JP7419340B2 - タンパク質バイオマーカーを定量するためのlc-ms/msの使用 - Google Patents
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Description
本願は、参照によりその内容が全体として本明細書中に組み込まれる、2018年8月8日に出願された、米国仮出願第62/715,973号に対する優先権及びその利益を主張する。
本願は、EFS-Webを介してASCIIフォーマットで提出され、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる配列表を含む。2019年7月29日に作成された当該ASCIIコピーは、「REGE-015-001WO_SeqList_ST25.txt」という名称であり、50,295バイトのサイズである。
本開示の様々な方法を本明細書中で詳細に記載する。
本開示の様々な組成物を本明細書中で詳細に記載する。
本明細書中で使用する場合、「m/z」は、イオンの質量対電荷比を意味する。
C1q標準及び品質管理(QC)サンプルを含む、既知C1q濃度のC1q基準溶液のセットを使用して、較正曲線とも称する標準曲線を作製するために本開示の方法を使用した。本開示の方法の感度及び精度も試験した。
精製C1qタンパク質を実験サンプルと同じ生体マトリックス中に希釈した。
試験したC1Q基準溶液のセットは、ダブルブランク、ブランク、及び少なくとも6つの非ゼロ濃度のC1qから構成されていた。
定量下限(LLOQ)は、LLOQサンプルの測定された応答がブランクサンプルの応答と比較して少なくとも5倍であるので、精度が公称濃度の25%以内であり、変動係数が25%未満であるC1qタンパク質の濃度と定義される。
定量上限(ULOQ)は、精度が公称濃度の20%以内であり、変動係数が20%未満であるように定義される。
少なくとも3つの濃度のQCサンプルを調製し、較正のために使用した。
各QCサンプルを二連で調製した。
QCサンプルは、アッセイの低、中及び高定量範囲を対象とし、低QC(LQC)サンプルはLLOQの濃度の3倍以内であった。
QCサンプルの少なくとも67%の精度は公称濃度の20%以内であった。
各レベルでのQCサンプルの少なくとも50%の精度は公称濃度の20%以内であった。
最小数のQCサンプルは未知サンプルの数の少なくとも5%以上又は6つの総QCサンプルであった。
QCサンプルは、C1q基準溶液の調製のためにストック溶液とは別のC1qストック溶液を用いて調製した。
精製ヒト補体タンパク質C1q(Quidel、Item#A400)
補体C1q枯渇血清、ヒト(Sigma-Aldrich、Cat#234401-1ML)
SLGFC(Cam)DTTNK(配列番号41)(New England Peptide)
IAFSATR(配列番号29)(New England Peptide)
QTHQPPAPNSLIR(配列番号36)(New England Peptide)
二重特異性モノクローナル抗体薬剤候補
再懸濁緩衝液を追加したシーケンシング等級の修飾トリプシン(Promega、Cat#.V5117)
UltraPure 1.0Mトリス-HCl pH7.5(Invitrogen、Cat#15567-027)
UltraPure 1.0Mトリス-HCl pH8.0(Invitrogen、Cat#15568-025)
UltraPure 1.0Mトリス-HCl pH8.5(Alfa Aesar、Cat#J61038)
尿素(Sigma Aldrich、Cat#U5128-100G)
TCEP HCL(Thermo Scientific;Cat#20491)
ヨードアセトアミド(Sigma-Aldrich;Cat#A3221-10VL)
ギ酸(Thermo Scientific;Cat#28905)
アセトニトリル(Fisher Chemical、Cat#A955-4)
ACQUITY UPLC BEH130 C18カラム、1.7μm、2.1mm×50mm(Waters、Part# 1860035554)
96ウェルプレート、0.5mL、ポリプロピレン(Agilent、Part#5042-1386)
25mLの使い捨て試薬容器(VistaLab、Part# 3054-1004)
TripleQuad質量分析計(Agilent、Model#6495)
1290 Infinity II LCシステム(Agilent、Model#1290)
