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Hintergrund
der Erfindung
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Die Drüsenkallikreine sind eine Untergruppe
der Serinproteasen, welche an der posttranslationalen Verarbeitung
spezifischer Polypeptid-Vorläufer
zu ihren biologisch aktiven Formen beteiligt sind. Die Wirbeltier-Kallikreingenfamilie
besteht aus mindestens 25 Genen. Die Human-Kallikreingenfamilie
ist jedoch viel kleiner und besteht aus drei Mitgliedern: dem Prostata-spezifischen
Antigen, Human-Drüsenkallikrein
und Pankreas-/Nieren-Kallikrein. Siehe J. A. Clements, Endocr. Rev.,
10, 393 (1989) und T. M. Chu et al. (US-Patent Nr. 4,446,122). Eine
gemeinsame Nomenklatur dieser Mitglieder der Gewebe(Drüsen-)-Kallikreingenfamilien
wurde kürzlich
von T. Berg et al. in Recent Progress on Kinins: Biochemistry and
Molecular Biology of the Kallikrein-Dinin System. Agents and Actions
Supplements, Bd. I, H. Fritz et al., Hrsg., Birkhauser Verlag, Basel (1992),
eingeführt
und ist in Tabelle I unten angegeben.
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TABELLE
I
Die Human-Gewebekallikreingenfamilie (anerkannte Speziesbezeichnung:
HSA)
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Von L. J. Schedlich et al., DNA,
6, 429 (1987) und B. J. Morris, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.,
16, 345 (1989) abgeleitete Aminosäuresequenzen deuten an, daß hK2 eine
Trypsin-artige Serinprotease sein kann, wohingegen hK3 (PSA) eine
Chymotrypsin-artige Serinprotease ist. Diese zwei Peptide können daher
unterschiedliche physiologische Funktionen aufweisen.
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Obwohl die cDNA und die Genomsequenzen
für hK2
beschrieben worden sind, ist das funktionierende hK2-Protein noch
nicht aus Prostatageweben isoliert und charakterisiert worden. Die DNA-Sequenzhomologie zwischen
hKLK2 und hKLK3 (Exonbereiche) beträgt 80%, wohingegen die Homologie
zwischen hKLK2 und hKLK1 65% beträgt. Die daraus abgeleitete
Aminosäuresequenzhomologie
von hK2 ist größer bezüglich hK3 und
kleiner bezüglich
hK1 und beträgt
jeweils 78% und 57%.
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Die Ähnlichkeiten der Genstruktur
und der abgeleiteten Aminosäuresequenzen
dieser Human-Kallikreine deuten darauf hin, daß an deren Evolution das gleiche
Vorfahrengen beteiligt sein könnte. Überdies
werden, wie von Morris, oben zitiert; P. Chapdelaine, FEBS Lett.,
236, 205 (1988), und Young, Biochemistry, 31, 1952 (1992) berichtet
wurde, sowohl hK2 als auch hK3 nur in der humanen Prostata exprimiert,
wohingegen hK1 auf den Pankreas, die Submandibulardrüse, die
Niere und andere Nicht-Prostatagewebe beschränkt ist. Die mutmaßliche Sequenz
eines Polypeptids, von dem berichtet wird, daß es humanem Harn-Kallikrein
entspricht, wurde von Amgen offenbart (EPA 297, 913).
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Interessanterweise befindet sich
das hK2-Gen ungefähr
12 kbp stromabwärts
des hK3-Gens in einer Kopf-Schwanz-Anordnung auf Chromosom 19. Siehe
P. H. Riegman et al., FEBS Lett., 247, 123 (1989). Der Zusammenhang
zwischen der hK2- und hK3-Genexpression
ist daher sehr überraschend
bzw. faszinierend, insbesondere bezüglich ihrer Evolution und funktionellen
Eigenschaften.
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Es hat sich ein enormes Interesse
an hK3 (PSA) entwickelt, aufgrund der wichtigen Rolle, die dieses als
Marker für
die Detektion und Überwachung
der Therapie von Prostatakarzinomen spielt. Dessen Eignung als Marker
basiert auf der erhöhten
Serumkonzentration zirkulierender hK3-Proteine, die häufig mit
Prostatakrebs in Verbindung gebracht werden. Es wurde gefunden,
daß die
Serumkonzentration von hK3 proportional zur Krebsmasse in unbehandelten
Patienten ist, jedoch auch proportional zum Volumen von hyperplastischem Gewebe
in Patienten mit gutartiger Prostata-Hyperplasie (BPH) ist. Die
Serumwerte von hK3 vermindern sich in der Folge einer Prostatakrebsbehandlung.
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Gegenwärtig untersucht das Mayo Laboratory über 60.000
Proben im Jahr auf hK3-Werte. Der hohe Grad an Sequenzhomologie
von hK2 mit hK3 weist daher darauf hin, daß die Werte beider Proteine
bei der Diagnose von Prostatakrebs verwendbar sein können. Beispielsweise
könnten
die gegen hK3 entwickelten, derzeit in diesen Tests verwendeten
Antikörper
theoretisch aufgrund einer gegenseitigen Verunreinigung der Antigenzubereitungen,
die zur Entwicklung der anti-hK3-Antikörper verwendet werden, auch
hK2 erkennen, oder deswegen weil die oben erwähnten strukturellen Ähnlichkeiten
der zwei Proteine kreuzreagierende Antikörper ergeben. Wenn erhöhte hK2-Serumwerte nicht
Prostatakrebs anzeigen, könnte
die Detektion von hK2 durch anti-hK3-Antikörper für den beträchtlichen Prozentsatz falscher
positiver Ergebnisse verantwortlich sein, die bei gegenwärtigen hK3-Tests
beobachtet werden. Wenn andererseits die zirkulierenden hK2-Werte
ebenfalls über
die Grundlinienwerte in Prostatakrebspatienten erhöht sind,
würde die
Detektion von hK2 durch hK2-spezifische Antikörper einen alternativen, bestätigenden
Test für
Prostatakrebs bereitstellen.
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Trotz der Information, die aus der
DNA-Sequenz und den cDNA-Sonden über hK2
ermittelt wurde, ist jedoch sehr wenig über das hK2-Protein selbst
bekannt. Der Grund hierfür
ist, daß das
Protein noch nicht gereinigt und charakterisiert wurde, und daß kein Verfahren
zur Messung des Proteins entweder im Prostataplasma, Seminalplasma
oder im Blutserum existiert.
