플록사신을 경합 ELISA법의 반응계에 공존시켜, 고상화 항원과 경합시킨 경우의 스크리닝용 항원과 각 마우스 항 혈청 중의 항체와의 반응량 변화를 조사한 결과, 3종의 마우스 항 혈청 중 어느 것에서도 반응계로의 레보플록사신의 첨가량에 따라서 스크리닝용 항원에 대한 항체의 반응량이 저하되었다(도 2). 따라서, 본 실시예에서 얻어진 각 마우스 항 혈청 중에는, 유리형 레보플록사신을 인식하는 항체가 포함되어 있다고 생각되었다.
(4) 스크리닝
1차 스크리닝 결과, 고상화된 LVFX-트랜스페린에 높은 반응성을 나타낸 63주를 1차 양성주로서 선택하였다. 또한 2차 스크리닝 결과, 유리형 레보플록사신과 높은 반응성을 나타낸 32주를 2차 양성주로서 얻었다. 또한, 3차 스크리닝 결과, 레보플록사신의 병용약, 유사 화합물 및 대사물과 교차 반응하지 않거나 또는 교차 반응성이 비교적 약한 10주를 선택하고, 이 10주 유래의 항체에 대하여 추가로 시험하였다.
3차 스크리닝에 의해서 선택된 상기 10종류의 항체에 대하여 경합 ELISA법의 반응계에 인간 혈청을 공존시켜 항체의 반응성에 미치는 혈청 성분의 영향을 조사하였다. 혈청의 첨가에 의해, 유리형 레보플록사신이 혈청 중의 단백질과 결합하여 결합형 레보플록사신이 되고, 항체의 반응에 영향을 줄 가능성이 생각되었지만, 모든 항체에 있어서 대조군(혈청비 첨가)과 혈청을 첨가한 경우의 반응성 차는 5 ％ 미만이었다.
3차 스크리닝에 의해서 선택된 상기 10종류의 항체에 대하여, 미리 유리형 오플록사신과 혈청을 인큐베이션하고, 유리형 오플록사신이 혈청 단백질과 결합한 결합형 오플록사신으로 변환되도록 한 인간 혈청 시약 b를, 경합 ELISA법의 시료로 하여 측정하였다. 경합 ELISA법에 의해 상기 항체의 반응성을 구한 결과, 인큐베이션 시간이 0 분인 경우와 비교하여 인큐베이션 시간 15 분 및 60 분일 때의 반응성 차는 5 ％ 미만이었다.
상기 혈청의 영향을 보는 2종류의 시험 결과로부터, 3차 스크리닝에 의해서 선택된 10종류의 항체는, 혈청 단백질과 결합한 결합형 레보플록사신에서도 혈청 단백질과 결합하지 않은 유리형 레보플록사신과 동일한 반응성을 나타내고, 시료 중의 유리형, 결합형을 동시에 검출 가능하다고 생각되었다.
(5) 클로닝 및 면역 글로불린(항체), 채취 서브클래스의 확인
3차 스크리닝으로 선택된 10종류 항체의 서브클래스를 조사한 결과, 10종류 중 8종류는 서브클래스가 IgG이며, 그 밖의 2종류의 항체는 IgA와 IgM이었다. 이 이후에, 서브클래스가 IgG이었던 77201 내지 77207 및 77209의 8종류의 모노클로날 항체만 평가를 계속하였다.
또한, 이들 8종류의 항체 중 실시예 2에서 레보플록사신 탈메틸체에 대하여 약간의 반응성을 나타낸 77203의 1종류를 제외한 7종류에 대하여, 상기 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소(일본국 이바라키켕 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 1 쥬오다이6)에 기탁하였다. 기탁 번호는 이하와 같다.
항체 번호: 기탁 번호
77201: FERM BP-11010
77202: FERM BP-11011
77204: FERM BP-11012
77205: FERM BP-11013
77206: FERM BP-11014
77207: FERM BP-11015
77209: FERM BP-11016
[실시예 2] 각 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체의 교차 반응성 평가
(I) 재료와 방법
(1) 시약의 제조
경합 ELISA법에 이용한 각 화합물은 실시예 1(I)(9)와 동일한 조작으로 제조하였다.
(2) 교차 반응성의 평가(경합 ELISA법)
실시예 1(I)(10) 경합 ELISA법과 동일하게 행하였다. 즉, 이용한 항체는 실시예 1(II)(5)에서 선택한 7종류의 모노클로날 항체(정제 IgG: 0.2 μg/mL)였다. 또한, 항체의 반응성 및 교차 반응성의 산출도 실시예 1(I)(13)과 동일하게 행하여 수치화하였다.
(II) 결과
(1) 유리형 레보플록사신에 대한 각 모노클로날 항체의 반응성
도 3에 나타내는 바와 같이, 각 항체 모두 유리형 레보플록사신에 대하여 반응하는 것이 확인되었다.
(2) 유사 화합물, 대사물 및 화학식 I로 표시되는 화합물의 S체(레보플록사신), R체 및 S체와 R체의 1:1 혼합물인 라세미체(오플록사신)와의 교차 반응성
유사 화합물 및 레보플록사신 대사물 및 오플록사신에 대한 각 항체의 교차율을 표 1에 나타내었다.
각 유사 화합물에 대한 각 모노클로날 항체의 교차 반응성에 대해서는, 77201, 77202 및 77204가 목시플록사신에 대하여 교차 반응성을 나타내었다. 77205, 77207 및 77209는 플레록사신에 약간 교차 반응성을 나타내었지만, 그 밖의 유사 화합물 모두에 대하여 교차 반응하지 않거나 약한 교차 반응성이었다.
오플록사신에 대한 각 항체의 교차 반응성에 대해서는, 77201, 77202, 77204, 77205, 77207의 5종류 항체는 S체에의 교차 반응성과 오플록사신에의 교차 반응성이 동일하였다. 77206은 오플록사신에 대한 교차 반응성이 50 ％이기 때문에, S체에 강하게 반응하는 항체인 것으로 판정하였다. 한편, 77209는 오플록사신에의 교차율이 250 ％로 레보플록사신 단체보다 오플록사신에 대한 교차 반응성쪽이 강하기 때문에, R체에 강하게 반응하는 항체인 것으로 판정하였다.
