JP6946926B2 - ビタミン類の遊離に使用する凍結乾燥試薬 - Google Patents

Description

本発明は、ビタミン類の遊離に使用する凍結乾燥試薬に関するものである。

ビタミン類にはビタミンＤ代謝産物、ビタミンＢ_１２及び葉酸などの小分子がある。血液中のそれらの小分子は、その大部分が特異的又は非特異的に蛋白質、脂質などと結合しているため、それらの小分子を測定するには、小分子を前記タンパク質等から遊離する必要がある。なお、ビタミン類にはそれぞれ特異的な結合タンパク質が存在し、血液中での安定性に貢献している。例えば、ビタミンＤバインディングプロテイン（ＤＢＰ）、ハプトコリンや内因子などが良く知られている。

従来知られているビタミン類の結合タンパク質の遊離方法として、アルカリ処理と還元処理が報告されており、特にアルカリ剤として水酸化ナトリウム水溶液、還元剤としてジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いる場合が多い。

還元剤は水溶液中、特にアルカリ水溶液中では還元力が低下するため、凍結乾燥して保存し、且つアルカリ剤とは別の容器に保存されている。そのためビタミン類と結合タンパク質の遊離を実施する前には還元剤とアルカリ剤のどちらか一方又は双方を水などで溶解した後に、それらを混合してから遊離に用いる方法が一般的である。しかし、そのような従来法では、煩雑であり、ビタミン類と結合タンパク質の遊離の再現性を低下させ、ビタミン類の測定精度を悪化させるといった問題を有している。

本発明は、同一容器内に還元剤とアルカリ剤を含有し、且つ還元剤の還元力を保持した試薬を提供することを目的としている。

本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、還元剤とアルカリ剤を同一容器内で別個に凍結した後、凍結乾燥することにより、還元剤とアルカリ剤を同一容器内に含有した凍結乾燥試薬とできることを見出した。

即ち、本発明は以下のとおりである。
（１）還元剤を含有する凍結乾燥体及びアルカリ剤を含有する凍結乾燥体を同一容器内に有することを特徴とする、凍結乾燥試薬。
（２）還元剤がトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ）、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエタノールアミン、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はジチオエリトリトール（ＤＴＥ）である、（１）に記載の凍結乾燥試薬。
（３）アルカリ剤が水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである、（１）又は（２）に記載の凍結乾燥試薬。
（４）アルカリ剤溶液又は還元剤溶液のいずれか一方を容器に分注し、凍結させた後、その凍結状態を保ったまま、他方を当該容器に分注し、凍結させ、その後、凍結乾燥する工程を含むことを特徴とする、凍結乾燥試薬の製造方法。
（５）（１）〜（３）のいずれかに記載の凍結乾燥試薬を水溶液で溶解し、血液試料と混合し、前記血液試料中に含有されるビタミン類とタンパク質との結合物から前記ビタミン類を遊離させることを特徴とする、ビタミン類の遊離方法。
（６）ビタミン類がビタミンＤ代謝産物、ビタミンＢ_１２又は葉酸である、（５）に記載の遊離方法。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の凍結乾燥試薬は、還元剤を含有する凍結乾燥体及びアルカリ剤を含有する凍結乾燥体を同一容器内に有することを特徴とする。還元剤及びアルカリ剤は、各成分以外に例えば糖類やｐＨを調製するための緩衝剤等を含んでいても良い。

また、還元剤としては、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ）、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエタノールアミン、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はジチオエリトリトール（ＤＴＥ）が好ましく、アルカリ剤としては水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムが好ましい。

次に、本発明の製造方法について説明する。

まず、還元剤成分又はアルカリ水溶液のいずれかを容器に分注し、凍結する。使用する容器に特に制限はないが、プラスチックやガラス容器等を用いることができる。分注方法としては室温条件下、凍結方法としては−２０〜−４０℃条件下で３０分以上置くことが好ましい。次に、分注した水溶液の凍結状態を保ったまま、他方成分を分注して凍結する。容器は十分に冷却しておき、分注と同時に容器内壁に接触した部分から分注された成分が凍結されるように−２０℃程度まで冷却しておくことが好ましい。分注などの各操作は、−２０〜−４０℃条件下で実施することが、分注した各成分の溶解を防止するうえで好ましい。

以上のようにして各成分を接触することなく凍結した後、凍結状態にて乾燥操作を行う。この操作は通常の凍結乾燥操作で良く、具体的な条件としては、真空度１００ｍＴｏａｒ以下、−２０℃の条件下に２時間置いた後、２５℃条件下に５時間置くこと等が例示できる。乾燥操作を終了した後は、酸化による各成分の劣化等を防止する目的で不活性ガス等を注入して密閉し、保管することが好ましい。

