DE69427122T2

DE69427122T2 - Kompetitiver immunotest unter verwendung eines bindenden proteins in multiklonaler antikoerperstruktur

Info

Publication number: DE69427122T2
Application number: DE69427122T
Authority: DE
Inventors: J. Beggs; J. Hawksworth; J. Herrmann; C. Hsu; S. Pinkus; J. Sohn
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1993-02-24
Filing date: 1994-02-24
Publication date: 2002-01-03
Anticipated expiration: 2014-02-25
Also published as: DE69427122D1; EP0686263A1; EP0686263A4; AU6176594A; ES2157979T3; CA2156736A1; US5434087A; EP0686263B1; CA2156736C; WO1994019695A1; JPH08507603A; JP3392868B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft spezifische Bindungsassays, in denen bindende Proteine, welche spezifisch sind für einer.
Analyten in einer Probe, durch Antikörper gebunden werden. Diese Antikörper sind spezifisch für unterschiedliche Epitope des bindenen Proteins und können angeheftet werden an entweder lösliche oder unlösliche Materialien, welche Trennverfahren vereinfachen.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Diese Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur Bestimmung des Vorhandenseins eines Liganden in einem flüssigen Medium basierend auf der Affinität des Liganden für einen spezifischen Bindungspartner. Insbesondere betrifft diese Erfindung Verfahren und Vorrichtungen zur Verwendung in spezifischen Blndungsassays, welche keine radioaktiven Materialien verwenden.
Folsäuremangelzustände im menschlichen Körper sind ein üblicher Auslöser einer megaloblastären Anämie. Bei Menschen wird Folsäure zu Tetrahydrofolsäure metabolisiert und in der Folge zu 5-Methyltetrahydrofolsäure (5'-mTHF). Oft wird die Konzentration von 5'-mTHF gemessen unter Verwendung eines kompetitiven Bindungsassays. Es wäre nützlich, 5'-mTHF, welches in den Standardreagenzien verwendet wird, als einen Kalibraror einzubeziehen. Unglücklicherweise ist 5'-mTHF sehr instabil und seine Verwendung kann es erforderlich machen, das Material in lyophilisierter Form zu versiegeln.
US Patent 4,350,659 von Riceberg von Corning Glass Works beschrieb ein Verfahren zur Stabilisierung von 5'-mTHF durch Komplexbildung mit einem bindenden Protein wie beispielsweise Folat-bindendes Protein (FBP). Der Komplex wird dann eingefroren und lyophilisiert, um ein trockenes Pulver zu ergeben. Die empfohlene Lagerung des Pulvers umfaßt luftdichte and lichtbeständige Behälter. Die Lypholisation ermöglicht die Lagerung von 5'mTHF in einer stabilen Form, bis zu dem Zeitpunkt, wo es benötigt wird. Solche Techniken sind unpraktisch bei der Herstellung von Assaytestsätzen und machen den Einsatz in klinischen Laborbedingungen schwierig. Darüber hinaus können nach der Rekonstitution des lypholisierten Materials Instabilitätsprobleme erneut auftreten.
Vitamin-B&sub1;&sub2;-Mangel kann zu neurologischen Schäden führen. Darüberhinaus führt sein Fehlen auch zu megaloblastären Anämien, da dieses Vitamin notwendig ist für den geregelten Folsäuremetabolismus. Da Megaloblastose ebenfalls durch Folsäuremangel erzeugt wird wegen anderer Gründe, ist es notwendig festzustellen, ob die Megaloblastose bedingt ist durch einen Mangel an einem oder an beiden Vitaminen.
Das US Patent 4,399,228 von Riceberg von Corning Glass Works beschreibt einen Folat- und einen Vitamin B&sub1;&sub2;- kompetitiven Proteinbindungsassay. Radioaktiver 57 oder ¹²&sup5;I Tracer wird zu Patientenproben hinzugefügt und mit einem Gammazähler gezählt. In dem Assay ist das bindende Protein kovalent an poröses Glas gebunden. Die endogenen Bindungsproteine in der Patientenprobe werden durch Kochen des Reaktionsröhrchens zerstört. Aufgrund der Gefahr und der Schwierigkeit, radioaktive Materialien zu handhaben, gab es viele Versuche, bequeme spezifische Bindungsassaysysteme zu entwerfen, die so sensitiv und schnell sind wie Radioimmunoassays, aber die andere Eigenschaften als Radioaktivität verwenden als Mittel zur Überwachung der Bindungsreaktion.
Das US Patent 4,028,465 von Lewin et al., von bio-Rad Laboratories beschreibt ein radioaktives kompetitives Assayverfahren, in dem das Serumfolat einer Probe gemessen wird. Die Serumfolatbindungsproteine werden durch Hitze inaktiviert. Die Erfindung beschreibt die Verwendung eines Sulfhydryls wie z. B. Dithiothreitol in Puffer, das verwendet werden kann, um Folat vor dem Erhitzungsverfahren zu stabilisieren. Die Verwendung dieses Stabilisators war vorteilhaft gegenüber Verfahren, die Mercaptoethanol verwenden, da es ein leicht abzuwiegender Feststoff mit nur mildem Geruch ist.
Folat- und Vitamin B&sub1;&sub2;- Assays verwendeten üblicherweise vor dem Testen Erhitzen oder Kochschritte, um Folat in der Probe von endogenen Bindungsproteinen freizusetzen. Es ist schwierig, die Erhitzungs- oder Kochschritte genau zu kontrollieren, und sie sind zeitintensiv. Aktuellere Assays denaturieren die Proben durch chemische Mittel ohne Kochen. Man kann Denaturation durch die Verwendung einer starken Base mit oder ohne anderen Chemikalien erzielen.
Das US Patent 4,418,151 von Forand et al., von Rohm und Haas Company bezieht sich ebenfalls auf ein Radioassay für Serumfolat. Eine gemessene Menge Serum wird mit einer konstanten Menge radioaktiv markiertem Vitamin B&sub1;&sub2; und/oder Folattracer gemischt. Die Lösung wird einem Mercaptan-denaturierenden Mittel in Anwesenheit eines Umwandlungsmittels, wie beispielsweise Kaliumcyanid in einer hochalkalischen Umgebung ausgesetzt. Die Verwendung von Mercaptanlösungen erlaubt die Stabilisierung in dem schützenden Puffer, während der hohe pH eine Inaktivierung der endogenen Bindungsproteine bewirkt.
Das US Patent 4,451,571 von Allen von University Patents beschreibt die Verwendung von starker Base mit einer Sulfhydralverbindung, wie z. B. Betamercaptoethanol (BME), Thioglycolat, Thioglyzerin oder Dlthiothreitol (DTT). Die Sulfhydralverbindungen zerstören endogene Bindungsproteine, wodurch das Vitamin B&sub1;&sub2; oder Folat, welches in der Probe enthalten ist, freigesetzt wird, um gemessen zu werden. Obwohl die starke Base Analyte aus seinem Bindungsprotein freisetzt, denaturiert es im wesentlichen nicht das gesamte endogene Bindungsprotein. Daher ist es nützlich, eine weitere Verbindung wie z. B. ein Suflhydral zu haben, um die Freisetzung des Analyten aus dem Bindungsprotein zu unterstützen, und ebenfalls blockierende Antikörper zu eliminieren, die in dem Assay interferieren könnten. Die blockierenden Antikörper könnten problematisch sein für Assay, da sie mit bindenden Faktoren reagieren.
Das US Patent 4,828,985 von Self von Cambridge Patent Developments berichtet von einem Verfahren, worin sekundäre Antikörper gegen Komplexe von nichtimmunogenen Materialien erzeugt werden, und primäre Antikörper gegen die nichtimmunogenen Materialien. Die sekundären Antikörper sind weder Antikörper gegen das nicht-immunogene Material noch gegen die primären Antikörper. Der Nachweis wird erzielt durch das Markieren der sekundären Antikörper mit Enzym oder irgendeinem anderen nachweisbaren Mittel.
WO 89/07271 beschreibt Immunoassays, die monoklonale Antikörper oder immunoreaktive monoklonale Antikörperfragmente gegen nicht-immune natürliche Bindungsproteine verwenden, sowie ein Verfahren zur Markierung von Bindungsproteinen. Beispiele sind angegeben, in welchen ein Komplex aus Folat-bindendem Protein (FBP) und anti-FBP-alkalischer Phosphatase in einem Immunoassay zum Nachweis von Folsäure in menschlichen Serumproben verwendet wird. Der Komplex bindet Folsäure in Lösung und Folsäure, die kovalent an eine feste Oberfläche angeheftet ist, wodurch es eine Konkurrenz des Komplexes für lösliche und immobilisierte Folsäure gibt.
Die vorliegende Erfindung ist eine Verbesserung gegenüber existierender Technologie, insofern als daß es ein Verfahren beschreibt, das mehr Kopplung von spezifischen Bindungsproteinen erlaubt. Diese Erfindung beschreibt ein Verfahren, wodurch eine Mischung von zwei monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern oder eine Mischung daraus gegen unterschiedliche Epitope eines Bindungsproteins eine erhöhte Kopplung ergibt. Dieses Verfahren kann für viele unterschiedliche Assays verwendet werden, in denen Analyten nachgewiesen werden. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß dieses multiklonale Format die Verwendung von Pteroylglutaminsäure (PGA) als einen Kalibrator in einem Folatassay gestattet, anstelle des instabilen 5'-mTHF.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren eines heterogenen Assays, wodurch die Fähigkeit, spezifische Bindungsproteine zu binden, verstärkt wird durch ein monoklonales Antikörperformat. Das multiklonale Format koppelt Bindungsproteine bis zu zehn mal wirksamer als ein einzelnes Antikörperformat. Das verbesserte Verfahren umfaßt im allgemeinen das direkte oder indirekte Binden eines spezifischen Bindungspaargliedes an ein einfangbares Material durch Verwendung einer Mischung von Antikörpern. Das spezifische Bindungspaarglied enthält Bindungsstellen, die dann besetz werden, entweder durch den Probenanalyten von Interesse oder durch ein markiertes Analyt-Analogon. Ein einfangbares Material, eines, in dem die Antikörper, spezifische Bindungspaarglieder und Probenanalyten oder Analyt-Analoga angeheftet sind, kann dann isoliert werden durch ionische Interaktionen mit einem Matrixmaterial, wo der Nachweis stattfinden kann.
Diese Erfindung kann für jeden Assay verwendet werden, der Bindungsproteine, die spezifische Liganden koppeln können, verwendet. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von PGA als Kalibrator in einem Folatassay anstelle von 5'-mTHF. Die traditionelle Verwendung von 5'-mTHF in Folatassays, hat bewiesen, daß es eine instablile Verbindung ist. Die Verwendung der vorliegenden Erfindung erlaubt es, PGA als Kalibrator zu verwenden, wohingegen ein monoklonales oder polyklonales Format alleine unterschiedliche Leistungen zeigte zwischen PGA und 5'-mTHF.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