각 항체의 레보플록사신 대사물, 오플록사신에 대한 교차 반응성을 통합하면 이하와 같았다.
77201, 77202, 77204, 77205, 77207: 오플록사신과 반응하고 그의 대사물인 N-옥시드체 및 탈메틸체와 반응하지 않는 항체로, 화학식 I로 표시되는 화합물의 S체(레보플록사신)와 R체에 모두 반응하는 항체
77206: 오플록사신과 반응하고 그의 대사물인 N-옥시드체 및 탈메틸체와 반응하지 않는 항체로, 레보플록사신과 강하게 반응하는 항체
77209: 오플록사신과 반응하고 그의 대사물인 N-옥시드체 및 탈메틸체와 반응하지 않는 항체로, 오플록사신 R체와 강하게 반응하는 항체
또한, 대표적인 레보플록사신 병용약과의 교차 반응성을 조사하였지만, 이들에 대한 교차 반응성은 모두 0.1 ％ 미만이었다. 따라서, 각 항체는 모두 대표적인 레보플록사신 병용약에 대하여 반응하지 않는 것으로 판정하였다.
[실시예 3] 혈청에 의한 영향의 평가(경합 ELISA법)
(I) 방법과 절차
(1) 혈청 첨가에 의한 영향
「실시예 1(I)(11) 경합 ELISA법에 의한 본 발명 항체에 대한 혈청 영향의 평가」의 조작 중, 공정(iv)에서의 융합 세포의 배양 상청을 모노클로날 항체(정제 IgG, 0.2 μg/mg)로 바꾼 것 이외에는 동일하게 행하였다. 또한, 반응성 및 교차 반응성도 실시예 1(I)(13)에 따라서 수치화하여 평가하였다.
(2) 미리 유리형 레보플록사신과 인간 혈청을 인큐베이션한 경우의 영향
「실시예 1(I)(12) 미리 유리형 레보플록사신과 인간 혈청을 인큐베이션한 시료를 경합 ELISA법으로 측정한 경우의 영향 평가」의 조작 중, 융합 세포의 배양 상청을 모노클로날 항체(정제 IgG, 0.2 μg/mg)로 바꾼 것 이외에는 동일하게 행하였다. 또한, 반응성 및 교차 반응성도 실시예 1(I)(13)에 따라서 수치화하여 평가하였다.
(II) 결과
(1) 혈청 첨가에 의한 영향
경합 ELISA법의 반응계에 인간 혈청을 공존시켜 항체의 반응성에 미치는 혈청 성분의 영향을 조사하였다. 혈청의 첨가에 의해, 유리형 레보플록사신이 혈청 중의 단백질과 결합하여 결합형 레보플록사신이 되고, 항체의 반응성에 영향을 줄 가능성을 생각할 수 있지만, 모든 항체에 있어서 대조군(혈청비 첨가)과 혈청을 첨가한 경우의 반응성 차는 5 ％ 미만이었다.
(2) 미리 인큐베이션한 유리형 레보플록사신과 인간 혈청의 첨가에 의한 영향
미리 유리형 레보플록사신과 혈청을 인큐베이션하고, 유리형 레보플록사신이 혈청 단백질과 결합한 결합형 레보플록사신으로 변환되도록 한 인간 혈청 시약 b를 경합 ELISA법의 시료로 하여 측정하였다. 경합 ELISA법에 의해 상기 항체의 반응성을 구한 결과, 인큐베이션 시간이 0 분인 경우와 비교하여 인큐베이션 시간 15 분 및 60 분일 때의 반응성 차는 5 ％ 미만이었다.
이상 (1) 및 (2)의 결과로부터, 본 항체는 항원 항체 반응에 있어서 혈청 단백질의 영향을 받지 않는 것을 알았다. 따라서, 본 항체는 혈 중 약물 농도 측정에 이용 가능한 항체이다.
[실시예 4] 본 발명의 항체를 이용한 시료 중의 레보플록사신의 면역학적 측정 방법
(I) 방법과 절차
(1) 시약의 제조
레보플록사신의 분말을 정제수에 용해시켜 1 mmol/L로 하고, 표준품 레보플록사신 용액(표준품 용액)으로 하였다. 상기 표준품 용액은 세럼 튜브에 분주 후, 사용시까지 -80 ℃에서 동결시켜 보존하였다.
(2) 검량선의 제조
(i) 표준품 용액을 1 ％ BSA-PBST로 2 μmol/L부터 0.0625 μmol/L까지 6 단계로 희석하고, 표준 시료로 하였다.
(ii) ELISA용 플레이트에 상기 표준 시료를 25 μL/웰씩 분주하고, 이어서 77206 항체(정제 IgG, 0.1 μg/mL, 1 ％ BSA-PBST)를 25 μL/웰씩 분주하여 실온에서 1 시간 정치하였다.
이후의 조작은 실시예 1(I)(8) 항원 고상화 ELISA법의 공정(ii) 내지 (iv)와 동일하게 행하였다.
(3) 희석 직선성 시험
(i) 표준품 용액을 인간 혈청으로 적당한 농도로 희석하여 레보플록사신 함유 인간 혈청을 3종류 제조하였다.
(ii) 상기 레보플록사신 함유 인간 혈청 각각을 우선 1 ％ BSA-PBST로 11배 희석하고, 이후에 이것을 2배씩 704배까지 희석하여 희석 직선성 시험 시료로 하였다.
(iii) ELISA용 플레이트에 상기 희석 직선성 시험 시료를 25 μL/웰씩 분주하고, 이어서 77206 항체(정제 IgG, 0.1 μg/mL, 1 ％ BSA-PBST)를 25 μL/웰씩 분주하여 실온에서 1 시간 정치하였다.
