BR112021001372A2 - ensaio, e, composição. - Google Patents

Abstract

ENSAIO, E, COMPOSIÇÃO. A presente divulgação fornece métodos e composições para determinar a abundância e/ou concentração de biomarcadores de proteína em uma amostra biológica.

Description

1 / 46 ENSAIO, E, COMPOSIÇÃO

PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica a prioridade e o benefício do Pedido Provisório dos EUA de nº 62/715.973, depositado em 8 de agosto de 2018, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O pedido instantâneo contém uma listagem de sequências que foi enviada em formato ASCII por meio de EFS-Web e é incorporada por meio deste documento por referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 29 de julho de 2019, é chamada de “REGE-015- 001WO_SeqList_ST25.txt” e tem 50.295 bytes.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] C1q é uma proteína importante e passível de fármaco envolvida no sistema complemento do sistema imunológico inato. Atualmente, existem métodos imunológicos para determinar a concentração de C1q em amostras biológicas derivadas de humanos. No entanto, existem imunoreagentes limitados para avaliar a abundância de C1q em amostras derivadas de primatas não humanos, um organismo modelo importante em pesquisas e ensaios pré-clínicos. Assim, há uma necessidade na técnica de métodos e composições direcionados à determinação da concentração de C1q em amostras derivadas de humanos, primatas não humanos e outros organismos modelo que sejam rápidos, específicos e precisos e que não requeiram o desenvolvimento caro e demorado de imunoreagentes. A presente divulgação aborda essas necessidades.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[004] A presente divulgação fornece um ensaio que compreende: (1) colocar uma amostra biológica em contato com pelo menos uma enzima proteolítica para produzir pelo menos um fragmento de peptídeo da proteína

2 / 46 C1q presente na amostra biológica; e (2) realizar espectrometria de massa de monitoramento de reação selecionada (SRM-MS) para medir a abundância de pelo menos um fragmento de peptídeo C1q, em que a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q determina a concentração de C1q na amostra biológica.

[005] O ensaio anterior pode compreender ainda, entre a etapa (1) e a etapa (2), adicionar à amostra biológica pelo menos um fragmento de peptídeo C1q sintético marcado compreendendo uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q.

[006] Medir a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q no ensaio anterior pode compreender comparar um sinal correspondente ao pelo menos um peptídeo C1q gerado por SRM-MS com uma curva padrão.

[007] A presente divulgação fornece um ensaio que compreende: (1) colocar uma amostra biológica em contato com pelo menos uma enzima proteolítica para produzir pelo menos um fragmento de peptídeo da proteína C1q presente na amostra biológica; (2) realizar espectrometria de massa de monitoramento de reação selecionada (SRM-MS) para gerar um sinal correspondente ao pelo menos um fragmento de peptídeo C1q; e (3) determinar a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q comparando o sinal a uma curva padrão, em que a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q determina a concentração de C1q na amostra biológica.

[008] O ensaio anterior pode compreender ainda, entre a etapa (1) e a etapa (2), adicionar à amostra biológica pelo menos um fragmento de peptídeo sintético marcado compreendendo uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q, e entre a etapa (2) e a etapa (3), realizar SRM-MS para gerar um sinal correspondente ao pelo menos um peptídeo sintético marcado.

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[009] A amostra biológica pode ser uma amostra de sangue. A amostra biológica pode ser uma amostra de humano. A amostra biológica pode ser uma amostra de primata não humano.

[0010] O pelo menos um fragmento de peptídeo pode compreender pelo menos 5 aminoácidos. O pelo menos um fragmento de peptídeo pode compreender um peptídeo selecionado da Tabela 2.

[0011] O pelo menos um fragmento de peptídeo pode compreender SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26), IAFSATR (SEQ ID NO: 29) ou QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36). O pelo menos um fragmento de peptídeo pode compreender pelo menos dois de SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26), IAFSATR (SEQ ID NO: 29) ou QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36). O pelo menos um fragmento de peptídeo pode compreender cada um de SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26), IAFSATR (SEQ ID NO: 29) e QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36).

[0012] A espectrometria de massa de monitoramento de reação selecionada pode ser LC-SRM-MS/MS.

[0013] A pelo menos uma enzima proteolítica pode ser tripsina.

[0014] Uma curva padrão pode ser produzida usando um método que compreende: (a) preparar pelo menos dois padrões de concentração de C1q misturando quantidades conhecidas de proteína C1q purificada e soro depletado de C1q; (b) adicionar aos pelo menos dois padrões de concentração de C1q pelo menos um fragmento de peptídeo sintético marcado com uma sequência de aminoácidos idêntica ao pelo menos um fragmento de peptídeo C1q que espera-se que seja produzido após o contato do padrão de concentração de C1q com uma enzima proteolítica; (c) colocar os pelo menos dois padrões de concentração de C1q marcados em contato com uma enzima proteolítica para produzir pelo menos um fragmento de peptídeo C1q; (d) realizar espectrometria de massa de monitoramento de reação selecionada para determinar a força do sinal que corresponde ao pelo menos um

4 / 46 fragmento de peptídeo C1q e a força do sinal que corresponde ao pelo menos um fragmento de peptídeo sintético marcado em cada um dos pelo menos dois padrões de concentração de C1q marcados; e (e) determinar uma curva padrão usando os sinais e as quantidades conhecidas de proteína C1q.

[0015] A presente divulgação fornece uma composição compreendendo pelo menos um peptídeo sintético isolado, a referida composição compreendendo pelo menos um peptídeo sintético isolado com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da proteína C1q.

[0016] Composição compreendendo pelo menos um peptídeo sintético isolado, a referida composição caracterizada por compreender pelo menos um peptídeo sintético isolado com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da proteína C1q, em que a sequência de aminoácidos selecionada a partir da proteína C1q é a sequência de um fragmento de peptídeo C1q gerada pelo contato de C1q com pelo menos uma enzima proteolítica.

[0017] A proteína C1q pode ser de um ser humano. A proteína C1q pode ser de um primata não humano.

[0018] O pelo menos um peptídeo sintético isolado pode compreender pelo menos 5 aminoácidos.

[0019] A sequência de aminoácidos selecionada da proteína C1q pode ser a sequência de um fragmento de peptídeo C1q gerado pelo contato de C1q com pelo menos uma enzima proteolítica. A pelo menos uma enzima proteolítica pode ser tripsina.

[0020] O pelo menos um peptídeo sintético isolado pode ser marcado.

[0021] O pelo menos um peptídeo sintético isolado pode compreender um peptídeo selecionado da Tabela 2.

[0022] O pelo menos um peptídeo sintético isolado pode compreender SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26), IAFSATR (SEQ ID NO: 29) ou QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36). A cisteína no peptídeo sintético

5 / 46 SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26) pode ser modificada. A modificação pode ser carbamidometilação.

[0023] A presente divulgação fornece uma composição compreendendo pelo menos um par de íons de transição, a referida composição compreendendo pelo menos um par de íons de transição da proteína C1q, em que o pelo menos um par de íons de transição consiste em um íon precursor com uma m/z correspondente e um fragmento de íon com uma m/z de íon correspondente.

[0024] A proteína C1q pode ser de um ser humano. A proteína C1q pode ser de um primata não humano.

[0025] A presente divulgação fornece uma composição compreendendo pelo menos um par de íons de transição, a referida composição compreendendo pelo menos um par de íons de transição da proteína C1q, em que o pelo menos um par de íons de transição consiste em um íon precursor com uma m/z correspondente e um fragmento de íon com uma m/z de íon correspondente, e em que o par de íons de transição é selecionado do precursor SLGFC(Cam)DTTNK (SEQ ID NO: 41) par de transição 571.8-942.3, precursor IAFSATR (SEQ ID NO: 29) par de transição

383.1-581.1 e precursor QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36) par de transição 487.0-350.3. Qualquer um dos aspectos acima pode ser combinado com qualquer outro aspecto.

[0026] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém técnico no assunto à qual esta divulgação pertence. No relatório descritivo as formas singulares também incluem o plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário; como exemplos, os termos "um", "uma" e "o", "a" são entendidos como singulares ou plural e o termo "ou" é considerado inclusivo. A título de exemplo, “um elemento” significa um ou mais elementos. Ao longo do relatório descritivo,

6 / 46 a palavra "compreendendo" ou variações como "compreende" ou "que compreende" serão entendidas como implicando a inclusão de um elemento, número inteiro ou etapa declarados, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas. "Cerca de" pode ser entendido como dentro de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% ou 0,01% do valor declarado. A menos que de outra forma claro no contexto, todos os valores numéricos fornecidos neste documento são modificados pelo termo "cerca de".

[0027] Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou no teste da presente divulgação, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todos os pedidos, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas neste documento são incorporados por referência em sua totalidade. As referências citadas neste documento não são admitidas como sendo do estado da técnica à invenção reivindicada. Em caso de conflito, o presente Relatório Descritivo, incluindo as definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitantes. Outras características e vantagens da divulgação serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e reivindicação.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0028] As características acima e outras serão mais claramente apreciadas a partir da seguinte descrição detalhada quando considerada em conjunto com as figuras anexas.

[0029] A Figura 1 é o alinhamento da sequência de aminoácidos da subunidade A de C1q de humano, macaco, camundongo e rato.

[0030] A Figura 2 é o alinhamento da sequência de aminoácidos da subunidade B de C1q de humano, macaco, camundongo e rato.

[0031] A Figura 3 é o alinhamento da sequência de aminoácidos da

7 / 46 subunidade C de C1q de humano, macaco, camundongo e rato.

[0032] A Figura 4 é uma curva de calibração gerada usando os métodos da presente divulgação e um peptídeo derivado da subunidade A da proteína C1q.

[0033] A Figura 5 é uma curva de calibração gerada usando os métodos da presente divulgação e peptídeo derivado da subunidade B da proteína C1q.

[0034] A Figura 6 é uma curva de calibração gerada usando os métodos da presente divulgação e um peptídeo derivado da subunidade C da proteína C1q.

[0035] A Figura 7 é uma série de cromatogramas LC-SRM-MS/MS de peptídeos selecionados derivados das subunidades A, B e C de C1q em amostras de preparação em branco, em branco duplo, em branco e de Limite inferior de quantificação (LLOQ).

[0036] A Figura 8 é uma série de cromatogramas LC-SRM-MS/MS de peptídeos selecionados derivados das subunidades A, B e C de C1q no Limite de Detecção (LOD) e amostras de LLOQ mostrando o sinal para ruído e os valores de resposta para os picos destacados.

[0037] A Figura 9 é uma série de cromatogramas LC-SRM-MS/MS de peptídeos selecionados derivados das subunidades A, B e C de C1q em amostras de preparação em branco antes e depois de analisar uma amostra de ULOQ.

[0038] A Figura 10 mostra os cromatogramas LC-SRM-MS/MS de peptídeos selecionados derivados das subunidades A, B e C de C1q em soluções padrão em Branco Duplo (L00) suplementadas com 2000 µg/mL de anticorpo biespecífico, 20 µg/mL de anticorpo biespecífico ou nenhum anticorpo biespecífico e uma amostra de LLOQ.

[0039] A Figura 11 é uma série de gráficos que mostram a resposta relativa de C1q em amostras incubadas com anticorpo biespecífico medido

8 / 46 usando os métodos da presente divulgação.

[0040] A Figura 12 é uma série de gráficos que mostram a resposta relativa medida para C1q endógeno em amostras diluídas em diferentes fatores de diluição em diferentes diluentes usando os métodos da presente divulgação.

[0041] A Figura 13 é uma série de gráficos que mostram a resposta relativa medida para C1q em amostras diluídas em diferentes fatores de diluição em diferentes diluentes usando os métodos da presente divulgação.

[0042] A Figura 14 é uma série de gráficos que mostram a precisão da concentração medida para C1q em amostras submetidas a três ciclos de congelamento e descongelamento ou armazenadas em um amostrador automático por 48 horas usando os métodos da presente divulgação.

[0043] A Figura 15 mostra um gráfico que representa a concentração de C1q ao longo do tempo nas amostras de sangue de macacos dosados, determinada usando os métodos da presente divulgação e um peptídeo selecionado derivado da subunidade A de C1q.

[0044] A Figura 16 mostra um gráfico que representa a concentração de C1q ao longo do tempo nas amostras de sangue de macacos dosados, determinada usando os métodos da presente divulgação e um peptídeo selecionado derivado da subunidade B de C1q.

[0045] A Figura 17 mostra um gráfico que representa a concentração de C1q ao longo do tempo nas amostras de sangue de macacos dosados, determinada usando os métodos da presente divulgação e um peptídeo selecionado derivado da subunidade C de C1q.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0046] A presente divulgação fornece métodos e composições para determinar a abundância e/ou concentração de biomarcadores de proteína em uma amostra biológica. Em alguns aspectos, esse biomarcador de proteína é a proteína C1q. Em alguns aspectos, os métodos da presente divulgação

9 / 46 compreendem análise de espectrometria de massa de monitoramento de reação selecionada por cromatografia líquida (LC-SRM-MS).