MULTIKLONALES FORMAT

Diese Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur Bestimmung des Vorhandenseins eines Liganden in einem flüssigen Medium basierend auf der Affinität des Liganden für ein spezifisches Bindungsprotein.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren für einen heterogenen Assay zur Messung von Analyten in Patientenproben. Es gibt zwei separate Phasen für dieses Verfahren. Die erste Phase ist die Kopplung einer polyanionischen Substanz an Antikörper mit unterschiedlichen Bindungsspezifitäten für ein bestimmtes bindendes Protein. Das bindende Protein wird dann zu den Antikörpern hinzugefügt, wodurch ein Polyanion : antibindendes-Protein-Antikörper : bindendes Protein -Komplex gebildet wird. Dieser Komplex wird als Einfangreagenz bezeichnet. Die zweite Phase ist die Reaktion von bestimmten Reagenzien mit der Patientenprobe. Das bindende Protein in dem Komplex fängt seinen besonderen Analyten in der Patientenprobe. Die Reaktionsmischung wird auf eine Polykationmatrix übertragen, wo das Polyanion gefangen wird. Ein Reagenz, das ein Anlyt-Analogon, gekoppelt an ein Enzym, umfaßt, wird hinzugefügt, um an alle unbesetzten Bindungsproteine zu binden. Nicht gebundene Materialien werden von der Matrix abgewaschen, und nach Zusatz eines Standardfluoreszenzsubstrates für das Enzym kann die Konzentration des Analyten bestimmt werden aus der Fluoreszenzintensität.
Die vorliegende Erfindung verwendet ebenfalls ein Verfahren, in dem eine Mischung aus zwei oder mehreren antibindendes-Protein monoklonalen oder einer Mischung aus monoklonalen und polyklonalen -Antikörpern besser funktioniert als ein einzelner Antikörper alleine. Ein Beispiel, wie dieses Verfahren arbeiten kann, ist Folat-bindendes Protein (FBP). Die zwei oder mehr Antikörper (zwei oder mehr monoklonale oder eine Mischung aus monoklonalen und polyklonalen Antikörpern) werden an ein Polyanion, wie z. B. Carboxymethylamylose (CMA), über kovalente Bindung angeheftet. FBP wird dann zu der Mischung hinzugefügt und das FBP wird nicht-kovalent an die Antikörper gekoppelt. Tatsächlich wirken die Antikörper als Bindeglied zwischen dem FBP und dem Polyanion. Dieses Verfahren verhindert, daß das bindende Protein direkt an das Polyanion angeheftet werden muß. Die direkte Verknüpfung des bindenden Proteins an das Polyanion könnte das bindende Protein hinsichtlich der Konformation verändern, wodurch seine Fähigkeit, den Testprobenanalyten zu binden, beeinflußt werden kann. Um den eindeutigen Unterschied aufzuzeigen, wenn zwei Antikörper verwendet werden gegenüber einem einzigen monoklonalen Antikörper, wurden zwei individuelle monoklonale Antikörper gegenüber einer 1 : 1 Mischung der beiden Antikörper getestet. In dem kompetitiven Assay, der oben beschrieben wurde, war das FBP durch einen, oder beide monoklonale Antikörper an das CMA angeheftet. Die 1 : 1 Mischung der zwei anti-FBP monoklonalen (Antikörper) funktioniert besser als jeder monoklonale alleine. Tabelle 1 gibt einen Hinweis darauf, wie wirksam das multiklonale Format ist. Die Zahlen in Tabelle 1 beziehen sich auf die Umsatzrate des Substrates. Es ist wichtig anzumerken, daß dieses Format Antikörper verwendet, welche unterschiedliche Affinitäten gegenüber demselben Protein aufweisen. TABELLE 1
Die 1 : 1 Mischung der beiden Antikörper ergab ein dramatisch erhöhtes Signal. Dies zeigt, daß in der 1 : 1 Mischung mehr Folatbindendes Protein durch die Antikörper gebunden wird. Dies wiederum besagt, daß das Analyt-Analogon mehr angekoppelt wurde und daher mehr Signal erzeugt wurde.
Das Koppeln des Antikörpers an das Polyanion kann durch einen von zwei Wegen erzielt werden. Erstens können die individuellen monoklonalen oder die Mischung aus monoklonalen und polyklonalen zu verschiedenen Zeitpunkten gekoppelt werden. Deshalb wird jeder der Antikörper in einem getrennten Inkubuationsschritt an das Polyanion gekoppelt, bevor sie in einer 1 : 1 Art und Weise gemischt werden. Das zweite Verfahren besteht im Zusammenmischen der beiden Antikörper (unter Verwendung geeigneter Antikörper-Verhältnisse) und dann Koppeln der Mischung an das Polyanion in einem einzigen Inkubationsschritt. Das zweite Verfahren ist nützlich, wenn mit großen Antikörper-Mengen gearbeitet wird, aufgrund der einzigen Inkbuationszeit.
Unterschiedliche Verhältnisse von monoklonalen Antikörpern ergeben bessere Ergebnisse mit dem multiklonalen Format als die individuellen Klone alleine. Offensichtlich ergeben selbst minimale Zusätze eines multiklonalen Formats erhöhte antibindendes-Protein-Antikörperbindendes Protein Fähigkeiten. Die Ergebnisse der Experimente, die monoklonales gegenüber multiklonalem Format verwenden und verschiedene Verhältnisse des multklonalen Formats, sind in Tabelle 2 gezeigt. Erneut sind die dargestellten Werte Substratumsatzraten, aufgrund von der nachweisbaren Markerbindung an unbesetzte Stellen des bindenden Proteins. TABELLE 2

CHARAKTERISIERUNG DES FOLAT-BINDENDEN PROTEIN ANTIGENS

FBP-Antigen wurde aus Kuhmolke durch PGA- Affinitätschromatographie isoliert. Silber gefärbte Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) und isoelektrische Fokussierung bestätigten die Homogenität des Proteins. Zwei Bänder, die durch PAGE sichtbar waren, entsprachen den publizierten Molekulargewichten von FBP bei Rindern mit und ohne Glykosilierung. Kation- und Anionaustausch-Chromatographie ebenso wie reverse Phase Hochleistungschromatographie-Verfahren zeigten nicht mehr als zwei Objekte in der FBP-Lösung. Die chemische Deglykosylierung mit Trifluormethansulfonsäure wandelte die Verbindung mit dem höheren Molekulargewicht in einen einzelnen Stoff mit einer elektrophoretischen Beweglichkeit um, die identisch war mit dem Band der Verbindung mit niedererem Molekulargewicht. Diese Daten stützen den Schluß, daß die beiden Verbindungen FBP mit unterschiedlichem Glykosylierungsgrad darstellen.
Eine weitere Bestätigung, daß das Protein FBP war, wurde durch folgendes geliefert: 1) das Protein zeigte spezifische Bindung mit hoher Affinität von radioaktivem Folat, 2) die Nterminale Aminosäuresequenzanalyse der ersten dreiundzwanzig Aminosäuren lieferte eine unzweideutige Sequenz, die vollkommen mit der Aminosäuresequenz übereinstimmte, die für Rinder-FBP publiziert ist (Svendsen, I., Hansen, S. I., Holm, J., und Lyngbye, J., Carlsberg Research Communications, 49: 12-31, 1984), und 3), die Gaschromatographie Massenspektroskopie- Analyse zeigte zwei Verbindungen mit Molekülmassen von 30,850 und 25,968, in Übereinstimmung mit der erwarteten Masse des FBP Polypeptids mit und ohne Kohlenhydrat-Seitenketten.

FBP MONOKLONALE ANTIKÖRPERENTWICKLUNG

Immunogenherstellung

Gereinigtes Folat-bindendes Protein (FBP) wurde als Immunogen für tierische Immunisierungen und als Antigen für das Reaktivitätscreening verwendet.