이후의 조작은 실시예 1(I)(8) 항원 고상화 ELISA법의 공정(ii) 내지 (iv)와 동일하게 행하였다. 측정한 흡광도를 검량선을 이용하여 농도로 환산하고, 혈청 희석률을 x축, 농도 환산값을 y축으로 하는 그래프에 플로팅하였다(또한, x축의 혈청 희석률은 10배 희석을 10/100과 같이 표기함). 또한, 농도 환산값과 혈청 희석률의 상관 계수를 구하였다.
(4) 동시 재현성 시험
(i) 표준품 용액을 1 ％ BSA-PBST로 30 μmol/L, 10 μmol/L, 6 μmol/L로 희석하고, 혈청으로 11배 희석한 후, 이어서 1 ％ BSA-PBST로 2배 희석하여 동시 재현성 시험용 시료(검체 A, 검체 B, 검체 C)로 하였다.
(ii) ELISA용 플레이트에 상기 동시 재현성 시험용 시료를 25 μL/웰씩 분주하고, 이어서 77206 항체(정제 IgG, 0.1 μg/mL, 1 ％ BSA-PBST)를 25 μL/웰씩 분주하여 실온에서 1 시간 정치하였다.
이후의 조작은 실시예 1(I)(8) 항원 고상화 ELISA법의 공정(ii) 내지 (iv)와 동일하게 행하였다. 측정한 흡광도를 검량선을 이용하여 농도로 환산하였다. 각 동시 재현성 시험용 시료에 대하여 각각 8회 측정을 행하고, 측정값의 평균, 표준 편차, 변동 계수를 구하였다.
(5) 첨가 회수 시험
(i) 표준품 용액을 1 ％ BSA-PBST로 적당한 농도로 희석하고, 혈청으로 11배 희석한 후, 이어서 1 ％ BSA-PBST로 2배 희석하여 첨가 회수 시험용 시료로 하였다.
(ii) ELISA용 플레이트에 상기 첨가 회수 시험용 시료를 25 μL/웰씩 분주하고, 이어서 77206 항체(정제 IgG, 0.1 μg/mL, 1 ％ BSA-PBST)를 25 μL/웰씩 분주하여 실온에서 1 시간 정치하였다.
이후의 조작은 실시예 1(I)(8) 항원 고상화 ELISA법의 공정(ii) 내지 (iv)와 동일하게 행하였다. 측정한 흡광도를 검량선을 이용하여 농도로 환산하고, 이론값을 x축, 농도 환산값을 y축으로 하는 그래프에 플로팅하였다. 또한, 농도 환산값과 이론값의 회귀식과 상관 계수를 구하였다.
(II) 결과
(1) 검량선의 제조
표준 시료를 이용하여 0.0625 μmol/L부터 2 μmol/L 범위에서의 검량선을 제조하였다. 상기 범위에서 검량선은 양호한 직선성을 나타내고, 본 발명의 측정 방법을 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물의 정량 측정에 사용할 수 있다는 것이 확인되었다.(도 4).
(2) 희석 직선성 시험
3종류의 희석 직선성 시험 시료의 농도 환산값과 혈청 희석률의 상관 계수는 모두 0.99 이상이고, 양호한 희석 직선성을 나타내었다(도 5). 본 발명의 항체를 사용하면, 시료 유래의 혈청 성분의 영향을 받지 않는 측정계를 구축할 수 있다는 것이 개시되었다.
(3) 동시 재현성 시험
3 농도의 동시 재현성 시험용 시료에 대하여, 동시에 8회 측정을 행한 결과, 모든 시료에서 변동 계수(CV ％) 10 ％ 미만으로 높은 동시 재현성을 나타내었다(표 2).
(4) 기지 농도의 검체 측정
첨가 회수 시험용 시료의 이론값과 농도 환산값의 회귀식은 y=1.078x+0.021이고, 상관 계수는 0.993이었다(도 6). 이상으로부터, 본 발명의 항체를 사용한 측정 방법은 생물 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물의 농도를 정확하게 측정할 수 있다는 것이 확인되었다.
[실시예 5] 생물 유래의 시료가 타액인 경우
(I) 방법과 절차
(1) 시약의 제조
실시예 4(I)(1)에서 제조한 표준품 용액을 사용하였다.
(2) 경합 ELISA법
(i) 1 ％ BSA-PBST로 10 ％, 5 ％, 2 ％ 인간 타액 희석액을 제조하였다.
(ii) 표준품 용액을 각 농도의 인간 타액 희석액으로 0.2 μmol/L로 희석하고, 인간 타액 시료로 하였다. 인간 타액을 포함하지 않는 (0 ％) 시료를 대조군으로 하였다.
(iii) ELISA용 플레이트에 인간 타액 시료를 25 μL/웰씩 분주하였다.
(iv) 이어서, 77201 항체(정제 IgG, 0.2 μg/mL, 1 ％ BSA-PBST)를 25 μL/웰 분주하여 실온에서 1 시간 정치하였다.
이후의 조작은 실시예 1(I)(8) 항원 고상화 ELISA법의 공정(ii) 내지 (iv)와 동일하게 행하였다.
(II) 결과
(1) 생물 유래의 시료가 타액인 경우
측정 시료 중의 타액 농도가 0 ％인 경우와 타액 농도가 10 ％, 5 ％, 2 ％인 경우에, 반응성의 차는 5 ％ 미만이며 타액 성분의 영향을 받지 않았다(도 7). 타액 중에는, 리소자임이나 뮤코 다당 등 면역 반응계를 저해하는 성분이 존재하고, 또한 상기 타액 중의 성분에 의해 유리형 항원 중의 에피토프가 덮혀 버릴 가능성 등을 생각할 수 있었지만, 본 발명의 항체를 사용한 측정 방법은 타액 성분의 영향을 받지 않고 생물 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물의 농도를 정확하게 측정할 수 있다는 것이 확인되었다.
[실시예 6] 혈장에 의한 영향 평가(경합 ELISA법)
혈청보다 함유 단백질의 종류, 양이 많은 혈장의 영향을 검토하였다.
(I) 방법과 절차
(1) 시약의 제조
경합 ELISA법에 이용한 각 화합물의 제조는 실시예 1(I)(9) 시약의 제조와 동일하게 행하였다.