[0047] O componente de complemento 1q (C1q) é um complexo proteico envolvido no sistema de complemento, que faz parte do sistema imunológico inato. C1q junto com C1r e C1s formam o complexo C1. C1q é uma proteína de 400 kDa que consiste em 18 subunidades de polipeptídeo: seis subunidades A, seis subunidades B e seis subunidades C. Os inibidores de complemento têm sido usados com sucesso no tratamento de várias doenças. Os anticorpos monoclonais direcionados a C1q têm potencial como terapia para doenças autoimunes que envolvem a via clássica de complemento. O desenvolvimento de abordagens de tratamento direcionadas a C1q requer métodos para determinar a concentração de níveis de C1q em amostras biológicas durante pesquisas de laboratório e ensaios clínicos. Até o momento, determinar a abundância de C1q em amostras de humano requer o uso de imunoensaios, tais como ELISA. Além disso, existem imunoreagentes limitados para o ensaio de C1q em amostras de primatas não humanos que são um aspecto importante de pesquisas e ensaios pré-clínicos. Assim, existe a necessidade de um ensaio aprimorado para determinar a concentração de C1q em amostras biológicas derivadas de humanos, primatas não humanos e outros organismos modelo.

[0048] Métodos de espectrometria de massa de monitoramento de reação selecionada por cromatografia líquida (LC-SRM-MS) são altamente desejáveis porque os métodos LC-SRM-MS fornecem especificidade estrutural absoluta para a proteína alvo e medição relativa ou absoluta da concentração de proteína alvo quando padrões internos adequados são usados.

MÉTODOS DA PRESENTE DIVULGAÇÃO

[0049] Vários métodos da presente divulgação são descritos em detalhes completos neste documento.

[0050] A presente divulgação fornece um método que compreende

10 / 46 um ensaio que compreende: (1) colocar uma amostra biológica em contato com pelo menos uma enzima proteolítica para produzir pelo menos um fragmento de peptídeo da proteína C1q presente na amostra biológica; e (2) realizar espectrometria de massa de monitoramento de reação selecionada (SRM-MS) para medir a abundância de pelo menos um fragmento de peptídeo C1q, em que a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q determina a concentração de C1q na amostra biológica.

[0051] Em alguns aspectos, o método anterior pode compreender ainda, entre a etapa (1) e a etapa (2), adicionar à amostra biológica pelo menos um fragmento de peptídeo C1q sintético marcado compreendendo uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q.

[0052] A presente divulgação também fornece um método que compreende um ensaio que compreende: (1) colocar uma amostra biológica em contato com pelo menos uma enzima proteolítica para produzir pelo menos um fragmento de peptídeo da proteína C1q presente na amostra biológica; (2) realizar espectrometria de massa de monitoramento de reação selecionada (SRM-MS) para gerar um sinal correspondente ao pelo menos um fragmento de peptídeo C1q; e (3) determinar a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q comparando o sinal a uma curva padrão, em que a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q determina a concentração de C1q na amostra biológica.

[0053] Em alguns aspectos, o método anterior pode compreender ainda, entre a etapa (1) e a etapa (2), adicionar à amostra biológica pelo menos um fragmento de peptídeo sintético marcado compreendendo uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q, e entre a etapa (2) e a etapa (3), realizar SRM-MS para gerar um sinal correspondente ao pelo menos um peptídeo sintético marcado.

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[0054] Em alguns aspectos, a amostra biológica pode ser uma amostra de sangue. Em aspectos preferidos, a amostra biológica pode ser uma amostra de soro. Em alguns aspectos, a amostra biológica pode ser uma amostra de humano. Alternativamente, a amostra biológica pode ser uma amostra de primata não humano. O primata não humano pode ser Macaca fascicularis ou Macaca mulatta.

[0055] Em alguns aspectos, a proteína C1q pode ser a proteína C1q de humano. Em outros aspectos, a proteína C1q é a proteína C1q de Macaca fascicularis. Em ainda outro aspecto, a proteína C1q pode ser a proteína C1q de Macaca mulatta. A proteína C1q pode compreender qualquer uma das sequências mostradas na Tabela 1. TABELA 1. SEQUÊNCIAS DE PROTEÍNAS C1Q

SEQ ID Espécies Subunidade nº de ref NCBI Sequência

NO MEGPRGWLVLCVLAISLASMVTEDLCRAPDGK KGEAGRPGRRGRPGLKGEQGEPGAPGIRTGIQG LKGDQGEPGPSGNPGKVGYPGPSGPLGARGIPG

IKGTKGSPGNIKDQPRPAFSAIRRNPPMGGNVVI A NP_057075 1

FDTVITNQEEPYQNHSGRFVCTVPGYYYFTFQV LSQWEICLSIVSSSRGQVRRSLGFCDTTNKGLFQ VVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDPKKGHIYQGS EADSVFSGFLIFPSA MMMKIPWGSIPVLMLLLLLGLIDISQAQLSCTG PPAIPGIPGIPGTPGPDGQPGTPGIKGEKGLPGLA

GDHGEFGEKGDPGIPGNPGKVGPKGPMGPKGG Humano

PGAPGAPGPKGESGDYKATQKIAFSATRTINVP (Homo B NP_000482 2

LRRDQTIRFDHVITNMNNNYEPRSGKFTCKVPG sapiens)

LYYFTYHASSRGNLCVNLMRGRERAQKVVTFC DYAYNTFQVTTGGMVLKLEQGENVFLQATDK NSLLGMEGANSIFSGFLLFPDMEA MDVGPSSLPHLGLKLLLLLLLLPLRGQANTGCY GIPGMPGLPGAPGKDGYDGLPGPKGEPGIPAIP GIRGPKGQKGEPGLPGHPGKNGPMGPPGMPGV

PGPMGIPGEPGEEGRYKQKFQSVFTVTRQTHQP C NP_758957 3

PAPNSLIRFNAVLTNPQGDYDTSTGKFTCKVPG LYYFVYHASHTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHT SKTNQVNSGGVLLRLQVGEEVWLAVNDYYDM VGIQGSDSVFSGFLLFPD MEGPQGWLVVCVLAISLASIVTQNVCRAPDGK

NGVAGRPGRPGRPGLKGERGEPGAPGIRTGIQG Macaco LKGDQGEPGPSGNPGKVGYPGPSGPLGDRGIPG Cynomolgus IKGIKGNPGNIKDQPRPAFSAIRRNPPMGGNVVI A XP_015296582 4 (Macaca FDMVITNQEEPYQNHSGRFVCTVPGYYYFTFQ fascicularis) VVSEREICLSIVSSSRGQVRRSLGFCDTTNKGLF

QVVSGGMVLQLQRGDQVWVEKDPRKGNIYQG LEADSVFSGFLIFPSS

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SEQ ID Espécies Subunidade nº de ref NCBI Sequência

NO MMMKILWGSIPVLMLLLLLGLLDVSWAQGSCT GPPAIPGTPGIPGTPGSDGQPGTPGIKGEKGLPG LAGDHGEFGEKGDPGIPGNPGKVGPKGPMGPK

GGPGAPGAPGPKGESGDYKATQKIAFSATRTV B XP_005544557 5

NTPLRRDQTIRFDHVITNMNNNYEPRSGKFTCR VPGLYYFTYHASSRGNLCVKLMRGRERPQKVV TFCDYAYNTFQVTTGGMVLKLEQGENVFLQAT DKNSLLGMEGANSIFSGFLLFPDVEA MDVGPSSLPHLGLKLLLLLLLLPLRGQANTGCY GIPGMPGLPGAPGKDGHDGLPGPKGEPGIPAIP GTRGPKGQKGEPGTPGHPGKNGPMGPPGMPG

VPGPMGIPGEPGEEGRYKQKYQSVFTVARQTH C XP_015296579 6

QPPAPNSLIRFNAVLTNPQGDYDTSTGKFTCKV PGLYYFVYHASHTANLCVLLYRGGVKVVTFCG HTSQANQVNSGGVLLRLQVGEEVWLGVNDYY DMVGIQGSDSVFSGFLLFPD MEGPQGWLVVCVLAISLASIVTQNVCRAPDGK NGVAGRPGRPGRPGLKGERGEPGAPGIRTGIQG LKGDQGEPGPSGNPGKVGYPGPSGPLGDRGIPG

IKGIKGNPGNIKDQPRPAFSAIRRNPPMGGNVVI A XP_014985904 7

FDMVITNQEEPYQNHSGRFVCTVPGYYYFTFQ VVSEREICLSIVSSSRGQVRRSLGFCDTTNKGLF QVVSGGMVLQLQRGDQVWVEKDPRKGNIYQG LEADSVFSGFLIFPST MMMKILWGSIPVLMLLLLLGLLDVSWAQGSCT

GPPAIPGTPGIPGTPGSDGQPGTPGIKGEKGLPG Macaco LAGDHGEFGEKGDPGIPGNPGKVGPKGPMGPK rhesus GGPGAPGAPGPKGESGDYKATQKIAFSATRTIN B XP_014985910 8 (Macaca TPLRRDQTIRFDHVITNMNNNYEPRSGKFTCRV mulata) PGLYYFTYHASSRGNLCVKLMRGRERPQKVVT

FCDYAYNTFQVTTGGMVLKLEQGENVFLQAT DKNSLLGMEGANSIFSGFLLFPDVEA MDVGPSSLPHLGLKLLLLLLLLPLRGQANTGCY GIPGMPGLPGAPGKDGHDGLPGPKGEPGIPAIP GTRGPKGQKGEPGTPGHPGKNGPMGPPGMPG

VPGPMGIPGEPGEEGRYKQKYQSVFTVARQTH C NP_001253737 9

QPPAPNSLIRFNAVLTNPQGDYDTSTGKFTCKV PGLYYFVYHASHTANLCVLLYRGGVKVVTFCG HTSQANQVNSGGVLLRLQVGEEVWLGVNDYY DMVGIQGSDSVFSGFLLFPD METSQGWLVACVLTMTLVWTVAEDVCRAPNG KDGAPGNPGRPGRPGLKGERGEPGAAGIRTGIR GFKGDPGESGPPGKPGNVGLPGPSGPLGDSGPQ

GLKGVKGNPGNIRDQPRPAFSAIRQNPMTLGN A NP_031598 10

VVIFDKVLTNQESPYQNHTGRFICAVPGFYYFN FQVISKWDLCLFIKSSSGGQPRDSLSFSNTNNKG

LFQVLAGGTVLQLRRGDEVWIEKDPAKGRIYQ Camundongo

GTEADSIFSGFLIFPSA (Mus

MKTQWGEVWTHLLLLLLGFLHVSWAQSSCTG musculus)

PPGIPGIPGVPGVPGSDGQPGTPGIKGEKGLPGL AGDLGEFGEKGDPGIPGTPGKVGPKGPVGPKG

TPGPSGPRGPKGDSGDYGATQKVAFSALRTINS B NP_033907 11

PLRPNQVIRFEKVITNANENYEPRNGKFTCKVP GLYYFTYHASSRGNLCVNLVRGRDRDSMQKV VTFCDYAQNTFQVTTGGVVLKLEQEEVVHLQA TDKNSLLGIEGANSIFTGFLLFPDMDA

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SEQ ID Espécies Subunidade nº de ref NCBI Sequência

NO MVVGPSCQPPCGLCLLLLFLLALPLRSQASAGC YGIPGMPGMPGAPGKDGHDGLQGPKGEPGIPA VPGTRGPKGQKGEPGMPGHRGKNGPRGTSGLP

GDPGPRGPPGEPGVEGRYKQKHQSVFTVTRQT C NP_031600 12

TQYPEANALVRFNSVVTNPQGHYNPSTGKFTC EVPGLYYFVYYTSHTANLCVHLNLNLARVASF CDHMFNSKQVSSGGVLLRLQRGDEVWLSVND YNGMVGIEGSNSVFSGFLLFPD METSQGWLVACVLAVTLVWTVAEDVCRAPNG KDGVAGIPGRPGRPGLKGERGEPGAAGIRTGIR GLKGDMGESGPPGKPGNVGFPGPTGPLGNSGP

QGLKGVKGNPGNIRDQPRPAFSAIRQNPPTYGN A NP_001008515 13

VVVFDKVLTNQENPYQNRTGHFICAVPGFYYF TFQVISKWDLCLSIVSSSRGQPRNSLGFCDTNSK GLFQVLAGGTVLQLQRGDEVWIEKDPAKGRIY QGTEADSIFSGFLIFPSA MKTQWSEILTPLLLLLLGLLHVSWAQSSCTGSP GIPGVPGIPGVPGSDGKPGTPGIKGEKGLPGLAG

DHGELGEKGDAGIPGIPGKVGPKGPVGPKGAP Rato

GPPGPRGPKGGSGDYKATQKVAFSALRTVNSA (Rattus B NP_062135 14

LRPNQAIRFEKVITNVNDNYEPRSGKFTCKVPG norvegicus)

