JP2023537588A - 標準タンパク質を含む固体混合物 - Google Patents

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Abstract

少なくとも１つの内部標準タンパク質を含む混合物、混合物を含む容器、混合物を含む容器を調製する方法、試料中に存在する標的タンパク質の量を決定する方法、混合物を含む容器を提供する方法、 方法を実行するためのキットが開示される。【選択図】図４

Description

本開示は、少なくとも１つの内部標準タンパク質を含む混合物に関する。本開示はさらに、混合物を含む容器、混合物を含む容器を調製する方法、サンプル中に存在する標的タンパク質の量を決定する方法、混合物を含む容器を提供する方法に関する。最後に、本開示は、本明細書に開示される方法のいずれかを実施するためのキットに関する。
体液中のタンパク質レベルの測定は、個人の健康状態を評価する上で不可欠な要素である。研究サンプル中のタンパク質レベルの測定は、タンパク質の機能と、例えばさまざまな細胞タイプとの関連性を理解する上で不可欠な要素である。多数のプロテオミクス技術が成功裏に確立され、臨床診療に導入され、分子レベルで患者を説明する情報を提供することができる。１００を超える臨床タンパク質アッセイが米国食品医薬品局(ＦＤＡ)によって血清又は血漿での使用が承認されており、同様に多数の目標が米国の標準化された実験室試験で承認されている。
質量分析（ＭＳ）技術は、検出器の高速化と質量による分離により、複数の標的タンパク質を同時に分析（マルチプレックス）することができる。これは、ＭＳがタンパク質又はペプチドの液体クロマトグラフィー分離（ＬＣ－ＭＳ)と一緒に使用される場合に特に当てはまる。質量分析の読み出しを使用した定量的プロテオミクスは、細胞株、組織、体液などの複雑のサンプルからタンパク質を定量する際に、高感度で堅牢なアッセイを提供する。
標的化されたプロテオミクスは、多くのサンプルにわたって高い再現性で測定される、事前に定義された一連の標的タンパク質に焦点を当てた質量分析ベースのアプローチである。このアプローチは、臨床応用を伴う研究に適していることが示されており、サンプルのマルチプレックス分析を実行することが有利な場合がある。
ＭＳによる検体の定量では、サンプル中の既知量の標準を使用する必要がある。標準の追加により、測定された重ペプチドピークと軽ペプチドピークの間、つまり重同位体で標識されたペプチドからのピークと非標識の内因性ペプチドからのピークの間のアッセイ内正規化が可能になる。
一般的に、同位体標識された標準物質を使用すると、最高レベルの定量的再現性が得られる。ここでは、内部標準は、サンプルの代謝又は化学標識によって、又はサンプルに安定同位体標準(ＳＩＳ)ペプチド又はタンパク質を単純に添加することによって、同位体標識される。
内部標準は通常、目的のサンプルに溶解可能な形式で追加されるが、常にそうであるとは限らない。国際公開第２００５／０３１３０４号は、収集装置の内壁の表面上で凍結乾燥され得る少なくとも１つの内部標準を使用して、質量分析を使用してサンプル又は抽出物中の少なくとも１つの分析物のレベルを定量化する方法を記載する。内部標準は通常、ＰＥＧデンドリマーなどのデンドリマーである。
国際公開第２０１７／２１０１４７号は、少なくとも１つの内部標準を含むバイオマーカーを検出するためのキットを記載しており、このキットは質量分析に使用するように構成することができる。内部標準は凍結乾燥されていてもよい。
タンパク質は、細心の注意を払って取り扱わないと、変性や断片化などにより安定性が低下する可能性がある。プロテオミクス分野でのアプリケーションでは、内部標準の使いやすさが向上すると有益である。
これら及びその他の理由から、さまざまな条件及び保存時の内部標準タンパク質の安定性を高める必要がある。つまり、安定性が向上したタンパク質混合物が求められている。
本開示の目的は、先行技術における課題を少なくとも部分的に軽減または克服し、少なくとも1つの標準タンパク質を含む安定した混合物を得るための手段を提供することである。本開示の別の目的は、標的プロテオミクスにおけるワンポットシステムのための手段を提供することである。ワンポットシステムは、標的タンパク質の大規模コホートなどの複数の標的タンパク質の分析を可能にする。
図１は、試験された同位体標識された内部タンパク質標準が、目的の標的タンパク質に固有のものであり、そして同位体標識されていない「タグ－軽（Ｔａｇ－ｌｉｇｈｔ）」と表示される同一の配列と比較することにより、内部標準タンパク質の定量化に使用される「タグ－重（Ｔａｇ－ｈｅａｖｙ）」と表示されるタグ配列に融合される、一連のアミノ酸を表すことを概略的に示す。
図２は、溶液中に保持された内部標準タンパク質と比較した、内部標準タンパク質の真空乾燥の効果、及び真空乾燥内部標準タンパク質の安定性に対する室温保存の効果の見積もりに使用されるワークフローを示す。
図３は、タグ－重及びタグ－軽ポリペプチド配列のトリプシン消化から生じるペプチドの曲線下の領域のオーバーラップを示す、抽出されたクロマトグラムを示す。
図４は、溶液中に保持された同位体標識された標準タンパク質と、本開示に従って真空乾燥された同位体標識された標準タンパク質との、３回の消化及びタグに基づく定量化からの中央値の比較の結果を示す。
図５は、図５に示すように、０(トリプリケートの中央値)、１及び４週間室温で保存されたすべての真空乾燥同位体標識タンパク質標準の定量結果間のＣＶの密度プロットを示す。
図６は、１００個の真空乾燥内部標準タンパク質の混合物を使用して、異なる消化時間にさらされた１００個のタンパク質の定量精度を推定するために使用されるワークフローを示す。
図７は、ほとんどのペプチド、つまりクラスター２とクラスター４のペプチドの開示に従って、内因性タンパク質と内部標準タンパク質の両方について同じ消化効率を示す、クラスター分析の結果を示す。
図８は、４．６％～６．１％の範囲の中央値(図に示されている)を有する各時点のペプチドごとの３つの技術的複製間の変動係数としての定量化の技術的再現性を示す。
図９は、真空乾燥した内部標準タンパク質の混合物を使用して定量化された全てのタンパク質及び、１６時間の消化後に測定されたそれらの動的範囲を示す。
本開示の第１の側面によれば、固体混合物が提供される。固体混合物は、少なくとも１つの内部標準タンパク質、少なくとも１つのカオトロピック剤又はその誘導体もしくは塩、及び任意には緩衝液を含む。
カオトロピック剤は、水分子間の水素結合ネットワークを破壊できる分子である。本開示の実施形態において有用であり得るカオトロピック剤の非限定的な例は、尿素、グアニジニウム、チオ尿素、ｎ－ブタノール、エタノール、過塩素酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、２－プロパノール及びドデシル硫酸ナトリウムである。いくつかの実施形態によれば、カオトロピック剤は、尿素、グアニジン、チオ尿素、及びそれらの誘導体及び塩から成る群から選択される。
本明細書で使用される「誘導体」という用語は、類似の化合物又は前駆体化合物を意味する場合がある。「誘導体」は、指定された化合物がより大きな構造の一部であることを意味する場合もある。
第１の態様の固体混合物はまさに固体であるため、溶媒を全く含まないか又は最少量しか含まず、従って、標準タンパク質の水溶液又は他の溶液と比較して非常に小さい体積を有する。有利なことには、体積が小さいため、固体混合物は複数の内部標準タンパク質を含むことができ、これが最終サンプル体積に有意な影響を与えることはない。これにより、サンプルのマルチプレックス分析が容易になる。理論に束縛されることを望むものではないが、驚くべきことに、第１の態様の固体混合物中のカオトロピック剤の存在は、その中の少なくとも１つの内部標準タンパク質が以前に知られているタンパク質標準混合物と比較して改善された安定性を提供するという利点を提供することが見出された。
得られた増加または保持された安定性は、経時的に増加又は保持された安定性、及び／又は温度変動に対して増加又は保持された安定性であり得る。このような有益な効果により、長期保存を含む保存が容易になる。例えば、本発明の混合物は、輸送中室温で保存することができ、輸送コストを削減することができる。また、特定の温度を維持する必要がないため、より気候に優しい輸送を提供する可能性がある。さらに、それは、固体混合物を含む製品の製造者と使用者の両方にとって使いやすさを提供する。固体混合物中のタンパク質の安定性が改善又は保持される多くの考えられる理由の１つは、タンパク質が溶液中と同程度に分解又は断片化されないことである。