Immunisierungsstrategie

Zwei weibliche 6-E3 Wochen alte BALB/c Mäuse (Charles River, Wilmington, MA) wurden mit gereinigtem Folat-bindenden Protein (FBP) immunisiert. Das Dosisniveau betrug 200 ug in 100 ul einer 1 : 1 Lösung der FBP Lösung in Freund's komplettem Adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, M1). Der Injektionsweg der Adjuvansemulsion war interperitoneal und subkutan gleich verteilt. Den Tieren wurde eine 3-wöchige Ruheperiode gestattet, bevor 3 Tage vor der Fusion eine 100 ug FBP intravenöse Prefusionsboosterinjektion in 100u1 verabreicht wurde.

Fusion

Am Tag der Fusion wurden die beiden Mäuse durch Genickbruch getötet und die Milz wurde entfernt. Die Splenozyten wurden einmal in Iscove's modifiziertem Dulbecco's Medium gewaschen (IMDM) (GIBCO, Grand Island, NY.) und 10 Minuten lang bei 1000 rpm zentrifugert. Die pelletierten Splenozyten wurden mit 522/0 Myelomazellen (aus dem habor von Dr. Milstein, Cambridge, U. K.) in einem 1 : 1 Verhältnis kombiniert, in IMDM gewaschen und zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und /ml 50%iges Polyethylenglykol (PEG) (American Type Culture Collection, Rockville, MD) wurde 1 Minute lang zu dem Pellet hinzugefügt wobei das Pellet vorsichtig durch antippen und schütteln dispergiert wurde. Dreißig ml IMDM wurden der Mischung hinzugefügt und es wurde wie oben beschrieben zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet wurde in IMDM mit HAT (Hypoxanthine, Aminopterin und Thymidin) (Gibco, Gaithersburg, MD.), 10%igem fetalen Rinderserum (FBS) (Hyclone Laboratories, Logan, UT), und Salmonella typhimurium Mitogen (STM) (1% v/v) (RIBI Immunochem Research, Inc., Hamilton, MT.) resuspendiert. STM ist ein B-Zell spezifisches Mitogen und wird verwendet, um die Fusionsfrequenz zu erhöhen. Die Fusionszellsuspension wurde in 96 Kammer Gewebekulturplatten gegeben.

Primäres Fusionsscreening

Das primäre Screening der Fusion erfolgte am Tag 10, wobei zu diesem Zeitpunkt die Kulturen zusammenlaufend waren. Ein Enzymimmunoassay (EIA) wurde verwendet, um anti-FBP Reativität in den Überstandsproben nachzuweisen. Die Mikrotiterkammern wurden mit 100u1 von einer 5 ug/ml FBP in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) beschichtet, und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Platten 30 Minuten lang pro Kammer mit 20 ul 3%igem Rinderserumalbumin (BSA) in PBS blockiert. Nach 3 maligem Waschen der Platten mit destilliertem Wasser wurde 50 ul Kulturüberstand pro Kammer hinzugefügt und 1 Stunde lang inkubiert. Die Platten wurden 3x gewaschen und pro Kammer wurde 50 ul verdünntes Ziegen anti-Maus IgG+ IgM-HRPO (Meerrettichperoxidase) -Konjugat (Kirkegaard Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) zu der Platte für eine 30 minütige Inkubationszeit hinzugefügt. Die Platte wurde ein letztes Mal gewaschen und die Farbentwicklung verwendete 0- Phenylendiamin: 2HCl (OPD) (Abbott Laboratories, Abbott Park, 1L). Die relative Intensität der optischen Dichteablesungen identifizierte Hybride Nr. 1-279 und Nr. 1-641 als 3-mal jene der negativen Kontrolle, normales Mäuseserum (NMS) (Organon Teknika-Cappel, Malvern, PA) und die Hybride wurden ausgewählt als Kandidaten für die Klonierung und weitere Beurteilung.

Hybridklonierung

Die Hybride Nr. 1-279 und Nr. 1-641 wurden durch limitierende Verdünnungen geklont. 1 bis 10 Verdünnungen wurden durchgeführt beginnend bei 1 · 10 = bis zu 1 · 106. Das verwendete Klonierungsmedium war IMDM mit 10% v/v FBS und 1% v/v ET (Hypoxanthin und Thymidin)Zusatz (Gibco, Gaithersburg, MD.). Eine 100 ul Zellsuspension wurde zu jeder der 96 Kammern in der TC Platte hinzugefügt. Am Tag 7 wurden die Platten mit 200 ul/Kammer Klonierungsmedium versorgt.

Klonauswahl

Die Klone Nr. 1-279-176 und Nr. 1-641-101 wurden gewählt aus den 1 · 106 Verdünnungskammern zur weiteren Beurteilung basierend auf zusätzlichem EIA Screening des Klonüberstandes von zusammenlaufenden Kulturen. Das EIA Screeningsprotokoll, welches verwendet wurde, wurde zuvor beschrieben.

Subklonauswahl

Für Zwecke der Reagenzienreproduzierbarkeit war es notwendig sicherzustellen, daß eine einzelne Zellinie von 1-279- 176 erhalten wurde. Um dies zu tun, wurde die Zellinie ein weiteres Mal wie oben beschrieben kloniert. Das EIA Screening, wie oben beschrieben, wurde für die Subklonauswahl von Nr. 1- 279-866 verwendet.

Western Blot Auswertung

Das FBP Antigen, 10 ug, entweder mit 2-Mercaptoethanol (Bio- Rad, Richmond, CA.) reduziert oder nicht reduziert, wurde untersucht auf einem 8-16%, 1,0 mm, mini-Polyacrylamidgel (Novex, San Diego, CA.) auf einem mini Elektrophorese und Transfersystem (Profiletystem, Schleicher & Schuell, Keene, N. H.) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Das Protein wurde als nächstes von dem Gel auf Nitrozellulose übertragen. Die Nitrozellulose wurde in Streifen geschnitten und Antikörper wurden für mehrere Stunden auf den Streifen inkubiert. Die Bindungsfähigkeit des Antikörpers für das reduzierte und nicht reduzierte Antigen wurde unter Verwendung des oben erwähnten Ziegen-anti-Maus IgG+M-HRPO Konjugates nachgewiesen, mit der Farbentwicklung durchgeführt durch durch 4-Chlor-napthol (Sigma, St. Louis, M0.). Der Antikörper aus 1-279-866 war nachweislich reaktiv gegenüber dem 32kD MW FBP in reduzierten und nicht reduzierten Bedingungen. Der Antikörper von. I-641-101 war nicht reaktiv gegenüber dem FBP Antigen im Western Blot -Test. Basierend auf diesen Daten wurde nachgewiesen, daß der monoklonale Antikörper, der durch die Hybridzellinien produziert wurde, auf zwei unterschiedliche Epitop-bindende Stellen gerichtet ist.

