DE69119656T2 - Satz zur spezifischen Bestimmung von Angiotensin-II - Google Patents

Satz zur spezifischen Bestimmung von Angiotensin-II

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Kit zur spezifischen immunologischen Bestimmung von Angiotensin II und ein Verfahren zur Immunbestimmung von Angiotensin II unter Verwendung dieses Kits.
  • Angiotensin II ist ein wirkungsstarker Vasopressor, der das biologisch aktive Produkt des Renin-Angiotensin-Systems ist: Renin wirkt auf Angiotensinogen im Plasma uniter Bildung eines Decapeptids (1-10), Angiotensin I, das durch die Einwirkung des Umwandlungsenzyms in ein Octapeptid (1-8), Angiotensin II, übergeführt wird, und dann produziert eine Aminopeptidase ein Heptapeptid (2-8): Angiotensin III.
  • Nachstehend sind die Formeln dieser verschiedenen Peptide bei Säugern angegeben:
  • Angiotensin I, nachstehend als Ang I bezeichnet:
  • Angiotensin II, nachstehend als Ang II bezeichnet:
  • Angiotensin III, nachstehend als Ang III bezeichnet:
  • Eine neuere Veröffentlichung hat gezeigt, daß Ang III selbst in zwei Peptide abgebaut wird (D.J. CAMBELL et al., J. Hypertens. 1990, 8, 165-172). Unter diesen Abbaupeptiden konnen insbesondere angegeben werden: ein Hexapeptid der Formel:
  • nachstehend als Hexapeptid (IV) bezeichnet, und ein Pentapeptid der Formel:
  • nachstehend als Pentapeptid (V) bezeichnet.
  • Diese Abbaupeptide liegen im menschlichen Plasma vor. Es ist wahrscheinlich, daß sie auch im Plasma anderer Säuger aüftreten.
  • Die hormonologische Untersuchung des Renin-Angiotensin-Systems ist für die Diagnose und Behandlung arterieller Hypertension sehr wichtig. Derzeit beschränkt sich diese klinisch durchgeführte Untersuchung auf die Messung der Enzymaktivität von Plasma-Renin, der Aktivität des Umwandlungsenzyms und die Messung der Plasma-Konzentration von aktivem Renin.
  • Die direkte Bestimmung von Ang II, welches das aktive Peptid des Systems darstellt, ist aus mehreren Gründen schwierig durchzuführen:
  • - sehr schwache Plasma-Konzentration von Ang II (3 bis 20 pg/ml bei Gesunden, d.h. 3.10&supmin;¹² bis 2.10&supmin;¹¹ M), wodurch die Verwendung. eines sehr affinen anti-Ang 11-Antikörpers erforderlich wird;
  • - Strukturanalogie von Ang II mit verschiedenen Peptiden, die von der Spaltung von Angiotensinogen stammen und im Plasma vorliegen, insbesondere Ang I und vor allem Ang III, oder anderen Abbaupeptiden, welche die Bestimmung beeinflussen können.
  • So beschreiben J. NUSSBERGER et al. eine radioimmunologische Bestimmung, die keine Unterscheidung von Ang II und III im menschlichen Plasma ermöglicht (Hormon. Metab. Res., 1984, L6 (II), 606-610, und J. Hyptertens., Suppl., 1988, 6 (4), S424- S425). Außerdem beschreibt die EP-Patentanmeldung 273 453 verschiedene monoklonale anti-Ang II-Antikörper, die alle eine Kreuzreaktivität mit Ang III aufweisen; die schwächste Kreuzreaktivität, die bei einem hievon festgestellt wird, beträgt 32 %. Daher ist die Reaktion von Ang II mit diesem Antikörper nicht spezifisch.
  • Ferner hat dieser monoklonale Antikörper eine schwache Affinität in der Größenordnung von 10&sup9; M&supmin;¹, die nicht ausreicht, um eine Bestimmung im Plasma zu ermöglichen (Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987, 143, S. 133-139).
  • Der anti-Ang II-Antikörper, der als 4D8 bezeichnet und in den Kongressakten "The Renin Angiotensin System as a Therapeutic Target" - Bâle, 29. - 31. Oktober 1989, SANOFI-Kommunikation, beschrieben wird, hat eine starke Affinität in der Größenordnung von 10¹¹ M&supmin;¹; er weist jedoch eine Kreuzreaktivität in der Größenordnung von 100 % mit Ang III und mit dem Hexapeptid (IV) auf; und er zeigt eine Kreuzreaktivität mit dem Pentapeptid (V) von ungefähr 50 %. Tatsächlich ist es sehr schwierig und bis heute nicht bekannt, einen Antikörper herzustellen, der gleichzeitig eine hohe Affinität für Ang II, jedoch keine Kreuzreaktion mit Ang III und den Abbaupeptiden aufweist.
  • Weiters kommt es bis heute bei der spezifischen Bestimmung von Ang II zu methodologischen Schwierigkeiten, die eine aufeinanderfolgende Durchführung mehrerer Schritte an den Blutproben erfordern (J. NUSSBERGER et al., Hypertension, 1986, 8, 476- 482):
  • 1. Extraktion verschiedener Angiotensine und Abbaupeptide zur Herstellung eines diese enthaltenden Plasma-Extrakts;
  • 2. Trennung verschiedener Angiotensine, die vom Angiotensinogen-Metabolismus stammen und im Plasma vorliegen, durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC);
  • 3. radioimmunologische Bestimmung der nach der Elution gesammelten Fraktionen.
  • Die Extraktion von Angiotensinen ausdem Plasma ist ein unbedingt notwendiger Schritt, den alle Techniken zur Bestimmung von Ang II gemeinsam haben; er wird durch Chromatographie auf einer Kieselerdesäule gemäß dem von J. NUSSBERGER et al. in Hypertension, 1985 (7), Suppl., 1, I-1-I-7, beschriebenen Verfahren durchgeführt.
  • Aufgrund des HPLC-Trennschritts ist die Durchführung dieser Technik mühevoll und zeitaufwendig; daher kann sie nicht zur Bestimmung einer großen Anzahl von Plasma-Proben unter Routinebedingungen verwendet werden.
  • Es wurde versucht, eine spezifische Bestimmung von Ang II zu entwickeln, welche die prazise Messung der Ang II-Rate ungeachtet der Konzentrationen von Ang I, Ang III und im Medium vorliegenden Abbaupeptiden ermöglicht, und welche in einer mit einer klinischen Routineverwendung kompatiblen Zeit durchgeführt werden kann. Eine derartige spezifische Bestimmung ist von großem Interesse:
  • - zur Untersuchung der Physiologie des Renin-Angiotensin- Systems bei verschiedenen Tierarten in Versuchssituationen,
  • - zur Diagnose pathologischer Zustände bei Menschen, oder
  • - zur Diagnose und folgenden Behandlung von arterieller Hypertension.
  • Allgemein wird Ang II aus dem Plasma bestimmt. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Bestimmung von Ang II entweder im Plasma oder in jeder anderen biologischen Flüssigkeit, in der es vorliegt, durchgeführt werden.
