DE69011613T2

DE69011613T2 - Monoklonaler Antikörper gegen Kern-hCG-beta, seine Herstellung und Verwendung.

Info

Publication number: DE69011613T2
Application number: DE69011613T
Authority: DE
Inventors: Makoto Katsuno; Kiyoshi Kobayashi; Takahisa Kobayashi
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1989-10-04
Filing date: 1990-10-04
Publication date: 1995-01-26
Anticipated expiration: 2010-10-05
Also published as: CA2025266A1; US5501988A; EP0421392A1; ATE110109T1; ES2057307T3; EP0421392B1; DE69011613D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper zum Erkennen des Kernfragments der menschlichen Choriongonadotropin-β-Untereinheit (nachstehend als hCG-β-Kern bezeichnet) und die Untereinheit selbst und bezieht sich auf den monoklonalen Antikörper. Weiter bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein immunchemisches Bestimmungsverfahren mittels des monoklonalen Antikörpers und ein Reagenz zur Bestimmung.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Das menschliche Choriongonadotropin (nachstehend als hCG abgekürzt) ist eine Art Proteinhormon, das aus bei Schwangerschaft gebildeten Trophoblastenzellen erzeugt wird und die Ausscheidung von Progesteron fördert. Der Nachweis von hCG wird im allgemeinen für eine erste Schwangerschaftsdiagnose verwendet. Weiter ist bei Chorionerkrankungen, wie etwa Blasenmole, destruktive Mole, Chorionkarzinom und dergleichen, gefunden worden, daß die Bestimmung von hCG in Körperflüssigkeiten, wie etwa Urin, Blut und dergleichen, unter den Gesichtspunkten einer frühen Entdekkung, der Beurteilung therapeutischer Wirkungen und der prognostischen Kontrolle dieser Erkrankungen von äußerster Bedeutung ist. Um diese Krankheiten zu diagnostizieren ist es jedoch notwendig, eine sehr geringe Menge hCG, wie etwa 100 IE/Liter oder weniger, zu bestimmen. In diesem Zusammenhang sind immunologische Überkreuzreaktionen mit Proteinhormonen ein Problem, die Strukturen besitzen, welche derjenigen von hCG ähnlich sind, nämlich das luteinisierende Hormon (nachstehend manchmal als hLH abgekürzt, follikelstimulierende Hormon (nachstehend manchmal als hFSH abgekürzt) und Thyroidea-stimulierendes Hormon (nachstehend manchmal als hTSH abgekürzt). Insbesondere besitzt hLH eine sehr hohe Ähnlichkeit zu hCG und die hLH-Konzentration im Urin erreicht manchmal in Abhängigkeit von den physiologischen Bedingungen 150 IE/Liter. Um hCG in einer kleinen Menge Körperflüssigkeit zu bestimmen, ist es daher notwendig hCG immunologisch von hLH zu unterscheiden.
Auf der anderen Seite ist der chemischen Analyse dieser Proteinhormone entsprechend gefunden worden, daß die Überkreuzreaktivität auf ihre jeweiligen α-Untereinheitsteile zurückzuführen ist, die viele gemeinsame Strukturen besitzen. So sind Versuche unternommen worden, hCG durch Isolieren und Reinigen der β- Untereinheit von hCG (nachstehend manchmal als hCG-β abgekürzt), die verhältnismäßig wenig Ähnlichkeit besitzt, und Erzeugen eines anti-hCG-β-Antikörpers spezifisch nachzuweisen.
Die Überkreuzreaktivität gegenüber hLH kann jedoch durch Verwenden des anti-hCG-β-Antikörpers nicht vollständig ausgeschaltet werden, da es in den β-Untereinheiten sowohl von hCG als auch hLH eine gemeinsame Aminosäurensequenz gibt. Auf der anderen Seite besitzt ein am C-Ende von hCG-β gelegenes Peptid, das aus etwa 30 Aminosäuren zusammengesetzt ist, eine Aminosäurensequenz, die in hLH nicht vorliegt, und es ist möglich geworden, hCG von hLH durch Verwenden dieses Teils vollständig zu unterscheiden. Ein Antikörper gegen die Region am C-Ende von hCG-β reagiert nur mit hCG-β und er geht keine Überkreuzreaktion mit hLH ein. Weiter ist zuvor bei Untersuchungen an hCG-β vermutet worden, daß eine hCG-β-Kernregion (nachstehend manchmal als β- Kern abgekürzt) vorhanden sein muß. Es ist nämlich gezeigt worden, daß der β-Kern ein Glycoprotein ist, das aus zwei Peptiden zusammengesetzt ist, die über eine Disulfidbindung(en) an einander gebunden sind, wovon ein Peptid aus dem 6. bis 40. Aminosäurerest der menschlichen Choriongonadotropin-β-Untereinheit (hCG-β) zusammengesetzt ist und das andere aus dem 55. bis 92. Aminosäurerest von hCG-β zusammengesetzt ist, und ein Molekulargewicht von 12 bis 17 Kilodalton besitzt (Endocrinology 123 572, 1988) und im Urin von Patienten mit nicht nur obstetrischen und gynäkologischen malignen Tumoren, wie etwa Eierstockkrebs, Cervixkrebs oder Gebärmutterkrebs, sondern auch verschiedenen malignen Tumoren, wie Magenkrebs, Nierenkrebs und dergleichen, vorhanden ist [J. Clin. Endocrinol. Metab., 53 1014, 1981; Cancer 45 2583, 1980; Acta Endocrinol. (Copenh) 112 415, 1986]. Es gibt jedoch keine anerkannte Theorie für seine Produktion, Ausscheidung und physiologische Bedeutung und es gibt kein biologisches Bestimmungsverfahren des β-Kerns. Obschon ein Radioimmuntest (RIA) mittels eines SB6 bezeichneten, polyklonalen anti-hCG-β-Antikörpers als immunologisches Bestimmungsverfahren eingeführt worden ist (Am. J. Obstet. Gynecol. 113 751, 1972), kann ein β-Kern nicht von menschlichem, Choriongonadotropin und hCG-β unterschieden werden, weil es keinen Unterschied zwischen der Affinität des Antikörpers zu einem β-Kern und derjenigen zu menschlichem Choriongonadotropin und hCG-β gibt.