驚くべきことに、内部標準タンパク質などのタンパク質をカオトロピック剤と一緒に乾燥させ、後で使用するためにタンパク質を再溶解させることができることがわかった。この発見は、蒸発にさらされたタンパク質の再溶解に関連する予想される困難と矛盾していた。実際、そのようなタンパク質は完全に溶解するのが難しいと考えられてきた。溶解レベルは、正確な量の測定に不可欠であるため、定量質量分析やその他のプロテオミクスアプリケーションなどで非常に重要である。プロテオミクス用途で本開示の固体混合物を使用することにより、系統的誤差を最小限に抑えることができる。
特に、組換えにより生成されたタンパク質標準は、緩衝液の保存条件に敏感であり、凝集又は沈殿する可能性が高いことが当技術分野で知られている。この理由は、それらが存在する配合物である可能性があり、その配合物は組換え生産及びその後の精製からの人工物である。これらの問題は、混合物にカオトロピック剤を使用することで軽減又は回避されると考えられる。
取り扱いの観点から、カオトロピック剤は、標準タンパク質の組換え生産中又は合成標準タンパク質の精製中にすでに添加され得ることがさらに有益である。この場合、本明細書に開示される固体混合物の容易且つ迅速な製造が達成される。
本開示の様々な態様の固体混合物、方法及びキットの利点は、サンプルの分析及びタンパク質標準の輸送のワークフローにおいて液体を取り扱う必要性が少ないことである。容器内の液体を輸送する際に生じる問題は、例えば容器の壁又は蓋に液滴が形成されることにより、液体が失われやすいことである。液滴は、容器の望ましくない部分に液体が飛び散ることによって形成されることがある。このように、容器を使用する場合、容器内の全ての液体を取り込むことは困難であり、その結果、容器を定量目的で使用する場合に不正確な測定につながる可能性がある。また、液体の凝縮により、混合物中の内容物の濃度が変化する可能性があり、混合物のメンバーの絶対量の測定精度に影響を与える可能性がある。これは、標準タンパク質を含む容器が、例えば質量分析及び他のプロテオミクス法における定量的測定に使用される場合、明らかな欠点である。液体の取り扱いに関連するこれらの欠点の一部又は全ては、本開示の固体混合物を使用することによって軽減される。
いくつかの実施形態によれば、固体混合物中のカオトロピック剤は、尿素、グアニジン、チオ尿素及びそれらの誘導体及び塩から成る群から選択される。
いくつかの実施形態によれば、固体混合物中のカオトロピック剤は、チオ尿素又はその誘導体もしくは塩である。特定のそのような実施形態によれば、固体混合物中のカオトロピック剤はチオ尿素である。いくつかの実施形態によれば、固体混合物中のカオトロピック剤は、グアニジン又は粗の誘導体もしくは塩である。特定のそのような実施形態によれば、固体混合物中のカオトロピック剤はグアニジンである。好ましい実施形態によれば、固体混合物中のカオトロピック剤は、尿素又はその誘導体もしくは塩である。特定のそのような実施形態によれば、固体混合物中のカオトロピック剤はグアニジンである。
いくつかの実施形態によれば、固化される混合物に添加すると、固体混合物のカオトロピック剤は、少なくとも０．２５Ｍ、例えば少なくとも０．５Ｍ、例えば少なくとも１Ｍ、例えば少なくとも２Ｍ、例えば少なくとも３Ｍ、例えば少なくとも４Ｍ、例えば少なくとも５Ｍ、例えば少なくとも６Ｍ、例えば少なくとも７Ｍ、例えば少なくとも８Ｍの濃度で存在し得る。
本明細書に開示される固体混合物の利点は、混合物中に存在する場合、少なくとも１つの内部標準タンパク質が、少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、例えば少なくとも３週間、例えば少なくとも４週間、例えば少なくとも５週間、例えば少なくとも６週間、例えば少なくとも７週間、例えば少なくとも８週間、例えば少なくとも９週間、例えば少なくとも１０週間、例えば少なくとも３か月、例えば少なくとも６か月、例えば少なくとも１年、例えば少なくとも２年間の保存時に安定したままであることである。
本明細書に開示される固体混合物の利点は、混合物中に存在する場合、少なくとも１つの内部標準タンパク質が、少なくとも４℃、例えば少なくとも７℃、例えば少なくとも１０℃、例えば少なくとも１５℃、例えば少なくとも２０℃、例えば少なくとも２５℃、例えば少なくとも３０℃、例えば少なくとも３５℃、例えば少なくとも４０℃の温度での保存時に安定したままであることである。
さらに、少なくとも１つの内部標準タンパク質は、最大０℃の温度での保存時、例えば最大で－１０℃、例えば最大で－２０℃、例えば最大で－５０℃、例えば最大で-８０℃で保存された場合に安定したままであり得る。
温度変動中の保持された安定性は、現在開示されている固体混合物の使いやすさを改善する。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの内部標準タンパク質は、少なくとも１回の凍結融解サイクル、例えば例えば少なくとも２回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも３回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも４回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも５回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも６回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも７回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも８回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも９回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも１０回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも１５回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも２０回の凍結融解サイクルに供された場合、安定したままである。
関連する実施形態によれば、少なくとも１つの内部標準タンパク質の安定性は、温度が変動しても保持される。すなわち、少なくとも１つの内部標準タンパク質を特定の温度で保存することは厳密には必要でないかもしれない。温度変化が生じても、タンパク質は安定であることが期待される。変動は、最大１０℃以上、例えば２０℃以上、例えば３０℃以上、例えば４０℃以上、例えば５０℃以上、例えば６０℃以上、例えば７０℃以上、例えば８０℃以上、例えば９０℃以上を超える変動の可能性がある。
本明細書で使用される場合、タンパク質の「保持された安定性」という用語は、タンパク質の不可逆的な凝集、分解、または断片化などの望ましくない現象が発生しないこと、すなわち、タンパク質を変性状態から非凝集及び非分解形態に復元する能力（ここでタンパク質は、トリプシン又は別のタンパク質分解タンパク質により切断されやすい）が、保持されることを意図している。安定性は、変動係数（「ＣＶ」）によって決定されることが好ましい。当業者は、サンプル間の変動の測定値が低いこと（例えば、経時的な一連の測定値における測定値）が、保持される安定性の程度が高いことを意味することを理解する。１つの実施形態によれば、「保持された安定性」は、異なるサンプルの比較で示されるＣＶが最大約２０％、最大１５％、最大１０％であることを意味する。当業者に知られているように、安定性の保持又は増加を測定および表示する他の方法も可能である。
タンパク質の安定性を決定する方法の非限定的な例は、ボトムアッププロテオミクス、トップダウンプロテオミクス、又は免疫親和性濃縮とそれに続く比色読み取り又はＬＣ－ＭＳ／ＭＳであろう。タンパク質が凝集しているかどうかを決定する方法の非限定的な例は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び質量分析である。