  • Die erfindungsgemäße Bestimmung kann für jede Tierart vorgenommen werden, bei der die spezifische Messung von Ang II gewünscht wird, und insbesondere bei Menschen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß eine spezifische Immunbestimmung von Ang II unter gleichzeitiger Verwendung eines Antikörpers, der gegen Ang II gerichtet ist, zur eigentlichen Bestimmung und eines für Ang III spezifischen Antikörpers sowie gegebenenfalls eines oder mehrerer jeweils für Ang I oder ein Abbaupeptid spezifischer Antikörper bewirkt werden kann. Für Ang III spezifischer Antikörper und für Ang I oder ein Abbaupeptid spezifischer Antikörper bedeutet Antikörper, die jeweils eine Kreuzreaktion mit Ang II von weniger als 10 % aufweisen. Daher sind Ang III und gegebenenfalls Ang I sowie die Abbaupeptide, die jeweils von einem spezifischen Antikörper als Sensor registriert werden, praktisch nicht mehr verfügbar, um Kreuzreaktionen mit dem anti-Ang II-Antikörper zu ergeben. Die Bestimmung von Ang II wird dadurch vollkommen spezifisch, d.h. ist ohne jeden Einfluß, der auf das Vorliegen von ähnlichen Peptiden in der Probe zurückzuführen ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt die Bestimmung von Ang II nur zwei Schritte:
  • 1. die Extraktion verschiedener Angiotensine und Abbaupeptide zur Herstellung eines Extrakts einer diese enthaltenden biologischen Flüssigkeit;
  • 2. die eigentliche immunologische Bestimmung von im Extrakt enthaltenem Ang II.
  • Auf diese Weise wird die Trennung der verschiedenen Angiotensine im Extrakt durch HPLC vermieden, wobei dieser Schritt der langsamste und aufwendigste des Protokolls der spezifischen Bestimmung von Ang II ist.
  • Die verwendete immunologische Bestimmung ist eine kompetitive Bestimmung: markiertes Ang II, das an den anti-Ang II-Antikörper gebunden ist, wird durch unmarkiertes Ang II, das in der zu messenden Probe enthalten ist, verdrängt. Die Bezugnahme auf eine Standardisierungskurve, die mit bekannte Ang II-Mengen enthaltenden Proben erstellt wird, ermöglicht die Bestimmung der in der Probe vorliegenden Ang II-Konzentration.
  • Ang II wird entweder mit einem radioaktiven Element, wie Tritium (³H) oder Jod 125 (¹²&sup5;I), oder mit einem Enzym, wie beispielsweise Acetylcholinesterase, Peroxidase, alkalischer Phosphatase oder β-Galactosidase, oder mit einem fluoreszierenden Marker, oder mit einem luminiszenten Marker markiert.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden dem Reaktionsmedium ein für Ang III spezifischer Antikörper und gegebenenfalls ein oder mehrere jeweils für Ang I oder ein Abbaupeptid spezifische Antikörper zugesetzt, welche Ang III und gegebenenfalls Ang I sowie Abbaupeptide, die in der Probe vorliegen, durch die Bildung eines oder mehrerer entsprechender Antigen-Antikörper- Komplexe maskieren. So wird das Auftreten von Kreuzreaktionen zwischen Ang III und gegebenenfalls Ang I sowie den Abbaupeptiden, die in der Probe vorhanden sind, mit dem anti-Ang II- Antikörper vermieden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Kit zur spezifischen Bestimmung von Ang II, welcher umfaßt:
  • - einen anti-Ang II-Antikörper,
  • - eine Lösung von markiertem Ang II,
  • - Lösungen, die Ang II-Standards in bekannten und zunehmenden Konzentrationen enthalten,
  • - die erforderliche Waschlösung oder die erforderlichen Waschlösungen,
  • - eine Lösung von anti-Ang III-Antikörper, welcher Antikörper eine Kreuzreaktion mit Ang II von weniger als 10 %, vorzugsweise weniger als 5 % aufweist,
  • - und gegebenenfalls eine Lösung von anti-Ang I-Antikörper und/oder eine Lösung von anti-Hexapeptid (IV)-Antikörper und/oder eine Lösung von anti-Pentapeptid (V)-Antikörper, welche Antikörper eine Kreuzreaktion mit Ang II von weniger als 10 %, vorzugsweise weniger als 5 % aufweisen.
  • Wenn Ang II mit einem Enzym markiert wird, umfaßt der Kit außerdem:
  • eine Lösung, die das Substrat des Enzyms und gegebenenfalls
  • -ein oder mehrere Reagentien, die zur Darstellung der Aktivität des Enzyms notwendig sind, enthält,
  • - eine Lösung zum Anhalten der enzymatischen Reaktion.
  • Der im Bestimmungs-Kit verwendete anti-Ang II-Antikörper kann polyklonal oder monoklonal sein; er kann in Lösung verwendet werden oder auf einem festen Träger fixiert sein. Als feste Träger können Röhrchen, Mikrotiterplatten und, gegebenenfalls magnetische, Teilchen angegeben werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der bevorzugte anti- Ang II-Antikörper monoklonal; vorteilhaft wird er gemäß Fachleuten wohlbekannten Verfahren auf einem festen Träger fixiert.
  • Der anti-Ang III-Antikörper kann ein polyklonaler Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper sein. Das gleiche gilt für die anti-Ang I-, anti-Hexapeptid (IV)- und anti-Pentapeptid (V)- Antikörper.
  • Wenn die verwendeten Antikörper in Lösung vorliegen, wird vor der Bestimmung die geeignete Verdünnung ermittelt, damit die in der zu bestimmenden Probe vorhandenen Peptide jeweils vom entsprechenden anti-Peptid-Antikörper eingefangen werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren unter Verwendung des erfindungsgemäßen Bestimmungs-Kits. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt, gemäß denen:
  • a) ein Reaktionsmedium hergestellt wird, das umfaßt:
  • - einen Extrakt der zu bestimmenden biologischen Flüssigkeit,
  • - einen anti-Ang II-Antikörper,
  • - markiertes Ang II,
  • - einen anti-Ang III-Antikörper,
  • - und gegebenenfalls einen anti-Ang I-Antikörper und/oder einen anti-Hexapeptid (IV)-Antikörper und/oder einen anti-Pentapeptid (V)-Antikörper;
  • b) gleichzeitig Reaktionsmedien hergestellt werden, die für eine Standardisierung verwendet werden, und die jeweils umfassen:
  • - einen Ang II-Standard,
  • - einen anti-Ang II-Antikörper,
  • - markiertes Ang II,
  • - einen anti-Ang III-Antikörper,
  • - und gegebenenfalls einen anti-Ang I-Antikörper und/oder einen anti-Hexapeptid (IV)-Antikörper und/oder einen anti- Pentapeptid (V)-Antikörper;
  • c) bei einer Temperatur zwischen 4ºC und Umgebungstemperatur während 12 bis 72 Stunden inkubieren gelassen wird;
  • d) an den anti-Ang II-Antikörper gebundenes Ang II von freiem Ang II getrennt wird;
  • e) schließlich die Ablesung der Ergebnisse gemäß einer geeigneten Methode durchgeführt wird.
  • Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Ang II in einem Plasma-Extrakt verwendet.
  • Wenn der anti-Ang II-Antikörper in Lösung verwendet wird, werden die Schritte a) und b) durchgeführt, indem gemischt werden:
  • - 25 bis 500 µl Extrakt einer zu bestimmenden biologischen Flüssigkeit, oder Ang II-Standard, mit einem Medium, das enthält:
  • - 25 bis 500 µl Lösung von anti-Ang II-Antikörper,
  • - 25 bis 500 µl Lösung von anti-Ang III-Antikörper,
  • - gegebenenfalls 25 bis 500 µl Lösung von anti-Ang 1-Antikörper und/oder 25 bis 500 µl anti-Hexapeptid (IV)-Antikörper und/oder 25 bis 500 µl anti-Pentapeptid (V)-Antikörper, und
  • - 25 bis 500 µl Lösung von markiertem Ang II.