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Es besteht daher ein Bedürfnis nach
Antikörpern
gegen hK2 (hGK-1), die nicht mit hK3 (PSA) kreuzreagieren. Es besteht
ein weiteres Bedürfnis
nach einem Test zur Bestimmung der Gegenwart und/oder des Gehalts
an hK2 in einer physiologischen Probe, ohne hK3 zu detektieren,
oder umgekehrt nach einem Test, mit dem die Gegenwart und/oder der
Wert von hK3 in einer Probe detektiert werden kann, der von der
Gegenwart von hK2 in der gleichen Probe unbeeinflußt ist.
Es besteht ein weiteres Bedürfnis
nach verbesserten und/oder alternativen Verfahren zum Nachweis,
zur Bestimmung des Stadiums und zur Verfolgung des Verlaufs von
Prostatakrebs.
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Kurze Beschreibung
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt
einen gereinigten Antikörper
bereit, der an ein Epitop auf humanem Prostata-spezifischen Drüsen-Kallikrein
(hK2) bindet (oder "damit
reagiert"), der
jedoch nicht wesentlich an das Prostata-spezifische Antigen (hK3)
bindet.
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Insbesondere betrifft die vorliegende
Erfindung einen isolierten Antikörper,
der mit einem Polypeptid reagiert, welches aus:
oder einer
Untereinheit hiervon besteht, wobei der Antikörper nicht wesentlich mit dem
Prostata-spezifischen Antigen (hK3) reagiert.
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Der Antikörper der vorliegenden Erfindung
bindet so spezifisch an gereinigte hK2-Präparationen, an hK2, das in
Prostataplasma, Seminalplasma, Blutserum und anderen physiologischen
Fluids bzw. Flüssigkeiten
vorliegt, sowie an Untereinheiten des hK2, die eine Aminosäuresequenz,
welche das Epitop beinhaltet, umfassen. Durch die vorliegende Erfindung
wird somit auch eine isolierte Zubereitung polyklonaler Antikörper bereitgestellt,
welche einen solchen gereinigten Antikörper umfaßt, d. h., wie sie durch Immunisieren
eines Säugers
mit einer gereinigten Antigenuntereinheit von hK2 hergestellt werden
kann, solange die polyklonale Antikörperzubereitung nicht wesentlich
mit hK3 kreuzreagiert. Der Antikörper
der vorliegenden Erfindung kann auch eine isolierte Antikörperzubereitung
sein, die aus einer homogenen Population monoklonaler anti-hK2-Antikörper besteht,
die unter Verwendung herkömmlicher
Hybridomtechnik hergestellt werden kann.
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Die vorliegende Erfindung basiert
auf dem Befund, daß es
mindestens eine Peptiduntereinheit des hK2-Proteins gibt, die zur
Erzeugung einer Antikörperantwort
in Säugern
verwendet werden kann, wobei die Antikörper nicht wesentlich mit hK3
kreuzreagieren. Dieser Befund war im Hinblick auf den hohen Grad
(78%) an Sequenzhomologie zwischen hK2 und hK3 und dem Fehlen jeglicher
Daten im Stand der Technik bezüglich der
Antigenizität
von hK2 überraschend.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Polypeptid, das
aus der Sequenz der Formel (I)
oder einer
immunreaktiven Untereinheit hiervon besteht, welches) an einen an
hK2 bindenden Antikörper
bindet, wobei der Antikörper
nicht an hK3 bindet.
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Das Peptid der Formel (I) stellt
formell die Reste 41–56
der abgeleiteten Aminosäuresequenz
von hK2 dar, so wie diese Sequenz von L. J. Schedlish et al., DNA,
6, 429 (1987) berichtet wurde. Immunogene oder immunreaktive Untereinheiten
dieses Peptids, bevorzugt mindestens 5 Peptidyleinheiten, die ebenfalls
spezifisch durch spezifische anti-hK2-Antikörper gebunden werden können, sind
ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung. Selbstverständlich kann
die Sequenz 41–56
(SEQ ID NO: 1) zusätzliche
oder alternative Peptidylreste umfassen, die deren Fähigkeit
zur Bewirkung einer für
hK2 spezifischen Antigenantwort nicht zerstören, wie unten diskutiert ist.
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Weiterhin wird angenommen, daß andere
immunogene hK2-Untereinheiten ebenfalls eine Antikörperantwort
erzeugen, die für
hK2 einzigartig ist, einschließlich
hK2 (80–95)
(SEQ ID NO: 2), hK2 (104–119) (SEQ
ID NO: 3), hK2 (140–157)
(SEQ ID NO: 4) und hK2 (168–174)
(SEQ ID NO: 5), hK2 (8–26)
(SEQ ID NO: 6), hK2 (15–26)
(SEQ ID NO: 7), hK2 (153–167)
(SEQ ID NO: 8) und hK2 (210–235)
(SEQ ID NO: 9), worin die Zahlen in Klammern die hK2-Aminosäurereste
der in 1 und von Schedlish
et al. wie oben zitiert offenbarten hK2-Sequenz bezeichnen. Diese
Untereinheiten sowie monoklonale Antikörper und polyklonale Antikörper, die
dafür spezifisch
sind, sind daher ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung.
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Die vorliegenden Zubereitungen von
anti-hK2-Antikörpern
können
durch Adsorption oder chemische Bindung an die Oberfläche des
festen Substrats, wie beispielsweise einem Papierstreifen oder einem
teilchenförmigen
Feststoff, immobilisiert werden und in einer Vielzahl immunologischer
Tests für
hK2 verwendet werden. In einer einfachen Ausführungsform wird eine immobilisierte
Zubereitung von hK2- Antikörpern mit
einer Probe, wie beispielsweise einer Flüssigkeitsprobe eines physiologischen
Fluids, das im Verdacht steht, hK2 zu enthalten, in Kontakt gebracht,
so daß hK2
mit den anti-hK2-Antikörpern
unter Bildung eines binären
Komplexes reagiert. Das Vorliegen des binären Komplexes wird dann nachgewiesen,
indem beispielsweise der Komplex mit einem zweiten Antikörper gegen
eine andere antigene Stelle des hK2-Moleküls zur Reaktion gebracht wird,
um einen ternären
Komplex zu bilden. Der zweite Antikörper umfaßt eine detektierbare Markierung,
wie beispielsweise eine Radiomarkierung, eine fluoreszierende Markierung,
eine chemilumineszierende Markierung oder ein Enzym oder eine Bindungsstelle
für eine
detektierbare Markierung, wie beispielsweise eines der Mitglieder
des Avidin-Biotin-Paares. Die Detektion des gebundenen zweiten Antikörpers liefert
eine Bestimmung der Menge an gebundenem hK2.