(2) 경합 ELISA법에 의한 혈장 영향의 평가
(i) 1 ％ BSA-PBST로 10 ％ 인간 혈장을 제조하였다.
(ii) 10 ％ 인간 혈장을 이용하여 0.4 μmol/L, 0.2 μmol/L, 0.01 μmol/L 레보플록사신을 제조하여, 인간 혈장 시약 a라 하였다. 대조군 시약으로서, 1 ％ BSA-PBST를 이용하여 0.4 μmol/L, 0.2 μmol/L, 0.01 μmol/L 레보플록사신을 제조하였다.
(iii) ELISA용 플레이트에 인간 혈장 시약 a 또는 대조군 시약을 25 μL/웰씩 분주하였다.
(iv) 이어서, 77206 항체(정제 IgG, 0.2 μg/mL, 1 ％ BSA-PBST)를 분주하여 실온에서 1 시간 정치하였다.
이후의 조작은 실시예 1(I)(8) 항원 고상화 ELISA법의 공정(ii) 내지 (iv)와 동일하게 행하였다.
(II) 결과
(1) 혈장 첨가에 의한 영향
혈장의 첨가에 의해 유리형 항원이 혈장 단백질과 결합하여 결합형 항원이 되고, 경합 반응이 저해될 것으로 예상되었지만, 모든 항체에 있어서 대조군(혈장 비첨가)과 혈장을 첨가한 경우의 반응성 차는 5 ％ 미만이었다(도 8). 본 항체는 항원 항체 반응에서 혈장 단백질의 영향을 받지 않고, 혈 중 약물 농도 측정에 이용 가능한 항체이다.
[비교예]
(1) 종래 항체의 성질(혈장 성분의 영향)
(I) 방법과 절차
특허문헌 2에 기재된 방법을 일부 개변하여 실시하였다.
(i) 96웰 플레이트에 0.1 mol/L 탄산 완충액(pH 9.5)으로 20 μg/mL로 제조한 염소 항 토끼 IgG를 100 μL/웰 첨가하고, 실온에서 2 시간 인큐베이션하여 1차 항체를 고상화한 후, 플레이트를 세정액(0.05 ％ 트윈20, 50 mmol/L 트리스-HCl, pH 7.4)으로 3회 세정하였다.
(ii) 다음에, 1 ％ BSA를 포함하는 50 mmol/L 트리스-HCl 완충액(pH 7.4) 300 μL/웰을 첨가하여 실온에서 2 시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 세정액으로 3회 세정하였다.
(iii) 다음에, 0.5 ％ BSA를 포함하는 50 mmol/L 트리스-HCl 완충액(EIA 완충액)으로 적절한 농도로 희석한 항 레보플록사신 토끼 항 혈청을 첨가하여 실온에서 2 시간 인큐베이션하고, 상기 항 레보플록사신 토끼 항 혈청 중의 항레보플록사신 항체를 1차 항체에 포착시켰다. 그 후, 플레이트를 세정액으로 3회 세정하였다.
(iv) 또한, 각 웰에 EIA 완충액으로 50배 희석한 알칼리 포스파타제 표지 항원 50 μL와 10 ％ 인간 혈장을 포함하는 EIA 완충액 또는 인간 혈장을 포함하지 않는 EIA 완충액으로 희석한 10 μg/mL 레보플록사신 용액 50 μL를 첨가하여 실온에서 2 시간 인큐베이션하였다.
(v) 플레이트를 세정액으로 3회 세정하고, p-니트로페닐ㆍ포스페이트 기질액을 100 μL 첨가하여 실온에서 30 분간 인큐베이션한 후, 1.6 mol/L 수산화나트륨 용액 25 μL를 첨가하여 반응을 정지시키고, 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
(II) 결과
혈장이 첨가되어 있는 시료의 반응성은 혈장 비첨가 시료의 반응성의 약 2배가 되었다(도 9). 이것은, 혈장 단백질이 유리형 레보플록사신과 결합하여 결합형 레보플록사신이 된 것에 의해, 항체가 레보플록사신 중의 에피토프를 인식할 수 없어진 결과, 경합 반응이 저해되었기 때문이라고 생각된다. 한편, 반응액 중의 효소 표지 항원에 대해서는, 항원에 결합되어 있는 표지 효소가 혈장 단백질과 레보플록사신의 결합을 방해하기 때문에, 항원 항체 반응에 영향을 주지 않았다고 생각된다.
[실시예 7] 경합 ELISA법 별법(1 스텝 경합 ELISA법)
실시예 1(I)(8) 항원 고상화 ELISA법의 공정에 기재된 경합 ELISA법은, 항체를 미리 HRP 표지함으로써 검출을 1 스텝으로 행하는 하기의 방법으로 실시하는 것도 가능하다.
(I) 방법과 절차
(1) HRP 표지 항체의 제조
(i) 7종류의 모노클로날 항체, 항체 77201, 77202, 77204, 77205, 77206, 77207, 77209를 4 ℃에서 2 일간, 0.1 mol/L 탄산수소나트륨 완충액(pH 9.3) 중에서 투석을 행하였다. 투석 후에 액을 회수하고, 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 항체 농도를 확인하였다.
(ii) HRP(도요보, PEO-301) 50 mg을 5 mmol/L 아세트산 완충액(pH 4.5) 5 mL에 용해시켰다. 여기에 과요오드산나트륨 수용액(100 mg/mL)을 21.5 μL 첨가하고, 차광 조건하에 실온에서 30 분간 정치하였다.
(iii) 계속해서 PD-10 칼럼(아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences), 17-0851-01)(용출액으로서 5 mM 아세트산 완충액(pH 4.5)을 사용)을 이용하여 정제하고, 진녹색 용액 분획을 회수하였다. 본 용액에 포함되는 활성화 HRP의 농도를 280 nm의 흡광도를 측정함으로써 확인하였다.
(iv) (i)에서 제조한 항체 및 (iii)에서 제조한 활성화 HRP를, 0.1 mol/L 탄산수소나트륨 완충액(pH 9.3)을 이용하여 1 mg/mL로 희석하였다. 두 용액을 250 μL씩 혼화하고, 차광 조건하에 실온에서 1 시간 정치하였다.
