CN110836973A - 检测肌钙蛋白及复合物的双标记试剂盒及制备与检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测肌钙蛋白及复合物的双标记试剂盒及制备与检测方法，属于免疫检测分析技术和纳米生物技术领域，在所述试剂盒中，包括集成在试剂条上的反应缓冲液、清洗液、增强液、包被cTnI单克隆抗体的磁微粒溶液、铕标记的cTnC单克隆抗体溶液和钐标记的cTnI单克隆抗体溶液，另附2‑6瓶不同浓度天然cTnI抗原(含cTnC)的冻干校准品。上述试剂盒可以提供一种接近均相的双标记反应体系，保证同时检测完整片段cTnI和cTnI‑C复合物的含量，缩短检测时间，提高了效率，为临床使用提供便利。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测分析技术和纳米生物技术领域，具体地说是检测肌钙 蛋白及复合物的双标记试剂盒及制备与检测方法。
背景技术
心肌肌钙蛋白(cardiac troponin，cTn)是心肌肌肉收缩的调节蛋白。cTn 是由三种不同基因的亚基组成：心肌肌钙蛋白I(cTn I)和肌钙蛋白C(TnC)、 心肌肌钙蛋白T(cTnT)。
cTn是以cTnI-C-T复合物和游离cTnI形式存在于心肌细胞中，心肌损伤时 释放到血循环中后，cTnI-C-T可进一步分解为cTnI-C复合物和游离cTnT，而且 cTnI-C是其在血液中的主要形式。由于它们在正常血清中含量极微，在急性心 肌梗死(AMI)时明显增高。当心肌细胞因缺血缺氧等因素遭破坏时，游离型cTnI 和cTnT可首先迅速从细胞中释放入血，随后结合于心肌结构蛋白中的结合型 cTnI和cTnT逐渐分解，缓慢释放入循环血中，AMI中，cTnI和cTnT在循环血 中较早出现并能持续较长时间的原因。虽然肌钙蛋白半衰期很短(cTnT 2小时， 游离cTnI 2h～5d)，但其从肌原纤维上降解的过程持续时间很长，可在血中保持 较长时间的升高。所以在发病早期cTnI较多，而随着发病时间的持续，cTnI-C 占主导。
肌钙蛋白的测定主要采用双抗体夹心的免疫学方法。当对患者进行血液 cTnI定量检测时，根据检测试剂所使用的抗体的抗原表位不同，影响也不一样。 血清中的单体cTnI分子极易降解，而在肌钙蛋白复合物中由于TnC的保护，cTnI 分子的中间区域更加稳定。因此，应优先使用识别cTnI分子中间稳定区域抗原 表位的抗体。在心肌细胞中，cTnI以I-T-C的三元复合物形式存在。而在患者血 液中，cTnI以I-C复合物形式而非I-T-C三元复合物形式存在。因此cTnI检测 所使用的抗体识别cTnI-C复合物的能力对于检测至关重要。
cTnI分子最稳定的区域为30-110氨基酸区域。因为在坏死组织以及血液中， 该区域受到了内源性cTnC的保护。由于缺乏cTnC的保护，cTnI的N端和C 端至少会发生部分截断，尤其是在临床表征发作的20小时之后。cTnI在血液中 主要以cTnI-C的二元复合物形式存在。游离的cTnI仅微量存在。cTnC不会受 到磷酸化影响，不易发生蛋白水解，对样本中的自身抗体和肝素也不敏感。这 些特性均有助于提升检测系统的分析灵敏度、精密度和可重复性。因此，可使 用识别cTnI-C复合物的抗体配对检测cTnI。因此同时检测完整片段cTnI及 cTnI-C复合物对AMI发作时间具有一定的指导意义。
为此，本发明将双标记时间分辨荧光免疫分析技术与磁微粒相结合，提供 了一种基于cTnI及cTnI-C复合物的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制 备方法和检测方法，能够同时检测样品中的完整片段cTnI及cTnI-C复合物水平， 具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数。
发明内容
反应原理如图，一个针对受到了内源性cTnC的保护的cTnI区域的抗体作 为固相抗体捕获所有的cTnI，一个针对cTnC的抗体标记Eu，用于检测cTnI-C 复合物，一个针对cTnI末端的抗体标记Sm，用于检测完整片段的cTnI，由于 cTnI进入血液后其末端易被水解掉，这样，完整的cTnI就减少，而cTnI-C复合 物较稳定存在，这样检测完整的cTnI和cTnI-C复合物，并计算其比值，将对判 断AMI的发病的持续时间有所帮助。
反应原理如图，一个针对受到了内源性cTnC的保护的cTnI区域的抗体作 为固相抗体捕获所有的cTnI，一个针对cTnC的抗体标记Eu，用于检测cTnI-C 复合物，一个针对cTnI末端的抗体标记Sm，用于检测完整片段的cTnI，由于 cTnI进入血液后其末端易被水解掉，这样，完整的cTnI就减少，而cTnI-C复合 物较稳定存在，这样检测完整的cTnI和cTnI-C复合物，并计算其比值，将对判 断AMI的发病的持续时间有所帮助。
为此，本发明提供一种基于cTnI及cTnI-C复合物的双标记时间分辨荧光免 疫分析试剂盒，包括集成在试剂条上的反应缓冲液、清洗液、增强液、包被cTnI 单克隆抗体的磁微粒溶液、铕标记的cTnC单克隆抗体溶液和钐标记的cTnI单 克隆抗体溶液，另附2-6瓶不同浓度cTnI的冻干校准品。