  • Gegebenenfalls kann eine Vorinkubation von 3 bis 24 Stunden vor dem Zusatz der Lösung von markiertem Ang II durchgeführt werden.
  • Der Schritt d) wird durch ein klassisch verwendeten Trennverfahren vorgenommen:
  • - durch immunologische Fixierung unter Verwendung von Antikörpern, die gegen Immunglobuline aus dem Tierreich gerichtet sind, und zu denen der verwendete anti-Ang II-Antikörper zählt, wobei diese Antikörper selbst auf einer Festphase (einem unlöslichen Träger, wie beispielsweise Röhrchen, Mikrotiterplatten oder, gegebenenfalls magnetische, Teilchen) insolubilisiert sind,
  • - durch physiko-chemische Ausfällung des Antigen-Antikörper-Komplexes mit Hilfe eine Ausfällungsmittels, wie Polyethylenglykol, oder
  • - durch Trennung von freiem Antigen durch den Kohle- Dextran-Komplex (J. NUSSBERGER et al., J. Lab. Clin. Med., 1984, 103 (2), 304-312).
  • Wenn gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens der anti-Ang II-Antikörper auf einem festen Träger fixiert ist, wird die Herstellung des Reaktionsmediums (Schritte a) und b)) in Anwesenheit des Trägers durchgeführt. Beispielsweise können mit anti-Ang II-Antikörper versehene Röhrchen verwendet werden, in denen gemischt werden:
  • - 25 bis 500 µl Extrakt einer zu bestimmenden biologischen Flüssigkeit, oder Ang II-Standard,
  • - 25 bis 500 µl Lösung von anti-Ang III-Antikörper,
  • - gegebenenfalls 25 bis 500 µl Lösung von anti-Ang I-Antikörper und/oder 25 bis 500 µl anti-Hexapeptid (IV)-Antikörper und/oder 25 bis 500 µl anti-Pentapeptid (V)-Antikörper, und
  • - 25 bis 500 µl Lösung von markiertem Ang II.
  • Gemäß dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Trennung (Schritt d)) durchgeführt, indem die Inkubationslösung vom Reaktionsmedium abgesaugt wird, anschließend gewaschen und erneut abgesaugt wird, um Ang II, das nicht durch den auf dem festen Träger fixierten Antikörper komplexiert ist, zu eliminieren.
  • Die oben angegebene Mischung kann auchin einem Röhrchen oder normalen Behälter durch den Zusatz von anti-Ang II-Antikörper in Form von, gegebenenfalls magnetischen, Teilchen hergestellt werden, auf denen der anti-Ang II-Antikörper fixiert ist. In diesem Fall wird Trennung (Schritt d)) gemäß dem gleichen Prinzip wie oben durchgeführt, jedoch unter Verwendung eines Verfahrens, welches das Zurückhalten der Teilchen ermöglicht (Zentrifugieren, Filtration, Verwendung eines Magneten, wenn es sich um magnetische Teilchen handelt).
  • In jedem Fall wird anschließend direkt der Ablesungsschritt e) an der Festphase durchgeführt, in welcher der das zu messende Ang II komplexierende anti-Ang II-Antikörper eingeschlossen ist oder an welche dieser gebunden ist.
  • Allgemein ist der Ablesungsschritt vom für Ang II verwendeten Markierungsverfahren abhängig. So wird durchgeführt:
  • - eine Messung der Radioaktivität, wenn eine radioaktive Markierung verwendet wurde, oder
  • - eine Messung des Absorptionsvermögens oder der Lichtemission, wenn eine fluoreszierende oder luminiszente Markierung oder eine enzymatische Markierung gemäß der Beschaffenheit des Enzyms und des eingesetzten Substrats verwendet wurde.
  • In der folgenden Beschreibung und den Ansprüchen werden die Aminosäuren unter Verwendung der von der IUPAC empfohlenen Abkürzungen angegeben; außerdem werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
  • BOP: Benzotriazolyloxytrisdimethylaminophosphoniumhexafluorphosphat
  • Boc: tert.Butoxycarbonyl
  • Mob: p-Methoxybenzyl
  • DCB: 2,6-Dichlorbenzyl
  • Tos: Tosyl
  • AcM: monoklonaler Antikörper
  • BSA: Rinderserumalbumin
  • BGG: Rinder-γ-Globulin
  • cpm: Zählung pro Minute
  • PEG: Polyethylenglykol
  • LPH: Hemocyanin von Limulus polyphemus
  • Sulfo MBS: N-(3-Maleimidobenzoyloxy)-sulfosuccinimidnatriumsalz
  • Bo : Konzentration von markiertem Ang II - anti-Ang II-Antikörper-Komplex in Abwesenheit von unmarkiertem Ang II oder Ang III
  • B : Konzentration von markiertem Ang II - anti-Ang II-Antikörper-Komplex für jede Konzentration von unmarkiertem Ang II oder Ang III
  • Schließlich ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung die Herstellung von anti-Ang III-Antikörpern.
  • Der anti-Ang III-Antikörper wird klassisch durch die Immunisierung eines Tieres mit einem Immunogen hergestellt. Dieses Immunogen besteht aus einem Peptid-Derivat, das auf einem modifizierten Protein oder Vektor-Protein fixiert ist (siehe Am. J. Obstet. Gyneco., 1972, 113, S. 751-757). Als Beispiel von Tieren, die in diesem Verfahren verwendet werden können, können Kaninchen, Ziegen, Schafe, Ratten und Mäuse angegeben werden.
  • Die monoklonalen Antikörper werden durch das Fachleuten wohlbekannte Verfahren von Kohler und Milstein erhalten.
  • Auf die gleiche Weise können anti-Ang I-, anti-Hexapeptid (IV)- und anti-Pentapeptid (V)-Antikörper hergestellt werden.
  • Die Verwendung eines Vektor-Proteins bei der Immunisierung gegen Moleküle mit niedriger Molmasse (Hapten) ermöglicht die Induktion der Bildung spezifischer anti-Hapten-Antikörper bei Tieren.
  • Die derzeit meistverwendeten Vektor-Proteine sind Albumine tierischen Ursprungs (im Handel erhältlich, stabil, sehr immunogen). Die Synthese des Protein-Peptid-Konjugats wird durch die Bildung einer kovalenten Bindung vom Thioether-Typ zwischen der Thiol-Gruppe des Peptids und der Maleimid-Gruppe des Proteins durchgeführt, die vorher durch Umsetzen mit Sulfo MBS eingeführt wurde.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung hat das als Immunogen zur Herstellung des anti-Ang III-Antikörpers ausgewählte Peptid- Derivat die Formel:
  • worin
  • - R&sub1; eine direkte Bindung oder eine Kette aus 1 bis 2 natürlichen Aminosäuren bedeutet, wobei R&sub1; vorzugsweise Pro, oder Pro gebunden an eine andere natürliche Aminosäure, darstellt;
  • - R&sub2; eine Gruppe der Formel: -NH-(CH&sub2;)n-CO- bedeutet, wobei n zwischen 1 und 9 variiert, und n vorzugsweise 5 ist.
  • Daher ist der bevorzugte anti-Ang III-Antikörper gemäß der Erfindung Antiserum, welches durch die Immunisierung eines Tieres mit dem Immunogen erhalten wird, das durch das auf einem Vektor-Protein fixierte Peptid (VI) gebildet wird.