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Alternativ kann die hK2-Menge in
einer Probe unter Verwendung eines kompetitiven Immunoassays nachgewiesen
werden, d. h. durch Zugabe einer begrenzten Menge des anti-hK2-Antikörpers und
einer bekannten Menge an hK2, welches selbst eine detektierbare
Markierung oder eine Bindungsstelle für eine detektierbare Markierung
umfaßt,
Ausfällen
des Komplexes und Bestimmen der Menge an freiem, markiertem hK2, wobei
die Menge hiervon umgekehrt proportional zur hK2-Menge in der Probe
ist. Viele andere Immunoassays ähnlicher
Formate sind dem Stand der Technik zugänglich, wie beispielsweise
in Ortho Pharmaceutical Corp. (PCT/US87/00577); IAF (EPA 32649);
und US-Patent Nrn. 4,629,783; 4,371,515; 4,487,715; 3,817,837; 3,850,752;
3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; und 4,098,876
beschrieben ist.
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Einbuchstaben- und Dreibuchstaben-Abkürzungen
der Aminosäuren
sind A, Alanin (Ala); R, Arginin (Arg); N, Asparagin (Asn); D, Asparaginsäure (Asp);
C, Cystein (Cys); Q, Glutamin (Gln); E, Glutaminsäure (Glu);
G, Glycin (Gly); H, Histidin (His); I, Isoleucin (Ile); L, Leucin
(Leu); K, Lysin (Lys); F, Phenylalanin (Phe); M, Methionin (Met);
P, Prolin (Pro); S, Serin (Ser); T, Threonin (Thr); W, Tryptophan
(Trp), Y, Tyrosin (Tyr); V, Valin (Val). In einer gegebenen Aminosäuresequenz
eines Peptids befindet sich der Aminoterminus des Peptids am linksseitigen
Ende des Peptids und der Carboxylterminus am rechtsseitigen Ende.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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1 zeigt
die Aminosäuresequenzen
von hK2 (abgeleitet aus der cDNA-Sequenz) (SEQ ID NO: 10) und hK3
(PSA) (SEQ ID NO: 11). Unterstrichene Sequenzen bezeichnen nicht-homologe
Bereiche, die zur Entwicklung monoklonaler Antikörper und polyklonaler Antikörper verwendet
wurden.
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2 zeigt
eine Dot-Blot-Analyse des hK2 (41–56)-Antiserums, wobei die
Bindung hieran von hK2 (41–56),
hK2 (153– 167)
und von hK3 (14–27),
hK3 (41–56)
und hK3 (153–167)
verglichen sind.
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3 zeigt
eine Titerkurve, in der die Bindung von Schafanti-hK2 (41–56)-Antiserum
an AE-markiertes hK2 (41–56)-BSA-Konjugat (O) gezeigt
ist, im Vergleich zur Bindung nicht-immunen Schafserums (Δ).
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4 zeigt
kompetitive Verdrängungskurven
für Schaf-hK2
(41–56)-Antikörper, worin
sowohl hK2 (41–56)
(⧠), hK3-Peptid (41–56)
(Δ) und
ein Samenfluidextrakt (*) das AE-markierte hK2 (41–56)-BSA-Konjugat
von dem Antikörper
verdrängen können, während hK3
das Konjugat nicht wesentlich verdrängen kann (O).
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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hK2-Peptidsynthese
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Das Polypeptid der Formel I, antigene
Analoga und Untereinheiten hiervon oder andere hK2-Untereinheitspolypeptide
können
durch das Festphasenpeptidsynthese (oder Merrifield-)-Verfahren synthetisiert
werden. Dieses etablierte und weithin verwandte Verfahren, einschließlich der
experimentellen Verfahren, ist in den folgenden Referenzen beschrieben:
Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San
Francisco (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1963);
Meienhofer in Hormonal Proteins and Peptides, Bd. 2, C. H. Li, Hrsg.,
(Academic Press, 1973), S. 48–267
und Barany und Merrifield in "The
Peptides," Bd. 2,
E. Gross und F. Meinenhofer, Hrsg., Academic Press (1980), S. 3–285. Die
Synthese beginnt am carboxyterminalen Ende des Peptids, wobei eine α-Amino-geschützte Aminosäure verwendet
wird. Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)- oder t-Butyloxycarbonyl
(Boc)-Schutzgruppen
können
für sämtliche
Aminogruppen verwendet werden, obwohl auch andere Schutzgruppen
verwendbar sind, und die ersten geschützten Aminosäuren können an
chlormethylierte Polystyrolharzträger verestert werden. Der Polystyrolharzträger ist bevorzugt
ein Copolymer aus Styrol mit ungefähr 0,5 bis 2% Divinylbenzol
als Vernetzungsmittel, welches bewirkt, daß das Polystyrolpolymer in
bestimmten organischen Lösungsmitteln
unlöslich
ist. Siehe Carpino et al., J. Org. Chem, 37, 3404 (1972); Meinhofer,
Int. J. Pept. Pro. Res., 11, 246 (1978); und Merrifield, J. Am.
Chem. Soc., 85, 2149 (1963). Diese und andere Verfahren der Peptidsynthese
sind auch beispielhaft durch die US-Patente Nrn. 3,862,925, 3,842,067,
3,972,859, 4,105,602 und 4,757,048 erwähnt.
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Das immobilisierte Peptid wird dann
N-entschützt,
und andere Aminosäuren
mit geschützten
Aminogruppen werden stufenweise zu dem immobilisierten Peptid gegeben.
Am Ende des Verfahrens wird das endgültige Peptid von dem Harz abgespalten,
und jegliche verbleibenden Schutzgruppen werden durch Behandlung
bei sauren Bedingungen entfernt, beispielsweise mit einem Gemisch
aus Bromwasserstoffsäure
und Trifluoressigsäure
oder mit Fluorwasserstoffsäure,
oder die Abspaltung von dem Harz kann unter basischen Bedingungen
bewirkt werden, beispielsweise mit Triethylamin, wobei die Schutzgruppen
dann unter sauren Bedingungen entfernt werden.
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Das abgespaltene Peptid wird mittels
im Stand der Technik weithin bekannter Mittel isoliert und gereinigt,
beispielsweise durch Lyophilisation gefolgt von entweder einer Ausschluß- oder
Verteilungschromatographie auf Polysaccharidgelmedien wie beispielsweise
Sephadex G-25, oder durch Gegenstromverteilung. Die Zusammensetzung
des endgültigen
Peptids kann mittels Aminosäureanalyse
nach Abbau des Peptids durch Standardverfahren bestätigt werden.