Kürzlich sind die monoklonalen Antikörper B202 und B204 zum Erkennen eines β-Kerns mittels eines β-Kerns als Immunogen hergestellt worden (Endocrinology 123 584, 1988) und der Radioimmuntest eines β-Kerns ist berichtet worden (Cancer Res. 48 1361, 1988; Cancer Res. 48 1356, 1988).
SB6 ist jedoch ein polyklonaler Antikörper und wenn der Antikörper in einem Radioimmuntest verwendet wird, besitzt er eine ähnliche Affinität zu einem β-Kern, hCG und hCG-β und besitzt etwa 10% Überkreuzreaktivität gegenüber hLH.
B202, B204 und dergleichen sind monoklonale Antikörper, die durch Immunisieren mit einem β-Kern erhalten wurden. A. Krichevsky et al. haben mehrere monoklonale Antikörper gegen einen β-Kern hergestellt und haben ihre Eigenschaften in Endocrinology 123 584-593, 1988 berichtet. In diesem Artikel haben sie jedoch klar beschrieben, daß kein Antikörper gegen einen β-Kern im Fall des Verwendens von hCG-β als Immunogen erhalten worden ist.
Auf der anderen Seite ist auf dem Gebiet klinischer Tests ein neuer monoklonaler Antikörper gegen einen β-Kern mit einer hohen Affinität gefordert worden, der einen hochempfindlichen Test ermöglicht.
Außerdem ist das Testsystem bei dem herkömmlichen RIA eines β- Kerns nur zum Bestimmen einer Urinprobe aufgebaut und es ist zum Bestimmen einer humoralen Gewebeflüssigkeit, einer Gewebeextraktsflüssigkeit und eines Gewebekulturüberstands unzureichend, die zum Untersuchen sowohl der Biosynthese, Ausscheidung, Verteilung, Metabolismus und physiobiologischer Wirkungen eines β- Kerns als auch der Beziehung zu Krankheiten und dergleichen wesentlichen sind.

GEGENSTÄNDE DER ERFINDUNG

Die Erfinder haben gefunden, daß im Unterschied zu monoklonalen Antikörpern, die durch das herkömmliche Verfahren zum Herstellen eines monoklonalen anti-β-Kern-Antikörpers hergestellt wurden, ein durch Immunisieren eines Tieres mit hCG-β als Immunogen und Ausführen einer Zellfusion erhaltener monoklonaler Antikörper nicht mit hCG und anderen Proteinhormonen mit ähnlichen Strukturen reagiert, aber einen β-Kern und hCG-β erkennt, und fanden weiter, daß die Verwendung des monoklonalen Antikörpers als diagnostisches Mittel von äußerster Wichtigkeit ist.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein neues Hybridom bereitzustellen, das einen neuen monoklonalen Antikörper zum Erkennen eines hCG-β-Kerns und hCG-β produziert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, den neuen monoklonalen Antikörper bereitzustellen.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein immunchemisches Bestimmungsverfahren mittels des neuen monoklonalen Antikörpers bereitzustellen.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Reagenz zur Bestimmung mittels des neuen monoklonalen Antikörpers bereitzustellen.
Sowohl diese Aufgaben als auch andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann aus der folgenden Beschreibung unter Bezug auf die begleitenden Zeichnungen deutlich.

KURZE ERLÄUTERUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, welche die Reaktivität des monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung gegenüber einem β-Kern ( ), hCG-β ( ), hCG ( ) und verschiedenen Glykoproteinhormonen veranschaulicht.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, welche sowohl die Standardkurve eines durch das Reagenz der vorliegenden Erfindung erhaltenen β-Kerns ( ) als auch die Überkreuzreaktivität mit hCG-β ( ) und die Überkreuzreaktivität gegenüber verschiedenen Glycoproteinhormonen des Reagenzes der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
Fig. 3 stellt die durch Bestimmen des Urins von Patienten mit obstetrischen und gynäkologischen Krankheiten erhaltenen Ergebnisse dar.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden bereitgestellt:
(1) das Hybridom 229, das die Zugangsnummer FERM BP-2614 besitzt und zum Produzieren eines monoklonalen Antikörpers zum Erkennen der hcG-β-Kernregion und der hCG-β-Untereinheit fähig ist, welches durch Fusion einer Milzzelle einer mit der hCG-β- Untereinheit immunisierten Maus und einer Mäuse-Myelomzellinie erhalten wird;
(2) ein monoklonaler Antikörper, der von dem Hybridom gemäß (1) vorstehend produziert wird, und
(3) ein immunologisches Bestimmungsverfahren, welches das Erkennen und Messen einer Substanz umfaßt, die mit dem monoklonalen Antikörper aus (2) vorstehend durch Verwenden des monoklonalen Antikörpers immunologisch reagieren kann. Beispiele einer derartigen Substanz schließen diejenigen ein, welche eine β-Kernregion und/oder hCG-β-Untereinheit enthalten, die durch den monoklonalen Antikörper erkannt werden können, wie etwa der β-Kern selbst, hCG-β und dergleichen.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Ein zur Herstellung des Hybridoms der vorliegenden Erfindung zu verwendendes hCG-ß kann durch ein bekanntes Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel kann hCG-ß durch Reinigung aus konzentriertem und gereinigtem hCG aus Urin schwangerer Frauen gemäß dem von F.J. Morgan et al., Endocrinology 88 1045-1053, 1971, beschriebenen Verfahren erhalten werden. Genauer wird natürlich vorkommendes hCG zum Beispiel durch sein Lösen in 10 M Harnstoff in hCG-α und hCG-β- dissoziiert und das Gemisch wird auf eine mit DEAE-Sephadex A-25 gepackte Säule unter Erhalten einer hCG-β-Fraktion aufgebracht.