LYYFTYHASSRGNLCVNIVRGRDRDRMQKVLT FCDYAQNTFQVTTGGVVLKLEQEEVVHLQATD KNSLLGVEGANSIFTGFLLFPDMDV MVVGTSCQPQHGLYLLLLLLALPLRSQANAGC YGIPGMPGLPGTPGKDGHDGLQGPKGEPGIPAI PGTQGPKGQKGEPGMPGHRGKNGPMGTSGSP

GDPGPRGPPGEPGEEGRYKQKHQSVFTVTRQT C NP_001008524 15

AQYPAANGLVKFNSAITNPQGDYNTNTGKFTC KVPGLYYFVHHTSQTANLCVQLLLNNAKVTSF CDHMSNSKQVSSGGVLLRLQRGDEVWLAVND YNGMVGTEGSDSVFSGFLLFPD MEAPWGWLALCVLATSLASAVTQDVCRALDG RDGAAGTPGRPGRPGLKGEQGEPGAPGMRTGI RGLKGDQGDPGPPGNPGNMGFPGPSGLMGLPG

IPGRRGPKGNPGNIRDQPRPAFSAIRRNPPTGGN A XP_535367 16

VVIFDTVITNQEGPYQNHSGRFICAVPGYYYFTF QVVSKWDICLSIVSSGRAQIRRSLGFCDTNSKGI FQVVSGGMALQLQQGDQVWIEKDPIKGRIYQG PEADSIFSGFLIFPSL MKTPRGGILALLLPLLLGLLEVSWAQSCTGHPA IPGIPGIPGAPGTDGTPGTPGTKGEKGLPGLAGD

HGEFGEKGDPGIPGTPGKVGPKGPVGPKGSPGP Cão

PGARGAKGESGDYKATQKIAFSAMRTINIPLRR (Canis lupus B XP_544507 17

DQTIRFDHIVTNENRNYEPRSGKFTCNVPGIYYF familiaris)

AYHASSRGNLCVNVMRGRERMQKVVTFCDYV QNTFQVTTGSVVLKLSQGENVYLQATDKNSLL GMEGANSIFSGFLLFPDAEA MDTGPSSWPHLGLNLLLLLLALPLGGQASTGC YGIPGMPGLPGAPGKDGHDGLPGPKGEPGIPAI PGTRGPKGQKGEPGTPGYPGKNGPMGTPGIPG

VPGPVGPPGEPGEEGRYKQKHQSVFTVTRQTA C XP_003433793 18

QYPLANNLVKFNTVITNPQGDYDTSTGKFTCK VPGLYYFVYHTSLTSNLCVHLYRSGTRVTTFCD HMSNSKQVSSGGVLLRLQMGEQVWLAVNDYN GMVGTEGSDSVFSGFLLFPD

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SEQ ID Espécies Subunidade nº de ref NCBI Sequência

NO MQPSAFFAFLWAGALFPFSFCQDECVKHGRNG ADGPNGRDGLPGPKGEKGEPALQVKLSSIALEE LKGDMGVRGPPGEPGLEGLMGAIGPRGPLGPA

GPRGSSVGADGAKASEKPAFSVLRNEASQAQY A ACN62221 19

KQPVTFNDKLSDANDDFQIKTGYFTCKVPGVY YFVFHASSEGRLCLRLKSTSAPPVSLSFCDFNSK SVSLVVSGGAVLTLLKGDKVWIEPFAGDGGVG QMPKRLYAVFNGFLIYRNAE MLFALMSAHVVPQLAIMLLLVTSSMSETCAGN KGFPGTPGIPGVPGTDGKDGAKGEKGDPGENE

VQMTGPKGDPGKPGLPGRPGVKGPEGPQGPPG Peixe-zebra PPGPKGQRGVLSGKVAPDQYFVFSYKKSQKLE B ACN62222 20 (Danio rerio) KILQDKLVVFDVPLITGIDGVLDGEGYFDVTITG

MYYISYQISFQQSACLKIQIGAEEKVKFCDSPKL ILGTAASVVLKLNKGDKVSVQSTGESTVFSRDT DCTFTGFMLFPIK MFGGHLILVSLLSASLCLCLASADTCPAGAMPG LPGIPGFPGRDGRQGMKGEKGDLGIPIKPGDTV KKGERGAFGLKGPPGKRGPHGDPGIMGPPGPP

GEPGEAGLVDVSGSQLQSAFSVSRHTRIPPDAN C ACN62223 21

KVIRFSKVITNPQGHFSTDESKFVCKIPGTYYFV LHASSHDKKLCVILVHDDKNLVSFCDHTQRGS QQVSSGGLSLYLKENEKVWLMTNALNGMYAT ADRADSVFSGFLIHAH

[0056] Em alguns aspectos dos métodos anteriores, o pelo menos um fragmento de peptídeo da proteína C1q compreende pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 ou pelo menos 20 aminoácidos.

[0057] Em alguns aspectos dos métodos anteriores, o pelo menos um fragmento de peptídeo da proteína C1q compreende um peptídeo selecionado da Tabela 2. Em outros aspectos, o pelo menos um fragmento de peptídeo compreende um peptídeo tríptico da proteína C1q. TABELA 2. SEQUÊNCIAS DE PEPTÍDEOS C1Q Sequência de Peptídeos Subunidade de C1q SEQ ID NO VGYPGPSGPLGAR A 22 DQPRPAFSAIR* A 23 NPPMGGNVVIFDTVITNQEEPYQNHSGR A 24 FVCTVPGYYYFTFQVLSQWEICLSIVSSSR A 25 SLGFCDTTNK* A 26 GLFVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDPK A 27 GHIYQGSEADSVFSGFLIFPSA A 28 IAFSATR* B 29 TINVPLRR B 30 FDHVITNMNNNYEPR* B 31 VPGLYYFTYHASSR* B 32 GNLCVNLMR B 33 LEQGENVFLQATDK* B 34 FQSVFTVTR C 35 QTHQPPAPNSLIR* C 36

15 / 46 Sequência de Peptídeos Subunidade de C1q SEQ ID NO FNAVLTNPQGDYDTSTGK* C 37 VPGLYYFVYHASHTANLCVLLYR* C 38 VVTFCGHTSK C 39 TNQVNSGGVLLR C 40 * denota o peptídeo comum C1q de humano/macaco.

[0058] Em alguns aspectos dos métodos anteriores, o pelo menos um fragmento de peptídeo da proteína C1q compreende SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26), IAFSATR (SEQ ID NO: 29) ou QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36). Em outros aspectos, o pelo menos um fragmento de peptídeo compreende pelo menos dois de SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26), IAFSATR (SEQ ID NO: 29) ou QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36). Em ainda outros aspectos, o pelo menos um fragmento de peptídeo compreende cada um de SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26), IAFSATR (SEQ ID NO: 29) e QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36).

[0059] Assim, a presente divulgação abrange um método que compreende um ensaio compreendendo: (1) colocar uma amostra biológica em contato com pelo menos uma enzima proteolítica para produzir pelo menos um fragmento de peptídeo da proteína C1q presente na amostra biológica, em que o pelo menos um fragmento de peptídeo compreende cada um de SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26), IAFSATR (SEQ ID NO: 29) e QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36); (2) realizar SRM-MS para gerar um sinal correspondente ao pelo menos um fragmento de peptídeo C1q, em que os sinais SRM-MS estão de acordo a pares de íons de transição compreendendo cada um do precursor SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26) par de transição 571.8-942.3, precursor IAFSATR (SEQ ID NO: 29) par de transição 383.1-581.1 e precursor QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36) par de transição 487.0 -350,3; e (3) determinar a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q comparando o sinal a uma curva padrão, em que a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q determina a concentração de C1q na amostra biológica.

[0060] A presente divulgação também abrange um método que

16 / 46 compreende um ensaio compreendendo: (1) colocar uma amostra biológica em contato com pelo menos uma enzima proteolítica para produzir pelo menos um fragmento de peptídeo da proteína C1q presente na amostra biológica, em que o pelo menos um fragmento de peptídeo compreende cada um de SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26), IAFSATR (SEQ ID NO: 29) e QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36); (2) adicionar à amostra biológica pelo menos um fragmento de peptídeo sintético marcado compreendendo uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de cada um de SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26), IAFSATR (SEQ ID NO: 29) e QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36); (3) realizar SRM-MS para gerar um sinal correspondente ao pelo menos um fragmento de peptídeo C1q, em que os sinais de SRM-MS estão de acordo a pares de íons de transição compreendendo cada um do precursor SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26) par de transição 571.8-942.3, precursor IAFSATR (SEQ ID NO: 29) par de transição 383.1-581.1 e precursor QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36) par de transição 487.0 -350,3, e um sinal correspondente ao pelo menos um peptídeo sintético marcado; e (4) determinar a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q comparando o sinal a uma curva padrão, em que a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q determina a concentração de C1q na amostra biológica.

[0061] A presente divulgação também abrange um método que compreende um ensaio compreendendo: (1) colocar uma amostra biológica em contato com pelo menos uma enzima proteolítica para produzir pelo menos um fragmento de peptídeo da proteína C1q presente na amostra biológica, em que o pelo menos um fragmento de peptídeo compreende SLGFCDTTNK (SEQ ID Nº: 26); (2) realizar espectrometria de massa de monitoramento de reação selecionada (SRM-MS) para gerar um sinal correspondente ao pelo menos um fragmento de peptídeo C1q, em que os sinais SRM-MS estão de acordo a pares de íons de transição compreendendo

17 / 46 o precursor SLGFC(Cam)DTTNK (SEQ ID NO: 41) par de transição 571,8- 942,3; e (3) determinar a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q comparando o sinal normalizado a uma curva padrão, em que a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q determina a concentração de C1q na amostra biológica.

[0062] A presente divulgação também abrange um método que compreende um ensaio compreendendo: (1) colocar uma amostra biológica em contato com pelo menos uma enzima proteolítica para produzir pelo menos um fragmento de peptídeo da proteína C1q presente na amostra biológica, em que o pelo menos um fragmento de peptídeo compreende SLGFCDTTNK (SEQ ID Nº: 26); (2) adicionar à amostra biológica pelo menos um fragmento de peptídeo sintético marcado compreendendo uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26); (3) realizar espectrometria de massa de monitoramento de reação selecionada (SRM-MS) para gerar um sinal correspondente ao pelo menos um fragmento de peptídeo C1q, em que os sinais SRM-MS estão de acordo a pares de íons de transição compreendendo o precursor SLGFC(Cam)DTTNK (SEQ ID NO: 41) par de transição 571.8-

942.3, e um sinal correspondendo ao pelo menos um peptídeo sintético marcado; e (4) determinar a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q comparando o sinal normalizado a uma curva padrão, em que a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q determina a concentração de C1q na amostra biológica.

[0063] A presente divulgação também abrange um método que compreende um ensaio compreendendo: (1) coloca uma amostra biológica em contato com pelo menos uma enzima proteolítica para produzir pelo menos um fragmento de peptídeo da proteína C1q presente na amostra biológica, em que o pelo menos um fragmento de peptídeo compreende IAFSATR (SEQ ID NO: 29); (2) realizar espectrometria de massa de monitoramento de reação

18 / 46 selecionada (SRM-MS) para gerar um sinal correspondente ao pelo menos um fragmento de peptídeo C1q, em que os sinais SRM-MS estão de acordo a pares de íons de transição compreendendo o precursor IAFSATR (SEQ ID NO: 29) par de transição 383,1-581,1; e (3) determinar a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q comparando o sinal a uma curva padrão, em que a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q determina a concentração de C1q na amostra biológica.

[0064] A presente divulgação também abrange um método que compreende um ensaio compreendendo: (1) colocar uma amostra biológica em contato com pelo menos uma enzima proteolítica para produzir pelo menos um fragmento de peptídeo da proteína C1q presente na amostra biológica, em que o pelo menos um fragmento de peptídeo compreende IAFSATR (SEQ ID NO: 29); (2) adicionar à amostra biológica pelo menos um fragmento de peptídeo sintético marcado compreendendo uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de IAFSATR (SEQ ID NO: 29); (3) realizar espectrometria de massa de monitoramento de reação selecionada (SRM-MS) para gerar um sinal correspondente ao pelo menos um fragmento de peptídeo C1q, em que os sinais de SRM-MS estão de acordo a pares de íons de transição compreendendo o precursor IAFSATR (SEQ ID NO: 29) par de transição 383.1-581.1, e um sinal correspondendo ao pelo menos um peptídeo sintético marcado; e (4) determinar a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q comparando o sinal a uma curva padrão, em que a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q determina a concentração de C1q na amostra biológica.

[0065] A presente divulgação também abrange um método que compreende um ensaio compreendendo: (1) colocar uma amostra biológica em contato com pelo menos uma enzima proteolítica para produzir pelo menos um fragmento de peptídeo da proteína C1q presente na amostra biológica, em que o pelo menos um fragmento de peptídeo compreende

19 / 46 QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36); (2) realizar espectrometria de massa de monitoramento de reação selecionada (SRM-MS) para gerar um sinal correspondente ao pelo menos um fragmento de peptídeo C1q, em que os sinais de SRM-MS estão de acordo a pares de íons de transição compreendendo o precursor QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36) par de transição 487,0-350,3; e (3) determinar a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q comparando o sinal a uma curva padrão, em que a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q determina a concentração de C1q na amostra biológica.