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Bei der Synthese können manuelle
Verfahren verwendet werden, oder sie kann vollständig automatisiert sein, wobei
beispielsweise ein Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Foster
City, CA) oder ein Biosearch SAM II automatic peptide synthesizer
(Biosearch, Inc., San Rafael, CA) verwendet wird, wobei die in der
Bedienungsanleitung bereitgestellten Anleitungen befolgt werden
und vom Hersteller gelieferte Reagenzien verwendet werden. Disulfidbindungen
zwischen Cys-Resten
können
durch milde Oxidation des linearen Peptids durch KCN eingeführt werden,
wie in US-Patent Nr. 4,757,048 in Spalte 20 gelehrt wird.
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Salze von Carboxylgruppen des Peptids
können
auf die übliche
Weise hergestellt werden, indem das Peptid mit einem oder mehreren Äquivalenten
einer gewünschten
Base in Kontakt gebracht wird, wie beispielsweise einer metallischen
Hydroxidbase, z. B., Natriumhydroxid, einer Metallcarbonat- oder Bicarbonatbase, wie
beispielsweise Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat, oder einer
Aminbase, wie beispielsweise Triethylamin, Triethanolamin und dergleichen.
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Säureadditionssalze
der Polypeptide können
hergestellt werden, indem das Polypeptid mit ein oder mehreren Äquivalenten
der gewünschten
anorganischen oder organischen Säure
in Kontakt gebracht wird, wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure.
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Ester von Carbonylgruppen der Polypeptide
können
durch eines der üblichen
im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Umwandlung einer Carbonsäure oder
eines Vorläufers
in einen Ester hergestellt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur
Herstellung von Estern der vorliegenden Polypeptide bei Verwendung
der oben beschriebenen Merrifield-Synthesetechnik ist es, das fertige
Polypeptid in Gegenwart des gewünschten Alkohols
entweder unter basischen oder sauren Bedingungen, abhängig von
dem Harz, von dem Harz zu abzuspalten. So wird das C-terminale Ende
des Peptids bei Freisetzung von dem Harz direkt ohne Isolierung
der freien Säure
verestert.
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Amide der Polypeptide der vorliegenden
Erfindung können
ebenfalls durch im Stand der Technik zur Umwandlung einer Carbonsäuregruppe
oder eines Vorläufers
in ein Amid weithin bekannte Verfahren hergestellt werden. Ein bevorzugtes Verfahren
zur Amidbildung an der C-terminalen Carboxylgruppe ist es, das Polypeptid
mit einem geeigneten Amin von einem festen Träger abzuspalten, oder in Gegenwart
eines Alkohols abzuspalten, wobei ein Ester erhalten wird, gefolgt
von einer Aminolyse mit dem gewünschten
Amin.
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N-Acylderivate einer Aminogruppe
der vorliegenden Polypeptide können
hergestellt werden, indem eine N-Acyl-geschützte Aminosäure für die endgültige Kondensation verwendet
wird, oder indem ein geschütztes
oder ungeschütztes
Peptid acyliert wird. O-Acylderivate können beispielsweise durch Acylierung
eines freien Hydroxypeptids oder Peptidharzes hergestellt werden.
Jede Acylierung kann unter Verwendung von Standard-Acylierungsreagenzien
wie Acylhalogeniden, Anhydriden, Acylimidazolen und dergleichen
durchgeführt werden.
Die N- und O-Acylierung
können
zusammen durchgeführt
werden, wenn erwünscht.
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Weiterhin können diese Peptidsequenzen
modifiziert werden, indem ein oder zwei konservative Aminosäuresubstitutionen
der spezifizierten Positionen substituiert werden, einschließlich Substitutionen,
bei denen die D- anstelle der L-Form verwendet wird. Da diese Peptide
unter Verwendung von Standard-Festphasentechniken
synthetisiert werden können,
ist es beispielsweise nicht notwendig, die konservativen Substitutionen
auf durch Gene codierte Aminosäuren
einzuschränken.
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Die Erfindung betrifft weiterhin
modifizierte Formen der Polypeptide. Ein oder mehrere Reste dieses Polypeptids
können
verändert
werden, solange dessen Aktivität
beibehalten wird. Konservative Aminosäuresubstitutionen sind bevorzugt,
das heißt
Asparat bzw. Asparaginsäure-Glutamat
bzw. Glutaminsäure
als saure Aminosäuren,
Lysin/Arginin/Histidin als basische Aminosäuren, Leucin/Isoleucin, Methionin/Valin
als hydrophobe Aminosäuren,
Serin/Glycin/Alanin/Threonin als hydrophile Aminosäuren. Da
diese Peptide jedoch nicht durch rekombinante Verfahren oder aus
dem Gen hergestellt werden brauchen, können die Substitutionen nicht-codierte
Aminosäuren,
wie beispielsweise die D- oder beta-Aminoformen beinhalten.
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Testformate
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Das Peptid der Formel I (41–56) (SEQ
ID NO: 1) und dessen antigene Derivate und Untereinheiten sind nicht
nur als Antigen zur Herstellung der vorliegenden anti-hK2-Antikörper geeignet,
sondern können
auch immobilisiert werden und als "Einfang-Antigene" (Englisch: capture antigens) verwendet
werden, um anti-hK2-Antikörper
aus einer Probe, die auf anti-hK2-Antikörper (oder
anschließend
nach anti-PSA-Antikörpern) untersucht
werden soll, zu binden und zu immobilisieren. Der zweiwertige Komplex
aus Peptid und anti-hK2-Antikörper
wird dann detektiert, z. B. im Fall einer Probe eines humanen physiologischen
Materials durch dessen Reaktion mit einem anti-Human-IgG-Antikörper, der
eine detektierbare Markierung oder eine Bindungsstelle für eine detektierbare
Markierung umfaßt.
Im letzteren Fall wird die Bindungsstelle selbst mit einer für die Bindungsstelle
spezifischen Verbindung umgesetzt, die selbst eine detektierbare
Markierung umfaßt.
Geeignete detektierbare Markierungen beinhalten Enzyme, Radiomarkierungen
oder fluoreszierende Markierungen. Der erhaltene ternäre oder
quaternäre
Komplex wird dann über
die detektierbare Markierung detektiert und/oder quantifiziert,
d. h. über
eine Enzym-Substrat-Farbbildungsreaktion, Radioemission, Agglomeration
und dergleichen.