Bei der Immunisierung können hCG-β, ein durch Binden von hCG-β an einen Polymerträger erhaltenes Produkt oder beide als Immunogen verwendet werden.
Das Binden zwischen dem Peptid und einem hier verwendeten Polymerträger kann durch das herkömmliche Verfahren (z.B. Hormone and Metabolic Research 8, 241, 1976) gebildet werden. Beispiele eines zum Binden zu verwendenden Reagenzes schließen Glutaraldehyd, wasserlösliches Carbodiimid und dergleichen ein. Beispiele des Polymerträgers schließen Rinderthyroglobulin, Rinderserumalbumin, Rindergammaglobulin, Hämocyanin und dergleichen ein. Das Verhältnis des Peptids zu dem Polymerträger beträgt vorzugsweise 1 : 1 bis 1 : 4 und in vielen Fällen können gute Ergebnisse durch Durchführen der Reaktion in einem neutralen pH-Bereich, insbesondere bei etwa pH 7,3 erhalten werden. Weiter können in vielen Fällen gute Ergebnisse durch Durchführen der Reaktion während 2 bis 6 Stunden, insbesondere 3 Stunden, erhalten werden. Das auf diese Weise erhaltene Produkt kann durchs sein Dialysieren gegen Wasser bei etwa 4ºC gemäß dem herkömmlichen Verfahren und anschließend Einfrieren oder Lyophilisieren gelagert werden.
Als Milzzelle wird vorzugsweise die durch Hyperimmunisieren einer Maus mit einem Antigen erhaltene verwendet. Als Maus- Myelomzellinie kann vorzugsweise die mit ausgezeichneter Zellfusionswirksamkeit, Vermehrungseigenschaften und dergleichen, insbesondere ein Myelom mit einem Marker, wie etwa ein Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase-Defekt (HGPRT&supmin;) oder Thymidin-Kinase-Defekt (TK&supmin;) [z.B. P3-X 63-Ag 8, Ul (Ichimori et al., Journal of Immunological Method 80 55, 1985), P3-X63-Ag8- 6.5.3 (Shulman, M. et al., Nature 276, 269, 1978), die Maus-Myelom-Zelle SP2/0-Ag14 (SP2), Nature 276 269, 1978] oder dergleichen, verwendet werden.
Zum Immunisieren einer Maus kann jeder Weg eingesetzt werden, wie etwa subkutan, intraperitoneal, intravenös, intramuskulär, intrakutan oder dergleichen. Insbesondere ist die subkutane, intraperitoneale oder intravenöse Injektion, besonders die subkutane Injektion bevorzugt. Weiter können die Intervalle zur Impfung, die Impfmengen und dergleichen verändert werden und es können verschiedene Verfahren eingesetzt werden. Zum Beispiel kann ein Immunogen alle zwei Wochen 2 bis 8 Mal eingeimpft werden und 1 bis 5 Tage, vorzugsweise 2 bis 4 Tage nach der letzten Immunisierung entnommene Milzzellen können geeigneterweise verwendet werden. Die gewünschte Impfmenge beträgt 0,1 ug oder mehr, vorzugsweise 10 bis 100 ug als hCG-β Menge je Beimpfung je Maus.
Es ist bevorzugt, vor der Entnahme der Milz ein teilweises Ausbluten auszuführen, um die Zunahme des Antikörpergehalts im Blut zu bestätigen, gefolgt von der Zellfusion.
Die Zellfusion zwischen einer Maus-Milzzelle und einer Maus- Myelomzellinie kann zum Beispiel durch Fusionieren der Milzzellen einer immunisierten Maus mit einer Myelomzellinie mit einem Marker, zum Beispiel ein Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribesyl- Transferase-Defekt (HGPRT&supmin;) oder Thymidin-Kinase-Defekt (TK&supmin;) [z.B. P3-X 63-Ag 8, Ul (Ichimori et al., Journal of Immunological Method 80 55, 1985), P3-X63-Ag8-6.5.3 (Shulman, M. et al., Nature 276, 269, 1978), die Maus-Myelom-Zelle SP2/0-Ag14 (SP2), Nature 276 269, 1978] oder dergleichen, ausgeführt werden. Zur Zellfusion kann ein Mittel zur Fusion, wie etwa HVJ(Sendai)- Virus, Polyethylenglykol (PEG) oder dergleichen, verwendet werden. Es ist selbstverständlich möglich, ein fusionsförderndes Mittel, wie etwa Dimethylsulfoxid (DMSO) und dergleichen, zuzusetzen. Üblicherweise wird PEG mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1000 bis 10000, vorzugsweise 1000 bis 6000, eine Reaktionszeit von 0,5 bis 30 Minuten und eine Konzentration von 10 bis 80% und dergleichen eingesetzt. Als ein Beispiel bevorzugter Bedingungen wird die Zellfusion durch Behandlung mit PEG 6000 in einer Konzentration von 35 bis 55% während 4 bis 10 Minuten durchgeführt. Fusionierte Zellen (Hybridome) können durch Verwenden eines Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-Mediums (HAT-Medium, Nature 256 495-497, 1975) oder dergleichen selektiv vermehrt werden.