所述的基于cTnI及cTnI-C复合物的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒， 所述铕标记的cTnC单克隆抗体溶液以Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙 酸钠标记cTnC单克隆抗体制备得到，所述cTnC单克隆抗体与所述Eu3+-N2-[P- 异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠的质量比为5:1；
所述钐标记的cTnI单克隆抗体溶液以Sm3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺 四乙酸钠标记cTnI单克隆抗体制备得到，所述cTnI单克隆抗体与所述 Sm3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠的质量比为5:1；
所述包被cTnI单克隆抗体的磁微粒溶液经直径为100-5000纳米的活化的磁 微粒与所述cTnI单克隆抗体连接、洗涤、封闭、洗涤制备得到；
所述的基于cTnI及cTnI-C复合物的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒， 所述的所述的清洗液为含0.48g/L的Tris，12.49g/L的NaCl，1.11g/L的 Tween-20，0.04g/L的Triton X-100，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液；
所述的增强液为含体积浓度为3.6‰的冰醋酸，0.5g/L的醋酸钠，0.05g/L的 β-萘甲酰三氟丙酮，0.03g/L的三辛基氧化膦和体积浓度为1‰的Triton X-100的 混合溶液；
所述的反应缓冲液为pH7.8的50mmol/L Tris-HCl含8mmol/L NaCl、 0.1％BSA、50μmol/L DTPA、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN3；
所述cTnI-C复合物的校准品溶液为用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的 50mmol/L的pH7.8 Tris-HCl的反应缓冲液。将天然cTnI抗原(含cTnC)配制 成不同浓度的校准品溶液后冻干保存。
所述的基于cTnI及cTnI-C复合物的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒包 含：
集成在试剂条上的反应缓冲液、清洗液、增强液、包被cTnI单克隆抗体的磁 微粒溶液、铕标记的cTnC单克隆抗体溶液和钐标记的cTnI单克隆抗体溶液，另 附2-6瓶不同浓度cTnI的冻干校准品。
本发明提供了一种制备所述的基于cTnI及cTnI-C复合物的双标记时间分辨 荧光免疫分析试剂盒的方法，包括如下制备方法中的任意一种或几种：
所述天然cTnI-C复合物校准品溶液的制备：取浓度为1mg/mL的天然cTnI-C 复合物抗原溶液用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH为7.8的 Tris-Hcl反应缓冲液配制成不同浓度的校准品溶液，进行分装，冻干，2-8℃保 存；
所述的包被cTnI单克隆抗体的磁微粒溶液的制备：取直径为100-5000nm 的四氧化三铁微球用质量浓度为5-10％的戊二醛活化，室温混匀4小时后，用 0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，然后用上述缓冲溶液进行悬 浮，制成浓度为100mg/mL的磁微粒悬浮液；取100μL所述磁微粒悬浮液，然 后加入1mL的0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液和50μg的cTnI单克隆抗 体，于25℃混匀温育2小时，然后进行磁性分离，保留磁微粒，用0.05mol/L的 pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用1mL的含质量浓度为5％BSA的0.0lmol/L的pH为7.2的PBS缓冲液于25℃下封闭30分钟，用0.05mol/L的pH为7.2 的PBS缓冲液清洗1-3次，用含有质量浓度为0.5％BSA和质量浓度为0.1％的 NaN3的0.05mol/L的pH为7.2的Tris-HCl缓冲液重悬，分装，置于2-8℃下保 存；