プロテオミクスの分野では、安定性が維持されることは、長期にわたって定量的な精度と精度が維持されることにもつながる。本明細書で使用される場合、タンパク質の保持された安定性は、同じタンパク質の定量化が、２つの異なる時点で同じ結果、又は少なくとも同じ範囲内の結果をもたらすことを意味する。上記の議論と同様に、「同じ範囲内の結果」は、典型的には、最大で２０％、例えば最大で１５％、例えば最大で１０％の変動係数を含む。場合により、異なる時点の間で、その時点は長期間離れていてもよいが、1つ又は複数の凍結融解サイクルが実施されているか、又は固体混合物が1つ又は複数の特定の温度で保存されている。
本明細書に開示される固体混合物の利点は、混合物が、複数の標準タンパク質などの複数の標準タンパク質を含み得ることである。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの内部標準タンパク質は、少なくとも２つの標準タンパク質、例えば少なくとも５つの標準タンパク質、例えば少なくとも１０の標準タンパク質、例えば少なくとも２０の標準タンパク質、例えば少なくとも３０の標準タンパク質、例えば少なくとも４０の標準タンパク質、例えば少なくとも５０個の標準タンパク質、例えば少なくとも６０個の標準タンパク質、例えば少なくとも７０個の標準タンパク質、例えば少なくとも８０個の標準タンパク質、例えば少なくとも９０個の標準タンパク質、例えば少なくとも１００個の標準タンパク質、例えば少なくとも２００個の標準タンパク質、例えば少なくとも３００個の標準タンパク質、例えば少なくとも４００個の標準タンパク質、例えば少なくとも５００個の標準タンパク質である。
固体混合物中の標準タンパク質は、標的タンパク質などの天然に存在するタンパク質と区別するために標識を含むことが有利であり得る。使用できる標識は当業者に公知であり、重同位体又は任意の他の濃縮同位体で濃縮された安定同位体標識アミノ酸から成る群から選択され得る。好ましい実施形態によれば、内部標準タンパク質は同位体標識を含む。いくつかの実施形態によれば、内部標準タンパク質は、少なくとも１つの同位体標識アミノ酸を含む。いくつかの実施形態によれば、同位体標識は、１５Ｎ、１３Ｃ及び１８Ｏからなる群から選択される。
タンパク質を産生する方法は当技術分野でよく知られている。タンパク質は、例えば、組換えＤＮＡ技術によって産生され得るか、又はペプチドシンセサイザーによって産生され得る。いくつかの実施形態によれば、内部標準タンパク質は組換えタンパク質である。他の実施形態によれば、内部標準タンパク質は合成タンパク質である。
いくつかの実施形態によれば、前記少なくとも１つの内部標準タンパク質及び少なくとも１つのカオトロピック剤を含む混合物は、リン酸又は緩衝特性を有する別の物質をさらに含む。リン酸塩は、使用前に内部標準が保存されている緩衝液に由来する可能性がある。当業者に明らかであるように、緩衝液は、タンパク質含有溶液を緩衝するのに適した任意の緩衝液であり得る。それにより、他の実施形態によれば、前記少なくとも１つの内部標準タンパク質及び少なくとも１つのカオトロピック剤を含む混合物は、緩衝特性を有する別の物質をさらに含む。緩衝液がリン酸を含む場合、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの任意のリン酸緩衝液であり得る。緩衝特性を有する別の化合物を含む緩衝液は、以下の非限定的な例のうちの１つであり得る：トリス、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ及びＡＢＣ（重炭酸アンモニウム）。緩衝液の適切なモル濃度、並びにｐＨ及び任意の添加剤は、当業者によって決定され得る。
いくつかの実施形態によれば、固体混合物は、少なくとも１つの標的タンパク質を含むことが疑われるサンプルをさらに含み得る。例の非限定的なリストとして、前記サンプルは、体液サンプル、細胞サンプル、又は組織サンプルであり得る。当業者は、タンパク質を含み、また使用され得る他のタイプのサンプルを知っている。本明細書に開示される固体混合物での使用に適した体液サンプルの非限定的な例は、血漿、血清、血液、脳脊髄液、乾燥血斑、唾液及び尿である。好ましい実施形態によれば、サンプルは、血漿、血清、血液、脳脊髄液、乾燥血斑及び唾液から成る群から選択された体液サンプルである。前記サンプルをさらに含む固体混合物を保存するために、形成された混合物中に液体が存在しないことが好ましい。いくつかの実施形態によれば、サンプルは固化される。
いくつかの実施形態によれば、内部標準タンパク質は、前記標的タンパク質の断片を含む。他の実施形態によれば、内部標準タンパク質は、さらに標識を含むことを除いて、全長標的タンパク質である。考えられる標識は上記で議論されている。
いくつかの実施形態によれば、固体混合物は、質量分析での使用に適している。使用される質量分析のタイプは、例えば、データ依存取得モードのタンデム質量分析、データ非依存取得モードのタンデム質量分析、又は選択的反応モニタリングモードのタンデム質量分析であり得る。当業者には明らかなように、他のタイプの質量分析法も使用可能である。質量分析機器の質量分析器は、イオントラップ、トリプル四重極、ＥＳＩ－ＴＯＦ、Ｑ－ＴＯＦタイプの機器、オービトラップ、又は適切な質量分解能（＞１，０００）及び感度の任意の他の機器であり得る。
いくつかの実施形態によれば、固体混合物は、標的プロテオミクスなどのプロテオミクスでの使用に適している。
本開示の第２の側面によれば、少なくとも１つの内部標準タンパク質を含む固体混合物を含む容器を調製する方法が提供される。この方法は、少なくとも１つの内部標準タンパク質及び少なくとも１つのカオトロピック剤又はその誘導体もしくは塩を含む溶液を提供する工程、溶液を容器に入れる工程、及び前記溶液から残留液体を除去する工程を含む。これにより、固体混合物を含む容器が得られる。固体混合物は、少なくとも１つの内部標準タンパク質及び少なくとも１つのカオトロピック剤を含む。
いくつかの実施形態によれば、カオトロピック剤は、尿素、グアニジン、チオ尿素及びそれらの誘導体及び塩から成る群から選択される。いくつかの実施形態によれば、カオトロピック剤は、グアニジン又はその誘導体もしくは塩である。いくつかの実施形態によれば、カオトロピック剤は、チオ尿素又はその誘導体もしくは塩である。好ましい実施形態によれば、カオトロピック剤は、尿素又はその誘導体もしくは塩である。
いくつかの実施形態によれば、カオトロピック剤は、溶液中に少なくとも０．２５Ｍ、例えば少なくとも０．５Ｍ、例えば少なくとも１Ｍ、例えば少なくとも２Ｍ、例えば少なくとも３Ｍ、例えば少なくとも４Ｍ、例えば少なくとも５Ｍ、例えば少なくとも６Ｍ、例えば少なくとも７Ｍ、例えば少なくとも８Ｍの濃度で存在する。
いくつかの実施形態によれば、前記少なくとも１つの内部標準タンパク質及び少なくとも１つのカオトロピック剤を含む溶液は、リン酸塩又は緩衝特性を有する別の物質をさらに含む。本開示の第１の態様に関連して上述したように、緩衝特性を有する任意の適切な物質を溶液に含めることができる。
いくつかの実施形態によれば、溶液から残留液体を除去する工程は、減圧によって液体を除去することを含む。好ましい実施形態によれば、減圧によって液体を除去する工程は、真空乾燥によるものである。真空を適用することに加えて、加熱も適用すると有利である。いくつかの実施形態によれば、真空によって液体を除去する工程は、５～６０℃の温度、例えば１０～５０℃、例えば１５～４５℃、例えば２０～４５℃、例えば２５～４５℃、例えば３０～４５℃、例えば３５～４５℃、例えば４０～４５℃、例えば４２℃の温度で実施される。熱を加えると、溶液から残留液体を除去して固体混合物を得るのにかかる時間が短縮される。
減圧により液体を除去する場合、凍結乾燥の手段を使用することも可能である。
本開示の第２の態様の方法の利点は、保存時に少なくとも１つの内部標準タンパク質の保持された安定性を提供することである。保存は、少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、例えば少なくとも３週間、例えば少なくとも４週間、例えば少なくとも５週間、例えば少なくとも６週間、例えば少なくとも７週間、例えば少なくとも８週間、例えば少なくとも９週間、例えば少なくとも１０週間、例えば少なくとも３か月、例えば少なくとも６か月、例えば少なくとも１年、例えば少なくとも２年間、可能である。