[0066] A presente divulgação também abrange um método que compreende um ensaio compreendendo: (1) colocar uma amostra biológica em contato com pelo menos uma enzima proteolítica para produzir pelo menos um fragmento de peptídeo da proteína C1q presente na amostra biológica, em que o pelo menos um fragmento de peptídeo compreende QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36); (2) adicionar à amostra biológica pelo menos um fragmento de peptídeo sintético marcado compreendendo uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36); (3) realizar espectrometria de massa de monitoramento de reação selecionada (SRM-MS) para gerar um sinal correspondente ao pelo menos um fragmento de peptídeo C1q, em que os sinais de SRM-MS estão de acordo a pares de íons de transição compreendendo o precursor QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36) par de transição 487,0-350,3, e um sinal correspondendo ao pelo menos um peptídeo sintético marcado; e (4) determinar a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q comparando o sinal a uma curva padrão, em que a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q determina a concentração de C1q na amostra biológica.

[0067] Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, a espectrometria de massa de monitoramento de reação selecionada é LC-SRM-

20 / 46 MS/MS.

[0068] Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, a pelo menos uma enzima proteolítica é tripsina. Outras enzimas proteolíticas adequadas serão conhecidas pelos técnicos no assunto, incluindo, mas não se limitando a, Glu-C protease, Lys-N protease, Lys-C protease, Asp-N protease ou quimiotripsina.

[0069] Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, uma curva padrão pode ser produzida usando um método compreendendo: (a) preparar pelo menos dois padrões de concentração de C1q misturando quantidades conhecidas da proteína C1q purificada e soro depletado de C1q; (b) adicionar aos pelo menos dois padrões de concentração de C1q pelo menos um fragmento de peptídeo sintético marcado com uma sequência de aminoácidos idêntica a pelo menos um fragmento de peptídeo C1q que espera-se que seja produzido após o contato do padrão de concentração de C1q com uma enzima proteolítica; (c) colocar os pelo menos dois padrões de concentração de C1q marcados em contato com uma enzima proteolítica para produzir pelo menos um fragmento de peptídeo C1q; (d) realizar espectrometria de massa de monitoramento de reação selecionada para determinar a força do sinal que corresponde ao pelo menos um fragmento de peptídeo C1q e a força do sinal que corresponde ao pelo menos um fragmento de peptídeo sintético marcado em cada um dos pelo menos dois padrões de concentração de C1q marcados; e (e) determinar uma curva padrão usando os sinais e as quantidades conhecidas de proteína C1q.

[0070] Em alguns aspectos, uma curva padrão pode ser produzida usando pelo menos três, ou pelo menos quatro, ou pelo menos cinco, ou pelo menos seis, ou pelo menos sete, ou pelo menos oito, ou pelo menos nove ou pelo menos dez padrões de concentrações de C1q. Em alguns aspectos, a preparação de um padrão de concentração de C1q pode compreender diluir ou diluir em série a proteína C1q purificada em soro depletado de C1q, em que o

21 / 46 fator de diluição pode ser 1:1, 1:1,5, ou 1:2, ou 1:2,5, ou 1:3, ou 1:3,5, ou 1:4, ou 1:5, ou 1:6, ou 1:7, ou 1:8, ou 1:9, ou 1:10, ou 1:100, ou 1:1000, ou qualquer fator de diluição dentro da faixa de 1:1 a 1:10000.

[0071] Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, pelo menos um fragmento de peptídeo sintético marcado pode ser adicionado a uma amostra biológica antes de colocar a amostra biológica em contato com uma enzima proteolítica.

[0072] Em alguns aspectos da presente divulgação, o pelo menos um fragmento de peptídeo sintético marcado pode ser usado para solucionar os métodos da presente divulgação.

[0073] Em alguns aspectos da presente divulgação, o sinal que corresponde ao pelo menos um fragmento de peptídeo sintético marcado pode ser usado para normalizar o sinal do pelo menos um fragmento de peptídeo da proteína C1q ao qual corresponde o fragmento de peptídeo sintético marcado.

[0074] Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, uma curva padrão de C1q pode ser usada para medir a abundância de C1q em amostras biológicas. A abundância dos peptídeos C1q em amostras padrão predeterminadas pode ser definida e os resultados comparados aos resultados LC-SRM-MS de um peptídeo C1q correspondente encontrado em uma amostra biológica. Isso permite o cálculo da abundância do peptídeo na amostra biológica. Assim, conhecendo a abundância de um peptídeo em uma amostra, a abundância da proteína a que corresponde é determinada.

COMPOSIÇÕES DA PRESENTE DIVULGAÇÃO

[0075] Várias composições da presente divulgação são descritas em detalhes no presente documento.

[0076] A presente divulgação fornece uma composição compreendendo pelo menos um peptídeo sintético isolado, a referida composição compreendendo pelo menos um peptídeo sintético isolado com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da proteína C1q.

22 / 46

[0077] Os peptídeos sintéticos podem ser gerados usando qualquer método conhecido na técnica. Esses métodos podem incluir técnicas de expressão recombinante, tais como expressão em bactérias ou expressão in vitro em lisado de células eucarióticas. Esses métodos também podem incluir a síntese em fase sólida.

[0078] Os peptídeos sintéticos podem ser marcados isotopicamente. 13 Os isótopos com os quais podem ser marcados incluem C, 2H, 15 Ne 18 O. Um peptídeo marcado pode compreender pelo menos um resíduo de Lisina 13 C marcado e/ou 15N marcado, ou, pelo menos, um resíduo de arginina 13C marcado e/ou 15N marcado. Os peptídeos também podem incluir um solvente polar. Os solventes polares podem incluir água e misturas de etanol e água.

[0079] Em alguns aspectos das composições da presente divulgação, a proteína C1q pode ser a proteína C1q humana. Em outros aspectos, a proteína C1q é a proteína C1q de Macaca fascicularis. Em ainda outro aspecto, a proteína C1q pode ser de Macaca mulatta. A proteína C1q pode compreender qualquer uma das sequências mostradas na Tabela 1.

[0080] Em alguns aspectos de uma composição da presente divulgação, o pelo menos um peptídeo sintético isolado compreende pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 ou pelo menos 20 aminoácidos.

[0081] Em alguns aspectos de uma composição da presente divulgação, um peptídeo sintético isolado compreende uma sequência de um fragmento de peptídeo C1q gerado pelo contato de C1q com uma enzima proteolítica. Em aspectos preferidos, a enzima proteolítica é tripsina. Assim, em aspectos preferidos, um peptídeo sintético isolado é um peptídeo tríptico de C1q.

[0082] Em alguns aspectos de uma composição da presente divulgação, um peptídeo sintético isolado é marcado. Os peptídeos sintéticos isolados podem ser marcados isotopicamente. Os isótopos com os quais

23 / 46 podem ser marcados incluem, mas não estão limitados a, 13C, 2H, 15N e 18O. Os peptídeos também podem incluir um solvente polar. Os solventes polares podem incluir água, misturas de etanol e água e acetonitrila.

[0083] Em alguns aspectos de uma composição da presente divulgação, o peptídeo sintético isolado compreende um peptídeo selecionado da Tabela 2. Em outros aspectos, a composição compreende quaisquer dois peptídeos descritos na Tabela 2. Em outros aspectos, a composição incluiu qualquer 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 peptídeos descritos na Tabela 2.

[0084] Em um aspecto preferido, uma composição da presente divulgação pode compreender pelo menos um peptídeo sintético isolado compreendendo SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26), IAFSATR (SEQ ID NO: 29) ou QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36). Uma composição pode compreender pelo menos um peptídeo sintético isolado compreendendo pelo menos dois de SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26), IAFSATR (SEQ ID NO: 29) ou QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36). Em ainda outros aspectos, uma composição pode compreender pelo menos um peptídeo sintético isolado compreendendo cada um de SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26), IAFSATR (SEQ ID NO: 29) ou QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36).

[0085] Em alguns aspectos das composições da presente divulgação, a cisteína no peptídeo sintético SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26) pode ser modificada. A modificação pode ser carbamidometilação.

[0086] A presente divulgação fornece uma composição compreendendo pelo menos um par de íons de transição, a referida composição compreendendo pelo menos um par de íons de transição da proteína C1q, em que o pelo menos um par de íons de transição consiste em um íon precursor com uma m/z correspondente e um fragmento de íon com uma m/z de íon correspondente.

[0087] Em alguns aspectos das composições da presente divulgação, a

24 / 46 proteína C1q pode ser a proteína C1q humana. Em outros aspectos, a proteína C1q é a proteína C1q de Macaca fascicularis. Em ainda outro aspecto, a proteína C1q pode ser de Macaca mulatta. A proteína C1q pode compreender qualquer uma das sequências mostradas na Tabela 1.

[0088] A presente divulgação fornece uma composição compreendendo pelo menos um par de íons de transição, a referida composição compreendendo pelo menos um par de íons de transição da proteína C1q, em que o pelo menos um par de íons de transição consiste em um íon precursor com uma m/z correspondente e um fragmento de íon com uma m/z de íon correspondente, e em que o par de íons de transição é selecionado do precursor SLGFC(Cam)DTTNK (SEQ ID NO: 41) par de transição 571.8-942.3, precursor IAFSATR (SEQ ID NO: 29) par de transição

383.1- 581.1 e precursor QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36) par de transição 487.0-350.3.

DEFINIÇÕES

[0089] Como usado neste documento, "m/z" indica a razão massa- carga de um íon.

[0090] Tal como usado neste documento, "MS/MS" representa espectrometria de massa em tandem, que é um tipo de espectrometria de massa envolvendo vários estágios de análise de massa com alguma forma de fragmentação ocorrendo entre os estágios.

[0091] Tal como usado neste documento, "LC-SRM-MS" é um acrônimo para "monitoramento de reação selecionada" e pode ser usado indistintamente com "LC-MRM-MS" ou "LC-SRM-MS/MS".

[0092] LC-SRM-MS é um método altamente seletivo de espectrometria de massa em tandem que tem o potencial de filtrar com eficácia todas as moléculas e contaminantes, exceto o(s) analito(s) desejado(s). Isto é particularmente benéfico se a amostra de análise for uma mistura complexa que pode compreender várias espécies isobáricas dentro de

25 / 46 uma janela analítica definida. Os métodos LC-SRM-MS podem usar um espectrômetro de massa triplo quadrupolo que, conforme é conhecido na técnica, inclui três conjuntos de haste quadrupolo. Um primeiro estágio de seleção de massa é realizado no primeiro conjunto de haste quadrupolo, e os íons transmitidos seletivamente são fragmentados no segundo conjunto de haste quadrupolo. Os íons de transição (produto) resultantes são transportados para o terceiro conjunto de hastes quadrupolo, que realiza um segundo estágio de seleção de massa. Os íons de produto transmitidos através do terceiro conjunto de hastes quadrupolo são medidos por um detector, que gera um sinal representativo do número de íons de produto transmitidos seletivamente. Os potenciais de RF e DC aplicados ao primeiro e terceiro quadrupolo são ajustados para selecionar (respectivamente) íons precursores e de produto que têm valores de m/z situados dentro de faixas estreitas especificadas. Ao especificar as transições apropriadas (valores de m/z de íons precursores e de produto), um peptídeo correspondente a uma proteína direcionada pode ser medido com altos graus de sensibilidade e seletividade. A razão sinal para ruído em LC-SRM-MS é frequentemente superior aos experimentos convencionais de espectrometria de massa em tandem (MS/MS) que não direcionam (filtram) seletivamente analitos específicos, mas visam pesquisar todos os analitos na amostra.

[0093] A espectrometria de massa LC-SRM-MS envolve a fragmentação de íons em fase gasosa e ocorre entre os diferentes estágios da análise de massa. Existem muitos métodos usados para fragmentar os íons e estes podem resultar em diferentes tipos de fragmentação e, portanto, diferentes informações sobre a estrutura e composição da molécula. Os íons de transição observados em um espectro LC-SRM-MS resultam de vários fatores diferentes, que incluem, mas não estão limitados a, sequência primária, a quantidade de energia interna, os meios de introdução da energia e o estado de carga. As transições devem carregar pelo menos uma carga a ser

26 / 46 detectada. Um íon é categorizado como a, b ou c se a carga estiver em uma transição compreendendo o N-terminal original do peptídeo, enquanto o íon é categorizado como x, y ou z se a carga estiver em uma transição compreendendo o C-terminal original do peptídeo. Um subscrito indica a posição dos resíduos na transição (por exemplo, primeiro resíduo de peptídeo em x1 do C-terminal, segundos resíduos de peptídeo em y2 do C-terminal e terceiros resíduos de peptídeo em z3 do C-terminal, etc.).