  • Besonders bevorzugt wird das Antiserum, welches durch das Immunogen erhalten wird, das aus--dem Peptid der Formel:
  • gebildet wird, worin R'&sub1; Pro, oder Pro gebunden an eine andere natürliche Aminosäure, bedeutet; und Ahx den Rest von Amino-6- hexansäure darstellt, wobei das Peptid von durch Sulfo MBS modifiziertem Rinderserumalbumin getragen wird. Wenn das Tier ein Kaninchen ist, weist das so erhaltene Antiserum eine Kreuzreaktion mit Ang II von weniger als 1 % auf.
  • Auf die gleiche Weise hat das als Immunogen zur Herstellung von anti-Ang I-Antikörper ausgewählte Peptid-Derivat gemäß der vorliegenden Erfindung die Formel:
  • worin
  • - R&sub3; eine direkte Bindung oder eine Kette aus 1 bis 2 natürlichen Aminosäuren bedeutet, wobei R&sub3; vorzugsweise Asp, oder Asp gebunden an eine andere natürliche Aminosäure, darstellt,
  • - R2 den oben für (VI) angegebenen Wert aufweist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung hat das als Immunogen zur Herstellung von anti-Hexapeptid-Antikörper ausgewählte Peptid- Derivat die Formel:
  • worin R&sub1; und R&sub2; die oben für (VI) angegebenen Bedeutungen haben.
  • Schließlich hat das als Immunogen zur Herstellung von anti- Pentapeptid-Antikörper ausgewählte Peptid-Derivat gemäß der vorliegenden Erfindung die Formel:
  • worin R&sub1; und R&sub2; die oben für (VI) angegebenen Bedeutungen haben.
  • In den Definitionen von R&sub1;, R'&sub1; und R&sub3; kann die andere natürliche Aminosäure aus den nachstehenden Aminosäuren ausgewählt sein: Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Ser, Thr, Cys, Tyr.
  • Auf diese Weise werden gemäß der vorliegenden Erfindung die Antikörper durch die Immunisierung eines Tieres mit einem Peptid-Derivat der Formel (VII) oder einem Peptid-Derivat der Formel:
  • erhalten, worin
  • - R&sub1; eine direkte Bindung oder eine Kette aus 1 bis 2 natürlichen Aminosäuren bedeutet, wobei R&sub1; vorzugsweise Pro, oder Pro gebunden an eine andere natürliche Aminosäure, darstellt,
  • - R&sub2; eine Gruppe der Formel: -NH-(CH&sub2;)n-CO- bedeutet, wobei n zwischen 1 und 9 variiert, und n vorzugsweise 5 ist,
  • und dieses ist dadurch gekennzeichnet, daß:
  • wenn X&sub1; eine direkte Bindung bedeutet, der Antikörper für das Pentapeptid spezifisch ist,
  • wenn X&sub1; einen Valinrest darstellt, der Antikörper für das Hexapeptid spezifisch ist, und
  • wenn X&sub1; einen Arg-Val-Dipeptidrest bedeutet, der Antikörper für Angiotensin III spezifisch ist.
  • Die erfindungsgemäßen Antikörper weisen eine Kreuzreaktion mit Ang II von weniger als 10 %, vorzugsweise weniger als 5 % auf.
  • Die obigen Peptid-Derivate, die zum Erhalten von erfindungsgemäßen Antikörpern verwendet werden, bilden ein anderes Ziel der Erfindung. Diese Peptide werden gemäß üblichen Verfahren der Peptidchemie erhalten. Insbesondere können sie durch ein Verfahren Schritt für Schritt, das als "schrittweises Verfahren" bezeichnet wird, ausgehend vom C-Terminus hergestellt werden. Vorzugsweise wird die Synthese dieser Peptide in der Festphase durchgeführt.
  • Die Erfindung wird nun durch die nachstehenden erläuternden Beispiele detaillierter beschrieben.
    • Beispiel 1: Herstellung von anti-Ang III A) Herstellung des Peptids (VI), worin R&sub1; = Pro, und R&sub2; = Ahx
  • Die Verbindung (VI) wurde in der Festphase unter Verwendung in der Peptidchemie bekannter Verfahren hergestellt.
  • Die verwendete Festphase ist 4-Methylbenzhydrylaminharz, funktionalisiert bei einer Rate von 0,4 mmol pro g. Die nachfolgende Kondensation von Aminosäuren wird durch das Reagens BOP bewirkt, wobei die aminierten α-Funktionen vorübergehend durch eine Boc-Gruppe geschützt und durch eine Trifluoressigsäure/Dichlorethan/Ethandithiol-Lösung (35/70/5; V/V/V) entschützt werden. Die Seitenketten der verschiedenen Aminosäuren werden durch geeignete Gruppen geschützt: Mob für Cys, Boc für His, DCB für Tyr, Tos für Arg.
  • Sobald es synthetisiert ist, wird das Peptid entschützt und durch die Einwirkung von 10 % Anisol enthaltender Fluorwasserstoffsäure während 1 h bei 0ºC vom Harz getrennt. Anschließend wird das Peptid in Ether ausgefällt, durch eine Lösung von Acetonitril/Wasser/Trifluoressigsäure (60/40/0,1; V/V/V) wiederaufgenommen und lyophilisiert. Die Reinigung wird durch Flüssigchromatographie unter Druck auf einer Umkehrphasensäule durchgeführt.
  • Die verschiedenen Analyseergebnisse stimmen mit der für das Peptid (VI) erwarteten Struktur überein.
    • B) Herstellung des modifizierten Proteins (LERNER, R.A. et al., (1981), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78, 3403-3407).
  • Das zur Fixierung des Peptids (VI) ausgewählte Protein ist durch Umsetzen mit Sulfo MBS modifiziertes Rinderserumalbumin (BSA).
  • Einer Lösung von 4 ml BSA (bei 10 mg/ml in 0,05 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0) werden 22,4 mg festes Sulfo MBS (Pierce) zugesetzt, d.h. eine Stöchiometrie von 80 val MBS/BSA. Die Reaktion wird 1 h lang bei Umgebungstemperatur unter sanftem Rühren entwickeln gelassen, dann wird die Mischung 18 h lang bei 4ºC gegen 2 l 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, dialysiert.
  • Die Bestimmung der Substitutionsrate wird durch die Messung der Anzahl von Maleimid-Gruppen durchgeführt, die beim Umsetzen mit durch ¹&sup4;C radioaktiv markiertem Cystein eingeführt werden. Zu 0,4 ml Reaktionsmedium werden 0,6 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, und 0,05 ml 20 mM Cystein, ergänzt mit ¹&sup4;C-cystein (End- Konzentration 3 KBq/µmol Cystein), zugesetzt. Nach 1 h 30 min Inkubation bei 30ºC und anschließender Filtration des Reaktionsmediums auf einer Chromatographiesäule unter geeigneten Bedingungen ermöglicht die Messung der Radioaktivität die Berechnung der festgestellten Modifikationsrate, die 11 Maleimid-Gruppen pro mol BSA beträgt.
  • C) Kopplung des Peptids (VI)
  • 5 mg Peptid (VI), hergestellt wie oben angegeben, werden in 0,25 ml destilliertem Wasser gelöst. Dieser Lösung wird 1 ml der modifizierten BSA-Lösung (10 mg/ml) zugesetzt. Die Mischung wird 3 h lang bei Umgebungstemperatur und 18 h lang bei 4ºC inkubiert, dann werden einige umfassende Dialysen gegen 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, durchgeführt.