Mausserum und ein Kulturüberstand der sich daraus ergebenden Zellen kann auf die Fähigkeit zum, Produzieren des gewünschten Antikörpers gescreent werden. Ein Screening auf den Antikörpergehalt kann wie folgt ausgeführt werden. Obschon das Screening durch einen Radioimmuntest (RIA), Enzymimmuntest (EIA) und dergleichen ausgeführt werden kann, sind verschiedene Abänderungen dieser Tests möglich. Als bevorzugtes Beispiel dieser Tests wird nachstehend ein Verfahren gemäß einem EIA veranschaulicht. Ein anti-Maus-Immunglobulin wird gemäß dem herkömmlichen Verfahren an einer festen Phase immobilisiert (es ist zum Beispiel vorteilhaft, eine Mikrotiterplatte mit 96 Näpfchen als feste Phase zu verwenden, da die Messung schnell mit einer Multiscanapparatur oder dergleichen ausgeführt werden kann) und der (die) zu messende(n) Kulturüberstand (Kulturüberstände) oder Mausseren werden der festen Phase zugesetzt, um sie bei konstanter Temperatur (nachstehend bedeutet dies 4 bis 40ºC) während eines vorbestimmten Zeitraums umzusetzen. Anschließend wird das Reaktionsprodukt gründlich gewaschen und hCG-β oder ein mit einem Enzym markierter β-Kern wird hinzugesetzt. Das Gemisch wird bei konstanter Temperatur über einen vorbestimmten Zeitraum umgesetzt. Nach gründlichem Waschen des Reaktionsprodukts wird ein Substrat für das Enzym zugesetzt und sie werden bei konstanter Temperatur über einen vorbestimmten Zeitraum umgesetzt. Anschließend wird ein produziertes Material mittels seiner Absorption, Fluoreszenzintensität oder dergleichen gemessen. Vorzugsweise werden Zellen in Näpfchen, die sich in einem selektiven Medium vermehren und Antikörperaktivitäten gegen einen β- Kern zeigen, durch Grenzverdünnung und dergleichen kloniert. Ein Überstand der klonierten Zellen wird einem ähnlichen Screening unterzogen, um die Zahl der Zellen in Näpfchen mit einem hohen Antikörpergehalt zu erhöhen. Dadurch kann ein Hybridom-Klon erhalten werden, der den gewünschten monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung (Hybridom 229) produziert.
Der monoklonale anti-hCG-β-Kern-Antikörper der vorliegenden Erfindung kann durch Vermehren des auf diese Weise klonierten Hybridoms 229 in einem flüssigen Medium oder in der Bauchhöhle eines Säugers erhalten werden. Der monoklonale Antikörper kann zum Beispiel aus einem Kulturmedium erhalten werden, das sich aus der Kultivierung der Zellen in einem flüssigen Medium, wie etwa dasjenige, das durch Zufügen von 0,1 bis 40% Rinderserum zu RPMI-1640 während 2 bis 10 Tagen, vorzugsweise 3 bis 5 Tagen, erhalten wurde, ergab. Außerdem kann eine große Menge des Antikörpers mit einem viel höheren Gehalt im Vergleich mit dem aus einem Überstand einer Zellkultur erhaltenen durch Einimpfen der Zellen in die Bauchhöhle eines Säugers, wie etwa einer Maus oder dergleichen, unter Vermehren der Zellen und Sammeln der Aszitesflüssigkeit erhalten werden. Im Falle einer Maus werden zum Beispiel 1 x 10&sup4; bis 1 x 10&sup7; Zellen, vorzugsweise 5 x 10&sup5; bis 2 x 10&sup6; Zellen des Hybridoms in die Bauchhöhle oder dergleichen einer BALB/c-Maus oder dergleichen eingeimpft, in welches ein Mineralöl oder dergleichen eingeimpft wurde, und nach 7 bis 20 Tagen, vorzugsweise 10 bis 14 Tagen, wird die Aszitesflüssigkeit oder dergleichen gesammelt. Der erzeugte und in der Aszitesflüssigkeit zurückgehaltene Antikörper kann leicht durch zum Beispiel Ammoniumsulfat-Fraktionierung, DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie, Protein-A-Sepharose-Säulenchromatographie und dergleichen unter Erhalten des monoklonalen Antikörpers als reines Immunglobulin isoliert und gereinigt werden.
Der monoklonale anti-hCG-β-Kern-Antikörper der Erfindung besitzt die folgenden Eigenschaften:
(1) er besitzt eine Reaktivität gegenüber dem β-Kern;
(2) er besitzt eine Reaktivität gegenüber hCG-β;
(3) er besitzt eine Reaktivität gegenüber dem Urin eines menschlichen Patienten mit Krebs in hoher Wahrscheinlichkeit;
(4) er besitzt eine Reaktivität gegenüber dem Serum eines Menschen mit Krebs in hoher Wahrscheinlichkeit und
(5) seine Antikörperklasse ist IgG1.
