JP7365063B2 - 血中レボフロキサシン濃度測定方法 - Google Patents
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Description
1%HSA溶液を浸漬させた濾紙上にナイロン膜(0.45μm Nylon transfer membrane)を載せ、3分間静置した後に、ナイロン膜を濾紙上から取出してドライヤーを用いて乾燥させた。ここで、1%HSA溶液は、HSA(ヒト血清アルブミン)をりん酸緩衝液(PBS)に溶解して1%に調整した。
次に、異なる濃度(100,200,400,800ng/mL)のレボフロキサシン水溶液それぞれと、2%EDC溶液と、1%NHS溶液とを、チューブ内で混合し、5分間静置して、レボフロキサシン濃度が異なる混合液を作製した。ここで、レボフロキサシン水溶液は、レボフロキサシンを超純水に溶解して所望の濃度に調整した。2%EDC溶液は、EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)をりん酸緩衝液に溶解して2%に調整した。1%NHS溶液は、NHS(N-hydroxysuccinimide)をりん酸緩衝液に溶解して1%に調整した。
次に、工程1で乾燥させたナイロン膜の上に、工程2で作製した各混合液と、ポジティブコントロールと、ネガティブコントロールを2μLずつ、それぞれ3点ずつブロット(滴下)し、その後30分間静置した。ここで、ポジティブコントロールとしては、レボフロキサシンとヒト血清アルブミンとの複合体を超純水に溶解して10μg/mLに調整したものを用いた。また、ネガティブコントロールとしては、超純水を用いた。
次に、2%EDC溶液と1%NHS溶液との混合液に浸漬させた濾紙上に工程3のナイロン膜を載せ、10分間静置した。
次に、工程4のナイロン膜をウォッシング溶液で振とう洗浄(5分間X3回)した後に、ブロッキング溶液中で30分間振とうした。ここで、ウォッシング溶液は、TBS-T(Tris Buffered Saline with Tween20)を用い、ブロッキング溶液は、5%スキムミルク/TBS-T溶液を用いた。
工程5のナイロン膜をウォッシング溶液で振とう洗浄(5分間X3回)した後に、一次抗体溶液中で60分間振とうした。ここで、一次抗体溶液としては、5mg/mLの抗レボフロキサシン抗体(LVFX-mAb)を5%BSA(Bovine Serum Albumin)/TBS-T溶液に1000倍希釈したものを用いた。
工程6のナイロン膜をウォッシング溶液で振とう洗浄(5分間X3回)した後に、二次抗体溶液中で60分間振とうした。ここで、二次抗体溶液としては、アルカリホスファターゼ標識抗マウスIgG抗体をブロッキング溶液に1000倍希釈したものを用いた。
工程7のナイロン膜をウォッシング溶液で振とう洗浄(5分間X3回)した後に、BCIP-NBT(ブロモクロロインドリルりん酸-ニトロブルーテトラゾリウム)混合溶液で20分間振とうした。
工程8のナイロン膜をイオン交換水ですすいでBCIP-NBT混合溶液を洗い流した後に、ナイロン膜上の発色を確認した。
工程9のナイロン膜上の各発色を画像解析ソフトを用いて発色とレボフロキサシン濃度との相関を調べた。ここでは、ナイロン膜上の各発色を撮影した画像から各発色の密度を数値化し、No.2~No.5で示す各レボフロキサシン濃度の発色密度からNo.6で示すネガティブコントロールの発色密度を引いた値を各レボフロキサシン濃度の真の発色密度とし、最大濃度のレボフロキサシンの発色密度との相対的な比(相対発色密度比)を求めた。なお、画像解析ソフトとしては、市販のものを用いることができる。また、発色とレボフロキサシン濃度との相関が求められればよく、発色密度に限られず輝度や彩度や明度などを用いてもよい。
Claims (2)
- ナイロン膜の上で異なる濃度のレボフロキサシンとヒト血清アルブミンとの複合体に抗レボフロキサシンモノクローナル抗体を結合させた後に、アルカリホスファターゼ標識IgG抗体とブロモクロロインドリルりん酸-ニトロブルーテトラゾリウムを反応させ、発色とレボフロキサシンの濃度とが線形的に相関する範囲における線形近似式を求めておき、
ナイロン膜の上で血液検体に抗レボフロキサシンモノクローナル抗体を結合させた後に、アルカリホスファターゼ標識IgG抗体とブロモクロロインドリルりん酸-ニトロブルーテトラゾリウムを反応させ、得られた発色に基づいて血中のレボフロキサシンの濃度を発色とレボフロキサシンの濃度とが線形的に相関する範囲内で前記線形近似式を用いて測定することを特徴とする血中レボフロキサシン濃度測定方法。 - 測定範囲を200ng/mL~800ng/mLとしたことを特徴とする請求項1に記載の血中レボフロキサシン濃度測定方法。
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JP2021113543A JP7365063B2 (ja) | 2021-07-08 | 2021-07-08 | 血中レボフロキサシン濃度測定方法 |
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WO2009075376A1 (ja) | 2007-12-13 | 2009-06-18 | Sekisui Medical Co., Ltd. | 抗オフロキサシンモノクローナル抗体、これを用いたオフロキサシンの免疫学的測定方法 |
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Non-Patent Citations (3)
Title |
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大磯 茂 ほか,抗レボフロキサシンモノクローナル抗体の作製およびレボフロキサシンELISAの開発,第26回日本医療薬学会年会講演要旨集,2016年,P1228-19-AM |
是枝 亜子 ほか,抗クロロキンモノクローナル抗体を用いた免疫学的簡易検出システム,日本法医学雑誌,2004年,Vol.58, No.1,Page.79 |
浜田 祐成 ほか,ナイロン膜を用いたドットブロット法によるダビガトラン濃度の高感度簡易測定法の開発,日本薬学会年会要旨集,2019年,21PO-pm342S |
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