(v) 수소화붕소나트륨 수용액(2 mg/mL)을 10 μL 첨가하고, 차광 조건하에 실온에서 15 분간 정치하였다.
(vi) 계속해서 포화 황산암모늄 수용액을 510 μL 첨가하고, 차광 조건하에 얼음 상에서 1 시간 정치하였다.
(vii) 얻어진 용액을 4 ℃, 10000 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 항체 펠릿을 얻었다.
(viii) 상기 항체 펠릿을 PBS(pH 7.2) 500 μL를 이용하여 재용해시키고, 또한 4 ℃에서 2 일간, PBS(pH 7.2) 중에서 투석을 행하였다.
(ix) 투석 후의 액을 회수하여 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 HRP 표지 항체의 농도를 확인하였다.
(2) 1 스텝 경합 ELISA법
(i) ELISA용 플레이트에, 실시예 1(I)(9) 경합 ELISA법에 이용하는 화합물 용액의 제조와 동일한 방법으로 제조한 각 농도의 레보플록사신 용액을 25 μL/웰씩 분주하였다.
(ii) 이어서, 상기 (1) HRP 표지 항체의 제조에서 제조한 HRP 표지 항체를 1 ％ BSA-PBST로 70배 내지 3500배 희석한 항체액을 25 μL/웰씩 분주하여 실온에서 1 시간 정치하였다.
이후의 조작은 실시예 1(I)(8) 항원 고상화 ELISA법의 공정(iii) 내지 (iv)와 동일하게 행하였다.
(II) 결과
단백질과 결합하지 않은 유리형 레보플록사신을 1 스텝 경합 ELISA법의 반응계에 공존시켜 고상화 항원과 경합시킨 결과, 모든 HRP 표지 항체에 있어서 반응계로의 레보플록사신의 첨가량에 따라서 고상화 항원에 대한 HRP 표지 항체의 반응량이 저하되었다(도 10). 따라서, 본 실시예에 나타낸 1 스텝 경합 ELISA법은 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물의 면역학적 측정 방법으로서 유용하다고 생각되었다.
[실시예 8] 라텍스 응집 저해법(항체 고상화 라텍스계)
본 실시예는 본 발명(20),
「고상에 고정화된 본 발명(1) 내지 본 발명(11) 중 어느 한 항에 기재된 항체에 대하여, 합성 다가 항원 및 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물을 경합적으로 반응시키는 것을 특징으로 하는, 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물의 면역학적 측정 방법.」
에 대응하는 것으로서, 입자 응집 저해법의 하나인 라텍스 응집 저해법(항체 고상화 라텍스계)에 대하여 시험한 것이다.
(I) 방법과 절차
(1) 시약의 제조
(i) 실시예 1(I)(1) 면역용 항원 및 스크리닝용 항원의 제조에 기재한 방법으로 제조한 LVFX-BSA(결합비 18)를 1.0 μg/mL가 되도록, 20 mmol/L 트리스 완충액(pH 7.0, 500 mmol/L 염화나트륨, 1 ％ BSA를 포함함)으로 희석하여 제1 시약으로 하였다. 상기 제1 시약은 상기 본 발명(20) 중의 「고상에 고정화된 본 발명(1) 내지 본 발명(11) 중 어느 한 항에 기재된 항체」를 포함하는 것이다.
(ii) 모노클로날 항체 77209를 0.8 mg/mL 포함하는 20 mmol/L 트리스 완충액(pH 8.5) 1.5 mL에, 평균 입경 약 200 nm의 1 ％ 라텍스(세키스이 가가꾸 고교사 제조) 현탁액을 1.5 mL 첨가하고, 4 ℃에서 2 시간 교반하였다. 계속해서 0.1 ％ BSA를 포함하는 20 mmol/L 트리스 완충액(pH 8.5) 3.0 mL를 첨가하고, 4 ℃에서 1 시간 교반하였다. 4 ℃, 13000 rpm에서 35 분간 원심 후, 상청을 제거하고, 제거량과 등량인 5 mmol/L MOPS 완충액(pH 7.0, 0.1 ％ BSA를 포함함)으로 재현탁시켰다. 초음파 분산(닛세이 울트라소닉 제너레이터(Ultrasonic Generater))을 행한 후, 얻어진 용액을 50 ℃에서 1 시간 가열하였다. 냉각 후, 파장 600 nm에서의 흡광도가 3 Abs가 되도록, 5 mmol/L MOPS 완충액(pH 7.0)으로 희석하여 제2 시약으로 하였다.
(iii) 실시예 1(I)(9) 경합 ELISA법에 이용하는 화합물 용액의 제조와 동일한 방법으로 농도 0.0 μg/mL, 1.0 μg/mL, 2.5 μg/mL, 5.0 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL의 레보플록사신 수용액을 제조하였다. 또한 별도로, 실시예 1(I)(9) 경합 ELISA법에 이용하는 화합물 용액의 제조와 동일한 방법으로 농도 0.0 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL, 200 μg/mL의 진한 레보플록사신 표준품 용액을 제조하였다. 상기 진한 레보플록사신 표준품 용액을 인간 혈청, 인간 혈장 또는 인간 타액으로 10배 희석하여 레보플록사신 농도 0.0 μg/mL, 1.0 μg/mL, 2.5 μg/mL, 5.0 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL의 레보플록사신 함유 인간 혈청, 인간 혈장 또는 인간 타액을 제조하였다.
(2) 측정 절차
범용형 히타치 7170S형 자동 분석 장치를 이용하여 각 레보플록사신 용액을 측정하였다. 구체적으로는 각 시료액 2.5 μL에 제1 시약 150 μL를 첨가 후 37 ℃에서 5 분간 가온하고, 추가로 제2 시약 150 μL를 첨가한 후, 37 ℃ 가온하에 측광(測光) 포인트 19 내지 34에서의 600 nm에서의 흡광도 변화량을 측정하였다.