Der zum nachstehend beschriebenen Nachweis und Bestimmung zu verwendende Antikörper kann eine Fraktion sein und Beispiele der Fraktion schließen Fab, Fab', F(ab')&sub2; und dergleichen ein.
Der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung ist zum Diagnostizieren von Krebs mittels Erkennung der β-Kernregion in einem System, das immunchemische Techniken verwendet, wie etwa EIA, ELISA, RIA und dergleichen, sehr nützlich.
Im allgemeinen können diese immunchemischen Techniken in die folgenden Klassen aufgeteilt werden:
(1) Kompetitives Verfahren: eine Probelösung, die eine unbekannte Menge eines Antigens und eine vorbestimmte Menge eines mit einem Markierungsmittel markierten Antigens enthält, wird mit einer vorbestimmten Menge des entsprechenden Antikörpers kompetitiv umgesetzt. Anschließend wird die Aktivität des Markierungsmittels, das an den Antikörper gebunden oder nicht gebunden ist, bestimmt.
(2) Sandwich-Verfahren: einer Probelösung, die eine unbekannte Menge Antigen enthält, wird eine überschüssige Menge Antikörper zugesetzt, der auf einem Träger festgehalten wird, um sie (erste Reaktion) umzusetzen, und eine vorbestimmte, überschüssige Menge eines mit einem Markierungsmittel markierten Antikörpers wird dem Reaktionsgemisch zugesetzt, um sie umzusetzen (zweite Reaktion). Die Aktivität des Markierungsmittels, das auf dem Träger festgehalten oder nicht festgehalten wird, wird bestimmt. Die erste und zweite Reaktion können gleichzeitig oder getrennt durchgeführt werden.
Bei dem immunologischen Bestimmungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann entweder (1) oder (2) eingesetzt werden. Das Verfahren gemäß dem Sandwich-Verfahren (2) ist jedoch wirkungsvoller. Bei dem Sandwich-Verfahren sollte sich die Antigenbestimmungsstelle des ursprünglich auf dem Träger festgehaltenen Antikörpers nicht mit derjenigen des an das Markierungsmittel gebundenen Antikörpers überlappen. Ein Antikörper sollte der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung sein, der mit dem β-Kern reagieren kann. Der andere Antikörper kann ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein, solange er mit hCG-β reagieren kann. Der Antikörper, der mit hCG-β reagieren kann, kann durch ein bekanntes Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel kann er im Fall eines polyklonalen Antikörpers durch mehrmaliges Immunisieren eines Säugers wie etwa eines Kaninchens oder dergleichen mit einem Komplex aus hCG-β und einem Trägerprotein als Immunogen und Reinigen des sich daraus ergebenden Antiserums durch eine Affinitäts-Säulenchromatographie mit immobilisiertem hCG-β unter Erhalten eines anti-hCG-β-Antikörpers hergestellt werden.
Zur Reinigung des β-Kerns, der zum Markieren oder zur Standardisierung verwendet wird, kann die herkömmliche Weise angewandt werden. Wie in Endocrinology 123 572-583, 1988, beschrieben, kann ein β-Kern aus im Handel erhältlichem, teilweise gereinigtem hCG durch sein Unterziehen der Gelchromatographie und Immunaffinitätschromatographie erhalten werden.
Beispiele einer Probe aus einem Patienten, die dem Nachweis und der Bestimmung der vorliegenden Erfindung unterzogen werden soll, schließen sowohl Körperflüssigkeiten, wie etwa Serum, Urin, Rückenmarksflüssigkeit und dergleichen, als auch in einigen Fällen Gewebe und ihre Extrakte und dergleichen ein.
Nachstehend wird als ein Beispiel des Bestimmungsverfahrens der vorliegenden Erfindung entsprechend einem EIA ein Verfahren unter Verwenden von Peroxidase als Markierungsmittel im einzelnen veranschaulicht. Das Bestimmungsverfahren der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf dasjenige beschränkt, das Peroxidase verwendet.
(1) Zuerst wird eine Probe einem auf einem Träger festgehaltenen Antikörper unter Hervorrufen einer Bindungsreaktion zugesetzt. Anschließend wird ein an Peroxidase gebundener Antikörper hinzugesetzt, um sie weiter umzusetzen.
(2) Dem in (1) erhaltenen Reaktionsprodukt wird ein Substrat(e) für Peroxidase zugesetzt und die Absorption oder Fluoreszensintensität des sich daraus ergebenden Materials wird gemessen, um die enzymatische Aktivität des vorstehenden Reaktionsprodukts zu bestimmen.
(3) Die vorstehenden Arbeitsschritte (1) und (2) werden zuvor an Standardlösungen ausgeführt, die eine vorbestimmte Menge(n) einer mit dem Antikörper reaktionsfähigen Substanz enthalten, um eine Standardkurve der Beziehung zwischen der Menge der Substanz zur Absorption oder Fluoreszenzintensität herzustellen.
(4) Was die Probe betrifft, die eine unbekannte Menge der Substanz enthält, wird die erhaltene Absorption oder Fluoreszenzintensität mit der Standardkurve verglichen, um die Substanzmenge zu bestimmen, die mit dem monoklonalen Antikörper in der Probe reagiert hat.
Nachstehend wird als Beispiel des Bestimmungsverfahrens der vorliegenden Erfindung gemäß einem RIA ein Verfahren im einzelnen veranschaulicht, das ¹²&sup5;I als Markierungsmittel verwendet.