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Umgekehrt kann der anti-hK2-Antikörper der
vorliegenden Erfindung auf der Oberfläche eines festen Substrats
immobilisiert werden und als Einfang-Antikörper verwendet werden, der
spezifisch an hK2 in einem physiologischen Fluid binden kann. Geeignete
Substrate beinhalten teilchenförmige
Substrate wie Polystyrolkügelchen,
die Vertiefungen von Kunststoff-Mikrotiterplatten, Papier- oder
Synthesefaser-Teststreifen
und dergleichen. Der immobilisierte Antikörper kann dann mit der zu untersuchenden
Testprobe in Kontakt gebracht werden, z. B. mit einem physiologischen
Fluid wie Samen, Blutserum, Prostatagewebehomogenaten, Prostataflüssigkeit
und dergleichem. Der erhaltene binäre Antikörper-hK2-Komplex kann dann mit einem anti-hK2-Antikörper oder
mit einem bekannten anti-PSA (anti-hK3)-Antikörper detektiert werden (aufgrund
der Kreuzreaktivität
von anti-PSA-Antikörpern mit
hK2), wie beispielsweise Kaninchen-anti-PSA-Serum. Der erhaltene ternäre Komplex
wird dann unter Verwendung eines im Handel erhältlichen anti-IgG-Antikörpers, wie
beispielsweise Ziegen-anti-Kaninchen-IgG, detektiert, welcher an
den gebundenen Kaninchen-anti-PSA-Antikörper bindet, und umfaßt selbst
eine detektierbare Markierung (wie beispielsweise eine Radiomarkierung,
ein Enzym oder eine Acridiniumgruppe) oder eine Bindungsstelle für eine detektierbare
Markierung (die beispielsweise den Avidin-Biotin-Komplex bilden würde).
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Der anti-hK2-Antikörper der
vorliegenden Erfindung kann selbst chemisch an eine detektierbare
Markierung oder an eine Bindungsstelle für eine detektierbare Markierung
gekoppelt sein. Beispielsweise können die
Antikörper
radioisotopisch markiert werden (z. B. durch 125I)
oder direkt an ein Detektorenzym gekoppelt werden (z. B, alkalische
Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase), oder sie können indirekt
mit einer Bindungsstelle für
eine detektierbare Markierung, z. B. über eine Biotinylierung, markiert
werden. Der biotinylierte Antikörper
kann dann aufgrund seiner Fähigkeit,
an ein Avidin-gebundenes Enzym zu binden, detektiert werden. Wenn
der zweite Antikörper
biotinyliert ist, wird anschließend
ein mit Avidin konjugiertes Detektorenzym zugegeben. Der endgültige Schritt
zur Detektion von an monoklonale Antikörper oder an Avidin konjugierte
Enzyme ist die Zugabe eines für
das Enzym geeigneten Substrats, um eine quantitative kolorimetrische
Detektion des Reaktionsprodukts zu ermöglichen. Der Wert (abgelesen
in Einheiten der optischen Dichte) kann durch Bezugnahme auf eine
in einem Kontrolltest erzeugte Standardkurve, bei der ein Standardextrakt
von Detergens-solubilisiertem hK2 in abgestuften Konzentrationen
zu dem immobilisierten anti-hK2-monoklonalen Antikörper gegeben
wird, in fmol hK2 umgewandelt werden.
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In einem alternativen Testformat
unter Verwendung dieses Materials wird ein anti-PSA (hK3)-Antikörper als
Einfang-Antikörper verwendet,
und jegliches aus der Testprobe (mit hK3) gebundene hK2 wird durch Reaktion
des binären
Komplexes mit einem anti-hK2-Antikörper, der eine Markierung oder
eine Bindungsstelle für
eine detektierbare Markierung umfaßt, unter Bildung eines ternären Komplexes
detektiert.
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Alternativ kann das Peptid der Formel
I mit einer detektierbaren Markierung markiert werden, wie beispielsweise über ein
oder mehrere radiomarkierte Peptidylreste, die verwendet werden
können,
um mit endogenem hK2 bei der Bindung an anti-hK2-Antikörper zu konkurrieren, d. h.
als "Einfang-Antikörper", um anti-hK2-Antikörper in
einer Probe eines physiologischen Fluids über verschiedene kompetitive
Immunoassay-Formate
zu binden. Beispielsweise wird ein kompetitives Immunoassay-Format
für hK-2
verwendet, bei dem die vorliegenden immobilisierten anti-hK2-Antikörper verwendet
werden, indem:
- (a) eine Menge an anti-hK2-Antikörpern, die
an einer festen Oberfläche
beziehungsweise Festkörperoberfläche befestigt
sind, bereitgestellt wird;
- (b) die Probe des zu untersuchenden physiologischen Fluids mit
einer bekannten Menge eines Polypeptids der Formel (I), welches
eine detektierbare Markierung umfaßt, vermischt wird, um eine
gemischte Probe herzustellen;
- (c) die Antikörper
auf der Festkörperoberfläche mit
der gemischten Probe für
eine ausreichende Zeit in Kontakt gebracht werden, um das Auftreten
von immunologischen Reaktionen zwischen den Antikörpern und dem
hK2 sowie zwischen den Antikörpern
und dem markierten Polypeptid zu ermöglichen; (d) Abtrennen der
Festkörperoberfläche aus
der gemischten Probe;
- (e) Detektieren oder Bestimmen der Gegenwart oder Menge von
markiertem Polypeptid, das entweder an die Antikörper auf der Festkörperoberfläche gebunden
ist oder in der gemischten Probe verbleibt; und
- (f) Bestimmen der Gegenwart oder Menge des hK2 in der Probe
aus dem Ergebnis in Schritt e).
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In einem anderen Format, mit dem
endogenes hK2 in einer Probe durch einen kompetitiven Inhibitions-Immunoassay
detektiert werden kann, wird eine bekannte Menge anti-hK2-Antikörper zu
einer Probe gegeben, die eine unbekannte Menge an endogenem hK2
enthält.
Die bekannte Menge wird so gewählt,
daß sie niedriger
als die erforderliche Menge zur Komplexierung von sämtlichem
vermutlich vorliegenden hK2 ist, z. B. die in einer Probe der gleichen
Menge eines physiologischen Fluids aus einem Patienten vorliegen
würde,
wovon bekannt ist, daß Prostatakrebs
vorliegt. Anschließend
wird eine bekannte Menge des Polypeptids der Formel I oder einer
Untereinheit davon, die eine detektierbare Markierung umfaßt, zugegeben.
Wenn endogenes hK2 in der Probe vorliegt, werden weniger Antikörper zur
Bindung des markierten Polypeptids zur Verfügung stehen, und es wird frei
in Lösung
verbleiben. Wenn kein endogenes hK2 vorliegt, wird das zugegebene
markierte Polypeptid mit den zugegebenen anti-hK2-Antikörpern einen
Komplex bilden, wobei binäre
Komplexe gebildet werden. Anschließend werden die binären Antikörper-Antigen-Komplexe
durch einen anti-Säuger-IgG-Antikörper (Schaf,
Ziege, Maus, etc.) präzipitiert.