  • Der Test auf radioaktiv markiertes Cystein wird am Protein nach der Kopplung des Peptids erneut durchgeführt. Die Bestimmung der Anzahl der unmodifizierten Maleimid-Gruppen zeigt durch die Differenz eine Substitutionsrate von 7 mol Peptid (VI) pro mol BSA.
  • Zwei andere Immunogen-Konjugate unter Verwendung vom Hemocyanin von Limulus polyphemus (LPH) und Human-Transferrin (SIGMA) als Träger-Proteine wurden unter den gleichen Bedingungen hergestellt.
    • D) Herstellung von anti-Ang III-Antikörper (oder -Antiserum)
  • Die verwendeten Tiere sind Neuseeland-Kaninchen. Die erste Immunisierung besteht aus der Injektion von 1 mg Immunogen in Anwesenheit von Freundschem vollständigen Adjuvans auf intradermalem Weg. Die Auffrischungen werden im Intervall von 1 Monat mit derselben Immunogen-Menge in Anwesenheit von Freundschem vollständigen Adjuvans auf subkutanem Weg durchgeführt.
    • E) Bestimmung des anti-Ang III-Serumtiters
  • 100 µl einer Verdünnung von Kaninchenserum in 0,1 M Imidazol-HCl-Puffer, pH 7,4, + 0,2 % BSA werden in Anwesenheit von 100 µg mit Jod 125 markiertem Ang III mit einer spezifischen Aktivität von 74 TBq/mmol (Amersham) inkubiert, wobei 5 000 cpm erhalten werden.
  • Die Trennung des an den Antikörper gebundenen Ang III vom freien Ang III wird durch den Zusatz von 1 ml 20 % Polyethylenglykol 6000 (PEG) und 100 µl Rinderglobulin-Lösung bei 10 mg/ml durchgeführt. Nach dem Zentrifugieren wird die Radioaktivität des Rückstands, der an den Antikörper gebundenem Ang III entspricht, gemessen. Die verwendete Technik ist jene, die von GREENWOOD, F.C. et al. (Biochem. J., 1963, 89, 114-118) beschrieben wird.
  • Das Kaninchenserum bindet an maximal 60 % mit Jod 125 markiertes Ang III.
    • F) Immunologische Charakterisierung von anti-Ang III-Antiserum a) Untersuchung der Immunreaktivität von hergestelltem Antiserum mit Ang III
  • 100 µl einer verdünnten Lösung von anti-Ang III-Antiserum (was ungefähr einer 50 % Bindung an jodiertes Ang III entspricht) werden in Anwesenheit von 50 µl freiem Ang III und 50 µl jodiertem Ang III 18 h lang bei 4ºC inkubiert, wobei 5000 cpm erhalten werden. Die Trennung von gebundenem Ang III und freiem Ang III erfolgt durch Ausfällung in Polyethylenglykol. Die Bindung jodiertes Ang III-Antikörper wird durch den Zusatz von 250 pg Ang III zu 50 % verdrängt. Daher erkennt der Antikörper Ang III.
    • b) Kreuzreaktionen von anti-Ang II-Antikörper mit Ang I und Ang II
  • Die Kreuzreaktion von anti-Ang III-Antikörpern mit Ang I und Ang II wurde gemessen. Der Prozentsatz liegt unter 1 % für die beiden Peptide.
  • Der anti-Ang III-Antikörper kann verwendet werden, wie er im Antiserum oder nach der Reinigung auf Protein-A-Sepharose erhalten wird.
    • Beispiel 2: Kapazität der oben beschriebenen anti-Ang III-Antikörper zum Einfangen von Ang III in Anwesenheit von monoklonalem anti-Ang II-Antikörper 4D8 und jodiertem Ang II
  • Der Antikörper 4D8 ist ein Mäuse-Immunglobulin; er ist in den Kongreßakten "The Renin Angiotensin System as a Therapeutic Target", Bâle, 29. - 31. Oktober 1989, SANOFI-Kommunikation, beschrieben.
  • Eine Lösung wird hergestellt, die enthält:
  • - 100 µl einer Lösung von anti-Ang III-Kaninchen-Antikörper, der in Beispiel 1 erhalten wurde,
  • - 50 µl einer Ang III-Lösung,
  • - 50 µl einer Lösung von jodiertem Ang II (spezifische Aktivität 74 TBq/mmol) (Amersham), wobei 4000 cpm erhalten werden,
  • - 100 µl einer Lösung von anti-Ang II-Antikörper (4D8), derart verdünnt, daß er nur an 30 % jodiertes Ang II bindet.
  • Das Reaktionsvolumen wird.mit Inkubationspuffer, d.h. 0,1 M Imidazol-HCl (pH 7,4), enthaltend 0,2 % BSA, auf 400 µl ergänzt. Die Inkubation wird 18 h lang bei +4ºC durchgeführt.
  • Eine Suspension von 500 µl magnetischen Teilchen, die von gegen Mäuse-Immunglobuline gerichteten Antikörpern stammen (Amerlex M, vertrieben von Amersham), wird zugesetzt. Die Inkubation erfolgt 15 min lang, dann werden die magnetischen Teilchen unter Verwendung eines Magneten vom Reaktionsmedium getrennt, und die in der Magnetphase enthaltene Radioaktivität wird gemessen.
  • Ein Meßbereich wurde durch Variieren der Ang III-Menge von 0 bis 40 pg/Versuch ermittelt. Kontrollversuche wurden in Abwesenheit von anti-Ang III-Antikörper vorgenommen.
  • Die Messung der Radioaktivität ermöglicht das Ausdrücken der Ergebnisse durch das Konzentrationsverhältnis B/Bo des jodierten Ang II - anti-Ang II-Antikörper-Komplexes für jede Ang III-Menge.
  • Diese Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Ang III (pg/Versuch) in Abwesenheit von anti-Ang III-Antikörper in Anwesenheit von anti-Ang III-Antikörper
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 1 hervorgeht, wird die Bindung von jodiertem Ang II an den Antikörper 4D8 durch den Zusatz von Ang III verringert; diese Bindung wird durch die Anwesenheit von anti-Ang III-Antikörper integral wiederhergestellt.
  • In diesem Versuch wurde außerdem verifiziert, daß der Zusatz von anti-Ang III-Antikörper zum Reaktionsmedium bei der verwendeten Konzentration keinen Einfluß auf die Reaktion von Ang II mit den anti-Ang II-Antikörpern ausübt.
    • Beispiel 3: Spezifische Bestimmung von Ang II in Anwesenheit von anti-Ang III-Antikörper
  • Gemäß einer oben beschriebenen Ausführungsform umfaßt der in diesem Beispiel verwendete Kit monoklonale anti-Ang II-Antikörper, die auf einem festen Träger fixiert sind.
  • Mehr im einzelnen werden die Antikörper an den Wänden eines Röhrchens fixiert (Startube , vertrieben von NUNC). Daher besteht der Kit aus den folgenden Elementen:
  • - Startube, NUNC, derart versehen mit monoklonalen anti- Ang II-Antikörpern 4D8, daß 30 % jodiertes Ang II gebunden sind,
  • - Ang II-Lösungen zur Standardisierung, kalibriert in bezug auf den internationalen Standard Ang II-Los 86/538, geliefert von Medical Research Council,
  • - einer Lösung von mit Jod 125 markiertem Ang II mit einer wie in Beispiel 2 definierten Aktivität,
  • - einer Lösung von polyklonalem anti-Ang III-Kaninchen- Antikörper, hergestellt im obigen Beispiel 1 und derart verdünnt, daß er als Sensor die Registrierung von zumindest 10 pg Ang III pro Versuch ermöglicht.