[0094] Em uma unidade de repetição de peptídeo genérico representada –N–C(O)-C-, um íon x e um íon são resultantes da clivagem da ligação carbonila-carbono (ou seja, C(O)-C). O íon x é um íon acílio e o íon a é um íon imínio. Um íon y e um íon ab resultam da clivagem da ligação carbonila-nitrogênio (ou seja, C(O)-N, também conhecida como ligação amida). Nesse caso, o íon y é um íon amônio e o íon b é um íon acílio. Finalmente, o íon az e o íon ac resultam da clivagem da ligação nitrogênio- carbono (isto é, C-N). O íon z é um carbocátion e o íon é um íon amônio.

[0095] Os sobrescritos às vezes são usados para indicar perdas neutras além da fragmentação da cadeia principal, por exemplo, * para perda de amônia e ° para perda de água. Além dos prótons, os íons c e os íons y podem abstrair um próton adicional do peptídeo precursor. Na ionização por electrospray, os peptídeos trípticos podem carregar mais do que uma carga.

[0096] As transições internas surgem da clivagem da cadeia principal dupla. Essas podem ser formadas por uma combinação de clivagem do tipo b e do tipo y (ou seja, a clivagem produzindo íons b e y). Os íons de clivagem interna também podem ser formados por uma combinação de clivagem do tipo a e tipo y. Uma transição interna com uma única cadeia lateral formada por uma combinação de clivagem do tipo a e do tipo y é chamada de íon imínio (às vezes também conhecido como imônio ou íon imônio). Esses íons são rotulados com o código de uma letra para o aminoácido correspondente.

[0097] CID de baixa energia (ou seja, dissociação induzida por

27 / 46 colisão em um triplo quadrupolo ou uma armadilha de íons) envolve a fragmentação de um peptídeo carregando uma carga positiva, principalmente ao longo de sua estrutura, para gerar principalmente íons a, b e y.

[0098] Uma ou mais etapas de purificação por cromatografia líquida (LC) são realizadas antes de uma etapa de análise LC-SRM-MS subsequente. A análise LC tradicional depende das interações químicas entre os componentes da amostra e os materiais de embalagem da coluna, onde o fluxo laminar da amostra através da coluna é a base para a separação do analito de interesse da amostra de teste. O técnico no assunto entenderá que a separação em tais colunas é um processo de difusão. Uma variedade de materiais de embalagem de coluna estão disponíveis para a separação cromatográfica de amostras, e a seleção de um protocolo de separação apropriado é um processo empírico que depende das características da amostra, do analito de interesse, das substâncias interferentes presentes e suas características, etc. Vários produtos químicos de embalagem podem ser usados dependendo das necessidades (por exemplo, estrutura, polaridade e solubilidade dos compostos sendo purificados). Em vários aspectos, as colunas são colunas C- 2, C-8, C-18 polares, de troca iônica (cátion e ânion), de interação hidrofóbica, de fenila, com revestimento polar em polímero poroso, ou outras que estão comercialmente disponíveis. Durante a cromatografia, a separação de materiais é afetada por variáveis, tais como a escolha do eluente (também conhecida como uma "fase móvel"), a escolha do gradiente de eluição e as condições do gradiente, temperatura, etc. Em certos aspectos, um analito pode ser purificado pela aplicação de uma amostra a uma coluna sob condições em que o analito de interesse é reversivelmente retido pelo material de embalagem da coluna, enquanto um ou mais outros materiais não são retidos. Nestes aspectos, uma primeira condição de fase móvel pode ser empregada onde o analito de interesse é retido pela coluna, e uma segunda condição de fase móvel pode ser subsequentemente empregada para remover

28 / 46 o material retido da coluna, uma vez que os materiais não retidos são lavados. Alternativamente, um analito pode ser purificado aplicando uma amostra a uma coluna sob condições de fase móvel, onde o analito de interesse elui a uma taxa diferencial em comparação com um ou mais outros materiais. Conforme discutido acima, tais procedimentos podem enriquecer a quantidade de um ou mais analitos de interesse em relação a um ou mais outros componentes da amostra.

[0099] Os seguintes parâmetros são usados para especificar um ensaio LC-SRM-MS de uma proteína sob um sistema LC-SRM-MS particular: (1) um peptídeo tríptico da proteína; (2) o tempo de retenção (TR) do peptídeo; (3) o valor de m/z do íon precursor de peptídeo; (4) o potencial de descompressão usado para ionizar o íon precursor; (5) o valor de m/z de um fragmento de íon gerado a partir do íon precursor de peptídeo; e (6) a energia de colisão (EC) usada para fragmentar o íon precursor de peptídeo que é otimizado para o peptídeo específico.

[00100] Como aqui usado, "PPI" refere-se a "peptídeos de padrão interno".

[00101] Para facilitar a quantificação precisa das transições de peptídeo pelos métodos divulgados aqui, um conjunto de versões sintéticas marcadas isotopicamente dos peptídeos de interesse pode ser adicionado em quantidades conhecidas à amostra para uso como padrões internos. Uma vez que os peptídeos marcados isotopicamente têm propriedades físicas e químicas idênticas ao peptídeo substituto correspondente, eles coeluem a partir da coluna cromatográfica e são facilmente identificáveis no espectro de massa resultante. A adição dos padrões marcados pode ocorrer antes ou depois da digestão proteolítica. Os métodos de síntese de peptídeos marcados isotopicamente serão conhecidos pelos técnicos no assunto. Assim, em alguns aspectos, as amostras experimentais contêm peptídeos de padrão interno. Outros aspectos podem usar padrões externos ou outros expedientes

29 / 46 para quantificação de peptídeos.

[00102] Como usado aqui, um "peptídeo tríptico" refere-se ao peptídeo que é formado pelo tratamento de uma proteína com tripsina.

[00103] Conforme usado neste documento, o termo "curva padrão" pode ser usado alternadamente com o termo "curva de calibração".

[00104] Conforme usado neste Relatório Específico e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um(a)" e "o(a)" incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário.

[00105] A menos que especificamente declarado ou óbvio a partir do contexto, conforme usado neste documento, o termo "ou" é entendido como inclusivo e cobre tanto "ou" quanto "e".

[00106] A menos que especificamente declarado ou óbvio a partir do contexto, como usado neste documento, o termo "cerca de" é entendido como dentro de uma faixa de tolerância normal na técnica, por exemplo, dentro de 2 desvios padrão da média. "Cerca de" pode ser entendido como dentro de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% ou 0,01% do valor declarado. A menos que de outra forma claro no contexto, todos os valores numéricos fornecidos neste documento são modificados pelo termo "cerca de".

[00107] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém técnico no assunto à qual a invenção pertence. Embora outras sondas, composições, métodos e kits semelhantes ou equivalentes àqueles descritos neste documento possam ser usados na prática da presente divulgação, os materiais e métodos preferidos são descritos neste documento. Deve ser entendido que a terminologia usada neste documento tem a finalidade de descrever aspectos particulares apenas e não se destina a ser limitante. EXEMPLOS:

30 / 46 EXEMPLO 1 - DETERMINANDO UMA CURVA PADRÃO DE CONCENTRAÇÃO DE C1Q USANDO OS MÉTODOS DA PRESENTE

DIVULGAÇÃO

[00108] Os métodos da presente divulgação foram usados para gerar curvas padrão, também chamadas de curvas de calibração, usando um conjunto de soluções de referência de C1q de concentrações conhecidas de C1q, incluindo padrão de C1q e amostras de controle de qualidade (QC). A sensibilidade e precisão dos métodos da presente divulgação também foram testadas.

[00109] As curvas de calibração foram geradas usando amostras padrão de C1q que foram preparadas e aplicadas usando as seguintes diretrizes: • a proteína C1q purificada foi diluída na mesma matriz biológica conforme as amostras experimentais; • o conjunto de soluções de referência de C1Q testado consistiu em um branco duplo, um branco e pelo menos 6 concentrações livres de zero de C1q; • o limite inferior de quantificação (LLOQ) é definido como a concentração da proteína C1q na qual a resposta medida da amostra LLOQ é pelo menos 5 vezes em comparação com a resposta da amostra em branco, de tal modo que a precisão esteja dentro de 25% da concentração nominal e o coeficiente de variação seja inferior a 25%; • o limite superior de quantificação (ULOQ) é definido de tal forma que a precisão esteja dentro de 20% da concentração nominal e o coeficiente de variação seja inferior a 20%.

[00110] As curvas de calibração foram geradas usando amostras QC de C1q que foram preparadas e aplicadas usando as seguintes diretrizes: • pelo menos 3 concentrações de amostras QC foram preparadas e

31 / 46 usadas para calibração; • cada amostra QC foi preparada em duplicata; • as amostras QC cobriram a faixa de quantificação baixa, média e alta do ensaio, e a amostra QC baixa (LQC) estava dentro de 3 vezes a concentração de LLOQ; • a precisão de pelo menos 67% das amostras QC estava dentro de 20% da concentração nominal; • A precisão de pelo menos 50% das amostras QC em cada nível estava dentro de 20% da concentração nominal; • O número mínimo de amostras QC foi igual ao maior de pelo menos 5% do número de amostras desconhecidas ou 6 amostras QC totais; • As amostras QC foram preparadas com uma solução estoque de C1q que foi separada da solução estoque para a preparação das soluções de referência de C1q.

MATERIAIS: • Proteína C1q de Complemento Humana Purificada (Quidel, item # A400) • Soro Depletado de C1q de Complemento, Humano (Sigma-Aldrich, Cat# 234401-1ML) • SLGFC(Cam)DTTNK (SEQ ID NO: 41) (New England Peptide) • IAFSATR (SEQ ID NO: 29) (New England Peptide) • QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36) (New England Peptide) • Candidato a fármaco de anticorpo monoclonal biespecífico • Tripsina modificada de grau de sequenciação fornecida com tampão de ressuspensão (Promega, Cat#. V5117) • UltraPure 1,0 M de Tris-HCl pH 7,5 (Invitrogen, Cat# 15567-027) • UltraPure 1,0 M de Tris-HCl pH 8,0 (Invitrogen, Cat# 15568-025) • UltraPure 1,0 M de Tris-HCl pH 8,5 (Alfa Aesar, Cat# J61038)

32 / 46 • Ureia (Sigma Aldrich, Cat# U5128-100G) • TCEP HCL (Thermo Scientific; Cat# 20491) • Iodoacetamida (Sigma-Aldrich; Cat# A3221-10VL) • Ácido fórmico (Thermo Scientific; Cat# 28905) • Acetonitrila (Fisher Chemical, Cat# A955-4) • Coluna C18 BEH130 ACQUITY UPLC, 1,7 µm, 2,1 mm× 50 mm (Waters, Parte# 1860035554) • Placa de 96 poços, 0,5 mL, polipropileno (Agilent, Parte# 5042- 1386) • Reservatório de reagente descartável de 25 mL (VistaLab, Parte# 3054-1004) • Espectrômetro de massa TripleQuad (Agilent, Modelo# 6495) • Sistema LC 1290 Infinity II (Agilent, Modelo# 1290)

PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

[00111] Uma solução estoque de C1q de 200 µg/mL foi preparada em soro humano depletado de C1q e tampão de diluição de ensaio (ADB) contendo 20 µg/mL do candidato a fármaco de anticorpo monoclonal biespecífico. A solução estoque de C1q foi diluída em série 1 a 3, seis vezes para preparar seis soluções padrão de C1q (L6-L1). As amostras LLOQ (limite inferior de quantificação), QC baixo, QC médio, QC alto e ULOQ (limite superior de quantificação) foram preparadas em ADB independentemente da solução estoque de C1q. Uma alíquota de ADB foi reservada como uma amostra L0 (branco). As concentrações do padrão de C1q e das soluções QC estão listadas na Tabela 3. TABELA 3. AS CONCENTRAÇÕES DO PADRÃO DE C1Q E DAS SOLUÇÕES QC. Nível/QC Concentração (µg/mL) L1/LLOQ 0,27 L2 0,82 L3 2,47 L4 7,41 L5 22,22 L6/ULOQ 66,67

33 / 46 Nível/QC Concentração (µg/mL) LQC 0,78 MQC 6,25 HQC 50

[00112] Os seguintes peptídeos de padrão interno (PPIs) marcados com isótopos foram reconstituídos para 6-12 mM em 30% de acetonitrila em ácido fórmico a 0,1% para criar soluções PPI marcadas com isótopos: SLGFC(Cam)DTTNK (SEQ ID NO: 41), IAFSATR (SEQ ID NO: 29) e QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36).