Isotyg

Die Isotypen des monoklonalen Antikörpers, der aus den Zellinien identifiziert als 1-279-866 und 1-641-101 ausgeschieden wurde, wurden auf einen EIA Clonotyping Testsatz (Southern Botech, Birmingham, AL.) nachgewiesen. Der Assay wird gemäß den Verkäuferempfehlungen durchgeführt und die Ergebnisse zeigten, das beide IgOl, kappa waren.

Isoelektrische Fokussierung

Die elektrophoretische Auswertung der 1-279-866 und 1-641- 101 Antikörper wurde auf dem PhastSystem (Pharmacia-LKB, Piscataway, N. J.) durchgeführt. Die Coomassiefärbung des Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Glelektrophorese (SDS-PAGE) -Profils identifizierte die typische Antikörperbandmusterung eines einzelnen Leichtkettenbandes bei 25kD und ein einzelnes schwerkettiges Band bei 55kD für jeden Antikörper. Das silbergefärbte IEF Profil identifizierte einen pl von 6,8 ± 0,2 für 1-279-866 und ein pl von 6,6 ± 0,2 für 1-641-101.

Hinterlegung

Die Zellinien 1-279-866 und 1-641-101 wurden bei der amerikanischen Gewebekultursammlung (American Tissue Culture Collection (A. T. T. C) (Rockville, Maryland) hinterlegt. Die Zellinie 1-279-866 wurde bezeichnet als A. T. C. C. Nr. HB 11249 und die Zellinie 1-641-101 wurde bezeichnet als A. T. C. C. Nr. HB 11250.