所述的钐标记的cTnI单克隆抗体的制备:取cTnI抗体1mL，经PD-10柱转 换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/L的pH为8.5的 Na2CO3-NaHCO3缓冲液，收集蛋白峰，获得浓缩至2g/L的cTnI单克隆抗体溶 液，取所述cTnI单克隆抗体溶液500μL加入0.2mg的所述异硫氰酸苄基二亚乙 基三胺四乙酸钐钠中，25℃磁力搅拌反应20小时，然后将反应液转移到预先用 pH为7.8的浓度为80mmol/L的Tris缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱上进行层 析，收集蛋白峰，稀释，进行分装，真空冷冻干燥，置于2-8℃保存；
所述的铕标记的cTnC单克隆抗体溶液的制备：取cTnC抗体1mL，经PD-10 柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/L的pH为8.5的 Na2CO3-NaHCO3缓冲液，收集蛋白峰，获得浓缩至2g/L的cTnC单克隆抗体溶 液，取所述cTnC单克隆抗体溶液500μL加入0.2mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三 胺四乙酸铕钠，25℃磁力搅拌反应20小时，将反应液转移到预先用pH为7.8 的浓度为80mmol/L的Tris缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱上进行层析，收集 蛋白峰，稀释，进行分装，真空冷冻干燥，置于2-8℃保存；
所述增强液的制备：取3.6mL冰醋酸、0.5g醋酸钠、0.05gβ-萘甲酰三氟丙 酮、0.03g三辛基氧化膦和1mL的Triton X-100，混匀，加去离子水定容至 1000mL，分装，置于2-8℃下保存；
所述的反应缓冲液为pH7.8的50mmol/L Tris-HCl含8mmol/L NaCl、 0.1％BSA、50μmol/L DTPA、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN3；
所述的清洗液为含0.48g/L的Tris，12.49g/L的NaCl，1.11g/L的Tween-20，0.04g/L的Triton X-100，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液；
所述的基于cTnI和cTnI-C的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒的同时检 测cTnI和cTnI-C的方法，其特征在于，包括如下步骤，
(1)、分别取所述cTnI-C复合物的校准品溶液和待测样品100ul，与所述包 被cTnI单克隆抗体的50ul磁微粒溶液混合，将以所述反应缓冲液稀释的100ul 钐标记的cTnI单克隆抗体溶液和铕标记的cTnC单克隆抗体溶液加入混合的磁 微粒溶液中，进行孵育10分钟，然后用所述清洗液进行清洗，进行磁性分离， 重复上述清洗步骤4次，然后加入所述增强液；
(2)、采用时间分辨荧光免疫分析仪分别测定加增强液后的溶液中铕和钐 的荧光值，分别获得所述cTnI-C复合物的校准品溶液和待测样品的荧光值，然 后分别根据所述校准品溶液中所述cTnI-C抗原的浓度和所述cTnI抗原(含 cTnC)的浓度和其各自对应的荧光值绘制标准曲线，然后将所述待测样品的对 应荧光值代入对应的所述cTnI-C标准曲线或cTnI标准曲线中，计算得到所述待 测样品中述cTnI-C复合物和完整片段cTnI的含量。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明提供一种基于cTnI及cTnI-C复合物的双标记时间分辨荧光免 疫分析试剂盒，包括反应缓冲液、清洗液、增强液、包被cTnI单克隆抗体的磁 微粒溶液、铕标记的cTnC单克隆抗体溶液和钐标记的cTnI单克隆抗体溶液都 集成在一个试剂条上，全自动操作，简便易行。15min内即可同时检测得到血清 中完整片段cTnI及cTnI-C复合物的含量，检测结果准确可靠，特别是对提高 cTnI/cTnI-C比值参数检测准确性具有突出优势，除了拥有TRFIA技术的灵敏度 高、储存时间长、无放射性污染、标准曲线范围宽等诸多优点外，还可通过免 疫磁微粒的富集作用以及磁微粒在液体中充分扩散使得结合表面积扩大的特性，大大缩短反应时间，提高检测灵敏度，同时磁微粒与抗体通过化学基团定 向连接，大大减少了配对抗体的用量以及显著提高检测的精密度，同时实现自 动化，克服了传统微孔板式TRFIA技术需要样本积累到一定数量才能检测，实 现了样本的即时检测，效率高；
该试剂盒是以纳米磁微粒为载体的高效双标记时间分辨荧光技术：磁微粒 与cTnI单克隆抗体的自由氨基连接，形成包被有cTnI单克隆抗体的免疫磁微粒， 该免疫磁微粒依靠其超大的比表面积可在短时间内“捕获”大量带有Eu或Sm 标记的抗原抗体复合物，用增强液将Eu和Sm从复合物上解离下来后，与增强 液中的螫合剂螯合形成一种胶态分子团，分子团在紫外光的激发下能发出很强 的发射波长(615nm和643nm)和寿命(820μs和880μs)不同的荧光，信号增 强了百万倍且两个信号易区分，可同时检测血清中cTnI及cTnI-C复合物的含量， 一次测量同时得到cTnI及cTnI-C复合物和cTnI/cTnI-C复合物三个结果，由于 条件一致，比值更准确。