本開示の第２の態様の方法の利点は、少なくとも４℃、例えば少なくとも７℃、例えば少なくとも１０℃、例えば少なくとも１５℃、例えば少なくとも２０℃、例えば少なくとも２５℃、例えば少なくとも３０℃、例えば少なくとも３５℃、例えば少なくとも４０℃の温度での保存時に、少なくとも１つの内部標準タンパク質の保持された安定性を提供することである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、最大０℃の温度での保存時、例えば最大で－１０℃、例えば最大で－２０℃、例えば最大で－５０℃、例えば最大で-８０℃で保存された場合、少なくとも１つの内部標準タンパク質の保持された安定性を提供する。いくつかの関連する実施形態によれば、少なくとも１つの内部標準タンパク質の安定性は、本開示の第１の態様に関して上で論じたように、温度が変動しても保持される。
さらに、繰り返しの温度変動に対しても安定性が保たれることが期待される。いくつかの実施形態によれば、この方法は、少なくとも１回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも２回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも３回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも４回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも５回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも６回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも７回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも８回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも９回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも１０回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも１５回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも２０回の凍結融解サイクルに供された場合に保持された安定性を提供する。
いくつかの実施形態によれば、保持された安定性は、本開示の第１の側面に関連して上で論じたように、変動係数によって決定される。
第２の側面の方法の利点は、複数の内部標準タンパク質を同じ容器に添加できることである。このようにして、容器は、複数の内部標準タンパク質を含むように製造され得る。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの内部標準タンパク質は、少なくとも２つの標準タンパク質、例えば少なくとも５つの標準タンパク質、例えば少なくとも１０の標準タンパク質、例えば少なくとも２０の標準タンパク質、例えば少なくとも３０の標準タンパク質、例えば少なくとも４０の標準タンパク質、例えば少なくとも５０個の標準タンパク質、例えば少なくとも６０個の標準タンパク質、例えば少なくとも７０個の標準タンパク質、例えば少なくとも８０個の標準タンパク質、例えば少なくとも９０個の標準タンパク質、例えば少なくとも１００個の標準タンパク質、例えば少なくとも２００個の標準タンパク質、例えば少なくとも３００個の標準タンパク質、例えば少なくとも４００個の標準タンパク質、例えば少なくとも５００個の標準タンパク質である。これにより、サンプル量を大幅に希釈することなく、1つのサンプル内で標的タンパク質の大規模なコホートを同時に分析することができる。
別の実施形態によれば、容器は、少なくとも１つの標的タンパク質、例えば少なくとも５つの標的タンパク質、例えば少なくとも１０の標的タンパク質、例えば少なくとも２０の標的タンパク質、例えば少なくとも３０の標的タンパク質な、例えば少なくとも４０の標的タンパク質、例えば少なくとも５０の標的タンパク質、例えば少なくとも６０の標的タンパク質、例えば少なくとも７０の標的タンパク質、例えば少なくとも８０の標的タンパク質、例えば少なくとも９０の標的タンパク質、例えば少なくとも１００の標的タンパク質、例えば少なくとも２００の標的タンパク質、例えば少なくとも３００の標的タンパク質、例えば少なくとも４００の標的タンパク質、例えば少なくとも５００の標的タンパク質の一重分析で使用するための１つの内部標準タンパク質を含むように製造されてもよい。
本開示の第１の態様に関して上述したように、標的タンパク質などの天然タンパク質と区別するために、内部標準タンパク質が標識を含む場合に有利であり得る。標識の例は上記で説明されている。好ましい実施形態によれば、内部標準タンパク質は同位体標識を含む。いくつかの実施形態によれば、内部標準タンパク質は、少なくとも１つの同位体標識アミノ酸を含む。好ましい実施形態によれば、同位体標識は、１５Ｎ、１３Ｃ及び１８Ｏから成る群から選択される。
本開示の第１の側面に関して上述したように、タンパク質は、例えば、組換えＤＮＡ技術によって産生され得るか、又はペプチドシンセサイザーによって産生され得る。いくつかの実施形態によれば、内部標準タンパク質は組換えタンパク質である。他の実施形態によれば、内部標準タンパク質は合成タンパク質である。
本開示の第３の側面では、第１の側面の任意の実施形態による固体混合物を含む容器が提供される。このような容器の１つの利点は、混合物が容器内に維持され、固体であることによって容器の底に固定され得ることである。このようにして、混合物のメンバーの量及び／又は添加されたサンプル中に存在するメンバーの量を決定する際のより高い精度が可能になる。
さらに、第３の側面は、第２の側面の任意の実施形態による方法を使用して調製された容器を提供する。本開示の第３の側面による容器は、マイクロタイタープレート、バイアル、収集管、ボトル、プレコート濾紙、血液管、Ｗｈａｔｍａｎ紙、ＤＢＳ収集デバイス、乾燥血漿スポットデバイス、乾燥血清スポットデバイス及び培養プレートから成る群から選択され得る。当業者には明らかなように、他のタイプの容器も妥当である。いくつかの実施形態によれば、容器は質量分析での使用に適している。いくつかの実施形態によれば、容器はプロテオミクスでの使用に適している。
本開示の第４の側面では、サンプル中に存在する標的タンパク質の量を決定する方法が提供される。この方法は、本開示の第３の側面による容器を提供する工程を含む。容器を調製する際に使用された前述の態様のどの実施形態に応じて、それはサンプルを含んでも含まなくてもよい。まだサンプルを含んでいない場合、そのようなサンプルは、この側面の方法の工程で追加される。例の非限定的なリストとして、前記サンプルは、体液サンプル、細胞サンプル、又は組織サンプルであり得る。当業者は、タンパク質を含み、また使用され得る他のタイプのサンプルを知っている。容器を調製する際に事前に添加するか、又は第４の側面の方法の実施に関連して添加するかにかかわらず、最終結果は、サンプルが前記混合物に含まれ、それによって試験サンプルを構成することである。この方法はさらに、試験サンプルを分析に供し、分析の結果を使用して、前記内部標準タンパク質と比較してサンプル中の少なくとも１つの標的タンパク質の量を決定する工程を含む。
第４の側面のいくつかの実施形態によれば、内部標準タンパク質は、前記標的タンパク質のフラグメントを含む。他の実施形態によれば、内部標準タンパク質は、上記で論じたように、標識を除いて全長標的タンパク質である。
いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの標的タンパク質の量の決定は、質量分析を使用して実行される。
いくつかの実施形態によれば、この方法は、前記サンプルを蒸発させることをさらに含む。蒸発させる場合、この方法は、サンプルを長期保存する工程をさらに含んでもよい。長期保存は、サンプルを分析し、続いて標準タンパク質と比較してサンプル中の少なくとも１つの標的タンパク質の量を決定する前に行う。いくつかの実施形態によれば、長期保存は少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、例えば少なくとも３週間、例えば少なくとも４週間、例えば少なくとも５週間、例えば少なくとも６週間、例えば少なくとも７週間、例えば少なくとも８週間、例えば少なくとも９週間、例えば少なくとも１０週間、例えば少なくとも３か月、例えば少なくとも６か月、例えば少なくとも１年、例えば少なくとも２年間である。