VERFAHREN UND REAGENZIEN

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren, worin eine Mischung aus zwei oder mehreren antibindendes Protein monoklonalen oder eine Mischung aus monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern eine bessere Reaktionsrate ergibt, als nur monoklonale oder polyklonale alleine. Dieses Assayverfahren ist für viele Proteine und ihre bindenden Stoffe einschließlich Folat und Vitamin B&sub1;&sub2; anwendbar, ist jedoch nicht auf sie beschränkt.
Die auf das Vorhandensein eines Analyten zu testende Probe kann vielen Schritten unterworfen werden, welche endogene Proteine denaturieren, die mit dem Assay interferieren können. Die vorliegende Erfindung verwendet vorzugsweise eine Vorbehandlung der Probe mit dem DTT gemischt mit Essigsäure, Natriumchlorid und Ethyldiamintetraessigsäure (EDTA). Das DTT denatuiert nicht nur das Protein, sondern konserviert auch die reduzierte Form von 5'-mTHF. Andere allgemein denaturierende Mittel können DTT ersetzen, abhängig vom Analyten.
Ein zweiter Denaturierungsschritt ist vorzugsweise der Zusatz von 0,75M Kaliumhydroxid zu der Probe. Dieser Zusatz erzeugt eine hoch basische Umgebung, welche die endogenen Folatbinder in der Probe weiter denaturiert, wodurch das Folat zur Messung freigesetzt wird. Andere starke Basen wie NaOH, LiCH und NH&sub4;OH können verwendet werden.
Die angewendete Fangtechnik benutzt ein Polyanion wie z. B. CMA. Gekoppelt an das Polyanion ist eine Mischung aus anti-Folat bindendem Protein-Antikörpern komplexiert mit Folat-bindendem Protein. Die Antikörper dienen als Linker zwischen dem Polyanion und dem Folat-bindenden Protein. Das Folat-bindende Protein bindet nicht-kovalent an die Antikörper, welche an das Polyanion angeheftet sind. Es ist wichtig, daß die denaturierte Probe durch Puffer vor oder zum Zeitpunkt des Zusatzes von FBP neutralisiert wird. In der vorliegenden Erfindung wird die Neutralisierung vorzugsweise zum Zeitpunkt des FBP Zusatzes durchgeführt. Das Fangreagens kann verdünnt sein in einem Puffer von 50 mM Borat, pH 8,1; 0,2%iges menschliches Serumalbumin (HSA); 0,1% Tween-20; 0,1% Natriumazid; 0,003% Dextransulfat; und 1 mM EDTA. Die HSA Komponente enthält kein endogenes Folatbindendes Protein. Natriumazid ist ein Konservierungsstoff, der üblicherweise bei Laborreagenzien verwendet wird, der eine gewisse antibakterielle Wirkung aufwiesen kann. Dextransulfat in der Fangreagenzie bindet an störende Kationen (z. B. Kationstaub aus der Matrix), welche die Genauigkeit des Assays beeinträchtigen könnten.
Der Zusatz des Fangreagenzes, das Boratpuffer enthält, zu der Reaktionskammer, neutralisiert die denaturierenden Stoffe und gestattet, daß Folat in den Proben an das Folat-bindende Protein bindet. Nach einer Inkubation wird die Reaktionsmischung auf die Matrix übertragen, wo das Polyanion an ein Polykationmaterial anhaftet.
Es gibt zahlreiche Wege durch die das Polykation zugesetzt werden kann. Das Polykation-Material kann direkt zu dem Fangreagenz hinzugefügt werden, wo es an das Polyanion anhaften wird. Ein weiteres Verfahern ist der Zusatz des Polykations zu der Reaktionsmischung einen Schritt vor dem Zusatz der Reaktionsmischung zu der Matrix. Das bevorzugte Verfahren ist das Vorbeschichten der Matrix mit Polykationen und daraufhin Hinzufügen der Reaktionsmischung.
Das Konjugatreagens enthält das Enzym alkalische Phosphatase konjugiert an Pteroinsäure und verdünnt in 50 mM Tris(Hydroxymethyl)aminomethan (TRIS), pH 7,4; 0,5% HSA; 0,1M Natriumchlorid; 1 mM Magnesiumchlorid; 0,1 mM Zinkchlorid; 0,1% Dextransulfat; und 0,1% Natriumazid. Das Konjugat bindet an die unbesetzten Folat-bindenden Protein-Stellen. Das Konjugatreagenz ist nicht beschränkt auf die Verwendung von Pteroinsäure. Andere Folatanaloga einschließlich PGA können in den Konjugatreagenzien verwendet werden.
Das Standard IMx® (Abbott Laboratories, North Chicago, IL., 60064) Methylumbelliferylphosphatsubstrat wird in der vorliegenden Erfindung verwendet.
Wie zuvor erwähnt, gab es Probleme bei der Verwendung von 5'-mTHF als Standard oder Kälibrator. Es ist instabil sobald es Licht, Temperatur und Atmosphäre ausgesetzt wird. Seine Instabilität verneint seine Nützlichkeit als Kalibrator. Darüber hinaus kann 5'-mTHF die Verwendung von menschlichem Serum in der Kalibrationsmatrix erforderlich machen. Ebenfalls notwendig bei der Verwendung von 5'-mTHF ist der Zusatz von Ascorbat und Citrat. Der Zusatz dieser Stoffe erhöht die Stabilität von 5'- mTHF während der Verwendung, aber es wurde herausgefunden, daß Ascorbat in dem Assay interferieren kann.
Die vorliegende Erfindung verwendet PGA als Kalibrationsreagenz. Die Vorteile der Verwendung von PGA sind zahlreich. Erstens ist PGA stabiler als 5'-mTHF; zweitens gib; es eine bessere Reproduzierbarkeit der Ergebnisse bei PGA Kalibrierung des Assays gegenüber 5'-mTHF; und drittens wird kein Ascorbat benötigt, um PGA zu stabilisieren. Zusätzlich gestattet die Verwendung von PGA als Kalibrator die Verwendun; von Rinderserumalbumin (BSA) anstelle von menschlichem Serum als Verdünner für den Kalibrator. Dieses verringert die Gefahren, Kosten und Verfügbarkeitsprobleme, die mit menschlichem Serum assoziiert sind.