(II) 결과
우선, 상기 레보플록사신 수용액을 측정하여 각 레보플록사신 농도에 대한 흡광도 변화량을 플로팅하였다(도 11). 반응계로의 레보플록사신의 첨가량에 따라서 흡광도가 저하되었다. 계속해서 스플라인 함수를 이용하여 검량선을 제조한 후, 각 농도의 상기 레보플록사신 함유 인간 혈청 또는 인간 혈장을 측정하고, 검량선으로부터 측정값을 계산하였다. 본 측정 범위에서 레보플록사신 용액 농도의 이론값과 측정값은 양호한 상관을 나타내었다(도 12, 13). 한편, 상기 레보플록사신 함유 타액을 측정하여 각 레보플록사신 농도에 대한 흡광도 변화량을 플로팅하였다. 반응계로의 레보플록사신의 첨가량에 따라서 흡광도가 저하되었다(도 14).
이상으로부터, 본 실시예에 나타낸 항체 고상화 라텍스를 사용한 라텍스 응집 저해법은, 혈청, 혈장, 타액 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물의 정량 측정에 사용할 수 있다는 것이 확인되었다.
[실시예 9] 라텍스 응집 저해법(항원 고상화 라텍스계)
본 실시예는 본 발명(21),
「본 발명(1) 내지 본 발명(11) 중 어느 한 항에 기재된 항체에 대하여, 고상화 합성 다가 항원 및 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물을 경합적으로 반응시키는 것을 특징으로 하는, 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물의 면역학적 측정 방법.」
에 대응하는 것으로서, 입자 응집 저해법의 하나인 라텍스 응집 저해법(항원 고상화 라텍스계)에 대하여 시험한 것이다.
(I) 방법과 절차
(1) 시약의 제조
(i) 모노클로날 항체 77206을 5.2 mg/mL가 되도록 5 mmol/L MOPS 완충액(pH 7.0)으로 희석하여, 제1 시약으로 하였다.
(ii) 실시예 1(I)(1) 면역용 항원 및 스크리닝용 항원의 제조에 기재한 방법으로 제조한 LVFX-BSA(결합비 3)를 20 μg/mL 포함하는 10 mmol/L 시트르산-인산수소이나트륨 완충액(pH 5.5, 0.8 ％ BSA를 포함함) 3.0 mL에, 평균 입경 약 210 nm의 1 ％ 라텍스(세키스이 가가꾸 고교사 제조) 현탁액을 3.0 mL 첨가하여, 4 ℃에서 2 시간 교반하였다. 4 ℃, 13000 rpm에서 30 분간 원심 후, 상청을 제거하고, 제거량과 등량인 5 mmol/L MOPS 완충액(pH 7.0, 0.1 ％ BSA를 포함함)으로 재현탁시켰다. 초음파 분산을 행한 후, 얻어진 용액을 파장 280 nm에서의 흡광도가 1.1 Abs가 되도록 5 mmol/LMOPS 완충액(pH 7.0)으로 희석하여, 제2 시약으로 하였다. 상기 제2 시약은 상기 본 발명(21) 중의 「(b) 화학식 I로 표시되는 화합물을 함유하는 항원 담체 복합물을 고상에 2 분자 이상 고정화한 합성 다가 항원」을 포함하는 것이다.
(iii) 실시예 1(9) 경합 ELISA법에 이용하는 화합물 용액의 제조와 동일한 방법으로 농도 0.0 μg/mL, 5.0 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL의 레보플록사신 수용액을 제조하였다.
(2) 측정 절차
범용형 히타치 7170S형 자동 분석 장치를 이용하여 각 농도의 레보플록사신 수용액을 측정하였다. 구체적으로는, 제1 시약 20 μL에 각 농도의 레보플록사신 수용액 4 μL를 첨가 후 37 ℃에서 5 분간 가온하고, 이어서 제2 시약 180 μL를 첨가한 후, 37 ℃, 측광 포인트 19 내지 34에서 700 nm에서의 흡광도 변화량을 측정하였다.
(II) 결과
레보플록사신 수용액을 측정하여 각 레보플록사신 농도에 대한 흡광도 변화량을 플로팅하였다. 본 측정 범위에서 플롯 근사식은 양호한 직선성을 나타내고, 본 발명의 측정 방법을 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물의 정량 측정에 사용할 수 있다는 것이 확인되었다(도 15).
[실시예 10] 라텍스 응집 저해법(항체 고상화 라텍스계)에서의 합성 다가 항원(결합비)의 검토
본 실시예는 본 발명(20),
「고상에 고정화된 본 발명(1) 내지 본 발명(11) 중 어느 한 항에 기재된 항체에 대하여, 합성 다가 항원 및 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물을 경합적으로 반응시키는 것을 특징으로 하는, 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물의 면역학적 측정 방법.」
에 있어서 「합성 다가 항원」 중의 오플록사신 결합비를 검토한 것이다.
(I) 방법과 절차
(1) 시약의 제조
실시예 1(I)(1) 면역용 항원 및 스크리닝용 항원의 제조에 기재된 방법에서의 레보플록사신 용액으로서 2.2, 5.4, 8.7, 11.9, 15.2, 18.4, 21.7 mg/2 mL의 용액을 사용하여 BSA와의 커플링 반응을 행하였다. 얻어진 커플링물의 LVFX-BSA 결합비를 실시예 1(I)(1)(v)의 흡광도 측정에 의해 구하였다.
(2) 측정 절차
각 LVFX-BSA를 각각 합성 다가 항원으로서 이용하여 실시예 8(I) 라텍스 응집 저해법(항체 고상화 라텍스계)에 기재된 방법으로, 검체로서 실시예 1(I)(9) 경합 ELISA법에 이용하는 화합물 용액의 제조와 동일한 방법으로 제조한 농도 0.0 μg/mL, 16.0 μg/mL의 레보플록사신 수용액을 측정하였다. 계속해서 레보플록사신 농도 0.0 μg/mL, 16.0 μg/mL의 경우의 각 반응의 흡광도차를 계산하였다. 결합비에 대한 그래프를 작성하였다.