  • Die Bestimmung wird in 0,1 M Imidazol-HCl-Puffer (pH 7,4), enthaltend 0,2 % BSA, durchgeführt. Das End-Volumen der Reaktionsmischung beträgt 250 µl.
  • a) Standardisierungskurve in Anwesenheit von 10 pg Ang III
  • In einem mit monoklonalem Antikörper 4D8 versehenen Röhrchen werden 100 µl polyklonaler anti-Ang Ill-Kaninchen-Antikörper mit 50 µl einer Ang III-Lösung (was 10 pg Ang III entspricht), 50 µl einer Standard-Ang II-Lösung und 50 µl einer jodierten Ang II-Lösung (4000 cpm) 18 h lang bei +4ºC inkubiert.
  • Die Radioaktivität wird in den trockenen Röhrchen nach Absaugen des Inkubationsmediums und Waschen mit 1 ml 0,1 M Imidazol-HCl-Puffer (pH 7,4) gemessen. Die Radioaktivität ist jene des anti-Ang II-Antikörper - jodierten Ang 11-Komplexes.
  • Ein Standardisierungsbereich wurde durch Variieren der Ang II-Mengen von 0 bis 40 pg/Versuch ermittelt. Die Messung der Radioaktivität ermöglicht das Ausdrücken der Ergebnisse durch das Konzentrationsverhältnis B/Bo des jodierten Ang II - anti- Ang II-Antikörper-Komplexes für jede Ang II-Menge (Säule 1).
  • 10 pg Ang II werden in jedem Versuch zugesetzt, entsprechend der Standardisierungskurve (Säule 2), und die Senkung des VerhältnissescB/Bo aufgrund der Kreuzreaktion des anti-Ang II- Antikörpers mit dem vorliegenden Ang III wird festgestellt.
  • Schließlich werden in einer dritten Versuchsreihe (Säule 3) 10 pg Ang III und anti-Ang III-Antikörper in jedem Versuch zugesetzt, entsprechend der Standardisierungskurve.
  • Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Zusatz von 10 pg Ang III B/Bo (%) Ang II (pg/Versuch) Säule 1 B/Bo (%) Säule 2 in Abwesenheit von anti-Ang III-Antikörper
  • Es wird festgestellt, daß die Anwesenheit von anti-Ang III- Antikörper das Erreichen der Werte der Standardisierungskurve aufgrund des spezifischen Einfangens von Ang III im Reaktionsmedium ermöglicht.
  • Darüberhinaus wurde, wie in Beispiel 2, verifiziert, daß der Zusatz von anti-Ang III-Antikörper bei der verwendeten Konzentration keinen Einfluß auf die Standardisierungskurve von Ang II ausübt.
  • b) Spezifische Bestimmung von Ang II aus dem Plasma
  • Die eigentliche Bestimmung wird an einem Humanplasma- Extrakt durchgeführt, einem Extrakt, der gemäß der von J. NUSSBERGER et al., Hypertension, 1985 (angegebene Literaturstelle), beschriebenen Technik erhalten und dann konzentriert wird.
  • Im mit monoklonalen Antikörper 4D8 versehenen Röhrchen werden 100 µl polyklonaler anti-Ang III-Kaninchen-Antikörper mit 100 µl Ang II-Standard-Lösung oder zu bestimmendem Plasma- Extrakt und 50 µl einer jodierten Ang II-Lösung (4000 cpm) 18 h lang bei +4ºC inkubiert.
  • Die Radioaktivität wird in den trockenen Röhrchen nach Absaugen des Inkubationsmediums wie in Beispiel 3a) gemessen.
  • Eine Bestimmung von Ang II, die in Abwesenheit von anti- Ang III-Antikörper vorgenommen wurde, führt zur Bestimmung einer scheinbaren Menge von 81 pg im Versuch, wohingegen in Anwesenheit von anti-Ang III nur 57 pg im Versuch gemessen werden. Die Differenz resultiert aus der Eliminierung der von den anti- Ang III-Antikörpern immuno-eingefangenen Ang III-Menge.
  • Daraus wird geschlossen, daß das Vorliegen von Ang III in diesem Fall zu einem Fehler von
  • führt, d.h. 42 % bei der direkten Bestimmung von Ang II, die mit Hilfe von anti-Ang II- Antikörper (4D8) durchgeführt wurde, aufgrund der Kreuzreaktion zwischen diesem Antikörper und Ang III. Dieser Fehler kann unter gleichzeitiger Verwendung des anti-Ang III-Antikörpers unterdrückt werden, der eines der Ziele der vorliegenden Erfindung ist.
    • Beispiel 4: Herstellung des anti-Ang I-Antikörpers
  • Das Peptid (VII), worin R&sub2; = Ahx, und R&sub3; = Asp, wird gemäß der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgangsweise hergestellt, dann wird Kaninchen-Antiserum durch Immunisierung gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erzeugt.
    • Beispiel 5: Herstellung des anti-Hexapeptid-Antikörpers
  • Das Peptid (VIII), worin R&sub1; = Pro, und R&sub2; = Ahx, wird unter Verwendung des in Beispiel 1, Schritt A, beschriebenen Verfahrens hergestellt.
  • Anschließend wird der Antikörper (Kaninchen-Antiserum) unter Verwendung des in Beispiel 1, Schritte B, C, D, beschriebenen Verfahrens hergestellt, dann wird er charakterisiert.
    • Beispiel 6: Herstellung des anti-Pentapeptid-Antikörpers
  • Es wird wie im vorhergehenden Beispiel vorgegangen, um das Peptid (IX) herzustellen, worin R&sub1; = Pro, und R&sub2; = Ahx, dann wird das Kaninchen-Antiserum durch Immunisierung unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens erzeugt, anschließend wird es charakterisiert.
  • Beispiel 7: Kapazität der in Beispiel 4 hergestellten anti- Pentapeptid-Antikörper zum Einfangen von Pentapeptid (V) in Anwesenheit von anti-Ang II 4D8 und jodiertem Ang II.
  • Eine Lösung wird hergestellt, die enthält:
  • - 100 µl einer Lösung von in Beispiel 5 hergestelltem anti- Pentapeptid-Antikörper,
  • - 100 µl einer Pentapeptid-Lösung,
  • - 50 µl einer Lösung von jodiertem Ang II (spezifische Aktivität 74 TBq/mmol) (Amersham), wobei 4000 cpm erhalten werden,
  • und diese wird in ein mit Antikörper gemäß Beispiel 3 versehenes Röhrchen gegeben.
  • Die End-Verdünnung des anti-Pentapeptid-Antikörpers ist 1/25. Die Inkubation wird 18 h lang bei 4ºC durchgeführt. Die Radioaktivität wird in den trockenen Röhrchen nach Absaugen des Inkubationsmediums und Waschen mit 1 ml 0,1 M Imidazol-HCl- Puffer (pH 7,4) gemessen. Die Radioaktivität ist jene des anti- Ang II-Antikörper - jodierten Ang II-Komplexes.