5'-mTHF ist die metabolische Form der Folsäure, welch tatsächlich in Patientenproben gemessen wird. Demgemäß müssen Kalibratoren, die nicht. 5'-mTHF sind, ausreichend gebunden sein durch die geeigneten bindenden Proteine, um eine gute Korrelation zu den 5'-mTHF Niveaus der Probe zu ergeben. Obwohl der Reaktionsmechanismus unbekannt ist, gestattet das multiklonale Format FBP PGA in einer ähnlichen Art und Weise wie 5'-mTHF zu binden. Daher gestattet das multiklonale Format die Kalibrierung mit PGA und ergibt eine gute Indikation für den 5'- mTHF Gehalt einer Testprobe. Ein Vergleichsbeispiel ist in Fig. 1 gezeigt.
Eine weitere Verbesserung der vorliegenden Erfindung ist die Erkenntnis, daß der Zusatz von Citrat die PGA Stabilität von Tag Null Werten bis zu mehreren Monaten verbesserte. Die PGA Stabilität am Tage Null wurde in dem BSA Verdünner mit und ohne Citrat (100 mW) beurteilt. Mit Citrat ist die Stabilität des PGA am Tage Null über die Zeit bei -20ºC, 4ºC, 45ºC, und Raumtemperaturen verbessert. Fig. 2 zeigt die Wirkungen der Citrat-verbesserten PGA Stabilität am Tage Null. Die Testpunkte wurden durchgeführt mit dem IMx® Instrument und die MUP Umsatzraten wurden an den angegebenen Tagen gemessen. Die erzielten Raten wurden mit Grundliniendurchläufen am Tage Null verglichen.
Die gleiche Methodik kann verwendet werden, um einen Assay für Vitamin B&sub1;&sub9; durchzuführen. Vitamin B&sub1;&sub2; wird vorzugsweise von seinem endogenen intrinsischen Faktor unter Verwendung von alpha-Methylthioglyzerin und nachfolgend hochalkalischer Umgebung getrennt. Dies gestattet es dem freigesetzten Vitamin B&sub1;&sub2; an den Fangreagenzienkomplex zu koppeln, wodurch das Nachweisverfahren vereinfacht wird.
Patientenproben wurden analysiert und individuelle Folatkonzentrationen wurden unter Verwendung von zwei üblicherweise verwendeten Assays gemessen. Die Patientenproben wurden analysiert durch die IMx® gegen Bio-Rad® -Assays (Bio-Rad Chemical Div. Richmond, CA., 94804) und Corning® (Corning Inc., Science Products Division, Corning, N. A., 14831) sowohl mit dem multiklonalen als auch dem polyklonalen Format. Wie in Tabelle 3 zu sehen ist, gab es eine gute Übereinstimmung zwischen den beiden Verfahren. Die Bezeichnung "N" bezieht sich auf die Anzahl der getesteten Patientenproben. TABELLE 3
Ebenfalls signifikant ist die Tatsache, daß das multiklonale Reagenz gute Stabilität nach 3 Tagen bei 45ºC zeigte. Zwei einzelne monoklonale, eine 1 : 1 Mischung der beiden monoklonalen, und eine polyklonale Probe wurden bei den unterschiedlichen Temperaturen getestet. Das multiklonale Reagenz (1 : 1 Mischung) verlor nur 10% von seiner 4ºC Aktivität nach 3 Tagen bei 45ºC. Wie in Tabelle 4 gezeigt, zeigte das multiklonale Format eine gute Fähigkeit, mehr bindendes Protein zu binden, wie durch höhere Substratumsatzraten nach Lagerung bei hohen Temperaturen gezeigt wurde. TABELLE 4
Die Methodik der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um sie auf verschiedenen Analyte anzupassen. Die verwendeten Antikörper wurden entwickelt, um bei der Beseitigung der Variabilität der Reagenzien bei der Durchführung zu helfen. Das multiklonale Format wurde zu Beginn durch Zusammenmischen zweier der. CMA-Antikörperkonjugate in dem Einfangreagenz hergestellt. Dies wurde später durch das Zusammenmischen der beiden Antikörper und nachfolgender Kopplung der Mischung an CMA vereinfacht, um ein multiklonales zu erzeugen. Die Antikörpermischung kann aus zwei unterschiedlichen monoklonalen oder einer Kombination aus monoklonalen und polyklonalen Antikörpern bestehen.
Das DTT Reagenz wird den Proben zu Beginn des Assays hinzugefügt, um für die Konservierung des 5'-mTHF in der Probe eine reduzierende Umgebung zu erhalten. DTT kann ebenfalls als ein Protein denaturierendes Mittel wirken, indem Disulfidbindungen reduziert werden und indem andere Proteine gegenüber alkalischer Denaturierung empfindlicher gemacht werden. Veröffentlichte Artikel haben angedeutet, daß Folatbindende Proteine irreversibel denaturiert werden bei einem pH von 12 oder höher. Die vorliegende Erfindung verwendet vorzugsweise ein Kaliurnhydroxidreagenz, um die Patientenproben zu denaturieren, indem endogene Folat-bindende Proteine zerstört werden. Dies gestattet dem CMA-multiklonal-FBP Komplex mit dem freigesetzten Folat in der Patientenprobe eine Bindung einzugehen. Daher muß der Assay reproduzierbar den pH zur Denaturierung anheben und dann die Base mit dem Einfang- Verdünnungsmittel neutralisieren. Die derzeitige Literatur und unsere Erfahrung besagt, daß ein pH von etwa 9,3 eine optimale Bindung von PGA in den Kalibratoren und des 5'-mTHF in den Proben ergibt.
In der vorliegenden Erfindung muß der Verdünner nicht nur für das CMA-multiklonal-FBP Einfangreagenz geeignet sein, damit dieses funktioniert und stabil bleibt, sondern es muß auch das KOH neutralisieren. Das Einfangreagenz puffert daher den Reaktions-pH für eine geeignete PGA und 5'-mTHF Leistung. Borat ist ein bevorzugter Puffer mit einem pKA nahe 9,3 und ist der FBP Bindungsfähigkeit dienlich. Der Zusatz von 4% Saccharose erhöht die Löslichkeit von Borat. Die Fähigkeit von Saccharose, diese Funktion auszuführen, ist durch die cis-Hydroxygruppen bedingt, die sich mit dem Borat vereinigen. Die Saccharose verhindert die gelegentliche Ausfällung von Borat aus dem Einfangverdünnungsmittel, das bei 4ºC gelagert wird.