附图说明
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
图1为cTnI-C标准曲线图；
图2为cTnI标准曲线图。
图3为试剂条的结构示意图。
图4为集成5人份试剂条的试剂盒的结构示意图。
图中部件名称对应的标号如下：
1、试剂条；2、试剂盒；3、预留孔；4、清洗孔；5、增强液孔；6、检测 孔；7、铕/钐标记物孔；8、反应缓冲液孔；9、磁微粒溶液孔。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步的详述：
作为本发明所述检测肌钙蛋白及复合物的双标记试剂盒及制备与检测方法 的实施例，反应原理如图1-2，一个针对受到了内源性cTnC的保护的cTnI区域 的抗体作为固相抗体捕获所有的cTnI，一个针对cTnC的抗体标记Eu，用于检 测cTnI-C复合物，一个针对cTnI末端的抗体标记Sm，用于检测完整片段的cTnI， 由于cTnI进入血液后其末端易被水解掉，这样，完整的cTnI就减少，而cTnI-C 复合物较稳定存在，这样检测完整的cTnI和cTnI-C复合物，并计算其比值，将 对判断AMI的发病的持续时间有所帮助。
本实施例中，基于cTnI及cTnI-C复合物的双标记时间分辨荧光免疫分析试 剂盒，如图3-4，包括若干个试剂条1和一个试剂盒2，所述试剂条1设置于所 述试剂盒2内部，并且上下堆叠设置，所述试剂条1的数量为五个，所述试剂 条1上设置有若干预留孔3、若干清洗孔4、一个增强液孔5、一个检测孔6、 一个铕/钐标记物孔7、一个反应缓冲液孔8和一个磁微粒溶液孔9，所述试剂 条1上包括有集成在上面的反应缓冲液、清洗液、增强液、包被cTnI单克隆抗 体的磁微粒溶液、铕标记的cTnC单克隆抗体溶液和钐标记的cTnI单克隆抗体 溶液，另附2-6瓶不同浓度天然cTnI(含cTnC)的冻干校准品。
本实施例中，所述的基于cTnI及cTnI-C复合物的双标记时间分辨荧光免疫 分析试剂盒，所述铕标记的cTnC单克隆抗体溶液以Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]- 二乙烯三胺四乙酸钠标记cTnC单克隆抗体制备得到，所述cTnC单克隆抗体与 所述Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠的质量比为5:1；
本实施例中，所述钐标记的cTnI单克隆抗体溶液以Sm3+-N2-[P-异氰酸-苄 基]-二乙烯三胺四乙酸钠标记cTnI单克隆抗体制备得到，所述cTnI单克隆抗体 与所述Sm3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠的质量比为5:1；
本实施例中，所述包被cTnI单克隆抗体的磁微粒溶液经直径为100-5000纳 米的活化的磁微粒与所述cTnI单克隆抗体连接、洗涤、封闭、洗涤制备得到；
本实施例中，所述的基于cTnI及cTnI-C复合物的双标记时间分辨荧光免疫 分析试剂盒，所述的所述的清洗液为含0.48g/L的Tris，12.49g/L的NaCl， 1.11g/L的Tween-20，0.04g/L的Triton X-100，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶 液；
本实施例中，所述的增强液为含体积浓度为3.6‰的冰醋酸，0.5g/L的醋酸 钠，0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮，0.03g/L的三辛基氧化膦和体积浓度为1‰的 Triton X-100的混合溶液；
本实施例中，所述的反应缓冲液为pH7.8的50mmol/L Tris-HCl含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、50μmol/L DTPA、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN3；
本实施例中，所述cTnI-C复合物的校准品溶液为用含2g/L的BSA和1g/L 的NaN3的50mmol/L的pH7.8 Tris-HCl的反应缓冲液。将天然cTnI抗原(含cTnC) 配制成不同浓度的校准品溶液后冻干保存。
本实施例中，所述的基于cTnI及cTnI-C复合物的双标记时间分辨荧光免疫 分析试剂盒包含：集成在试剂条上的反应缓冲液、清洗液、增强液、包被cTnI 单克隆抗体的磁微粒溶液、铕标记的cTnC单克隆抗体溶液和钐标记的cTnI单 克隆抗体溶液，另附2-6瓶不同浓度cTnI的冻干校准品。
本实施例中，制备所述的基于cTnI及cTnI-C复合物的双标记时间分辨荧光免 疫分析试剂盒的方法，包括如下制备方法中的任意一种或几种：
本实施例中，所述天然cTnI-C复合物校准品溶液的制备：取浓度为1mg/mL 的天然cTnI-C复合物抗原溶液用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L 的pH为7.8的Tris-Hcl反应缓冲液配制成不同浓度的校准品溶液，进行分装， 冻干，2-8℃保存；