いくつかの実施形態によれば、サンプルは、血漿、血清、血液、脳脊髄液、乾燥血斑、唾液及び尿から成る群から選択される体液サンプルである。
当業者に明らかであるように、いくつかの分析方法、例えば、質量分析では、分析を行う前に、本開示による固体混合物を適切な液体又は流体サンプルに溶解又は再構成する必要がある。
本開示の第５の側面では、本開示の第４の側面の開示のいずれかによる方法を実施するためのキットが提供される。キットは、本開示の第３の側面による容器と、方法を実施するための説明書とを含む。
実施例１
真空乾燥した同位体標識タンパク質標準の安定性評価
材料及び方法
自社製の安定同位体標識内部標準タンパク質ライブラリーからランダムに96個の内部標準タンパク質を選択し、９６穴プレートに分注した。続いて、定量化タグ（「タグ－軽」、アミノ酸分析により絶対的に定量化）を１ｘＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）及び１Ｍ尿素で最終濃度１０μＭに希釈し、別の９６ウェルプレートに等分した。図１は、内在性タンパク質、内部標準タンパク質、タグ－重配列、及びＴタグ－軽配列の間の関係を示している。内部標準タンパク質を含むプレートからのアリコートを８枚の新しいプレートに分配し、全てのウェルに各内部標準タンパク質が５μｌ(約５０ｐｍｏｌ)含まれるようにした。８枚のプレートのうち５枚を４２℃で３時間真空乾燥し、室温で保存した。その間、残りの３枚のプレートは、内部標準タンパク質が溶解した状態で氷上に置かれた。
消化:真空乾燥した５枚のプレートのうち３枚を、溶液中に保存したアリコート標準の３枚のプレートと一緒に準備した。１０μＭタグ－軽５μｌを添加する前、５５μｌの９０．９ｍＭ炭酸水素アンモニウム(ＡＢＣ)を、真空乾燥した内部標準タンパク質を含む９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、そして溶液に保たれた内部標準タンパク質を含む ９６ウェルプレートの各ウェルに５０μｌの１００ｍＭ ＡＢＣを添加した。６枚のプレート全てを１８０秒間超音波処理し、２００ｎｇのブタトリプシン（Thermo Scientific）を３７℃で一晩加えて消化した。最終濃度０．６％(ｖ／ｖ)になるようにギ酸(ＦＡ)を添加して消化をクエンチし、並列反応モニタリング(ＰＲＭ)モードで動作するＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用してサンプルを分析した。
５枚の真空乾燥プレートのうち残りの２枚は、上記のように、ＡＢＣ及びタグ－軽の添加、トリプシン消化、及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳ－ＰＲＭ分析の前に、室温でそれぞれ１週間及び４週間維持した。ワークフローを図２に示す。
ＬＣ－ＰＲＭを使用した内部標準タンパク質の定量化
定量化は、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ ＭＳ(Thermo Fisher)に接続されたＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＬＣオンラインシステム(Thermo Fisher)を使用して実行された。各内部標準タンパク質２．５ｐｍｏｌをＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ１００トラップカラム(カタログ番号１６４５３５;Thermo Scientific)にロードし、溶媒Ａ(３％アセトニトリル(ＡＣＮ)、０．１ ％ ＦＡ)で８．５μｌ/分で３分間洗浄し、そして次に、分析用ＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ Ｃ１８カラム(カタログ番号ＥＳ８０２;Thermo Scientific)によって分離した。ペプチドの溶出には、０．６μｌ/分で３％～２０％の溶媒 Ｂ (９５ ％ ＡＣＮ、０．１ ％ ＦＡ)の３分間の直線グラジエントを使用した。次に、分析カラムを９９ ％溶媒Ｂで１μｌ／分で３分間洗浄し、０．６μｌ／分で３％Ｂで4分間再平衡化した。
ＭＳはＰＲＭモードで動作し、各サイクルは１５，０００の解像度(ＡＧＣ標的２ｅ５、質量範囲３５０～１，６００ｍ／ｚ、注入時間５５ミリ秒)で実行される1つの完全なＭＳスキャン、その後、スケジュールされた(０．４分ウィンドウ)分離リストによって定義された１５，０００解像度(ＡＧＣ標的１ｅ６、ＮＣＥ ２７、分離ウィンドウ１．５ｍ／ｚ、注入時間１０５ミリ秒)で２０のＰＲＭ ＭＳ／ＭＳスキャンで構成された。
得られたＲＡＷファイルは、Ｓｋｙｌｉｎｅ(v. 20.1.0.76; MacLean et al. (2010), Bioinformatics 26:966-968)に、タグ－軽及びタグ－重の配列と遷移と共にロードされた。ペプチドＤＬＱＡＱＶＶＥＳＡＫ(配列番号:１;表１)の遷移のクロマトグラムを ＲＡＷファイルから抽出し、５つの例について図３に示すようにそれぞれの曲線の下の面積を計算した。重タグ配列ペプチドと軽タグ配列ペプチドとの間の比率をエクスポートし、溶液中の標準タンパク質で得られた比率を、本開示による真空乾燥内部標準タンパク質を使用して得られた比率に対してプロットした（図４）。
結果
溶液中に保持された同位体標識された内部標準タンパク質を使用して得られた軽タグペプチドと重タグペプチドの曲線下面積の比率が、真空乾燥された同位体標識された内部標準タンパク質を使用して得られた対応する比率に対してプロットされた(図４)。結果は、同位体標識された標準が溶液中に保持されていても、分析対象及び酵素消化のサンプルを追加する前に真空乾燥されて固体であったとしても、２つの戦略の間に違いはなく、アクセス可能な同位体標識された標準タンパク質の量は同じであることを示している。
さらに、真空乾燥形式で長期間(１及び４週間)室温で保存されたプレートは、２０％未満の変動係数（ＣＶ）によって証明されるように、同位体標識タンパク質標準の保持された安定性とアクセス可能性を示した。これを図５に示す。1つの同位体標識標準タンパク質のみが２０％を超える ＣＶ を示した(ＣＶ＝２９．１％)。この変異体では、内部標準タンパク質とそのタグ－重配列は、追加されたタグ－軽定量タグよりも１００倍少なく、定量の精度が低下し、この同位体標識標準タンパク質の生産が完全に成功しなかったことを示唆している。実際、溶液中に保持された同じ同位体標識標準タンパク質の３回の定量のＣＶは３６．８％であり(データは示していない)、これは、３つの時点間の定量精度の低下は、タグ－軽ペプチドとタグ－重ペプチドの間の量の大きな違い(オフ比が大きい)が原因であり、そしてこの内部標準タンパク質のアクセス可能な量は同じままであった仮説を支持する。
凍結融解サイクルの繰り返しによるタグ－軽定量化タグの減衰が観察されたが、全ての複製で一定であったため、正規化できた。内部標準タンパク質の量が時間の経過とともに増加することは不可能であるため、３回繰り返される凍結融解サイクルにわたる一定のタグ－軽分解の正規化は合理的である。
Figure 2023537588000002
実施例２
真空乾燥内部標準タンパク質を使用した血漿タンパク質の定量
材料及び方法
１００個のヒト内因性血漿タンパク質を標的とする１００個の同位体標識内部標準タンパク質（１Ｍ尿素及び１ｘＰＢＳ中)を単一の容器で混合した。その混合物を１５本の試験管に等分し、４２℃で３時間真空乾燥した。デオキシコール酸ナトリウム(ＳＤＣ)をＭｉｌｌｉ－Ｑ水で希釈し、真空乾燥した同位体標識標準に加えて、希釈血漿の添加後のＳＤＣ、尿素、及びＰＢＳの最終濃度が１％ＳＤＣ、１Ｍ尿素、及び１ｘＰＢＳになるようにした。