FOLATASSAY

1. Verfahren

a. Beladen des IMx® (Abbott Laboratories, Abbott Park, 1L., 60064) Karussells mit den Kalibratoren und/oder Kontroll- und Testproben (minimum 100u1 von jedem). Dann werden 0,4 ml Dithiothreitol (DTT) in die Vorverdünnerkammer der ersten Reaktionszelle in dem Karussell eingebracht.
b. Der Assay beginnt damit, daß jede Reaktionskammer 0,015 ml des Du's aus der ersten Reaktionszellevorverdünnerkammer erhält, und 0,018 ml des Kalibrators, der Kontrolle oder Probe. Das DTT denaturiert Proteine und konserviert die reduzierte Form von 5'-mTHF in den Proben. Jede Kammer wird 8 Minuten lang inkubiert.
c. Zusatz von 0,028 ml von 0,75M Kaliumhydroxid (KOH) in jede Reaktionskammer und Inkubation für 8 Minuten.
d. Zusatz von 0,15 ml Einfangreagenz (Polyanion-anti-FBP Antikörper, komplexiert mit FBP in Boratpuffer) zu der Reaktionskammer. Der Boratpuffer in dem Einfangreagenz neutralisiert die denaturierenden Stoffe (endgültiger pH nahe 9,3), und gestattet dem Folat in den Proben, an das FBP zu binden. Das Dextransulfat in dem Einfangreagenz bindet an überschüssige Kationen (z. B. Kationenstaub aus der Matrix) und reduziert die Variabilität des Assays. Inkubieren der Kammern für 12,5 Minuten.
e. Transferieren von 0,22 ml der Reaktionsmischung zu der Ioneneinfangreaktions-Zellmatrix, wo das Polyanion (angeheftet an das FBP durch die Antikörper) durch ionische Interaktionen an das Polykation auf der Reaktionszellmatrix anhaftet.
f. Zwei Verdünnerwäschen der Matrix entfernen ungebundene Materialien und werden dann gefolgt von dem Zusatz von 0,06 ml des Konjugatreagenzes. Das verwendete Konjugatreagenz ist alkalische Phosphatase vom Kalbsdarm konjugiert an Pteroinsäure. Das Konjugat bindet an Stellen auf dem eingefangenen FBP, die nicht durch Folat besetzt sind.
g. Ungebundenes Konjugat wird dann von der Oberfläche der Matrix abgewaschen, 0,06 ml Methylumbelliferylphosphat (MUP) Reagenz wird hinzugefügt und die Fluoreszenz des freigesetzten MU wird abgelesen. Die Flucreszenzintensität ist umgekehrt proportional zu der Menge an Folat in den Kalibratoren oder den Patientenproben.