[00113] Cada amostra de C1q foi diluída 50 vezes em Tris-HCl de 100 mM, pH 7,5 e 20 µg/mL do anticorpo biespecífico. 5 µL de cada amostra de C1q diluída foram então desnaturados e reduzidos em 20 µL de 8 M de ureia e 10 mM de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) a 56 °C com agitação por 30 minutos. 5 µL de 50 mM de iodoacetamida foram então adicionados a cada amostra e as amostras foram então incubadas no escuro a 25 °C com agitação por 30 minutos. 10 µL da solução apropriada de PPI marcado com isótopo foram então adicionados a cada amostra. Após a adição dos PPIs, 100 µL de 0,01 µg/µL de tripsina também foram adicionados a cada amostra. As amostras foram então incubadas a 37 °C no escuro com agitação por 4 horas. 5 µL de 20% de ácido fórmico foram adicionados às amostras para extinguir a reação de digestão tríptica. As amostras foram misturadas e centrifugadas a 4680 rpm por 5 minutos antes de serem analisadas por LC-SRM-MS/MS. ANÁLISE LC-SRM-MS

[00114] A análise LC-SRM-MS foi realizada em um espectrômetro de massa TripleQuad (Agilent, modelo 6495) com um sistema LC 1290 Infinity II (Agilent, modelo# 1290). O gradiente LC usado é descrito na Tabela 4, em que o Tampão A consistia em ácido fórmico a 0,1% em água e o tampão B consistia em ácido fórmico a 0,1% em acetonitrila. TABELA 4. GRADIENTE LC Tempo (minuto) Tampão A (%) Tampão B (%) Fluxo (mL/minuto) 0,5 97 3 0,4 8,0 75 25 0,4 8,1 10 90 0,4 10,5 10 90 0,4

34 / 46 Tempo (minuto) Tampão A (%) Tampão B (%) Fluxo (mL/minuto) 10,6 97 3 0,4 13,0 97 3 0,4

[00115] A análise SRM-MS monitorou simultaneamente fragmentos de peptídeos C1q nativos e peptídeos marcados com isótopos nas amostras. As áreas de pico para duas transições (marcador nativo e pesado) foram coletadas e relatadas para ambos os peptídeos C1q nativos e marcados com isótopo. Para cada padrão C1q e amostras de QC, a saída de dados para a proteína C1q analisada por LC-SRM-MS rendeu seis medições que consistem em duas medições de transição (marcador nativo e pesado) de cada um dos três peptídeos selecionados apresentados na Tabela 5 abaixo. TABELA 5. A TRANSIÇÃO DE M/Z E A ENERGIA DE COLISÃO DE PEPTÍDEOS ALVO C1Q. Subunidade de C1q Sequência de peptídeos SEQ ID NO Transição de m/z Energia de colisão (V) A SLGFC(Cam)DTTNK 41 571,8 > 942,3 18 B IAFSATR 29 383,1 > 581,1 10 C QTHQPPAPNSLIR 36 487,0 > 350,3 13

[00116] Cada um dos três peptídeos na Tabela 5 são de uma subunidade diferente de C1q. O fragmento de peptídeo derivado da subunidade B foi usado como o peptídeo de quantificação (referido neste documento como o peptídeo da subunidade B), e os fragmentos de peptídeo derivados das subunidades A (referido neste documento como o peptídeo da subunidade A) e C (referido neste documento como o peptídeo da subunidade C) foram usados como peptídeos de confirmação. Os PPIs marcados com isótopo têm sequências de aminoácidos que são idênticas a cada um dos três peptídeos selecionados e são referidos neste documento como o peptídeo de controle da subunidade A marcado com isótopo, o peptídeo de controle da subunidade B marcado com isótopo e peptídeo de controle da subunidade C marcado com isótopo

[00117] Os três peptídeos listados na Tabela 5 foram selecionados com base em resultados anteriores que mostraram que esses peptídeos eram os melhores peptídeos para quantificar a concentração de C1q em um ensaio LC- SRM-MS/MS. A seleção desses peptídeos foi parcialmente baseada na

35 / 46 conservação da sequência de peptídeo entre humanos e macacos (Macaca fascicularis). A Figura 1 mostra um alinhamento de sequência da subunidade A de C1q de humano, macaco (Macaca fascicularis), camundongo e rato destacando o peptídeo da subunidade A. A Figura 2 mostra um alinhamento de sequência da subunidade B de C1q de humano, macaco (Macaca fascicularis), camundongo e rato destacando a subunidade B do peptídeo. A Figura 3 mostra um alinhamento de sequência da subunidade C de C1q de humano, macaco (Macaca fascicularis), camundongo e rato destacando o peptídeo C da subunidade. Vários peptídeos trípticos de cada uma das subunidades A, B e C de C1q foram inicialmente testados. Os peptídeos testados estão listados na Tabela 2.

RESULTADOS

[00118] Cada amostra padrão de C1q e cada amostra QC de C1 foram analisadas usando LC-SRM-MS/MS. Para cada amostra, 6 sinais foram registrados: o sinal correspondente ao peptídeo nativo da subunidade A, o sinal correspondente ao peptídeo nativo da subunidade B, o sinal correspondente ao peptídeo nativo da subunidade C, o sinal correspondente ao peptídeo de controle da subunidade A marcado com isótopo, o sinal correspondente ao peptídeo de controle da subunidade B marcado com isótopo e o sinal correspondente ao peptídeo de controle da subunidade C marcado com isótopo. Os dados para peptídeos marcados com isótopos foram usados como controles internos para fins de resolução de problemas de desempenho do ensaio.

[00119] Para cada um dos três peptídeos selecionados (o peptídeo da subunidade A, o peptídeo da subunidade B e o peptídeo da subunidade C), uma curva de calibração foi gerada traçando o sinal LC-SRM-MS normalizado registrado a partir de amostras padrão de C1q contra as concentrações nominais correspondentes dessas amostras. A Figura 4 mostra a curva de calibração gerada usando o sinal correspondente ao peptídeo da

36 / 46 subunidade A. A Figura 5 mostra a curva de calibração gerada usando o sinal correspondente ao peptídeo da subunidade B. A Figura 6 mostra a curva de calibração gerada usando o sinal correspondente ao peptídeo C da subunidade. Para as Figuras 4 a 6, os pontos pretos representam amostras padrão de C1q nas concentrações de L1-L6. Os triângulos azuis representam amostras QC de C1q nas concentrações de LLOQ, LQC, MQC, HQC e ULOQ.

[00120] Depois de gerar a curva de calibração, as concentrações das amostras QC foram então determinadas comparando o sinal LC-SRM-MS/MS de cada um dos três peptídeos alvo nas amostras QC com a curva de calibração correspondente. A precisão do ensaio foi avaliada comparando as concentrações determinadas com as concentrações nominais das amostras QC. Os resultados da comparação são mostrados nas Tabelas 6-8. TABELA 6. EXATIDÃO DO ENSAIO USANDO O PEPTÍDEO ALVO SLGFC(CAM)DTTNK (SEQ ID NO: 41) DERIVADO DA SUBUNIDADE A DE C1Q. Padrões L1 L2 L3 L4 L5 L6 Conc. Nominal (µg/mL) 0,27 0,82 2,47 7,41 22,22 66,67 Precisão (%) 103 91 104 100 104 99 QC (N=3) LLOQ LQC MQC HQC ULOQ Conc. Nominal (µg/mL) 0,27 0,78 6,25 50 66,67 Precisão (%) - Conjunto1 96 99 97 95 97 Precisão (%) - Conjunto2 102 94 100 96 102 Precisão (%) - Conjunto3 71 101 101 97 104 % de RSD (N=3) 19% 4% 2% 1% 4% TABELA 7. PRECISÃO DO ENSAIO USANDO O PEPTÍDEO ALVO IAFSATR (SEQ ID NO: 29) DERIVADO DA SUBUNIDADE B DE C1Q. Padrão L1 L2 L3 L4 L5 L6 Conc. Nominal (µg/mL) 0,27 0,82 2,47 7,41 22,22 66,67 Precisão (%) 101 95 106 98 99 100 QC (N=3) LLOQ LQC MQC HQC ULOQ Conc. Nominal (µg/mL) 0,27 0,78 6,25 50 66,67 Precisão (%) - Conjunto1 98 95 97 105 96 Precisão (%) - Conjunto2 94 94 100 106 111 Precisão (%) - Conjunto3 99 94 95 109 113 % de RSD (N=3) 3% 1% 3% 2% 9% TABELA 8. CALIBRAÇÃO DO ENSAIO DE C1Q COM BASE NO PEPTÍDEO ALVO QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36) DERIVADO DA

37 / 46 SUBUNIDADE C DE C1Q. Padrão L1 L2 L3 L4 L5 L6 Conc. Nominal (µg/mL) 0,27 0,82 2,47 7,41 22,22 66,67 Precisão (%) 101 95 103 100 101 100 QC (N=3) LLOQ LQC MQC HQC ULOQ Conc. Nominal (µg/mL) 0,27 0,78 6,25 50 66,67 Precisão (%) - Conjunto1 98 98 99 106 99 Precisão (%) - Conjunto2 104 101 103 105 110 Precisão (%) - Conjunto3 93 97 102 107 111 % de RSD (N=3) 6% 2% 2% 1% 6%

[00121] Esses resultados demonstram que o ensaio é preciso e sensível. Eles também demonstram que o uso do peptídeo IAFSATR (SEQ ID NO: 29) derivado da subunidade B de C1q forneceu os melhores resultados, pois houve uma alta resposta registrada por LC-SRM-MS/MS e o sinal estava livre de interferência de fundo. LLOQ E LIMITE DE DETECÇÃO (LOD)

[00122] Conforme mostrado nos painéis esquerdo e do meio da Figura 7, o cromatograma de massa registrado na concentração de LLOQ (0,27 µg/mL) para o peptídeo da subunidade A e o peptídeo da subunidade B exibiu pouco ou nenhum pico de fundo localizado no mesmo tempo de aquisição conforme os picos de peptídeo nas amostras em branco e em branco duplo. No entanto, como mostrado no painel direito da Figura 7, o cromatograma de massa registrado para o peptídeo da subunidade C exibiu picos de fundo nas amostras em branco e em branco duplo. A área sob a curva para o pico de fundo na amostra em branco foi de aproximadamente 5% da área sob a curva para o pico da amostra. No geral, como mostrado na Figura 8, as razões de sinal para ruído para o peptídeo da subunidade A, o peptídeo da subunidade B e o peptídeo da subunidade C na concentração de LLOQ foram 51, 36, 94, respectivamente, e na concentração limitada de detecção (LOD) foram 7, 9 e 6, respectivamente. EXEMPLO 2 - TRANSPORTE DE INSTRUMENTO DE TESTE DOS

MÉTODOS DA PRESENTE DIVULGAÇÃO

[00123] Como os métodos da presente divulgação podem ser usados

38 / 46 para realizar experimentos consecutivos no mesmo instrumento, é importante ter certeza de que o transporte da última amostra não irá interferir com o ensaio para a próxima amostra. O transporte de instrumento durante a prática dos métodos da presente divulgação foi medido.

[00124] Um cromatograma LC-SRM-MS foi registrado primeiro para uma amostra de preparação em branco. Imediatamente depois, um cromatograma de massa para uma amostra QC de C1q na concentração ULOQ (66,7 µg/mL) foi registrado no mesmo instrumento. Finalmente, uma segunda amostra de preparação em branco foi analisada no mesmo instrumento após a análise da amostra ULOQ. Conforme mostrado na Figura 9, não houve mudança significativa nos cromatogramas de preparação em branco antes ou depois de analisar a amostra ULOQ para o peptídeo da subunidade A, subunidade B ou subunidade C. Esses resultados demonstram que o transporte de instrumento para os métodos da presente divulgação é mínimo. EXEMPLO 3 - TESTANDO A TOLERÂNCIA A FÁRMACOS DOS

MÉTODOS DA PRESENTE DIVULGAÇÃO

[00125] Para examinar se a presença de fármacos de anticorpo interfere ou não com os métodos da presente divulgação, diferentes concentrações (0,20 µg/mL ou 2000 µg/mL) de um anticorpo biespecífico foram adicionadas às amostras de referência de C1q na concentração em Branco Duplo (apenas matriz em branco, sem padrão interno; L00). Como mostrado na Figura 10, a adição do anticorpo biespecífico não produziu quaisquer mudanças significativas no cromatograma de massa registrado.