  • Anschließend wird wie in Beispiel 2 vorgegangen, und die in nachstehender Tabelle 3 angegebenen Ergebnisse werden gemessen: Tabelle 3 Pentapeptid (pg/Versuch) in Abwesenheit von anti-Pentapeptid-Antikörper in Anwesenheit von anti-Pentapeptid-Antikörper
    • Beispiel 8: Spezifische Bestimmung von Ang II in Anwesenheit von anti-Ang II-Antikörper und anti-Pentapeptid (V)-Antikörper
  • Gemäß einer der oben beschriebenen Ausführungsformen umfaßt der in diesem Beispiel verwendete Kit monoklonale anti-Ang II- Antikörper, die auf einem festen Träger fixiert sind.
  • Mehr im einzelnen werden die Antikörper an den Wänden eines Röhrchens fixiert (Startube , vertrieben von NUNC). Daher beteht der Kit aus den folgenden Elementen:
  • - Startube, NUNC, derart versehen mit monoklonalen anti-Ang II-Antikörpern 4D8, daß 30 % jodiertes Ang II gebunden sind,
  • - Ang II-Lösungen zur Standardisierung, kalibriert in bezug auf den internationalen Standard Ang II-Los 86/538, geliefert von Medical Research Council,
  • - einer Lösung von mit Jod 125 markiertem Ang II mit einer wie in Beispiel 2 definierten Aktivität,
  • - einer Lösung von polyklonalem anti-Ang III-Kaninchen- Antikörper, hergestellt im obigen Beispiel 1 und derart verdünnt, daß er als Sensor die Registrierung von zumindest 10 pg Ang III pro Versuch ermöglicht,
  • - einer Lösung von polyklonalem anti-Pentapeptid (V) Kaninchen-Antikörper, derart hergestellt wie in Beispiel 5, daß er als Sensor die Registrierung von 10 pg Pentapeptid pro Versuch ermöglicht.
  • Die Bestimmung wird in 0,1 M Imidazol-HCl-Puffer (pH 7,4), enthaltend 0,2 % BSA, durchgeführt. Das End-Volumen der Reaktionsmischung beträgt 250 µl.
  • Die Standardisierungskurve wird in Anwesenheit von 4 pg Ang III und 4 pg Pentapeptid erstellt.
  • In einem mit monoklonalem Antikörper 4D8 versehenen Röhrchen werden 100 µl einer Lösung von polyklonalem anti-Ang III- Kaninchen- und anti-Pentapeptid-Antikörper mit 50 µl einer Lösung von Ang III und Pentapeptid (V) (was 4 pg jedes der Peptide entspricht), 50 µl einer Standard-Ang II-Lösung und 50 µl einer jodierten Ang II-Lösung (4000 cpm) 18 h lang bei +4ºC inkubiert.
  • Die Radioaktivität wird in den trockenen Röhrchen nach Absaugen des Inkubationsmediums und Waschen mit 1 ml 0,1 M Imidazol-HCl-Puffer (pH 7,4) gemessen. Die Radioaktivität ist jene des anti-Ang II-Antikörper - jodierten Ang II-Komplexes.
  • Ein Standardisierungsbereich wurde durch Variieren der Ang II-Mengen von 0 bis 40 pg/Versuch ermittelt. Die Messung der Radioaktivität ermöglicht das Ausdrücken der Ergebnisse durch das Konzentrationsverhältnis B/Bo des jodierten Ang II - anti- Ang II-Antikörper-Komplexes für jede Ang II-Menge (Säule 1).
  • 4 pg Ang III und 4 pg Pentapeptid (V) werden in jedem Versuch zugesetzt, entsprechend der Standardisierungskurve (Säule 2), und die Senkung des Verhältnisses B/Bo aufgrund der Kreuzreaktion des anti-Ang II-Antikörpers mit dem vorliegenden Ang III und Pentapeptid (V) wird festgestellt.
  • Schließlich werden in einer dritten Versuchsreihe (Säule 3) 4 pg Ang III, 4 pg Pentapeptid (V) sowie anti-Ang III- und anti- Pentapeptid (V)-Antikörper in jedem Versuch zugesetzt, entsprechend der Standardisierungskurve.
  • Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4 Zusatz von 4 pg Ang III, 4 pg Ang 4-8 B/Bo (%) Ang II (pg/Versuch) Säule 1 B/Bo (%) Säule in Abwesenheit von anti-Ang III- und anti-Pentapeptid-Antikörper
  • Es wird festgestellt, daß die Anwesenheit von anti-Ang III- und anti-Pentapeptid (V)-Antikörper das Erreichen der Werte der Standardisierungskurve aufgrund des spezifischen Einfangens von Ang III und Pentapeptid (V) im Reaktionsmedium ermöglicht.
  • Darüberhinaus wurde, wie in Beispiel 2, verifiziert, daß der Zusatz von anti-Ang III- und anti-Pentapeptid (V)-Antikörper bei der verwendeten Konzentration keinen Einfluß auf die Standardisierungskurve von Ang II ausübt.

Claims (26)

1. Kit zur spezifischen Bestimmung von Angiotensin II, welcher umfaßt:
- einen anti-Ang II-Antikörper,
- eine Lösung von markiertem Ang II,
- Lösungen, die Ang II-Standards in bekannten und zunehmenden Konzentrationen enthalten,
- die erforderliche Waschlösung oder die erforderlichen Waschlösungen,
- eine Lösung von anti-Ang III-Antikörper, welcher Antikörper eine Kreuzreaktion mit Ang II von weniger als 10 %, vor zugsweise weniger als 5% aufweist,
- und gegebenenfalls eine Lösung von anti-Ang I-Antikörper und/oder eine Lösung von anti-Pentapeptid-Antikörper und/oder eine Lösung von anti-Hexapeptid-Antikörper, welche Antikörper eine Kreuzreaktion mit Ang II von weniger als 10 %, vorzugsweise weniger als 5 % aufweisen.
2. Kit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Ang II mit einem Enzym markiert ist.
3. Kit nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß er außerdem eine Lösung umfaßt, die das Substrat des Ang II markierenden Enzyms, gegebenenfalls ein oder mehrere Reagentien zur Darstellung der Aktivität des Enzyms und eine Lösung zum Anhalten der enzymatischen Reaktion enthält.
4. Kit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Ang II entweder mit einer fluores zierenden Verbindung, mit einer lumineszenten Verbindung oder einem radioaktiven Element markiert ist.
5. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welchem der anti- Ang II-Antikörper, die anti-Ang III- und anti-Ang I-, anti- Pentapeptid- und anti-Hexapeptid-Antikörper monoklonale oder polyklonale Antikörper sind.
6. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der anti-Ang II-Antikörper in Lösung vorliegt oder auf einem festen Träger fixiert ist.
7. Kit nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger ein Röhrchen, eine Mikrotiterplatte oder, gegebenenfalls magnetische, Teilchen sind.
8. Kit nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper polyklonal sind und jeweils von einem Kaninchen-Antiserum stammen.
9. Antikörper, welcher durch die Immunisierung eines Tieres mit einem Peptid-Derivat der Formel:
erhalten wird, worin
- R&sub1; eine direkte Bindung oder eine Kette aus 1 bis 2 natürlichen Aminosäuren bedeutet,
- R&sub2; eine Gruppe der Formel: -NH-(CH&sub2;)n-CO darstellt, wobei n zwischen 1 und 9 variiert,
- X&sub1; eine direkte Bindung, Val oder Arg-Val, gemäß der Spezifität des herzustellenden Antiserums, ist,
wobei das Peptid-Derivat auf einem. Vektor-Protein fixiert ist, und die Antikörper eine Kreuzreaktion mit Angiotensin II von weniger als 10 %, vorzugsweise weniger als 5 % aufweisen.