VITAMIN B&sub1;&sub2; ASSAY

1. Verfahren

a. Beladen des Karussells mit den Kalibratoren und/oder Kontrollen und Testproben (minimum 100u1 von jedem). Dann werden 0,4 ml alpha Monothioglycerin in die Vorverdünnerkammer der ersten Reaktionszelle in dem Karussell eingebracht.
b. Der Assay beginnt damit, daß jede Reaktionskammer 0,0/ml von alpha Monothioglycerin und 0,06 ml des Kalibrators, der Kontrolle oder Probe erhält. Das reduzierende Mittel denaturiert Proteine. Inkubation für 8 Minuten.
c. Zusatz von 0,08 ml des KOH in jede Reaktionskammer und Inkubation für 8 Minuten.
d. Der Zusatz von 0,15 ml Einfangreagenz (Polyanion-antiintrisischer Faktor Antikörper, komplexiert mit intrinsischem Faktor in Boratpuffer) zu der Reaktionskammer neutralisiert dann die denaturierenden Mittel (endgültiger pH nahe 9,3) und gestattet es dem Vitamin B11 in den Proben, an den intrinsischen Faktor zu binden. Das Dextransulfat in dem Einfangreagenz bindet an überschüssige Kationen (z. B. Kation enstaub aus der Matrix) und reduziert die Variabilität des Assays. Inkubation für 12,5 Minuten.
e. 0,15 ml der Reaktionsmischung wird in die Ionenfangreaktions-Zellmatrix übertragen, wo das Polyanion (verbunden mit dem intrinischen Faktor über den anti-intrinsischen Faktor Antikörper) durch ionische Interaktionen an das Polykation anheftet, das auf die Matrix beschichtet ist.
f. Zwei Verdünnerwäschen der Matrix werden gefolgt von dem Zusatz von 0,05 ml Konjugatreagenz. Das Konjugatreagenz, das verwendet wird, ist alkalische Phosphatase vom Kalbsdarm, konjugiert an Vitamin B&sub1;&sub2; oder Vitamin B&sub1;&sub2; Analogon. Das Konjugat bindet an Stellen des eingefangengen intrinsischen Faktors, die nicht durch Vitamin B&sub1;&sub2; besetzt sind.
g. Ungebundenes Konjugat wird dann von der Oberfläche der Matrix abgewaschen, 0,06 ml
Methylumbelliferylphosphat (MUP)-Reagenz wird hinzugefügt, und die Fluoreszenz des freigesetzten MU wird abgelesen. Die Fluoreszenzintensität ist umgekehrt proportional zu der Menge an Vitamin B&sub1;&sub2; in den Kalibratoren oder Patientenproben.

Claims

1. Ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder der Menge eines Analyten in einer Testprobe, das folgendes umfaßt: Anknüpfen eines ersten Bindungspaarglieds, das spezifisch für den Analyten ist, an einen einfangbaren Stoff unter Verwendung einer Mischung aus mindestens zwei verschiedenen monoklonalen Antikörpern oder einer Mischung aus monoklonalen und polyklonalen Antikörpern, die spezifisch für das erste Bindungspaarglied sind und die an den einfangbaren Stoff gekoppelt sind; Erlauben, daß das erste Bindungspaarglied den Analyten von Interesse, der in der Testprobe vorhanden ist, einfängt; Hinzufügen einer detektierbaren Markierung, die entweder direkt oder indirekt an ein zweites spezifisches Bindungspaarglied angebracht ist, das entweder auf den Analyten oder das erste Bindungspaarglied gerichtet ist; Einfangen des einfangbaren Stoffes, um ihn von der Testprobe abzutrennen; und, Überwachen von entweder der freien oder eingefangenen detektierbaren Markierung für die Anwesenheit oder Menge des Analyten.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1 zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge eines Analyten in einer Testprobe, das folgendes umfaßt:

Bilden einer Testmischung, indem die Testprobe mit einem Indikatorreagens und einem Einfangreagens in Kontakt gebracht wird, wobei das Einfangreagens ein erstes spezifisch es Bindungspaarglied umfaßt, das an ein Polyanionpolymer durch eine Mischung aus mindestens zwei verschiedenen monoklonalen Antikörpern oder eine Mischung aus monoklonalen und polyklonalen Antikörpern geknüpft ist, die gegen das erste spezifische Bindungspaarglied gerichtet sind; wobei das Indikatorreagens eine detektierbare Markierung umfaßt, die entweder direkt oder indirekt an ein zweites spezifisches Bindungspaarglied geknüpft ist, das spezifisch für das erste spezifische Bindungspaarglied ist, wobei gestattet wird, daß die Testprobe mit dem Indikatorreagens um die Bindung an das Einfangreagens konkurriert; Abtrennen des Polyanionpolymers von der Testprobe durch Ionenadhäsion an eine Matrix und Überwachen entweder der freien oder eingefangenen detektierbaren Markierung, um die Anwesenheit oder Menge des Analyten in der Testprobe zu bestimmen.

3. Das Verfahren nach Anspruch 2, worin die Testmischung durch aufeinanderfolgendes In-Kontakt-bringen der Testprobe mit dem Einfangreagens und dann mit dem Indikatorreagens gebildet wird.

4. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Mischung von Antikörpern durch Mischen verschiedener einfangbarer Stoffe erhalten werden kann, von denen jeder an einen unterschiedlichen Antikörper gekoppelt worden ist.

5. Das Verfahren nach Anspruch 2, worin das erste spezifische Bindungspaarglied ein bindendes Protein ist, das spezifisch für einen speziellen Analyten in der Testprobe ist.

6. Das Verfahren nach Anspruch 5, worin das erste spezifische Bindungspaarglied Folat-bindendes Protein ist und der Analyt Folat ist.

7. Das Verfahren nach Anspruch 2, worin die Testprobe mit einem Reduktionsmittel behandelt wird, gefolgt von einer Behandlung mit einem alkalischen Mittel vor der Vereinigung mit dem Einfangreagens.

8. Das Verfahren nach Anspruch 6, worin Pteroylglutaminsäure (PGA) als ein Standard benutzt wird.

9. Das Verfahren nach Anspruch 8, worin die PGA durch den Zusatz von Citrat stabilisiert ist.

10. Das Verfahren nach Anspruch 6, worin das zweite spezifische Bindungspaarglied, das mit dem Folat-Analyten konkurriert, Pteroinsäure ist.

11. Das Verfahren nach Anspruch 2, worin das erste spezifische Bindungspaarglied intrinsischer Faktor ist und der Analyt Vitamin B12 ist.

12. Das Verfahren nach Anspruch 2, worin die Matrix durch Vorbeschichtung der Matrix mit einem Polykationstoff hergestellt wird.

13. Eine Hybridomzelllinie (1-279-866), A. T. C. C. Deposit No. HB-11249, die einen monoklonalen Antikörper absondert, der spezifisch an Folat-bindendes Protein bindet.

14. Eine Hybridomzelllinie (1-641-101), A. T. C. C. Deposit No. HB-11250, die einen monoklonalen Antikörper absondert, der spezifisch an Folat-bindendes Protein bindet.

15. Die im Verfahren nach Anspruch 1 nützlichen monoklonialen Antikörper, die von der Zelllinie A. T. C. C. Deposit No. HB 11249 abgesondert werden.

16. Die im Verfahren nach Anspruch 1 nützlichen monoklonalen Antikörper, die von der Zeillinie A. T. C. C. Deposit No. HB 11250 abgesondert werden.