ヒト対象(男性３人、女性２人)からの血漿のプールを１ｘＰＢＳで１０倍に希釈した。内部標準タンパク質の真空乾燥混合物を含む１５本の試験管のそれぞれに、希釈していない血漿０．５μｌに相当する量を加えた。サンプルを、１０ｍＭ ＤＴＴで３７℃で１時間、５０ｍＭ ＣＡＡで室温で３０分間、暗所で処理した。ＳＤＣを１ｘＰＢＳで最終濃度０．２５％(ｗ／ｗ)に希釈した後、ブタトリプシン(Thermo Scientific)を酵素:基質比１：５０で添加した。消化は３７℃で行い、１、２、３、４、１６時間後に０．５％(ｖ／ｖ)トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)でクエンチした(図６)。クエンチしたサンプルを１３，２００ｒｃｆで５分間遠心分離し、上清液を社内で調製した３層Ｃ１８ＳｔａｇｅＴｉｐｓで脱塩した(Rappsilber et al. (2007), Nat. Protoc. 2:1896-1906)。簡単に説明すると、ＳｔａｇｅＴｉｐｓを５０μｌの１００％ＡＣＮで活性化し、５０μｌの０．１％ＴＦＡで平衡化した後、生血漿中の１５μｇのタンパク質に相当する消化サンプルを添加した。Ｃ１８マトリックスを０．１％ＴＦＡで２回洗浄し、ペプチドを８０％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡで２段階で溶出した。溶出したペプチドを４２℃で真空乾燥した。脱塩したサンプルを溶媒Ａに溶解し、希釈していない血漿中のタンパク質４μｇに相当する量を、データに依存しない取得(ＤＩＡ)を使用してＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析にかけた。
ＬＣ－ＤＩＡを使用した内部標準タンパク質の定量化:
分析は、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ ＭＳ(Thermo Fisher)に接続されたＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＬＣオンラインシステム(Thermo Fisher)を使用して実行された。まず、未希釈の血漿中のタンパク質４μｇに相当する量をトラップカラム(カタログ番号１６０４３８、Thermo Scientific)に負荷し、溶媒Ａで１５μl/分の流速で１分間洗浄した。次に、ペプチドを１５ｃｍ分析カラム(カタログ番号ＥＳ８０６Ａ、Thermo Scientific)で分離した。ペプチドの溶出には、３．６ μｌ／分 の流速で１％～３２％の溶媒Ｂの範囲の直線勾配を使用した５０分メソッドを使用した。分析カラムを９９％の溶媒Ｂで３０秒間洗浄した後、１％～９９％ の溶媒Ｂまでの２つのシーソー勾配で洗浄した。その後、カラムを１％の溶媒Ｂで１分間再平衡化した。
ＭＳは、ＤＩＡモードで作動し、各サイクルは、解像度６０，０００(ＡＧＣ標的３ｅ６、質量範囲３００～１，２００ｍ／ｚ、注入時間１０５ｍ秒)で実行される１回の完全なＭＳスキャンと、それに続く、３５０～１，０００ｍ／ｚの範囲の包含リストによって定義される、３０，０００解像度 (ＡＧＣ 標的１ｅ６、ＮＣＥ２６、 分離ウィンドウ １２ ｍ／ｚ、注入時間 ５５ｍ秒)での３０回のＤＩＡ ＭＳ／ＭＳスキャンとを含む。得られた ＲＡＷ ファイルを Ｓｋｙｌｉｎｅ (v. 20.1.0.76; MacLean et al. (2010), Bioinformatics 26:966-968) にロードし、内部タンパク質標準からの重ペプチドと内因性タンパク質からのペプチドの曲線下面積の比率をエクスポートし、そして 分析した。
結果
クラスター分析は、５つの時点で内因性タンパク質 (光) と同位体標識された標準タンパク質 (重) からエクスポートされたペプチド比を使用して実行され、ペプチドの ４つのクラスターが同定された (図 ７)。 群を抜いて最も多くのメンバーを持つ ２つのクラスター (クラスター２及び４) は、経時変化がほとんどなく、同位体標識タンパク質標準と対応するペプチド領域の対応する内因性タンパク質の両方の消化効率が、時間の経過を通じて一定であることを示している。クラスター１ は、そのクラスターの少数のメンバーについて、時間経過中に内因性タンパク質よりも内部標準タンパク質の消化効率が高いことを示している。 これにより、１６時間後に平衡に達する前の線の正の勾配によって示されるように、内因性タンパク質からの対応するペプチドよりも内部標準タンパク質からの特定のペプチドの量が多くなる。 一方、クラスター３のいくつかのメンバーは、同位体標識タンパク質標準よりも内因性タンパク質の消化効率が高くなる。
最も重要なことは、定量化されたペプチド クラスターの場所や消化時間に関係なく、全てのクラスターで定量化の精度が安定して高く維持され、ＣＶ の中央値が ４．６％～６．１％ の範囲にあることである (図８)。 これにより、短い消化時間と迅速なサンプル調製プロトコルが可能になり、定量化が非常に正確になる。
１００個の血漿タンパク質のセットが、本開示に従って真空乾燥された１００個の内部標準タンパク質の混合物を使用して定量化された。 タンパク質は２９２のペプチドを使用して定量化され、４桁以上の血漿濃度範囲をカバーしている(１０－２－１０２、図 ９)。 技術的なレプリケート間の ＣＶ の中央値は ４．６％ であり、開発されたアッセイの精度が高いことを示している。
実施形態の項目別リスト
１．以下：
－ 少なくとも １つの内部標準タンパク質；
－ 少なくとも１つのカオトロピック剤又はその誘導体もしくは塩；及び
－ 任意には、緩衝液、
を含む固体混合物。
２．前記カオトロピック剤が、尿素、グアニジン、チオ尿素、及びそれらの誘導体及び塩から成る群から選択される、項目１に記載の固体混合物。
３．前記カオトロピック剤が、尿素又はその誘導体もしくは塩である、項目１に記載の固体混合物。
４．前記カオトロピック剤が、尿素である、項目３に記載の固体混合物。
５．前記カオトロピック剤が、グアニジン又はその誘導体もしくは塩である、項目１に記載の固体混合物。
６．前記カオトロピック剤が、チオ尿素又はその誘導体もしくは塩である、項目１に記載の固体混合物。
７．前記少なくとも１つの内部標準タンパク質が、少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、例えば少なくとも３週間、例えば少なくとも４週間、例えば少なくとも５週間、例えば少なくとも６週間、例えば少なくとも７週間、例えば少なくとも８週間、 例えば少なくとも９週間、例えば少なくとも １０ 週間、例えば少なくとも３か月、例えば少なくとも６か月、例えば少なくとも１ 年、例えば少なくとも ２年間の保存時に安定したままである、項目１～６のいずれか１項目に記載の固体混合物。
８．前記少なくとも１つの内部標準タンパク質が、少なくとも４℃、例えば少なくとも７℃、例えば少なくとも１０℃、例えば少なくとも１５℃、例えば少なくとも２０℃、例えば少なくとも２５℃、例えば少なくとも３０℃、例えば少なくとも３５℃、例えば少なくとも４０℃の温度での保存時に安定したままである、項目１～７のいずれか１項目に記載の固体混合物。
９．前記少なくとも１つの内部標準タンパク質が、最大０℃の温度での保存時、例えば最大で－１０℃、例えば最大で－２０℃、例えば最大で－５０℃、例えば最大で-８０℃で保存された場合に安定したままである、項目１～８のいずれか１項目に記載の固体混合物。
１０．前記少なくとも１つの内部標準タンパク質は、少なくとも１回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも ２ 回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも ３ 回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも４回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも ５回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも６回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも ７回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも８回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも９回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも１０ 回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも１５回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも２０回の凍結融解サイクルに供された場合、安定したままである、項目１～９のいずれか１項目に記載の固体混合物。