[00126] Amostras de referência de C1q nas concentrações de LQC, MQC e HQC (0,8 µg/mL, 6,3 µg/mL e 50,0 µg/mL, respectivamente) foram incubadas na ausência do anticorpo biespecífico ou com 0 µg/mL, 20 µg/mL, 40 µg/mL ou 2000 µg/mL do anticorpo biespecífico e analisadas usando LC- SRM-MS/MS. Estas concentrações do anticorpo biespecífico no ensaio de

39 / 46 C1q corresponderam a 1 mg/mL, 2 mg/mL ou 100 mg/mL do anticorpo biespecífico em soro puro. Para colocar essas concentrações no contexto da farmacocinética, quando administradas na dosagem de 50 mg/kg, a concentração sérica máxima (Cmáx) do anticorpo biespecífico 6 é de 1,25 - 1,5 mg/mL. Como mostrado na Figura 11, a adição do anticorpo biespecífico realmente aprimora a recuperação do sinal para os peptídeos da subunidade A, subunidade B e subunidade C. Na Figura 11, a primeira barra rosa ou em cada grupo corresponde a amostras incubadas na ausência do anticorpo biespecífico; a barra amarela ou a segunda barra em cada grupo corresponde a amostras incubadas com 20 µg/mL do anticorpo biespecífico; a barra verde ou terceira em cada grupo corresponde a amostras incubadas com 40 µg/mL do anticorpo biespecífico; a barra azul ou a quarta barra em cada grupo corresponde a amostras incubadas com 2000 µg/mL do anticorpo biespecífico. EXEMPLO 4 - TESTANDO A RECUPERAÇÃO DE DILUIÇÃO E

LINEARIDADE DE DILUIÇÃO DOS MÉTODOS DA PRESENTE DIVULGAÇÃO

[00127] A recuperação do sinal de C1q endógeno nos métodos da presente divulgação também foi testada em amostras diluídas em diferentes diluentes e com diferentes fatores de diluição. Os diluentes testados incluíram soro humano depletado a 2% incubado com 20 µg/mL do anticorpo biespecífico, soro humano depletado a 2%, BSA a 0,1% e uma solução de Tris-HCl. Essas amostras foram diluídas 20x, 50x e 100x e LC-SRM-MS/MS foi usada para analisar as diluições. Como mostrado na Figura 12, a adição do anticorpo biespecífico aprimora a recuperação dos sinais de peptídeo da subunidade A, subunidade B e subunidade C, mesmo em fatores de diluição mais elevados. Houve uma menor recuperação do sinal nas amostras diluídas com 0,1% de BSA e Tris-HCl. Na Figura 12, a barra azul ou primeira em cada grupo corresponde a amostras diluídas com 2% de soro humano depletado

40 / 46 incubado com 20 µg/mL do anticorpo biespecífico; a barra laranja ou segunda em cada grupo corresponde a amostras diluídas com 2% de soro humano depletado; a barra verde ou terceira em cada grupo corresponde a amostras diluídas com 0,1% de BSA; a barra roxa ou quarta em cada grupo corresponde a amostras diluídas com Tris-HCl.

[00128] A recuperação do sinal de padrões de referência de C1q usando diferentes diluentes também foi testada. Amostras de referência de C1q nas concentrações de LQC, MQC e HQC (0,8 µg/mL, 6,3 µg/mL e 50,0 µg/mL, respectivamente) foram diluídas com 2% de soro humano depletado incubado com 20 µg/mL do anticorpo biespecífico, 2% de soro humano depletado ou 0,1% de BSA. Conforme mostrado na Figura 13, o anticorpo biespecífico melhorou a recuperação dos sinais de peptídeo da subunidade A, subunidade B e subunidade C. Na Figura 13, a barra azul ou primeira em cada grupo corresponde a amostras diluídas com 2% de soro humano depletado incubado com 20 µg/mL do anticorpo biespecífico; a barra laranja ou segunda em cada grupo corresponde a amostras diluídas com 2% de soro humano depletado; a barra verde ou terceira em cada grupo corresponde a amostras diluídas com 0,1% de BSA.

[00129] Para testar a linearidade de diluição dos métodos da presente divulgação, amostras agrupadas de soro humano, macaco macho e macaca fêmea foram diluídas em 20 vezes, 50 vezes e 100 vezes. As concentrações de C1q endógeno nessas amostras diluídas foram determinadas usando os métodos da presente divulgação. Os resultados deste teste são mostrados na Tabela 9 abaixo. TABELA 9. TESTE DE LINEARIDADE DE DILUIÇÃO COM C1Q ENDÓGENO. Por C1Q-A Por C1Q-B Por C1Q-C Fator de Amostra Cal. Conc. Cal. Conc. Cal. Conc. diluição % de RSD % de RSD % de RSD (ug/mL) (ug/mL) (ug/mL) Soro 100X 89 80 78 Humano 50X 70 12,4% 72 5,3% 70 6,0% Agrupado 20X 87 74 74

41 / 46 Por C1Q-A Por C1Q-B Por C1Q-C Fator de Amostra Cal. Conc. Cal. Conc. Cal. Conc. diluição % de RSD % de RSD % de RSD (ug/mL) (ug/mL) (ug/mL) 100X 87 59 61 Macaco 50X 81 8,7% 58 0,8% 60 2,7% Macho 20X 96 58 58 100X 70 56 55 Macaca 50X 67 2,1% 49 6,2% 50 8,7% Fêmea 20X 69 54 59 EXEMPLO 5 - REPETIBILIDADE DA PREPARAÇÃO DA AMOSTRA E

ESTABILIDADE DA AMOSTRA EM MÉTODOS DA PRESENTE DIVULGAÇÃO

[00130] A repetibilidade da preparação da amostra dos métodos da presente divulgação foi testada usando amostras QC de C1q em concentrações de LLOQ, LQC, MQC, HQC e ULOQ. Para a repetibilidade da injeção, alíquotas da mesma amostra QC foram injetadas no instrumento de ensaio no mesmo dia (intradia) ou em dias diferentes (interdia). Para a repetibilidade da preparação da amostra, as amostras foram preparadas a partir de soluções QC no mesmo dia (intradia) ou em dias diferentes (interdia). 3 amostras para cada condição foram testadas e o desvio padrão relativo das 3 amostras para cada condição é mostrado na Tabela 10 abaixo. TABELA 10. REPETIBILIDADE DA INJEÇÃO E PREPARAÇÃO DA

AMOSTRA DOS MÉTODOS DA PRESENTE DIVULGAÇÃO % de RSD C1Q QC (N=3) Preparação da Preparação da Injetor Intradia Injetor Interdia Amostra Intradia Amostra Interdia LLOQ 0,6 10,2 3,0 14,0 LQC 7,8 7,1 9,2 13,7 C1Q-A MQC 1,2 5,4 2,7 4,3 HQC 1,2 1,3 0,9 1,3 ULOQ 2,5 2,0 2,0 2,0 LLOQ 4,8 5,0 0,8 6,0 LQC 4,4 9,3 2,0 4,6 C1Q-B MQC 1,8 6,2 1,5 3,9 HQC 0,5 2,0 1,2 1,8 ULOQ 0,4 0,8 1,2 1,7 LLOQ 6,8 6,2 4,6 5,6 LQC 1,3 1,6 3,3 5,6 C1Q-C MQC 2,3 2,0 3,2 2,9 HQC 1,3 2,2 1,6 2,5 ULOQ 1,0 1,9 1,9 2,7

42 / 46

[00131] Para a estabilidade da amostra, as amostras QC de C1q em concentrações de LLOQ, LQC, MQC, HQC e ULOQ (0,3 µg/mL, 0,8 µg/mL, 6,3 µg/mL, 50,0 µg/mL e 66,7 µg/mL, respectivamente) foram submetidas a três ciclos de congelamento e descongelamento ou armazenados em um amostrador automático por 48 horas antes de suas concentrações de C1q serem determinadas pelo ensaio de C1q. Como mostrado na Figura 14, a precisão dos métodos da presente divulgação não foi significativamente afetada por três ciclos de congelamento e descongelamento ou por 48 horas de armazenamento em um amostrador automático. Na linha superior dos gráficos na Figura 14, a primeira barra em cada grupo corresponde às amostras que foram analisadas recentemente antes do congelamento; a segunda barra em cada grupo corresponde às amostras que foram submetidas a três ciclos de congelamento e descongelamento. Na linha inferior dos gráficos da Figura 14, a primeira barra de cada grupo corresponde às amostras que foram analisadas recentemente; a segunda barra em cada grupo corresponde às amostras que foram analisadas após 48 horas de armazenamento em um amostrador automático.

[00132] Em experimentos separados, 72 horas de armazenamento também foram testadas, e nenhuma degradação ou perda da amostra foi observada. EXEMPLO 6 - VARIAÇÃO DE ENSAIO RELACIONADA A PEPTÍDEOS DE PADRÃO INTERNO EM MÉTODOS DA PRESENTE DIVULGAÇÃO.

[00133] Peptídeos marcados com isótopos pesados; chamados de peptídeos de padrão interno (PPIs) têm sequências de aminoácidos idênticas aos peptídeos da subunidade A, subunidade B e subunidade C. Amostras QC de C1q nas concentrações de LLOQ, LQC, MQC, HQC e ULOQ (0,3 µg/mL, 0,8 µg/mL, 6,3 µg/mL, 50,0 µg/mL e 66,7 µg/mL, respectivamente) foram analisadas na presença e ausência de cada PPI. Os resultados dessa análise são mostrados na Tabela 11. A inclusão dos PPIs não interferiu na análise.

43 / 46 Portanto, os peptídeos marcados com isótopos foram usados para confirmação do tempo de retenção, calibração de desempenho do instrumento e solução de problemas. TABELA 11. VARIAÇÃO DO ENSAIO DE C1Q COM OU SEM

PEPTÍDEOS DE PADRÃO INTERNO MARCADOS COM ISÓTOPOS % de RSD de QC (n=3) C1QA C1QB C1QC QC (N=3) - PPI + PPI - PPI + PPI - PPI + PPI LLOQ 8% 12% 4% 2% 2% 8% LQC 11% 11% 4% 2% 2% 1% MQC 2% 6% 3% 5% 2% 4% HQC 2% 6% 1% 4% 0% 8% ULOQ 2% 3% 1% 1% 2% 7% EXEMPLO 6 - QUANTIFICAÇÃO DE C1Q EM AMOSTRAS DE

SANGUE DE MACACOS TRATADOS USANDO OS MÉTODOS DA PRESENTE DIVULGAÇÃO.

[00134] Os métodos da presente divulgação foram usados para quantificar a concentração da proteína C1q presente nas amostras de sangue de macacos tratados com um anticorpo biespecífico. A designação do grupo de macacos e os níveis de dose são mostrados na Tabela 12. TABELA 12. DESIGNAÇÃO DO GRUPO DE MACACOS E NÍVEIS DE

DOSE Nº de animais Nível de dose Concentração de dose Grupo (machos) (mg/kg) (mg/mL) 1 (controle de isotipo) 3 50 25 2 (baixo) 3 2 1 3 (médio) 3 10 5 4 (alto) 3 50 25

[00135] O Grupo 1 foi administrado com um anticorpo de controle de isotipo diluído por meio de injeção intravenosa em bolus lento a um volume de dose de 2 mL/kg. Os Grupos 2, 3 e 4 receberam um anticorpo biespecífico diluído por meio de injeção intravenosa em bolus lento a uma dose de 2 mL/kg. Amostras de sangue de 0,5 mL foram coletadas de acordo com o seguinte cronograma: amostra pré-dose e aproximadamente 5 minutos após a amostra de dose ter sido coletada no Dia 1; as amostras subsequentes foram coletadas 24 horas, 72 horas e 168 horas após a dose; as amostras também

44 / 46 foram coletadas uma vez em cada dia 14 após a dose, dia 42 após a dose e dia 56 após a dose. As amostras de sangue foram centrifugadas por 1 hora após a coleta e as amostras de soro coletadas foram divididas em 4 alíquotas de 50 µL cada.

[00136] Cada amostra de soro de macaco foi diluída 50 vezes em 100 mM de Tris-HCl, pH 7,5 e 20 µg/mL do anticorpo biespecífico. 5 µL de cada amostra de soro de macaco diluída foram então desnaturados e reduzidos em 20 µL de 8 M de ureia e tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 10 mM a 56 °C com agitação por 30 minutos. 5 µL de iodoacetamida 50 mM foram então adicionados a cada amostra e as amostras foram então incubadas no escuro a 25 °C com agitação por 30 minutos. 10 µL da solução de peptídeo de padrão interno marcado com isótopo apropriado (vide Exemplo 1) foram adicionados antes de 100 µL de 0,01 µg/µL de tripsina serem adicionados a cada amostra. As amostras foram então incubadas a 37 °C no escuro com agitação por 4 horas. 5 µL de 20% de ácido fórmico foram adicionados às amostras para extinguir a reação de digestão tríptica. As amostras foram misturadas e centrifugadas a 4680 rpm por 5 minutos antes de serem analisadas por LC- SRM-MS/MS.

[00137] Para cada amostra de soro de macaco, LC-SRM-MS/MS foi usada para registrar o sinal correspondente ao peptídeo da subunidade A, ao peptídeo da subunidade B e ao peptídeo da subunidade C, bem como os sinais correspondentes aos peptídeos de padrão interno marcados com isótopos.