(II) 결과
얻어진 커플링물의 결합비를, 사용한 레보플록사신 용액 농도(mg/2 mL) ⇒ 결합비의 형식으로 나타내면 이하였다. 2.2 ⇒ 3.9, 5.4 ⇒ 5.0, 8.7 ⇒ 6.2, 11.9 ⇒ 8.1, 15.2 ⇒ 10.2, 18.4 ⇒ 13.0, 21.7 ⇒ 16.7. 이로부터 BSA 캐리어 1 분자와 반응시키는 LVFX량에 의존하고, LVFX-BSA 결합비가 증가하는 것이 확인되었다(도 16).
다음에, 레보플록사신 농도 0.0 μg/mL와 16.0 μg/mL의 경우의 흡광도의를 구하여 결합비에 대한 그래프를 작성한 결과, LVFX-BSA의 결합비 상승과 함께 흡광도차도 커졌다. 라텍스 응집 저해법에 있어서는, 시료 중의 항원비 존재(농도 0)의 경우의 흡광도와 시료 중에 항원이 존재하는 경우의 흡광도차가 클수록, 시료 중의 항원을 고감도로 측정할 수 있다고 말할 수 있다. 본 실시예의 조건에서는, 결합비가 8 내지 15인 경우에 양호한 감도가 얻어지고, 결합비 15 이상에서는 더욱 양호한 것을 알았다(도 17).
본 발명은 오플록사신에 대한 항체 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이들의 항체를 이용한 면역 분석법, 예를 들면 방사 면역 분석법, 효소 면역 분석법이나 입자 응집 저해 면역 분석법 등에 관한 것이다. 본 발명을 이용함으로써 강력한 항균제인 오플록사신의 체내 존재량을 임상 현장에서 신속하면서 정확하게 측정하는 것이 가능하다.
[기탁 생물 재료에 대한 언급]
(1) 항체 번호 77201
가. 상기 생물 재료를 기탁한 기탁 기관의 명칭 및 주소
독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터
일본국 이바라키켕 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 1 쥬오다이6(우편 번호 305-8566)
나. 가의 기탁 기관에 생물 재료를 기탁한 날짜
2007년 9월 11일(원기탁일)
2008년 9월 5일(원기탁에 의해 부다페스트 조약에 기초하는 기탁에의 이관일)
다. 가의 기탁 기관이 기탁에 대하여 부여한 수탁 번호
FERM BP-11010
(2) 항체 번호 77202
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2008년 9월 5일(원기탁에 의해 부다페스트 조약에 기초하는 기탁에의 이관일)
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(3) 항체 번호 77204
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2008년 9월 5일(원기탁에 의해 부다페스트 조약에 기초하는 기탁에의 이관일)
다. 가의 기탁 기관이 기탁에 대하여 부여한 수탁 번호
FERM BP-11012
(4) 항체 번호 77205
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2007년 9월 11일(원기탁일)
2008년 9월 5일(원기탁에 의해 부다페스트 조약에 기초하는 기탁에의 이관일)
다. 가의 기탁 기관이 기탁에 대하여 부여한 수탁 번호
FERM BP-11013
(5) 항체 번호 77206
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일본국 이바라키켕 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 1 쥬오다이6(우편 번호 305-8566)
나. 가의 기탁 기관에 생물 재료를 기탁한 날짜
2007년 9월 11일(원기탁일)
2008년 9월 5일(원기탁에 의해 부다페스트 조약에 기초하는 기탁에의 이관일)
다. 가의 기탁 기관이 기탁에 대하여 부여한 수탁 번호
FERM BP-11014
(6) 항체 번호 77207
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2007년 9월 11일(원기탁일)
2008년 9월 5일(원기탁에 의해 부다페스트 조약에 기초하는 기탁에의 이관일)
다. 가의 기탁 기관이 기탁에 대하여 부여한 수탁 번호
FERM BP-11015
(7) 항체 번호 77209
가. 상기 생물 재료를 기탁한 기탁 기관의 명칭 및 주소
독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터
일본국 이바라키켕 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 1 쥬오다이6(우편 번호 305-8566)
나. 가의 기탁 기관에 생물 재료를 기탁한 날짜
2007년 9월 11일(원기탁일)
2008년 9월 5일(원기탁에 의해 부다페스트 조약에 기초하는 기탁에의 이관일)
다. 가의 기탁 기관이 기탁에 대하여 부여한 수탁 번호
FERM BP-11016
<도면의 간단한 설명>
도 1은 항원 고상화 ELISA법으로 마우스 항 혈청 중의 항체가를 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 유리형 레보플록사신의 첨가량과 마우스 항 혈청 중 항체의 고상화 항원에의 반응량(Abs.)의 관계를 경합 ELISA법으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 유리형 레보플록사신의 첨가량과 각 모노클로날 항체의 고상화 항원에의 반응성 관계(교차율)를 경합 ELISA법으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 표준품을 이용한 경합 ELISA법에 의한 검량선을 나타낸다.
도 5는 각 혈청 첨가 농도에서의 희석 직선성 시험의 결과를 나타낸다.
도 6은 기지 농도의 검체를 이용한 경합 ELISA법에 의한 측정값과 이론값의 상관 관계를 나타낸다.
도 7은 경합 ELISA법 측정계에의 타액 첨가의 영향을 조사한 결과를 나타낸다.
도 8은 경합 ELISA법 측정계에의 혈장 첨가의 영향을 조사한 결과를 나타낸다.
도 9는 종래 항체를 이용한 경합 ELISA법 측정계에의 혈장 첨가의 영향을 조사한 결과를 나타낸다.
도 10은 표준품을 이용한 1 스텝 경합 ELISA법에 의한 검량선을 나타낸다.
도 11은 표준품을 이용한 라텍스 응집 저해법(항체 고상화 라텍스계)에 의한 검량선을 나타낸다.
도 12는 기지 농도의 레보플록사신 함유 인간 혈청을 이용한 라텍스 응집 저해법(항체 고상화 라텍스계)에 의한 측정값과 이론값의 상관 관계를 나타낸다.