１１．前記の安定性が、変動係数によって決定される、項目７～１０のいずれか１項目に記載の固体混合物。
１２．前記少なくとも１つの内部標準タンパク質が、少なくとも２つの標準タンパク質、例えば少なくとも５つの標準タンパク質、例えば少なくとも１０の標準タンパク質、例えば少なくとも２０の標準タンパク質、例えば少なくとも３０の標準タンパク質、例えば少なくとも４０の標準タンパク質、例えば少なくとも５０個の標準タンパク質、例えば少なくとも６０個の標準タンパク質、例えば少なくとも７０個の標準タンパク質、例えば少なくとも８０個の標準タンパク質、例えば少なくとも９０個の標準タンパク質、例えば少なくとも１００個の標準タンパク質、例えば少なくとも２００個の標準タンパク質、例えば少なくとも３００個の標準タンパク質、例えば少なくとも４００個の標準タンパク質、例えば少なくとも５００個の標準タンパク質である、項目１～１１のいずれか１項目に記載の固体混合物。
１３．前記内部標準タンパク質が同位体標識を含む、項目１～１２のいずれか１項目に記載の固体混合物。
１４．前記内部標準タンパク質が、少なくとも１つの同位体標識アミノ酸を含む、項目１～１３のいずれか１項目に記載の固体混合物。
１５．前記同位体標識が、１５Ｎ、１３Ｃ及び１８Ｏから成る群から選択される、項目１３～１４のいずれか１項目に記載の固体混合物。
１６．前記内部標準タンパク質が組換えタンパク質である、項目１～１５のいずれか１項目に記載の固体混合物。
１７．前記内部標準タンパク質が合成タンパク質である、項目１～１５のいずれか１項目に記載の固体混合物。
１８．前記少なくとも１つの内部標準タンパク質及び少なくとも１つのカオトロピック剤を含む前記混合物が、リン酸塩をさらに含む、項目１～１７のいずれか１項目に記載の固体混合物。
１９．少なくとも1つの標的タンパク質を含むと疑われるサンプルをさらに含む、項目１～１８のいずれか１項目に記載の固体混合物。
２０．前記サンプルが、血漿、血清、血液、脳脊髄液、乾燥血斑、唾液及び尿から成る群から選択される体液サンプルである、項目１９に記載の固体混合物。
２１．前記のサンプルが固化される、項目１９～２０のいずれか１項目に記載の固体混合物。
２２．前記内部標準タンパク質が、前記標的タンパク質のフラグメントを含む、項目１９～２１のいずれか１項目に記載の固体混合物。
２３．質量分析で使用するための、項目１～２１のいずれか１項目に記載の固体混合物。
２４．プロテオミクスで使用するための、項目１～２３のいずれか１項目に記載の固体混合物。
２５．少なくとも１つの内部標準タンパク質を含む固体混合物を含む容器を調製するための方法であって、
－前記少なくとも１つの内部標準タンパク質及び、尿素、グアニジン及びそれらの誘導体及び塩から成る群から選択された少なくとも１つのカオトロピック剤を含む溶液を提供し；
－ 前記溶液を容器に入れ、
－ 前記溶液から残留液体を除去し、
それにより、前記少なくとも１つの内部標準タンパク質及び前記少なくとも１つのカオトロピック剤を含む固体混合物を含む容器を得ることを含む方法。
２６．前記カオトロピック剤が、尿素、グアニジン、チオ尿素、及びそれらの誘導体及び塩から成る群から選択される、項目２５に記載の方法。
２７．前記カオトロピック剤が、尿素又はその誘導体もしくは塩である、項目２５～２６のいずれか１項目に記載の方法。
２８．前記カオトロピック剤が、グアニジン又はその誘導体もしくは塩である、項目２５～２６のいずれか１項目に記載の方法。
２９．前記カオトロピック剤が、チオ尿素又はその誘導体もしくは塩である、項目２５～２６のいずれか１項目に記載の方法。
３０．前記カオトロピック剤が、少なくとも０．５Ｍ、例えば少なくとも１Ｍ、例えば少なくとも２Ｍ、例えば少なくとも３Ｍ、例えば少なくとも４Ｍ、例えば少なくとも５Ｍ、例えば少なくとも６Ｍ、例えば少なくとも７Ｍ、例えば少なくとも８Ｍの濃度で前記溶液中に存在する、項目２５～２９のいずれか１項目に記載の方法。
３１．前記少なくとも１つの内部標準タンパク質及び少なくとも１つのカオトロピック剤を含む前記溶液が、リン酸塩をさらに含む、項目２５～３０のいずれか１項目に記載の方法。
３２．前記溶液から残留液体を除去する工程が、減圧によって液体を除去することを含む、項目２５～３１のいずれか１項目に記載の方法。
３３．減圧によって液体を除去する工程が、真空乾燥によるものである、項目３２に記載の方法。
３４．真空によって液体を除去する工程が、５～６０℃の温度、例えば１０～５０℃、例えば１５～４５ ℃、例えば２０～４５℃、例えば２５～４５℃、例えば３０～４５℃、例えば３５～４５ ℃、例えば４０～４５℃、例えば４２℃の温度でである、項目３２～３３のいずれか１項目に記載の方法。
３５．減圧により液体を除去する工程が、凍結乾燥によってである、項目３２に記載の方法。
３６．前記方法が、少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、例えば少なくとも３週間、例えば少なくとも４週間、例えば少なくとも５週間、例えば少なくとも６週間、例えば少なくとも７週間、例えば少なくとも８週間、 例えば少なくとも９週間、例えば少なくとも １０ 週間、例えば少なくとも３か月、例えば少なくとも６か月、例えば少なくとも１ 年、例えば少なくとも ２年間の保存時に、前記少なくとも１つの内部標準タンパク質の保持された安定性を提供する、項目２５～３６のいずれか１項目に記載の方法。
３７．前記方法が、少なくとも４℃、例えば少なくとも７℃、例えば少なくとも１０℃、例えば少なくとも１５℃、例えば少なくとも２０℃、例えば少なくとも２５℃、例えば少なくとも３０℃、例えば少なくとも３５℃、例えば少なくとも４０℃の温度での保存時に、前記少なくとも１つの内部標準タンパク質の保持された安定性を提供する、項目２５～３６のいずれか１項目に記載の方法。
３８．前記方法が、最大で０℃、例えば最大で－１０℃、例えば最大で－２０℃、例えば最大で－５０℃、例えば最大で-８０℃での温度での保存時に、前記少なくとも１つの内部標準タンパク質の保持された安定性を提供する、項目２５～３７のいずれか１項目に記載の方法。
３９．前記方法が、少なくとも１回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも ２ 回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも ３ 回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも４回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも ５回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも６回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも ７回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも８回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも９回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも１０ 回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも１５回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも２０回の凍結融解サイクル、例えば少なくとも５０回の凍結融解サイクルに供された場合に、前記少なくとも１つの内部標準タンパク質の保持された安定性を提供する、項目２５～３８のいずれか１項目に記載の方法。
４０．前記保持された安定性が、変動係数によって決定される、項目３７～３９のいずれか１項目に記載の方法。