Die Menge an Radioaktivität
oder einer anderen Markierung in dem Präzipitat (ein ternärer Komplex)
ist umgekehrt proportional zur Menge an endogenem hK2, das in der
Probe vorliegt, beispielsweise ist ein Rückstand, der verminderte Mengen
an Radioaktivität
enthält, ein
Hinweis für
die Gegenwart an endogenem hK2.
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Die Verwendung immunometrischer Tests
beziehungsweise Assays, wobei zwei oder mehrere anti-hK2-Antiseren
kombiniert werden, sollten sowohl erhöhte Detektionsgrenzen als auch
eine bessere Spezifizität
liefern. Wenn Antiseren gegen zwei einzigartige Teile des hK2-Moleküls in einem "Sandwich"-Test verwendet werden,
wird die Kreuzreaktivität
einer verwandten Verbindung stark vermindert. Wenn mehrere Antiseren
gleichzeitig zur Immunisierung von extrahiertem hK2 verwendet werden,
kann eine größere Affinität aufgrund
möglicher
synergistischer kooperativer Wechselwirkungen erhalten werden, wie
von P. H. Ehrlich et al., J. Immunol., 131, 1906 (1983) beschrieben
wurde. Wenn weiterhin spezifische Immunoextraktionsantikörper verwendet
werden, die einzigartig an hK2 binden, könnte ein Signalantikörper verwendet
werden, der sowohl an hK2 als auch an hK3 bindet, um den erhaltenen
Komplex zu detektieren. Es kann auch ein Test entwickelt werden,
mit dem sowohl hK3 als auch hK2 unter Verwendung spezifischer anti-hK2-
und anti-hK3-Einfang-Antikörper
auf dem gleichen Träger
und ein gemeinsamer Signalantikörper
gemessen werden würden.
Wenn umgekehrt ein gemeinsamer Antikörper für den Einfang-Prozeß verwendet
wird, könnte
eine gleichzeitige Quantifizierung sowohl von hK3 als auch hK2 unter
Verwendung zweier verschiedener Signaldetektionssysteme, die an
den spezifischen anti-hK3- und anti-hK2-Antikörpern angebracht sind, erreicht
werden.
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Die anti-hK2-Antikörper der
Erfindung und die hK2-Untereinheitspeptide können in vielen anderen Testformaten
verwendet werden, wie beispielsweise kompetitiven Immunoassays,
Kügelchenagglomerationstests
und Immunoassays vom Sandwich-Typ, wie beispielsweise ELISA, wie
der Fachmann erkennen wird.
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Die hK2-spezifischen Antikörper der
Erfindung sind auch zur Isolierung von hK2 selbst in im wesentlichen
reiner Form aus Prostatagewebe oder Fluiden oder im Anschluß an die
Produktion von hK2 durch rekombinante Expressionssysteme geeignet,
z. B. unter Verwendung von Affinitätsreinigungstechniken. Reines
hK2 selbst kann dann markiert werden und in einem kompetitiven Immunoassay
verwendet werden, wenn es zu einem Fluid gegeben wird, das natives
hK2 enthält,
wie oben diskutiert wurde. Somit können diese Tests die Menge
an hK2 in einer physiologischen Probe detektieren und quantifizieren
und können
zur Bestimmung verwendet werden, in welchem Ausmaß die Bindung
im Handel erhältlicher
anti-hK3-Antikörper
an hK2 die Fähigkeit
der Antikörper
stört,
an hK3 zu binden, und so hK3 genau zu detektieren und zu quantifizieren.
Die vorliegenden anti-hK2-Antikörper
können
weiterhin dazu verwendet werden, um zu bestimmen, ob hK2-Proteinwerte
ein geeigneter Marker zur Detektion oder Bestimmung des Stadiums
von Prostatakrebs sind oder nicht.
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Monoklonale
Antikörper
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Alternativ zu den herkömmlichen
Verfahren zur Herstellung von Antikörpern im Labor und in Nutztieren können monoklonale
Antikörper
gegen hK2 unter Verwendung bekannter Hybridomzellkulturtechniken
hergestellt werden. Insbesondere beinhaltet dieses Verfahren die
Herstellung einer Antikörperproduzierenden
fusionierten Zellinie, z. B. aus primären Milzzellen, die mit einer
kompatiblen kontinuierlichen Myelomzellinie fusioniert sind, und
Züchten
der fusionierten Zellen entweder in Massenkultur oder in einer Tierart,
aus der die verwendete Myelomzellinie stammte oder die damit kompatibel
ist. Solche Antikörper
bieten viele Vorteile im Vergleich zu denjenigen, die durch Impfung
von Tieren hergestellt werden, da sie hochspezifisch und empfindlich und
immunchemisch relativ "rein" sind. Immunologisch
aktive Fragmente der vorliegenden Antikörper sind ebenfalls im Umfang
der vorliegenden Erfindung, z. B. das f(ab)-Fragment, sowie auch
teilweise humanisierte monoklonale Antikörper.
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Die vorliegenden immobilisierten
Antikörper,
markierten Antikörper,
sowie freien und markierten hK2-Untereinheitspolypeptide werden
bequemerweise in Kitform verpackt, worin zwei oder mehr der verschiedenen
Immunreagenzien separat in vorgewählten Mengen verpackt sind,
innerhalb der äußeren Verpackung des
Kits, welches eine Schachtel, eine Hülle oder ähnliches sein kann. Die Verpackung
enthält
bevorzugt weiterhin Bedienungsanweisungen, wie beispielsweise eine
gedruckte Einlage, eine Markierung, eine Haftvorrichtung, ein Kassettenband
und dergleichen, die dem Anwender bezüglich der Durchführung des
Testformats Anweisungen geben.
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Beispielsweise umfaßt ein solches
diagnostisches Kit zur Detektion oder Bestimmung von Antikörpern gegen
hK2 eine Verpackung, die separat verpackt enthält: (a) eine Festkörperoberfläche, wie
beispielsweise ein faserartiger Teststreifen, eine Mikrotiterplatte
mit vielen Vertiefungen, ein Testrohr oder Kügelchen mit einem daran gebundenem
Peptid der Formel I; und (b) markiertes anti-Human-Immunglobulin.