[00138] As concentrações de C1q em cada uma das amostras de soro de macaco dosadas foram então determinadas comparando os sinais dos peptídeos da subunidade A, subunidade B e subunidade C com curvas de calibração (geradas conforme descrito no Exemplo 1). As concentrações de C1q, conforme determinado pelo peptídeo da subunidade A, peptídeo da subunidade B e peptídeo da subunidade C, são apresentadas nas Tabelas 13-

15. O curso de tempo pós-dose das concentrações de C1q no sangue de

45 / 46 macaco são representados nas Figuras 15-17. A Figura 15 mostra a concentração de C1q nas amostras de dose de macaco quantificadas usando o peptídeo da subunidade A. A Figura 16 mostra a concentração de C1q nas amostras de dose de macaco quantificadas usando o peptídeo da subunidade B. A Figura 17 mostra a concentração de C1q nas amostras de dose de macaco quantificadas usando o peptídeo C da subunidade. Na Figura 15-17, a linha azul corresponde aos macacos do Grupo 1, a linha vermelha corresponde aos macacos do Grupo 2, a linha verde corresponde aos macacos do Grupo 3 e a linha roxa corresponde aos macacos do Grupo 4. TABELA 13. QUANTIFICAÇÃO DE AMOSTRAS DE SANGUE DE MACACO DOSADAS PARA CONCENTRAÇÃO DE C1Q PELO PEPTÍDEO ALVO SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26) DERIVADO DA SUBUNIDADE A DE C1Q. Concentração de C1q pela subunidade A (µg/mL) Ponto de Grupo 1 (controle de Grupo 2 (baixo) Grupo 3 (médio) Grupo 4 (alto) Tempo isotipo) P0001 P0002 P0003 P0101 P0102 P0103 P0201 P0202 P0203 P0301 P0302 P0303 Pré-dose 124 87 102 89 93 76 114 120 90 59 92 92 5 min 102 88 94 78 81 72 90 91 74 43 70 67 24 h 118 83 108 78 89 74 84 102 66 4* 58 9* 72 h 112 76 96 80 79 64 93 96 67 5* 53 13* 168 h 116 80 96 81 86 79 106 106 81 8* 67 28 D14 105 77 99 78 100 70 120 93 79 25 71 63 D42 106 81 96 74 103 80 85 106 91 56 83 99 D56 109 91 96 79 104 74 105 117 92 53 86 94 * Uma concentração estimada de C1q. Concentração abaixo de LLOQ (0,27 µg/mL), mas acima de LOD (0,027 µg/mL).

TABELA 14. QUANTIFICAÇÃO DE AMOSTRAS DE SANGUE DE MACACO DOSADAS PARA CONCENTRAÇÃO DE C1Q PELO PEPTÍDEO ALVO IAFSATR (SEQ ID NO: 29) DERIVADO DA SUBUNIDADE B DE C1Q. Concentração de C1q pela subunidade B (µg/mL) Ponto de Grupo 1 (controle de Grupo 2 (baixo) Grupo 3 (médio) Grupo 4 (alto) Tempo isotipo) P0001 P0002 P0003 P0101 P0102 P0103 P0201 P0202 P0203 P0301 P0302 P0303 Pré-dose 99 72 88 69 79 67 90 93 67 49 75 74 5 min 82 67 80 61 69 59 71 77 58 34 58 55 24 h 90 66 82 66 75 62 65 76 51 1* 44 5* 72 h 90 63 75 59 75 59 72 73 53 2* 44 7* 168 h 88 67 74 66 77 62 82 81 64 6* 50 19 D14 85 68 75 62 77 66 85 78 63 17 60 49

46 / 46 Concentração de C1q pela subunidade B (µg/mL) Ponto de Grupo 1 (controle de Grupo 2 (baixo) Grupo 3 (médio) Grupo 4 (alto) Tempo isotipo) P0001 P0002 P0003 P0101 P0102 P0103 P0201 P0202 P0203 P0301 P0302 P0303 D42 86 65 76 61 79 67 75 80 69 46 66 76 D56 82 76 82 63 88 68 84 85 74 44 69 73 * Uma concentração estimada de C1q. Concentração abaixo de LLOQ (0,27 µg/mL), mas acima de LOD (0,027 µg/mL).

TABELA 15. QUANTIFICAÇÃO DE AMOSTRAS DE SANGUE DE MACACO DOSADAS PARA CONCENTRAÇÃO DE C1Q PELO PEPTÍDEO ALVO QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36) DERIVADO DA SUBUNIDADE C DE C1Q. Concentração de C1q pela subunidade C (µg/mL) Ponto de Grupo 1 (controle de Grupo 2 (baixo) Grupo 3 (médio) Grupo 4 (alto) Tempo isotipo) P0001 P0002 P0003 P0101 P0102 P0103 P0201 P0202 P0203 P0301 P0302 P0303 Pré-dose 94 66 78 65 73 62 94 88 66 51 41 73 5 min 76 59 70 53 60 54 68 73 61 37 31 52 24 h 88 63 76 57 68 58 62 75 51 6* 23 9* 72 h 87 58 64 57 61 54 69 70 54 7* 24 12* 168 h 79 62 72 62 69 58 79 81 60 8* 28 22 D14 86 67 73 61 77 59 79 74 62 21 34 48 D42 82 60 73 53 74 62 71 76 66 45 39 77 D56 78 73 78 58 82 62 85 80 74 47 39 75 * Uma concentração estimada de C1q. Concentração abaixo de LLOQ (0,27 µg/mL), mas acima de LOD (0,027 µg/mL).

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Ensaio, caracterizado por compreender: (1) colocar uma amostra biológica em contato com pelo menos uma enzima proteolítica para produzir pelo menos um fragmento de peptídeo da proteína C1q presente na amostra biológica; e (2) realizar espectrometria de massa de monitoramento de reação selecionada (SRM-MS) para medir a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q, em que a abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q determina a concentração de C1q na amostra biológica.

2. Ensaio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda, entre a etapa (1) e a etapa (2), adicionar à amostra biológica pelo menos um fragmento de peptídeo C1q sintético marcado compreendendo uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q.

3. Ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por a medição da abundância do pelo menos um fragmento de peptídeo C1q compreender comparar um sinal correspondente ao pelo menos um peptídeo C1q gerado por SRM-MS com uma curva padrão.

4. Ensaio, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a curva padrão ser produzida usando um método que compreende: (a) preparar pelo menos dois padrões de concentração de C1q misturando quantidades conhecidas de proteína C1q purificada e soro depletado de C1q; (b) adicionar aos pelo menos dois padrões de concentração de C1q pelo menos um fragmento de peptídeo sintético marcado com uma sequência de aminoácidos idêntica a pelo menos um fragmento de peptídeo C1q que espera-se que seja produzido após o contato do padrão de concentração de C1q com uma enzima proteolítica;

(c) colocar os pelo menos dois padrões de concentração de C1q marcados em contato com uma enzima proteolítica para produzir pelo menos um fragmento de peptídeo C1q; (d) realizar espectrometria de massa de monitoramento de reação selecionada para determinar a força do sinal que corresponde ao pelo menos um fragmento de peptídeo C1q e a força do sinal que corresponde ao pelo menos um fragmento de peptídeo sintético marcado em cada um dos pelo menos dois padrões de concentração de C1q marcados; e (e) determinar uma curva padrão usando os sinais e as quantidades conhecidas de proteína C1q.

5. Ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a amostra biológica ser: i) uma amostra de sangue; e/ou ii) uma amostra de humano ou uma amostra de primata não humano.

6. Ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o pelo menos um fragmento de peptídeo compreender: i) pelo menos 5 aminoácidos; e/ou ii) um peptídeo selecionado da Tabela 2; e/ou iii) SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26), IAFSATR (SEQ ID NO: 29) ou QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36); e/ou iv) pelo menos dois de SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26), IAFSATR (SEQ ID NO: 29) ou QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36); e/ou v) cada um de SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26), IAFSATR (SEQ ID NO: 29) e QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36).

7. Ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por a espectrometria de massa de monitoramento de reação selecionada ser LC-SRM-MS/MS.

8. Composição compreendendo pelo menos um peptídeo sintético isolado, a referida composição caracterizada por compreender pelo menos um peptídeo sintético isolado com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da proteína C1q, em que a sequência de aminoácidos selecionada a partir da proteína C1q é a sequência de um fragmento de peptídeo C1q gerada pelo contato de C1q com pelo menos uma enzima proteolítica.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por C1q ser de um humano ou de um primata não humano.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizada por o pelo menos um peptídeo sintético isolado compreender pelo menos 5 aminoácidos.

11. Ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizados por a pelo menos uma enzima proteolítica ser tripsina.

12. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizada por o pelo menos um peptídeo sintético isolado ser marcado.

13. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizada por o pelo menos um peptídeo sintético isolado compreender um peptídeo selecionado da Tabela 2.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por o pelo menos um peptídeo sintético isolado compreender SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26), IAFSATR (SEQ ID NO: 29) ou QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36); opcionalmente, em que a cisteína no peptídeo sintético SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 26) é modificada; e, opcionalmente, em que a cisteína é modificada por carbamidometilação.

15. Composição compreendendo pelo menos um par de íons de transição, a referida composição caracterizada por compreender pelo menos um par de íons de transição da proteína C1q, em que o pelo menos um par de íons de transição consiste em um íon precursor com uma m/z correspondente e um íon de fragmento com uma m/z de íon correspondente, e em que o par de íons de transição é selecionado do precursor SLGFC(Cam)DTTNK (SEQ ID NO: 41) par de transição 571.8-942.3, precursor IAFSATR (SEQ ID NO: 29) par de transição 383.1-581.1 e precursor QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 36) par de transição 487.0-350.3.

Peptídeo Sinal Humano 1-22 humano macaco (mf) camundongo rato

Petição 870210008573, de 25/01/2021, pág. 61/82 Cabeça globular 110-245 humano macaco (mf) camundongo rato humano macaco (mf) camundongo rato 1/17 humano macaco (mf) camundongo rato

Peptídeo Alvo LCMS FIGURA 1

Peptídeo Sinal Humano 1-27 humano macaco (mf) camundongo

Petição 870210008573, de 25/01/2021, pág. 62/82 rato

Cabeça globular 117-253 humano macaco (mf) camundongo rato humano macaco (mf) camundongo 2/17 rato humano macaco (mf) camundongo rato Peptídeo Alvo LCMS

FIGURA 2

Peptídeo Sinal Humano 1-28 humano macaco (mf) camundongo

Petição 870210008573, de 25/01/2021, pág. 63/82 rato

Cabeça globular 115-245 humano macaco (mf) camundongo rato humano macaco (mf) camundongo 3/17 rato humano macaco (mf) camundongo rato Peptídeo Alvo LCMS

FIGURA 3

Concentração (ug/ml)

FIGURA 4

Respostas

Concentração (ug/ml)

FIGURA 5

Respostas

Concentração (ug/ml)

FIGURA 6

Respostas

C1Q por C1QA C1Q por C1QB C1Q por C1QC Preparação em Branco

Petição 870210008573, de 25/01/2021, pág. 67/82 Branco Duplo

Branco 7/17

FIGURA 7

C1Q por C1Q-C C1Q por C1Q-B

FIGURA 8 C1Q por C1Q-A

C1Q por C1QA C1Q por C1QB C1Q por C1QC

Preparação em Branco Depois

Petição 870210008573, de 25/01/2021, pág. 69/82 9/17

Preparação em Branco Antes

FIGURA 9

C1Q por C1Q-A C1Q por C1Q-B C1Q por C1Q-C 2000 µg/mL de anticorpo

Petição 870210008573, de 25/01/2021, pág. 70/82 20 µg/mL de anticorpo 10/17

Controle – sem anticorpo

FIGURA 10

Tolerância a Fármacos C1Q por C1Q-A Tolerância a Fármacos C1Q por C1Q-B Tolerância a Fármacos C1Q por C1Q-C

Petição 870210008573, de 25/01/2021, pág. 71/82 Resposta Relativa Resposta Relativa

Resposta Relativa FIGURA 11 11/17

C1Q por C1Q-A C1Q por C1Q-B C1Q por C1Q-C

Petição 870210008573, de 25/01/2021, pág. 72/82 Resposta Relativa (%) Resposta Relativa (%)

Resposta Relativa (%) Fator de Diluição Fator de Diluição Fator de Diluição 12/17

FIGURA 12

C1Q por C1Q-A Padrão C1Q por C1Q-B Padrão C1Q por C1Q-C Padrão

Petição 870210008573, de 25/01/2021, pág. 73/82 Resposta Relativa (%) Resposta Relativa (%) FIGURA 13 Resposta Relativa (%) 13/17

Estabilidade Gelo-Degelo C1Q por C1QA Estabilidade Gelo-Degelo C1Q por C1QB Estabilidade Gelo-Degelo C1Q por C1QC

Petição 870210008573, de 25/01/2021, pág. 74/82 Precisão (%) (Recuperação)

Precisão (%) (Recuperação)

Precisão (%) (Recuperação) Estabilidade de Amostra Processada C1Q por C1QA Estabilidade de Amostra Processada C1Q por C1QB Estabilidade de Amostra Processada C1Q por C1QC 14/17

Precisão (%) (Recuperação) Precisão (%) (Recuperação)

Precisão (%) (Recuperação) FIGURA 14

Conc.

C1Q Méd por C1Q-A

Petição 870210008573, de 25/01/2021, pág. 75/82 Conc (µg/mL) 15/17

Tempo (Dia)

Controle Baixo Méd Alto

FIGURA 15

Conc.

C1Q Méd por C1Q-B

Petição 870210008573, de 25/01/2021, pág. 76/82 Conc (µg/mL) 16/17

Tempo (Dia) Controle Baixo Méd Alto

FIGURA 16

Conc.

C1Q Méd por C1Q-C

Petição 870210008573, de 25/01/2021, pág. 77/82 Conc (µg/mL) 17/17

Tempo (Dia) Controle Baixo Méd Alto

FIGURA 17