Das Bestimmungsverfahren der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf das beschränkt, das ¹²&sup5;I verwendet.
(1) Zuerst wird eine Probe einem auf einem Träger festgehaltenen Antikörper zugesetzt, um eine Bindungsreaktion hervorzurufen. Anschließend wird ¹²&sup5;I-markierter Antikörper hinzugesetzt, um sie weiter umzusetzen.
(2) Die γ-Radioaktivität des vorstehend in (1) erhaltenen Reaktionsprodukts wird gemessen.
(3) Zuvor werden die vorstehenden Arbeitsschritte (1) und (2) an Standardlösungen ausgeführt, die eine vorbestimmte Menge(n) einer mit dem Antikörper reaktionsfähigen Substanz enthalten, um eine Standardkurve der Beziehung zwischen der Menge der Substanz zur γ-Radioaktivität herzustellen.
(4) Was die Probe betrifft, die eine unbekannte Menge der Substanz enthält, wird die erhaltene γ-Radioaktivität mit der Standardkurve verglichen, um die Substanzmenge in der Probe zu bestimmen.
Beispiele des Markierungsmittels schließen außer Enzymen und Radioisotopen fluoreszierende Materialien, leuchtende Materialien und dergleichen ein.
Als Radioisotope können ¹²&sup5;I, ¹³¹I, ³H, ¹&sup4;C und dergleichen verwendet werden. Als Enzyme sind diejenigen bevorzugt, die stabil sind und größere spezifische Aktivitäten besitzen. Beispiele der Enzyme schließen (1) Carbohydrasen [z.B. Glycosidase (z.B. β- Galactosidase, β-Glucosidase, β-Glucuronidase, β-Fructosidase, α-Galactosidase, α-Glucosidase, α-Mannosidase), Amylasen (z.B. α-Amylase, β-Amylase, Isoamylase, Glucoamylase, Taka-Amylase A), Cellulase, Lysozym], (2) Amidasen (z.B. Urease, Asparaginase), (3) Esterasen [z.B. Cholinesterasen (z.B. Acetylcholinesterase), Phosphatasen (z.B. alkalische Phosphatase), Sulfatase, Lipase], (4) Nucleasen (z.B. Deoxyribonuclease, Ribonuclease), (5) Eisenporphyrin-Enzyme (z.B. Katalase, Peroxidase, Cytochromoxidase), (6) Kupfer-Enzyme (z.B. Tyrosinase, Ascorbatoxidase), (7) Dehydrogenasen (z.B. Alkoholdehydrogenase, Malatdehydrogenase, Lactatdehydrogenase, Isocitratdehydrogenase) und dergleichen ein. Beispiele des fluoreszierenden Materials schließen Fluorescamin, Fluoreszeinisothiocyanat und dergleichen ein. Beispiele des leuchtenden Materials schließen Luminol, Luminolderivate, Luziferin, Luzigenin und dergleichen ein.
Zum Binden des Antikörpers an das Markierungsmittel können die herkömmlichen Verfahren, wie etwa das Chloramin T-Verfahren (Nature 194 495, 1962), Periodatverfahren (Journal of Histochemistry and Cytochemistry 22 1084, 1974), Maleimidverfahren (Journal of Biochemistry) 79 233, 1976) und dergleichen eingesetzt werden.
Zum Ausführen des speziellen immunchemischen Bestimmungsverfahrens der vorliegenden Erfindung gemäß dem Sandwichverfahren wird eine feste Phase, in der ein Antikörper physikalisch oder chemisch an einen Träger gebunden ist, einer Probe zugesetzt, die eine unbekannte Menge β-Kern enthält, um sie umzusetzen (erste Reaktion). Nach Waschen der festen Phase wird der festen Phase eine vorbestimmte Menge mit einem Markierungsmittel markierter Antikörper zugesetzt, um sie umzusetzen (zweite Reaktion). Anschließend wird üblicherweise nach gründlichem Waschen der festen Phase die Aktivität des an die feste Phase gebundenen Markierungsmittels gemessen. Wenn das Markierungsmittel ein Radioisotop ist, wird die Messung mit einem Näpfchenzähler oder einem Flüssigkeitsszintillisationszähler durchgeführt. Wenn das Markierungsmittel ein Enzym ist, wird dem Reaktionsgemisch ein Substrat(e) zugesetzt und es wird stehen lassen. Die enzymatische Aktivität wird durch ein kolorimetrisches oder Fluoreszenzverfahren bestimmt. Wenn das Markierungsmittel ein fluoreszierendes oder leuchtendes Material ist, kann es gemäß einem bekannten Verfahren bestimmt werden. Bei diesen Bestimmungsverfahren kann das Waschen zwischen der ersten und zweiten Reaktion ausgelassen werden. Zur weiteren Vereinfachung können eine Probe, ein an eine feste Phase gebundener Antikörper und ein mit einem Markierungsmittel markierter Antikörper gemischt werden, um sie gleichzeitig umzusetzen. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Antikörper besitzen verschiedene Antigenbestimmungsstellen und dadurch besitzt die vorliegende Erfindung die sehr nützliche, kennzeichnende Eigenschaft, wie daß das Ergebnis der Bestimmung nicht durch die Reihenfolge der Reagenzienzugabe, die für die Zugabe erforderliche Zeit, die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Waschschritts und dergleichen beeinflußt wird.