Eine zweite Ausführungsform
eines diagnostischen Kits zur Detektion oder Bestimmung von hK2
umfaßt
eine Verpackung, die separat verpackt enthält: (a) eine Festkörperoberfläche mit
daran gebundenen Antikörpern
gegen das Peptid der Formel I; und (b) eine bekannte Menge von (a)
spezifischen Antikörpern
gegen hK2 oder (b) Antikörpern gegen
hK2, die auch an hK3 binden, worin die Antikörper eine detektierbare Markierung
oder eine Bindungsstelle für
eine detektierbare Markierung umfassen. Eine dritte Ausführungsform
eines diagnostischen Kits zur Detektion von hK kann in verpackter
Anordnung separat verpackte Mengen umfassen, von: (a) einem hK2-spezifischen Antikörper; (b)
dem markierten Polypeptid der Formel I und (c) eines anti-Säuger-Immunglobulins.
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Die Erfindung wird weiter durch Bezugnahme
auf die folgenden ausführlichen
Beispiele beschrieben.
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Beispiel 1
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Entwicklung und Reinigung
von polyklonalen Antiseren und monoklonalen Antikörpern
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Ausgehend von der veröffentlichten
mutmaßlichen
Aminosäuresequenz
von hK2 wurde eine Reihe von Aminosäuresequenzen als mögliche Kandidaten
zur Entwicklung von Antikörpern,
die einzigartig für hGK-1
sind, identifiziert (siehe 1).
Peptide, die jeder dieser Sequenzen entsprachen, wurden durch die 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
(FMOC)-Strategie synthetisiert und durch Reverse-Phase-HPLC gereinigt.
Diese Peptide wurden dann zur Bestimmung ihrer Struktur sequenziert.
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Peptide (41–56 und 153–167) wurden an Keyhole Limpet
Hemocyanin (KLH) konjugiert. Schafe, Mäuse oder Ziegen wurden mit
100 μg konjugiertem
Peptid in vollständigem
Freund-Adjuvans (CFA) immunisiert (Peptide von 41–56 und
153–167
in jeweils ein Schaf, s. c., Peptide 8–26, 15–26, 43–66, 153–167 und 210– 235 jeweils
in eine Ziege, s. c., und Peptide 8–26, 15–26, 41– 56, 43–66, 153–167 und 210–235 in
jeweils vier Mäusen
s. c.) und in dreiwöchigen
Intervallen mit 100 μg
Peptid in nicht-vollständigem Freund-Adjuvans
(IFA) auffrischungsgeimpft. Anschließend wurden 5 Ziegen und 24
Balb/c-Mäuse
mit diesen Peptiden immunisiert. Eine Kombination von KLH-konjugiertem
Peptid (100 μg)
plus freiem Peptid (100 μg)
wurde für
dieses zweite Immunisierungsprogramm verwendet.
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Nach den ersten drei Immunisierungen
wurde das Blut der Tiere 6 bis 10 Tage nach jeder Immunisierung
auf Antikörper
getestet. Peptide wurden auf 0,25 Inch Polystyrolkügelchen
(Clifton, Clifton Heights, Pa.) immobilisiert, indem 1 μg des Peptids
(konjugiert an Bovines Serum Albumin (BSA)) pro Kügelchen
in einem Carbonatpuffer mit pH 9,6 über Nacht bei 4°C inkubiert
wurde. Die Kügelchen
wurden dann dreimal mit 0,01 M Phosphat-gepuffertem Kochsalz (PBS),
pH 7,4 mit 0,1% Tween 20 gewaschen und mit 1% entrahmter Milch plus
1% BSA blockiert. Diese Kügelchen
wurden 18 Stunden bei 4°C
mit 250 μl
von 1 : 100, 1 : 1000 und 1 : 10.000 Verdünnungen der Tierseren inkubiert.
Nach dreimal Waschen wurden 250 μl
Kaninchen-anti- Schaf, anti-Maus
oder anti-Ziegen-Antikörper,
konjugiert an Meerrettich-Peroxidase (Cappel-Organon Teknica Corporation,
Durham, NC), mit jedem Kügelchen
für 3 h
auf einem horizontalen Inkubator bei 150 UpM inkubiert. Das Enzymsignal
wurde spektrophotometrisch unter Verwendung von Orthophenylendiamin
als Substrat quantifiziert. Nicht-Immunseren wurden als Negativkontrolle
verwendet, und die Immunserummessungen wurden als Vielfache der
Kontrollablesewerte ausgedrückt.
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Lymphozyten aus der Milz von Mäusen mit
positiven Serumtitern wurden mit Myelomzellen zur Erzeugung von
Hybridomzellen fusioniert. Durch Klone dieser Zellen hergestellte
Antikörper
wurden wie oben beschrieben gescreent. Positive Klone wurden durch
Grenzverdünnung
subkloniert und wieder gescreent. Monoklonale Hybridome wurden in
die Peritonealhöhlen
von Pristin-behandelten Mäusen
injiziert, um eine Aszitesflüssigkeit
zu erhalten.
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Sowohl die polyklonalen (Schaf und
Ziege) als auch die monoklonalen Antiseren wurden vor deren Verwendung
in Immunoassays gereinigt. Beide Antiseren-Typen wurden zunächst einer
IgG-Trennung durch Präzipitation
mit gesättigtem
Ammoniumsulfat und einer Größenausschlußchromatographie
unter Verwendung einer Ultragel ACA-34-Säule unterzogen. Die polyklonalen
Antiseren wurden weiter unter Verwendung von Säulen affinitätsgereinigt,
die durch Cyanogenbromid-Kopplung der Peptide an Sepharose 4B hergestellt wurden.
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Der gereinigte Antikörper wurde
mit saurem PBS (pH 2,45) aus den Säulen eluiert.
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Tabelle II faßt die für Antiseren und für monoklonale
Antikörper
entwickelten Daten zusammen, wobei ein Signal von mindestens dem
Zweifachen des Vorimmunisierungswerts erhalten wurde. Die besten
Anfangsantiseren wurden in Schafen mit dem hK2 (41–56)-Peptid
erzeugt. Diese Antiseren wurden am umfassendsten bewertet. Unter
den anderen Antiseren ergaben diejenigen gegen hK2 (210–235) die
höchste
Immunreaktivität.
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TABELLE
II
Antiseren gegen hK2
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2 zeigt
eine Dot-Blot-Analyse von anti-hK2 gegen hK2- und hK3("PSA")-spezifische
Peptide. hK3 14–27
und hK3 41–56
sowie hK3 153–167
wurden aus dem hK3-Polypeptid abgeleitet und sind homolog mit gleichen
Bereichen des hK2-Proteins. Diese Peptide wurden in H2O
gelöst
und auf Nitrocellulose membranen bei den angegebenen Konzentrationen
geblottet. Ein aus Schafen, in welche das mit Hämocyanin konjugierte hK2 41– 56-Peptid
injiziert wurde, erhaltenes Antiserum wurde auf seine Spezifität und den
Titer untersucht. Die Reaktion des primären Antikörpers mit den Peptiden auf
Nitrocellulosemembranen wurde durch alkalische Phosphatase detektiert,
die mit einem anti-Schaf-IgG-Antikörper konjugiert war. Diese
Daten zeigen, daß dieses
anti-hK2-Antiserum eine geringe Kreuzreaktivität mit hK3 aufweist.