200μg/mLのC1qストック溶液を、C1q枯渇ヒト血清及び、20μg/mLの二重特異性モノクローナル抗体薬剤候補を含むアッセイ希釈緩衝液(ADB)中で調製した。C1qストック溶液を1~3、6回連続希釈して、6つのC1q標準溶液(L6~L1)を調製した。LLOQ(定量下限)、低QC、中QC、高QC、及びULOQ(定量上限)サンプルをC1qストック溶液から独立してADB中で調製した。ADBのアリコートをL0(ブランク)サンプルとして保存した。C1q標準及びQC溶液の濃度を表3に記載する。
LC-SRM-MS分析を、1290 Infinity II LCシステム(Agilent、Model#1290)を備えたTripleQuad質量分析計(Agilent、Model#6495)で実施した。使用したLC勾配を表4に記載し、ここで、緩衝液Aは0.1%水中ギ酸からなり、緩衝液Bは0.1%アセトニトリル中ギ酸から構成されていた。
各C1q標準サンプル及び各C1q QCサンプルを、LC-SRM-MS/MSを使用して分析した。各サンプルについて、6つのシグナル:天然のサブユニットAペプチドに対応するシグナル、天然のサブユニットBペプチドに対応するシグナル、天然のサブユニットCペプチドに対応するシグナル、アイソトープ標識サブユニットA対照ペプチドに対応するシグナル、アイソトープ標識サブユニットB対照ペプチドに対応するシグナル及びアイソトープ標識サブユニットC対照ペプチドに対応するシグナルが記録された。アイソトープ標識ペプチドのデータを、アッセイ性能トラブルシューティングのための内部標準として使用した。
図7の左及び中央のカラムに示すように、サブユニットAペプチド及びサブユニットBペプチドについてLLOQ濃度(0.27μg/mL)で記録されたマスクロマトグラムは、ブランク及びダブルブランクサンプルにおけるペプチドピークと同じ捕捉時間に位置するバックグラウンドピークを殆ど乃至全く示さなかった。しかしながら、図7の右パネルに示すように、サブユニットCペプチドについて記録されたマスクロマトグラムはブランク及びダブルブランクサンプルにおいてバックグラウンドピークを示した。ブランクサンプルにおいてバックグラウンドピークの曲線の下の面積は、サンプルピークの曲線の下の面積の約5%であった。全体として、図8に示すように、LLOQ濃度でのサブユニットAペプチド、サブユニットBペプチド及びサブユニットCペプチドのシグナル対ノイズ比は、それぞれ、51、36、94であり、検出限界(LOD)濃度では、それぞれ、7、9及び6であった。
本開示の方法は同じ器具に対して連続実験を実施するために使用する場合があるので、最後のサンプルからのキャリーオーバーが次のサンプルのアッセイを妨害しないことを確実にすることが重要である。本開示の方法を実施する間の器具キャリーオーバーを測定した。
抗体薬剤の存在が本開示の方法を妨害するか否かを調べるために、様々な濃度(0、20μg/mL、又は2000μg/mL)の二重特異性抗体をダブルブランク(ブランクマトリックスのみ、内部標準なし;L00)濃度のC1q基準サンプルに添加した。図10に示すように、二重特異性抗体の添加は、記録されたマスクロマトグラムにおいて有意な変化をもたらさなかった。
本開示の方法における内因性C1qシグナルの回復も、様々な希釈剤中、様々な希釈因子で希釈されたサンプルにおいて試験した。試験した希釈剤は、20μg/mLの二重特異性抗体、2%枯渇ヒト血清、0.1%BSA及びトリス-HCl溶液と共にインキュベートした2%枯渇ヒト血清を含んでいた。これらのサンプルを20倍、50倍及び100倍に希釈し、LC-SRM-MS/MSを使用して希釈物を分析した。図12に示すように、二重特異性抗体の添加によって、さらに高い希釈因子でも、サブユニットA、サブユニットB及びサブユニットCペプチドシグナルの回復が改善される。0.1%BSA及びトリス-HClで希釈されたサンプルでのシグナルの回復はより低かった。図12において、各群における青色または一番目の棒グラフは、20μg/mLの二重特異性抗体とともにインキュベートした2%枯渇ヒト血清で希釈されたサンプルに相当し;各群におけるオレンジ色又は二番目の棒グラフは2%枯渇ヒト血清で希釈されたサンプルに相当し;各群における緑色又は三番目の棒グラフは0.1%BSAで希釈されたサンプルに相当し;各群における紫色又は四番目の棒グラフはトリス-HClで希釈されたサンプルに相当する。