Somit besitzt das Bestimmungsverfahren der vorliegenden Erfindung die folgenden Vorteile:
(1) Eine sehr kleine Menge β-Kern und hCG-β können ohne irgendeine Beeinflussung durch Peptidhormone wie etwa hCG, hLH und dergleichen bestimmt werden.
(2) Als zu bestimmende Probe aus einem Patienten können andere Materialien als Urin, wie etwa Serum und dergleichen, verwendet werden, obschon Urin besonders geeignet ist, und
(3) verschiedene maligne Tumore, insbesondere Krebs auf obstetrischem und gynäkologischem Gebiet und die Geschlechtsorgane betreffende, werden als zu bestimmende Zielerkrankungen ausgewählt und das Verfahren ist zur Diagnose- und Prognosekontrolle dieser Krankheiten gut anwendbar.
Um das immunchemische Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung der β-Kernregion der vorliegenden Erfindung zum Beispiel durch das Sandwichverfahren durchzuführen, kann ein Reagenzienkit verwendet werden. Als derartiger Kit kann derjenige veranschaulicht werden, der die folgenden Reagenzien (1) bis (6) umfaßt:
(1) ein auf einem Träger festgehaltener Antikörper,
(2) ein markierter Antikörper,
(3) Standard-β-Kern oder hCG-β,
(4) Pufferlösung(en) zum Verdünnen dieser Reagenzien (1) bis (3) und einer Probe (der Puffer kann irgendein Puffer sein, der zum Verdünnen dieser Reagenzien und einer Probe verwendet werden kann, und ein Beispiel davon ist eine Phosphat- oder Glycinpufferlösung mit pH 6 bis 9),
(5) Pufferlösung(en) zum Waschen des Trägers nach der Inkubation (der Puffer kann irgendein Puffer sein, der zum Waschen des Trägers verwendet werden kann, und ein Beispiel davon ist eine Phosphat- oder Glycinpufferlösung) und
(6) im Fall des Verwendens eines Enzyms als Markierungsmittel Reagenzien zum Messen des Enzyms [zum Beispiel im Fall von Peroxidase, wenn ein Fluoreszenzverfahren eingesetzt wird, p-Hydroxyphenylessigsäure als Substrat des Enzyms und Wasserstoffperoxid, und wenn ein kolorimetrisches Verfahren eingesetzt wird, o-Phenylendiamin als Substrat des Enzyms und Wasserstoffperoxid; eine Pufferlösung zum Lösen des Substrats (vorzugsweise eine Phosphatpufferlösung) und ein Mittel zum Anhalten der enzymatischen Reaktion].
Dieser Kit kann zum Beispiel wie folgt verwendet werden:
Der Standard-β-Kern, hCG-β oder die Probe (etwa 10 bis 200 ul) wird mit dem Reagenz (4) verdünnt. Eine vorbestimmte Menge des Reagenzes (1) wird der verdünnten Lösung zugesetzt und die Reaktion wird bei etwa 0 bis 40ºC etwa 1 bis 48 Stunden durchgeführt. Nach Waschen des Trägers mit Wasser wird das Reagenz (2) (etwa 10 bis 300 ul) zugesetzt und die Reaktion wird bei etwa 0 bis 40ºC ausgeführt. Nach der Reaktion während etwa 1 bis 48 Stunden wird der Träger mit Wasser gewaschen und die an den Träger gebundene Peroxidaseaktivität wird gemessen.
Eine Lösung eines Peroxidase-Substrats (etwa 10-1000 ul) wird zugegeben und die Reaktion wird bei etwa 20-40ºC für 0,1 bis 2 Stunden durchgeführt. Dann wird die Reaktion abgebrochen und die Extinktion oder Fluoreszenzintensität der Reaktionsmischung wird gemesen.
Da der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung sowohl mit dem β-Kern als auch hCG-β reagiert und keine Überkreuzreaktivität mit hLH, hFSH und hTSH besitzt, ist es gemäß dem immunchemischen Bestimmungsverfahren der vorliegenden Erfindung möglich, den β-Kern, hCG-β oder sowohl den β-Kern als auch hCG-β gleichzeitig mit hoher Empfindlichkeit mit einer Messung durch eine einfache Technik in einem normalen klinischen Test zu bestimmen.
Wie vorstehend beschrieben besitzt der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung eine hohe Reaktivität mit dem Urin, Serum oder dergleichen von Patienten mit verschiedenem Krebs und er wird deshalb vorteilhafterweise als diagnostisches Mittel für Krebs und dergleichen verwendet.
Weiter kann mit dem Reagenz zur immunchemischen Bestimmung der vorliegenden Erfindung mittels des monoklonalen Antikörpers eine sehr hochempfindliche Bestimmung innerhalb eines kurzen Zeitraums ausgeführt werden und der Wert normaler, gesunder Menschen kann bestimmt werden.
Somit wird durch Einführen des Bestimmungsreagenzes gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nur eine Förderung der Grundlagenforschung des β-Kerns, wie etwa seine Biosynthese, Ausscheidung, Metabolismus und dergleichen erwartet, sondern da das vorliegende Bestimmungsverfahren auch sehr positive und genaue Ergebnisse ergibt, wird es möglich, die Diagnose von unterschiedlichem Krebs außer malignen Tumoren auf obstetrischem und gynäkologischem Gebiet einfach und genau durchzuführen und den Behandlungsfortschritt derartiger Krankheiten zu beobachten.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung weiter im einzelnen, sind aber nicht als deren Umfang begrenzend aufzufassen.