本实施例中，所述的包被cTnI单克隆抗体的磁微粒溶液的制备：取直径为 100-5000nm的四氧化三铁微球用质量浓度为5-10％的戊二醛活化，室温混匀4 小时后，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，然后用上述缓冲 溶液进行悬浮，制成浓度为100mg/mL的磁微粒悬浮液；取100μL所述磁微粒 悬浮液，然后加入1mL的0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液和50μg的cTnI 单克隆抗体，于25℃混匀温育2小时，然后进行磁性分离，保留磁微粒，用 0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用1mL的含质量浓度为5％BSA的0.0lmol/L的pH为7.2的PBS缓冲液于25℃下封闭30分钟，用0.05mol/L的 pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用含有质量浓度为0.5％BSA和质量浓度为 0.1％的NaN3的0.05mol/L的pH为7.2的Tris-HCl缓冲液重悬，分装，置于2-8℃ 下保存；
本实施例中，所述的钐标记的cTnI单克隆抗体的制备:取cTnI抗体1mL， 经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/L的pH为 8.5的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，收集蛋白峰，获得浓缩至2g/L的cTnI单克隆抗 体溶液，取所述cTnI单克隆抗体溶液500μL加入0.2mg的所述异硫氰酸苄基二 亚乙基三胺四乙酸钐钠中，25℃磁力搅拌反应20小时，然后将反应液转移到预 先用pH为7.8的浓度为80mmol/L的Tris缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱上进 行层析，收集蛋白峰，稀释，进行分装，真空冷冻干燥，置于2-8℃保存；
本实施例中，所述的铕标记的cTnC单克隆抗体溶液的制备：取cTnC抗体 1mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/L的 pH为8.5的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，收集蛋白峰，获得浓缩至2g/L的cTnC单 克隆抗体溶液，取所述cTnC单克隆抗体溶液500μL加入0.2mg的异硫氰酸苄基 二亚乙基三胺四乙酸铕钠，25℃磁力搅拌反应20小时，将反应液转移到预先用 pH为7.8的浓度为80mmol/L的Tris缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱上进行层 析，收集蛋白峰，稀释，进行分装，真空冷冻干燥，置于2-8℃保存；
本实施例中，所述增强液的制备：取3.6mL冰醋酸、0.5g醋酸钠、0.05gβ- 萘甲酰三氟丙酮、0.03g三辛基氧化膦和1mL的Triton X-100，混匀，加去离子 水定容至1000mL，分装，置于2-8℃下保存；
本实施例中，所述的反应缓冲液为pH7.8的50mmol/L Tris-HCl含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、50μmol/L DTPA、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN3；
本实施例中，所述的清洗液为含0.48g/L的Tris，12.49g/L的NaCl，1.11g/L 的Tween-20，0.04g/L的Triton X-100，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液；
本实施例中，所述的基于cTnI和cTnI-C的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂 盒的同时检测cTnI和cTnI-C的方法，其特征在于，包括如下步骤，
(1)、分别取所述cTnI-C复合物的校准品溶液和待测样品100ul，与所述包 被cTnI单克隆抗体的50ul磁微粒溶液混合，将以所述反应缓冲液稀释的100ul 钐标记的cTnI单克隆抗体溶液和铕标记的cTnC单克隆抗体溶液加入混合的磁 微粒溶液中，进行孵育10分钟，然后用所述清洗液进行清洗，进行磁性分离， 重复上述清洗步骤4次，然后加入所述增强液；
(2)、采用时间分辨荧光免疫分析仪分别测定加增强液后的溶液中铕和钐 的荧光值，分别获得所述cTnI-C复合物的校准品溶液和待测样品的荧光值，然 后分别根据所述校准品溶液中所述cTnI-C抗原的浓度和所述cTnI抗原(含 cTnC)的浓度和其各自对应的荧光值绘制标准曲线，然后将所述待测样品的对 应荧光值代入对应的所述cTnI-C标准曲线或cTnI标准曲线中，计算得到所述待 测样品中述cTnI-C复合物和完整片段cTnI的含量。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本 领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节。