本開示の方法のサンプル調製再現性は、LLOQ、LQC、MQC、HQC、及びULOQ濃度にてC1q QCサンプルを用いて試験した。注射再現性のために、同じQCサンプルのアリコートを、同じ日(intra-day)又は異なる日(inter-day)のいずれかにアッセイ器具に注入した。サンプル調製再現性のために、サンプルを同日(intra-day)又は異なる日(inter-day)のいずれかでQC溶液から調製した。各状態に対して3個のサンプルを試験し、各状態に対する3個のサンプルの相対的標準偏差を下記表10に示す。
内部標準ペプチド(ISP)と呼ばれる重アイソトープ標識ペプチドは、サブユニットA、サブユニットB及びサブユニットCペプチドと同じアミノ酸配列を有する。LLOQ、LQC、MQC、HQC、及びULOQ濃度(それぞれ、0.3μg/mL、0.8μg/mL、6.3μg/mL、50.0μg/mL及び66.7μg/mL)のC1q QCサンプルを各ISPの存在下及び非存在下で分析した。この分析の結果を表11に示す。ISPを含むことは分析を妨害しなかった。したがって、アイソトープ標識ペプチドを保持時間確認、器具性能較正、及びトラブルシューティングのために使用した。
本開示の方法を使用して、二重特異性抗体で処置したサルの血液サンプル中に存在するC1qタンパク質の濃度を定量した。サル群指定及び服用レベルを表12に示す。
Claims (8)
- (1)生体サンプルを少なくとも1つのタンパク質分解酵素と接触させて、前記生体サンプル中に存在するタンパク質C1qのペプチドフラグメントを産生すること、ここで、前記タンパク質C1qのペプチドフラグメントは、以下の標的ペプチド:
IAFSATR(配列番号29)のアミノ酸配列を有する標的ペプチド;並びに
以下の標的ペプチド:
SLGFCDTTNK(配列番号26)のアミノ酸配列を有する標的ペプチド;及び
QTHQPPAPNSLIR(配列番号36)のアミノ酸配列を有する標的ペプチド の少なくとも1つ、
を含む;そして
(2)選択反応モニタリング質量分析(SRM-MS)を実施して、前記標的ペプチドの存在量を測定すること、ここで、前記標的ペプチドの存在量は、前記生体サンプル中のC1qタンパク質の濃度を決定する、
を含むアッセイ。 - 前記タンパク質C1qのペプチドフラグメントが、以下:
SLGFCDTTNK(配列番号26)のアミノ酸配列を有する標的ペプチド;
IAFSATR(配列番号29)のアミノ酸配列を有する標的ペプチド;及び
QTHQPPAPNSLIR(配列番号36)のアミノ酸配列を有する標的ペプチド、
の各々を含む、請求項1に記載のアッセイ。 - ステップ(1)とステップ(2)との間で、前記生体サンプルに、少なくとも1つの前記標的ペプチドのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む少なくとも1つの標識された合成C1qペプチドフラグメントを添加することをさらに含む、請求項1~2のいずれか一項に記載のアッセイ。
- 前記標的ペプチドの存在量を測定することが、SRM-MSによって得られた前記標的ペプチドに対応するシグナルを標準曲線と比較することを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載のアッセイ。
- 前記標準曲線が、
(a)既知量の精製C1qタンパク質とC1q枯渇血清とを混合することによって少なくとも2つのC1q濃度標準を調製し;
(b)前記少なくとも2つのC1q濃度標準に、少なくとも1つの前記標的ペプチドと同じアミノ酸配列を有する少なくとも1つの標識された合成ペプチドを添加し;
(c)前記少なくとも2つの標識されたC1q濃度標準をタンパク質分解酵素と接触させて、前記少なくとも1つの前記標的ペプチドを産生し;
(d)選択反応モニタリング質量分析を実施して、前記少なくとも1つの前記標的ペプチドに対応するシグナルの強度、及び前記少なくとも2つの標識されたC1q濃度標準の各々において前記少なくとも1つの標識された合成ペプチドに対応するシグナルの強度を決定し;そして
(e)前記シグナル及び前記既知量のC1qタンパク質を用いて標準曲線を決定すること、
を含む方法を用いて作成される、請求項4に記載のアッセイ。 - 前記生体サンプルが:
i)血液サンプル;及び/又は
ii)ヒトサンプル若しくは非ヒト霊長類サンプルである、請求項1~5のいずれか一項に記載のアッセイ。 - 前記選択反応モニタリング質量分析がLC-SRM-MS/MSである、請求項1~6のいずれか一項に記載のアッセイ。
- 前記少なくとも1つのタンパク質分解酵素が、トリプシンである、請求項1~7のいずれか一項に記載のアッセイ。
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