도 13은 기지 농도의 레보플록사신 함유 인간 혈장을 이용한 라텍스 응집 저해법(항체 고상화 라텍스계)에 의한 측정값과 이론값의 상관 관계를 나타낸다.
도 14는 라텍스 응집 저해법(항체 고상화 라텍스계)에 의해 측정한, 기지 농도의 레보플록사신 함유 타액 중의 레보플록사신 농도와 흡광도 변화의 상관 관계를 나타낸다.
도 15는 표준품을 이용한 라텍스 응집 저해법(항원 고상화 라텍스계)에 의한 검량선을 나타낸다.
도 16은 캐리어로서 BSA를 이용하여 합성 다가 항원을 제조하였을 때의, 원료로서 이용한 레보플록사신의 양과 BSA에의 결합비의 상관 관계를 나타낸다.
도 17은 라텍스 응집 저해법(항체 고상화 라텍스계)에 의해 측정한 BSA에의 레보플록사신 결합비와, 검체 중의 레보플록사신량이 0.0 μg/mL 및 16.0 μg/mL였던 경우의 흡광도차의 상관 관계를 나타낸다.
Claims (27)
- 하기 화학식 I로 표시되는 화합물과 반응하고, 그의 대사물인 N-옥시드체 및/또는 탈메틸체와 교차 반응하지 않는 항체.
<화학식 I>
- 제1항에 있어서, 화학식 I로 표시되는 화합물의 S체에 강하게 반응하는 항체인 항체.
- 제1항에 있어서, 화학식 I로 표시되는 화합물의 R체에 강하게 반응하는 항체인 항체.
- 제1항에 있어서, 화학식 I로 표시되는 화합물의 라세미체에 강하게 반응하는 항체인 항체.
- 제1항에 있어서, 디클로페낙나트륨, 나부메톤, 플루르비프로펜, 케토프로펜, 록소프로펜나트륨, 옥사프로진, 나프록센, 이부프로펜, 카르보시스테인, 살리실아미드, 아세트아미노펜, 무수 카페인, 메틸렌디살리실산, 프로메타진 및 테오필린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과 교차 반응하지 않는 항체.
- 제1항에 있어서, 화학식 I로 표시되는 화합물을 제외한 뉴퀴놀론계 항균제와 교차 반응하지 않거나 또는 교차 반응성이 약한 항체.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I로 표시되는 화합물과의 반응성이 생물 시료 유래 성분의 공존에 의해 변화되지 않는 항체.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 생물 시료 유래 성분이 혈청 성분, 혈장 성분 또는 타액 성분인 항체.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I로 표시되는 화합물과의 반응성이 화학식 I로 표시되는 화합물과 혈청 성분의 결합에 의해 변화되지 않는 항체.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
- 제10항에 있어서, 화학식 I로 표시되는 화합물에 특이적인 모노클로날 항체이며, 고상에 고정화된 상기 화합물과 상기 항체와의 면역 반응이 저해되도록 시료 중의 상기 화합물 및 시료 중의 상기 화합물의 N-옥시드체 및/또는 탈메틸체가 존재하는 반응계에서, 상기 시료 중의 상기 화합물에 의한 면역 반응의 50 ％ 저해 활성이, 시료 중의 상기 화합물의 N-옥시드체 및/또는 탈메틸체에 의한 상기 면역 반응의 50 ％ 저해 활성과 비교하여 커지는 반응 조건을 만족하는 모노클로날 항체.
- 제10항 또는 제11항에 기재된 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
- 화학식 I로 표시되는 화합물의 6 위치의 카르복시기를 통해 캐리어 단백질과 결합시킨, 제1항에 기재된 항체를 제조하기 위한 항원.
- 제13항에 있어서, 캐리어 단백질이 BSA 또는 트랜스페린인 항원.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 화학식 I로 표시되는 화합물이 캐리어 단백질 1 분자당 12 내지 14 분자 결합되어 있는 항원.
- 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 항원을 동물에 면역시키는 것을 특징으로 하는 면역 방법.
- 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 항원을 동물에 면역시켜 얻어진 항체를, 교차 반응성을 확인하고자 하는 화합물의 존재하에서 고상에 고정화된 화학식 I로 표시되는 화합물과 반응시켜, 교차 반응성을 확인하고자 하는 화합물의 비존재하에서의 반응성과 비교함으로써 원하는 항체를 선발하는 항체의 스크리닝 방법.
- 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 항원을 동물에 면역시켜 얻어진 항체를, 생물 시료 유래 성분의 존재하에서 고상에 고정화된 화학식 I로 표시되는 화합물과 반응시켜, 생물 시료 유래 성분의 비존재하에서의 반응성과 비교함으로써 원하는 항체를 선발하는 항체의 스크리닝 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물의 면역학적 측정 방법.
- 고상에 고정화된 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 항체에 대하여, 합성 다가 항원 및 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물을 경합적으로 반응시키는 것을 특징으로 하는, 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물의 면역학적 측정 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 항체에 대하여, 고상화 합성 다가 항원 및 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물을 경합적으로 반응시키는 것을 특징으로 하는, 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물의 면역학적 측정 방법.
- 고상에 고정화된 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 항체에 대하여, 고상화 합성 다가 항원 및 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물을 경합적으로 반응시키는 것을 특징으로 하는, 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물의 면역학적 측정 방법.
- 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 고상이 라텍스 입자인 면역학적 측정 방법.
- 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 경합 반응을 응집 저해법에 의해서 측정하는 것을 특징으로 하는 면역학적 측정 방법.
- 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 시료가 생물 유래의 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 타액, 객담, 눈물, 이루 또는 전립선액인 면역학적 측정 방법.
- 제25항에 있어서, 시료가 화학식 I로 표시되는 화합물을 투여한 환자의 시료인 면역학적 측정 방법.
- 하기 (a) 및 (b)로 구성되는 것을 특징으로 하는, 시료 중의 화학식 I로 표시되는 화합물의 면역학적 측정용 시약.
(a) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 고상에 고정화된 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 항체
(b) 합성 다가 항원 또는 고상화 합성 다가 항원
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