发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此, 无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明 的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同 要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方 式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领 域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当 组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (6)
1.检测肌钙蛋白及复合物的双标记试剂盒，其特征在于包括若干个试剂条和一个试剂盒，所述试剂条设置于所述试剂盒内部，并且上下堆叠设置，所述试剂条的数量为五个，所述试剂条上设置有若干预留孔、若干清洗孔、一个增强液孔、一个检测孔、一个铕/钐标记物孔、一个反应缓冲液孔和一个磁微粒溶液孔，所述试剂条上包括有集成在上面的反应缓冲液、清洗液、增强液、包被cTnI单克隆抗体的磁微粒溶液、铕标记的cTnC单克隆抗体溶液和钐标记的cTnI单克隆抗体溶液，另附2-6瓶不同浓度天然cTnI(含cTnC)的冻干校准品。
2.如权利要求1所述的检测肌钙蛋白及复合物的双标记试剂盒，其特征在于所述铕标记的cTnC单克隆抗体溶液以Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠标记cTnC单克隆抗体制备得到，所述cTnC单克隆抗体与所述Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠的质量比为5:1；
所述钐标记的cTnI单克隆抗体溶液以Sm3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠标记cTnI单克隆抗体制备得到，所述cTnI单克隆抗体与所述Sm3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠的质量比为5:1；
所述包被cTnI单克隆抗体的磁微粒溶液经直径为100-5000纳米的活化的磁微粒与所述cTnI单克隆抗体连接、洗涤、封闭、洗涤制备得到。
3.如权利要求2所述的检测肌钙蛋白及复合物的双标记试剂盒，其特征在于所述的清洗液为含0.48g/L的Tris，12.49g/L的NaCl，1.11g/L的Tween-20，0.04g/L的Triton X-100，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液；
所述的增强液为含体积浓度为3.6‰的冰醋酸，0.5g/L的醋酸钠，0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮，0.03g/L的三辛基氧化膦和体积浓度为1‰的Triton X-100的混合溶液；
所述的反应缓冲液为pH7.8的50mmol/L Tris-HCl含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、50μmol/L DTPA、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN3；
所述cTnI-C复合物的校准品溶液为用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH7.8Tris-HCl的反应缓冲液，将天然cTnI抗原(含cTnC)配制成不同浓度的校准品溶液后冻干保存。
4.如权利要求1-3任一项所述的检测肌钙蛋白及复合物的双标记试剂盒，其特征在于每个所述试剂盒的配方为：试剂条上集成了反应缓冲液、清洗液、增强液、包被cTnI单克隆抗体的磁微粒溶液、铕标记的cTnC单克隆抗体溶液和钐标记的cTnI单克隆抗体溶液，每个试剂架可放5个试剂条，一盒含25-100个试剂条，另附2-6瓶不同浓度cTnI的冻干校准品。
5.一种制备权利要求1-4任一项的所述检测肌钙蛋白及复合物的双标记试剂盒的方法，其特征在于包括如下制备方法中的任意一种或几种：
所述天然cTnI-C复合物校准品溶液的制备：取浓度为1mg/mL的天然cTnI-C复合物抗原溶液用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH为7.8的Tris-HCl反应缓冲液配制成不同浓度的校准品溶液，进行分装，冻干，2-8℃保存；