４１．前記少なくとも１つの内部標準タンパク質が、少なくとも２つの標準タンパク質、例えば少なくとも５つの標準タンパク質、例えば少なくとも１０の標準タンパク質、例えば少なくとも２０の標準タンパク質、例えば少なくとも３０の標準タンパク質、例えば少なくとも４０の標準タンパク質、例えば少なくとも５０個の標準タンパク質、例えば少なくとも６０個の標準タンパク質、例えば少なくとも７０個の標準タンパク質、例えば少なくとも８０個の標準タンパク質、例えば少なくとも９０個の標準タンパク質、例えば少なくとも１００個の標準タンパク質、例えば少なくとも２００個の標準タンパク質、例えば少なくとも３００個の標準タンパク質、例えば少なくとも４００個の標準タンパク質、例えば少なくとも５００個の標準タンパク質である、項目２５～４０のいずれか１項目に記載の方法。
４２．前記内部標準タンパク質が同位体標識を含む、項目２５～４１のいずれか１項目に記載の方法。
４３．前記内部標準タンパク質が、少なくとも１つの同位体標識アミノ酸を含む、項目２５～４２のいずれか１項目に記載の方法。
４４．前記同位体標識が、１５Ｎ、１３Ｃ及び１８Ｏから成る群から選択される、項目２５～４３のいずれか１項目に記載の方法。
４５．前記内部標準タンパク質が組換えタンパク質である、項目２５～４４のいずれか１項目に記載の方法。
４６．前記内部標準タンパク質が合成タンパク質である、項目２５～４５のいずれか１項目に記載の方法。
４７．項目１～１８のいずれか１項目に記載の固体混合物を含む容器。
４８．項目１９～２２のいずれか１項目に記載の固体混合物を含む容器。
４９．項目２５～４６のいずれか１項目に記載の方法により入手できる容器。
５０．マイクロタイタープレート、バイアル、収集管、ボトル、プレコート濾紙、血液管、Ｗｈａｔｍａｎ紙、ＤＢＳ収集デバイス、乾燥血漿スポット デバイス、乾燥血清スポット デバイス及び培養プレートから成る群から選択される、項目４７～４９のいずれか１項目に記載の容器。
５１．質量分析で使用するための、項目４７～５０のいずれか１項目に記載の容器。
５２．プロテオミクスで使用するための、項目４７～５１のいずれか１項目に記載の容器。
５３．サンプル中に存在する標的タンパク質の量を決定するための方法であって、
－項目４７に記載の容器を提供し；
－少なくとも１つの標的タンパク質を含むと疑われるサンプルを前記混合物に加え、それによって試験サンプルを調製し、
－ 前記試験サンプルを分析にかけ、
－ 分析の結果を使用して、内部標準タンパク質と比較することにより、サンプル中の少なくとも１つの標的タンパク質の量を決定することを含む方法。
５４．サンプル中に存在する標的タンパク質の量を決定するための方法であって、
－項目４８に記載の容器を提供し；
－ 前記サンプルを分析にかけ、
－ 分析の結果を使用して、内部標準タンパク質と比較することにより、サンプル中の少なくとも１つの標的タンパク質の量を決定することを含む方法。
５５．サンプル中に存在する標的タンパク質の量を決定するための方法であって、
－項目４９に記載の容器を提供し；
－ まだ存在しない場合、少なくとも１つの標的タンパク質を含むと疑われるサンプルを前記固体混合物に加え、それによって試験サンプルを調製し、
－ 前記試験サンプルを分析にかけ、
－ 分析の結果を使用して、内部標準タンパク質と比較することにより、サンプル中の少なくとも１つの標的タンパク質の量を決定することを含む方法。
５６．前記内部標準タンパク質が、前記標的タンパク質の断片を含む、項目５１～５４のいずれか１項目に記載の方法。
５７．前記分析が、質量分析法を使用して実行される、項目５１～５６のいずれか１項目に記載の方法。
５８．前記方法が、前記サンプルから残留液体を除去することをさらに含む、項目５１～５７のいずれか１項目に記載の方法。
５９．前記方法が、前記サンプルを分析する工程及び、前記標準タンパク質との比較により前記サンプル中の前記少なくとも１つの標的タンパク質の量を決定する工程の前に、前記サンプルを長期保存する工程を含む、項目５１～５８のいずれか１項目に記載の方法。
６０．前記長期保存は少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、例えば少なくとも３週間、例えば少なくとも４週間、例えば少なくとも５週間、例えば少なくとも６週間、例えば少なくとも７週間、例えば少なくとも８週間、 例えば少なくとも９週間、例えば少なくとも １０ 週間、例えば少なくとも３か月、例えば少なくとも６か月、例えば少なくとも１ 年、例えば少なくとも２年間である、項目５９に記載の方法。
６１．前記サンプルが、血漿、血清、血液、脳脊髄液、乾燥血斑、唾液及び尿から成る群から選択された体液サンプルである、項目５３～６０のいずれか１項目に記載の方法。
６２．項目５３～６１のいずれか１項目に記載の方法を実施するためのキットであって、
－項目４７～５２のいずれか１項目に記載の容器、及び
－前記方法を実行するための説明書、
を含むキット。

Claims (14)

  1. 以下：
    － 少なくとも １つの内部標準タンパク質；
    － 少なくとも１つのカオトロピック剤又はその誘導体もしくは塩；及び
    － 任意には、緩衝液、
    を含む固体混合物。
  2. 前記カオトロピック剤が、尿素、グアニジン、チオ尿素、及びそれらの誘導体及び塩から成る群から選択される、請求項１に記載の固体混合物。
  3. 少なくとも１つの標的タンパク質を含むと疑われるサンプルをさらに含む、請求項１又は２に記載の固体混合物。
  4. 前記内部標準タンパク質が、前記標的タンパク質のフラグメントを含む、請求項３に記載の固体混合物。
  5. 少なくとも１つの内部標準タンパク質を含む固体混合物を含む容器を調製するための方法であって、
    －前記少なくとも１つの内部標準タンパク質及び、尿素、グアニジン及びそれらの誘導体及び塩から成る群から選択された少なくとも１つのカオトロピック剤を含む溶液を提供し；
    － 前記溶液を容器に入れ、
    － 前記溶液から残留液体を除去し、
    それにより、前記少なくとも１つの内部標準タンパク質及び前記少なくとも１つのカオトロピック剤を含む固体混合物を含む容器を得ることを含む方法。
  6. 前記カオトロピック剤が、尿素、グアニジン、チオ尿素、及びそれらの誘導体及び塩から成る群から選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記カオトロピック剤が、少なくとも０．５Ｍ、例えば少なくとも１Ｍ、例えば少なくとも２Ｍ、例えば少なくとも３Ｍ、例えば少なくとも４Ｍ、例えば少なくとも５Ｍ、例えば少なくとも６Ｍ、例えば少なくとも７Ｍ、例えば少なくとも８Ｍの濃度で前記溶液中に存在する、請求項５又は６に記載の方法。
  8. 前記溶液から残留液体を除去する工程が、減圧によって液体を除去することを含む、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 請求項１～４のいずれか１項に記載の固体混合物を含むか、又は請求項５～８のいずれか１項に記載の方法によって得られる容器。
  10. サンプル中に存在する標的タンパク質の量を決定するための方法であって、
    －請求項９に記載の容器を提供し；
    － まだ存在しない場合、少なくとも１つの標的タンパク質を含むと疑われるサンプルを前記固体混合物に加え、それによって試験サンプルを調製し、
    － 前記試験サンプルを分析にかけ、
    － 分析の結果を使用して、内部標準タンパク質と比較することにより、サンプル中の少なくとも１つの標的タンパク質の量を決定することを含む方法。
  11. 前記内部標準タンパク質が、前記標的タンパク質のフラグメントを含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記サンプルを分析する工程及び、前記標準タンパク質との比較により前記サンプル中の前記少なくとも１つの標的タンパク質の量を決定する工程の前に、前記サンプルを長期保存する工程を含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 前記サンプルが、血漿、血清、血液、脳脊髄液、乾燥血斑、唾液及び尿から成る群から選択された体液サンプルである、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 請求項１０～１３のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、
    －請求項９に記載の容器、及び
    －前記方法を実行するための説明書、
    を含むキット。
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