本発明の凍結乾燥試薬は、還元剤とアルカリ剤が乾燥状態で同一容器に入れられていることから、ビタミン類を含む血液試料を投入するだけでビタミン類と結合タンパク質との遊離を簡便に行うことができる。ビタミン類としては、ビタミンＤ代謝産物、ビタミンＢ_１２又は葉酸が例示できるが、これに限定されるものではない。

本発明によれば、還元剤とアルカリ剤を同一容器内に入れておくことが可能となり、ビタミン類を含む血液試料を投入するだけで、ビタミン類と結合タンパク質との遊離を簡便に行うことができる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本実施例により限定されるものではない。

免疫測定装置及びビタミン類の前処理装置として全自動エンザイムイムノアッセイ装置（ＡＩＡ−ＣＬ２４００、東ソー社製）と当該装置用葉酸免疫反応試薬と葉酸前処理用試薬を用い、前処理とＤｅｌａｙ１ステップ競合法により各測定を行った。なお、葉酸免疫反応試薬と葉酸前処理用試薬は後述したようにして調製した。

葉酸免疫反応試薬
（１）固相懸濁液の調製
葉酸結合タンパク質固定化磁性微粒子をコラーゲンペプチド、糖、塩類等を含むＴｒｉｓ緩衝液で希釈し、固相懸濁液を作製した。
（２）検出用標識葉酸溶液の調製
アルカリホスファターゼ標識葉酸をコラーゲンペプチド、糖、塩類等を含むＴｒｉｓ緩衝液で希釈し、検出用標識葉酸溶液を作製した。
（３）葉酸免疫反応試薬の調製
固相懸濁液と検出用標識葉酸溶液をそれぞれ凍結乾燥し、葉酸免疫反応試薬を調製した。

葉酸前処理用試薬
（４）アルカリ剤溶液
糖類等と水酸化ナトリウム水溶液を混合し、アルカリ剤溶液を作製した。
（５）還元剤溶液
糖類等とトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を水で溶解し、還元剤溶液を作製した。
（６）中和剤溶液
糖類等とリン酸緩衝液を混合し、中和剤溶液を作製した。
（７）葉酸前処理用試薬の調製
アルカリ剤溶液を容器に分注し、凍結した。次に、分注したアルカリ剤溶液の凍結状態を保ったまま、還元剤溶液を分注して凍結した。中和剤溶液は別の容器に分注して凍結し、それぞれを凍結乾燥し、葉酸前処理用試薬として調製したものを試薬Ａとした。また、アルカリ剤溶液と還元剤溶液を混合し、２５℃で３日間保存した後に、その混合液と中和剤溶液それぞれを凍結乾燥し、葉酸前処理用試薬を調製したものを試薬Ｂ、２５℃で７日間保存した後に同様に調製したものを試薬Ｃとした。

次に、上記のように調製した葉酸免疫反応試薬と葉酸前処理用試薬Ａ、Ｂ、Ｃに対して前記自動免疫測定装置で各試薬に対して血清サンプル２種類を測定し、アルカリホスファターゼの基質である化学発光基質の発光強度を測定した。各血清サンプルは４回ずつ測定し、その平均値を測定値とした。結果を表１に示す。

葉酸前処理用試薬の試薬Ｂと試薬Ｃの２種類の血清サンプルの発光強度が試薬Ａと比較して、試薬Ｂで１０５．８％、１０６．７％、試薬Ｃで１０７．９％、１１５．３％であった。発光強度が高いことは、前処理時にサンプル中の結合タンパク質からの遊離が少なく、遊離している葉酸が少ないことを意味する。これはアルカリ剤溶液と還元剤溶液を混合してからの経過日数と関連して発光強度が高くなることから還元剤の還元力がアルカリ剤溶液中で徐々に低下していたことを示している。

Claims (6)

1. 還元剤を含有する凍結乾燥体及びアルカリ剤を含有する凍結乾燥体を同一容器内に有することを特徴とする、凍結乾燥試薬。
2. 還元剤がトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ）、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエタノールアミン、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はジチオエリトリトール（ＤＴＥ）である、請求項１に記載の凍結乾燥試薬。
3. アルカリ剤が水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである、請求項１又は２に記載の凍結乾燥試薬。
4. アルカリ剤溶液又は還元剤溶液のいずれか一方を容器に分注し、凍結させ、その凍結状態を保ったまま、他方を当該容器に分注し、凍結させ、その後、凍結乾燥する工程を含むことを特徴とする、凍結乾燥試薬の製造方法。
5. 請求項１〜３のいずれかに記載の凍結乾燥試薬を水溶液で溶解し、血液試料と混合し、前記血液試料中に含有されるビタミン類とタンパク質との結合物から前記ビタミン類を遊離させることを特徴とする、ビタミン類の遊離方法。
6. ビタミン類がビタミンＤ代謝産物、ビタミンＢ_１２又は葉酸である、請求項５に記載の遊離方法。