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Beispiel 2
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Kompetitive Immunoassays
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Acridinium-N-hydroxysuccinimidester
(London Diagnostics, Eden Prairie, MN) wurde an die Amingruppe der
Lysinreste von BSA-Peptidkonjugaten
angebracht. Die Kopplungsreaktion wurde unter Verwendung von 20
g/L Lysinmonohydrochlorid abgeschreckt. Das nicht umgesetzte AE
wurde durch Größenausschlußchromatographie
unter Verwendung einer Sephadex G-25-Säule
entfernt, gefolgt von einer Dialyse. Die BSA-Peptidkonjugate wurden
mit EDC (Pierce, Rockford, IL) unter Verwendung gleicher Gewichte
von EIA-gradigem BSA und Peptid verbunden.
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Eine Titerkurve wurde zunächst erzeugt,
indem verschiedene Verdünnungen
des gereinigten Schaf-anti-hK2 (41–56)-Antikörpers mit dem AE-markierten
BSA-Peptidkonjugat inkubiert wurden. Die Inkubationsdauer betrug
15 Stunden bei 20°C.
Die Komplexe aus gebundenem Antikörper-Markierung wurden mit Esel-anti-Schaf-Antiseren
ausgefällt,
und das Signal in dem isolierten Präzipitat wurde unter Verwendung
von Chemilumineszenz quantifiziert.
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3 zeigt
die Titerkurve des Affinitäts-gereinigten
Schaf-hGK-1 (41–56)-Antikörpers (O)
unter Verwendung von nicht-immunen Schafseren als Kontrolle (Δ). Bei einer
Antikörperverdünnung von
1 : 7000 beträgt
die Bindung des AE-markierten
Peptids an den Antikörper
etwa die Hälfte
des Maximums.
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Anschließend wurden Tests basierend
auf der kompetitiven Bindung der Schaf-Antiseren an das entsprechende
Acridiniumester(AE)-markierte Peptid gegenüber dem unmarkierten Peptid
entwickelt. Zusätzlich zur
Verdrängung
des nicht-markierten
Peptids wurden Verdrängungskurven
für die
Verdrängung
des hK2 (41–56)-AE-Peptid-BSA-Konjugats
von einer festgelegten Menge an Schaf-anti-hK2 (41–56) sowohl
durch das Prostata-spezifische Antigen (hK3) und durch hK2-Typmaterial,
das aus Samenfluid immunextrahiert war, erstellt. Komplexe, die
sich nach Kombinieren des Antikörpers
mit markiertem hK2 (41–56)
und dem konkurrierenden Antigen bilden, werden präzipitiert,
und die Menge an Markierung im Präzipitat nimmt ab mit Steigerung der
Fähigkeit
des Testantigens, markiertes hK2 (41–56) zu verdrängen. Der
Samenfluidextrakt wurde unter Verwendung einer Immunaffinitätssäule erhalten,
hergestellt durch Kopplung von gereinigtem Schaf-anti-hK2 (41–56) an
eine AminolinkTM-Säule (Pierce, Rockford, IL).
Das immunreaktive Material wurde mit 0,1 M Glycin, pH 2,8, eluiert
und mit 1 M Tris, pH 10 neutralisiert.
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Die als (⧠) in 4 gezeigte kompetitive Verdrängungskurve
für hK2
(41–56)
zeigt, daß geringe
Mengen dieses Peptids die Markierung verdrängen können. Basierend auf einer Verdrängung von
20% (80% B/Bo) beträgt
die minimale Nachweisgrenze des kompetitiven Tests etwa 0,03 ng/Röhrchen an
hK2 (41–56).
Die Kreuzreaktivität
des entsprechenden hK3 (41–56)-Peptids
beträgt
weniger als 0,1% (Δ).
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4 zeigt
außerdem,
daß das
aus Samenfluid immunextrahierte Material (*) die an die Schaf-anti-hK2-Seren
gebundene hK2 (41–56)-Markierung
verdrängen
kann. Dies zeigt, daß dieses
Material immunreaktiv ist. Die offenen Kreise (O) zeigen, daß die Verdrängung mit
gereinigtem hK3 (Scripps Laboratories, San Diego, CA) minimal ist.
Das immunextrahierte Material, selbst in nicht-gereinigter Form,
ist reaktiver als gereinigtes hK3 (Δ), jedoch nicht so reaktiv wie
das hK2-Peptid (⧠)
auf Gewichtsbasis. Das hK2-Peptid ist jedoch nur aus 16 Aminosäuren aufgebaut,
wohingegen hK2 und hK3 Polypeptide mit 237 Aminosäuren sind.
Auf Gewichtsbasis würde
man also erwarten, daß das
Peptid etwa 15-mal reaktiver ist. Das entsprechende hK3-Untereinheitspolypeptid
(41–56)
konnte die AE-hK2 (41–56)-Markierung
(Δ) im wesentlichen
nicht verdrängen (Kreuzreaktivität ca. 1%),
wohingegen hK2 (41–56)
selbst auch bezüglich
der Verdrängung
der hK2 (41–56)-Markierung
(⧠) wirksam war. Die immunreaktive Substanz aus dem Samenfluid
unterscheidet sich daher von hK3 und ist wahrscheinlich hK2.
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Diese Daten zeigen die Verwendbarkeit
von synthetischen hK2-Peptiden,
die auf den vermuteten Sequenzen basieren, die aus hK2-cDNA abgeleitet
sind, zur Bildung von anti-hK2-Peptid-Antikörpern. Die Antikörper sind
spezifisch gegen die hK2-Peptide
und erkennen Peptide des homologen Bereichs in hK3 nicht. Eine Peptidaffinitätssäule wurde
zur Reinigung eines Antikörpers
verwendet, der einen Bestandteil in humanem Seminalplasma erkennt,
der nicht hK3 (PSA) war. Durch die vorliegende Erfindung wird daher
ein Test für hK2
in humanem Seminalplasma bereitgestellt, der zum Test auf hK2 in
Humanblutserum und in anderen Fluids geeignet sein sollte.
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Die Erfindung wurde mit Bezug auf
verschiedene spezifische und bevorzugte Ausführungsformen und Verfahren
beschrieben. Es versteht sich jedoch, daß viele Abwandlungen und Modifikationen
vorgenommen werden können,
wobei man im Umfang der durch die Ansprüche definierten Erfindung bleibt.
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