10. Anti-Ang III-Antikörper nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid-Derivat die Formel:
aufweist, worin
- R&sub1; eine direkte Bindung oder eine Kette aus 1 bis 2 natürlichen Aminosäuren bedeutet,
- R&sub2; eine Gruppe der Formel: -NH-(CH&sub2;)n-CO- darstellt, wobei n zwischen 1 und 9 variiert.
11. Anti-Ang III-Antikörper nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid-Derivat die Formel:
aufweist, worin
- Ahx den Rest von Amino-6-hexansäure bedeutet,
- und R'&sub1; Pro, oder Pro gebunden an eine andere natürliche Aminosäure, darstellt.
12. Anti-Ang III-Antikörper nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Kaninchen-Antiserum ist, und daß er eine Kreuzreaktion mit Ang II von weniger als 1 % aufweist.
13. Anti-Pentapeptid-Antikörper (V) nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid-Derivat die Formel:
aufweist, worin
- R&sub1; eine direkte Bindung oder eine Kette aus 1 bis 2 natürlichen Aminosäuren bedeutet,
- R&sub2; eine Gruppe der Formel: -NH-(CH&sub2;)n-CO- darstellt, wobei n zwischen 1 und 9 variiert.
14. Anti-Pentapeptid-Antikörper (V) nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid-Derivat die Formel:
aufweist, worin
- Ahx den Rest von Amino-6-hexansäure bedeutet,
- und R'&sub1; Pro, oder Pro gebunden an eine andere natürliche Aminosäure, darstellt.
15. Anti-Hexapeptid-Antikörper (IV) nach Ansprüch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid-Derivat die Formel:
aufweist, worin
- R&sub1; eine direkte Bindung oder eine Kette aus 1 bis 2 natürlichen Aminosäuren bedeutet,
- R&sub2; eine Gruppe der Formel: -NH-(CH&sub2;)n-CO- darstellt, wobei n zwischen 1 und 9 variiert.
16. Anti-Hexapeptid-Antikörper (IV) nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid-Derivat die Formel:
aufweist, worin
- Ahx den Rest von Amino-6-hexansäure bedeutet,
- und R'&sub1; Pro, oder Pro gebunden an eine andere natürliche Aminosäure, darstellt.
17. Anti-Ang I-Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er durch die Immunisierung eines Tieres mit einem Peptid-Derivat der Formel:
erhalten wird, worin
- R&sub3; eine direkte Bindung oder eine Kette aus 1 bis 2 natürlichen Aminosäuren bedeutet,
- R&sub2; eine Gruppe der Formel: -NH-(CH&sub2;)n-CO- darstellt, wobei n zwischen 1 und 9 variiert.
18. Antikörper nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid-Derivat die Formel:
aufweist, worin
- Ahx den Rest von Amino-6-hexansäure bedeutet,
- R'&sub3; Asp, oder Asp gebunden an eine andere natürliche Aminosäure, darstellt.
19. Verfahren zur Bestimmung von Angiotensin II unter Verwendung des Bestimmungs-Kits nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt, gemäß denen:
a) ein Reaktionsmedium hergestellt wird, das umfaßt:
- einen Extrakt der zu bestimmenden biologischen Flüssigkeit,
- einen anti-Ang II-Antikörper,
- markiertes Ang II,
- einen anti-Ang III-Antikörper,
- und gegebenenfalls einen anti-Ang I-Antikörper und/oder einen anti-Pentapeptid-Antikörper und/oder einen anti-Hexapeptid-Antikörper;
b) gleichzeitig Reaktionsmedien hergestellt werden, die für eine Standardisierung verwendet werden, und die jeweils umfassen:
- einen Ang II-Standard,
- einen anti-Ang II-Antikörper,
- markiertes Ang II,
- einen anti-Ang III-Antikörper,
- und gegebenenfalls einen anti-Ang I-Antikörper und/oder einen anti-Pentapeptid-Antikörper und/oder einen anti-Hexapeptid-Antikörper;
c) bei einer Temperatur zwischen 4ºC und Umgebungstemperatur während 12 bis 72 Stunden inkubieren gelassen wird;
d) an den anti-Ang II-Antikörper gebundenes Ang II von freiem Ang II getrennt wird;
e) schließlich die Ablesung der Ergebnisse gemäß einer geeigneten Methode durchgeführt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte a) und b) durchgeführt werden, indem gemischt werden:
- 25 bis 500 µl Extrakt einer zu bestimmenden biologischen Flüssigkeit, oder Ang II-Standard, mit einem Medium, das ent-
- 25 bis 500 µl Lösung von anti-Ang II-Antikörper,
- 25 bis 500 µl Lösung von anti-Ang III-Antikörper,
- gegebenenfalls 25 bis 500 µl Lösung von anti-Ang 1-Antikörper und/oder 25 bis 500 µl Lösung von anti-Pentapeptid-Antikörper und/oder 25 bis 500 µl Lösung von anti-Hexapeptid-Antikörper, und
- 25 bis 500 µl Lösung von markiertem Ang II.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte a) und b) durchgeführt werden, indem gemischt werden:
- 25 bis 500 µl Extrakt einer zu bestimmenden biologischen Flüssigkeit, oder Ang II-Standard, mit einem Medium, das enthält:
- 25 bis 500 µl Lösung von anti-Ang II-Antikörper,
- 25 bis 500 µl Lösung von anti-Ang III-Antikörper, und
- 25 bis 500 µl Lösung von markiertem Ang II.
22. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte a) und b) durchgeführt werden, indem mit anti-Ang II- Antikörper versehene Röhrchen verwendet werden, in die gemischt werden:
- 25 bis 500 µl Extrakt einer zu bestimmenden biologischen Flüssigkeit, oder Ang II-Standard, mit einem Medium, das enthält:
- 25 bis 500 µl Lösung von anti-Ang III-Antikörper,
- 25 bis 500 µl Lösung von markiertem Ang II,
und Schritt d) durchgeführt wird, indem die Inkubationslösung vom Reaktionsmedium abgesaugt wird, anschließend gewaschen und erneut abgesaugt wird, um Ang II, das nicht durch den auf dem festen Träger fixierten Antikörper komplexiert ist, zu eliminieren.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der anti-Ang II-Antikörper auf, gegebenenfalls magnetischen, Teilchen fixiert ist.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Bestimmung eines Plasma-Extrakts verwendet wird.
25. Peptid-Derivat der Formel:
worin
- R&sub1; eine direkte Bindung oder eine Kette aus 1 bis 2 natürlichen Aminosäuren bedeutet, und vorzugsweise R&sub1; Pro, oder Pro gebunden an eine andere natürliche Aminosäure, darstellt,
- R&sub2; eine Gruppe der Formel: -NH-(CH&sub2;)n-CO- bedeutet, wobei n zwischen 1 und 9 variiert, und n vorzugsweise 5 ist,
- X&sub1; eine direkte Bindung, einen Valinrest oder einen Arg-Val-Dipeptidrest darstellt.
26. Peptid-Derivat der Formel:
worin
- R&sub3; eine direkte Bindung 6der eine Kette aus 1 bis 2 natürlichen Aminosäuren bedeutet, und R&sub3; vorzugsweise Asp, oder Asp gebunden an eine andere natürliche Aminosäure, darstellt,
- R&sub2; eine Gruppe der Formel: -NH-(CH&sub2;)n-CO- bedeutet, wobei n zwischen 1 und 9 variiert, und n vorzugsweise 5 ist.
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