所述的包被cTnI单克隆抗体的磁微粒溶液的制备：取直径为100-5000nm的四氧化三铁微球用质量浓度为5-10％的戊二醛活化，室温混匀4小时后，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，然后用上述缓冲溶液进行悬浮，制成浓度为100mg/mL的磁微粒悬浮液；取100μL所述磁微粒悬浮液，然后加入1mL的0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液和50μg的cTnI单克隆抗体，于25℃混匀温育2小时，然后进行磁性分离，保留磁微粒，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用1mL的含质量浓度为5％BSA的0.0lmol/L的pH为7.2的PBS缓冲液于25℃下封闭30分钟，用0.05mol/L的pH为7.2的PBS缓冲液清洗1-3次，用含有质量浓度为0.5％BSA和质量浓度为0.1％的NaN3的0.05mol/L的pH为7.2的Tris-HCl缓冲液重悬，分装，置于2-8℃下保存；
所述的钐标记的cTnI单克隆抗体的制备:取cTnI抗体1mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/L的pH为8.5的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，收集蛋白峰，获得浓缩至2g/L的cTnI单克隆抗体溶液，取所述cTnI单克隆抗体溶液500μL加入0.2mg的所述异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸钐钠中，25℃磁力搅拌反应20小时，然后将反应液转移到预先用pH为7.8的浓度为80mmol/L的Tris缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱上进行层析，收集蛋白峰，稀释，进行分装，真空冷冻干燥，置于2-8℃保存；
所述的铕标记的cTnC单克隆抗体溶液的制备：取cTnC抗体1mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/L的pH为8.5的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，收集蛋白峰，获得浓缩至2g/L的cTnC单克隆抗体溶液，取所述cTnC单克隆抗体溶液500μL加入0.2mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，25℃磁力搅拌反应20小时，将反应液转移到预先用pH为7.8的浓度为80mmol/L的Tris缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱上进行层析，收集蛋白峰，稀释，进行分装，真空冷冻干燥，置于2-8℃保存；
所述增强液的制备：取3.6mL冰醋酸、0.5g醋酸钠、0.05gβ-萘甲酰三氟丙酮、0.03g三辛基氧化膦和1mL的Triton X-100，混匀，加去离子水定容至1000mL，分装，置于2-8℃下保存；
所述的反应缓冲液为pH7.8的50mmol/L Tris-HCl含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、50μmol/L DTPA、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN3；
所述的清洗液为含0.48g/L的Tris，12.49g/L的NaCl，1.11g/L的Tween-20，0.04g/L的Triton X-100，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液。
6.一种利用权利要求1-4任一项基于所述检测肌钙蛋白及复合物的双标记试剂盒的同时检测cTnI和cTnI-C的方法，其特征在于包括如下步骤，该步骤可由全自动设备完成：
(1)分别取所述天然cTnI抗原(含cTnC)的校准品溶液或待测样品，与所述包被cTnI单克隆抗体的磁微粒溶液混合，将以所述反应缓冲液稀释的钐标记的cTnI单克隆抗体溶液和铕标记的cTnC单克隆抗体溶液加入混合的磁微粒溶液中，进行孵育，然后用所述清洗液进行清洗，进行磁性分离，然后吸弃上清液，重复上述清洗步骤，然后加入所述增强液；
(2)采用时间分辨荧光免疫分析仪分别测定加增强液后的溶液中铕和钐的荧光值，分别获得所述cTnI-C复合物的校准品溶液和待测样品的荧光值，然后分别根据所述校准品溶液中所述cTnI-C抗原的浓度和所述cTnI抗原(含cTnC)的浓度和其各自对应的荧光值绘制标准曲线，然后将所述待测样品的对应荧光值代入对应的所述cTnI-C标准曲线或cTnI标准曲线中，计算得到所述待测样品中述cTnI-C复合物和完整片段的cTnI的含量。
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