Beispiel 1

Hybridomherstellung

In fünf BALB/c-Mäuse wurde eine Suspension von hCG-β (100 ug je Maus), das in physiologischer Kochsalzlösung (0,5 ml) und Freundschem kompletten Adjuvans (0,5 ml) gelöst war, intraperitoneal injiziert. Nach 2 bis 12 Wochen wurde jeder Maus ein in physiologischer Kochsalzlösung (0,25 ml) gelöster hCG-β-Booster (50 ug) intravenös in die Schwanzvene injiziert. Die Milzzellen der Mäuse wurden zum Ausführen der Zellfusion 3 Tage nach der letzten Immunisierung entnommen.
Die gesammelten Milzzellen (1,0 x 10&sup8; Zellen) und Myelomzellen P3X63Ag8U1 (1,0 x 10&sup7; Zellen) wurden in RPMI-1640-Medium gemischt und das Gemisch wurde 5 Minuten bei 1000 Upm zentrifugiert. Dem sich daraus ergebenden Pellet wurde langsam 50%iges Polyethylenglykol 1500 (1 ml) während 1 Minute bei 37ºC zugesetzt, um die Zellen zu fusionieren. RPMI-1640 (7 ml) wurden 5 Minuten lang bei 37ºC hinzugefügt, und das Gemisch wurde zentrifugiert. Die auf diese Weise erhaltenen fusionierten Zellen wurden mit HAT- Medium (30 ml) verdünnt und Portionen von 0,1 ml davon wurden in Näpfchen einer 96-Näpfchen-Mikrotiterplatte verteilt. Anschließend wurde die Kultivierung fortgesetzt, während eine Hälfte des HAT-Mediums alle 2 bis 3 Tage durch frisches HAT-Medium ersetzt wurde. Nach 7 bis 14 Tagen wurden Hybridome in etwa 60% aller 288 Näpfchen (170/288) vermehrt und 40% dieser Näpfchen (68/170) produzierten einen anti-hCG-β-Antikörper. Weiter zeigten etwa 30% der letzteren Näpfchen (17/68) eine β-Kern-Bindungsaktivität.
Die Zellen in dem Näpfchen, welche den höchsten Antikörpergehalt zeigten, wurden durch Grenzverdünnung kloniert. BALB/c-Maus- Thymozyten (10&sup5; Zellen/Näpfchen) als Feeder-Zellen und das Hybridom (1 Zelle/Näpfchen) wurden den Näpfchen zugesetzt und sie wurden in HT-Medium kultiviert. Dieser Arbeitsschritt wurde zwei Mal wiederholt. Ein Klon, der am stabilsten eine große Menge Antikörper produzierte, wurde durch Klonieren selektiert und 229 genannt. Gemäß demselben Arbeitsschritt wurde das Hybridom 233 erstellt.
Das Hybridom 229 ist seit dem 26. September 1989 beim Fermentationsforschungsinstitut, Amt für industrielle Wissenschaft und Technologie (FRI), unter der Zugangsnummer FERM BP-2614 unter dem Budapester Vertrag hinterlegt worden.
Die Messung des Antikörpergehalts wurde wie folgt ausgeführt:
Ein Kulturüberstand eines Hybridoms (50 ul) wurde auf einer Mikrotiterplatte immobilisiertem anti-Maus-Immunglobulin(IgG + IgM + IgA)-Antikörper zugesetzt und 1 Tag bei 4ºC umgesetzt. Nach dem Waschen wurde mit Peroxidase markierter hCG-β oder β- Kern zugesetzt und 1 Tag bei 4ºC weiter umgesetzt. Nach dem Waschen wurde eine Lösung aus Enzymsubstrat, o-Phenylendiamin (nachstehend als OPD abgekürzt) und die Absorption wurde zum Bestimmen des Antikörpergehalts des Kulturüberstands des Hybridoms gemessen.
Das mit Peroxidase markierte Antigen wurde wie folgt hergestellt:
eine Lösung von 4-(N-Maleimidomethyl)-cyclohexancarbonsäure-N- succinimidester (100 ul) wurde hCG-β oder β-Kern (500 ug/ml) zugesetzt und das Gemisch wurde 90 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde der Gelfiltration unterzogen, indem es durch eine Sephadex G-25-Säule unter Erhalten eines maleimidierten Antigens geleitet wurde. In 0,02 M Phosphatpufferlösung, die 0,1 M Natriumchlorid enthielt, gelöste Meerettichperoxidase (7 mg) wurde mit der 20-fachen Menge 3-(2- Pyridylthio)propionsäure-N-succinimidylester 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Weiter wurde in 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,5) gelöster Dithiothreit (0,25 ml) zugesetzt und das Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Das letztere Reaktionsgemisch wurde der Gelfiltration unterzogen, indem es durch eine Sephadex G-25-Säule geleitet wurde, und das Filtrat wurde mit dem vorstehenden maleimidierten Antigen gemischt. Nach 20 Stunden Reaktion bei 4ºC wurde das Reaktionsgemisch zum Reinigen des Antigens der Gelfiltration mit Ultragel AcA-44 unterzogen.

Beispiel 2

Herstellung von monoklonalem Antikörper

Einer durch intraperitoneale Verabreichung von Pristan (0,5 ml) vorbehandelte BALB/c-Maus wurde in RPMI-1640 (0,5 ml) suspendiertes Hybridom 229 (5 x 10&sup6; Zellen) intraperitoneal injiziert. Nach 10 bis 14 Tagen wurde die zurückgehaltene Aszitesflüssigkeit gesammelt und durch Protein-A-Sepharose unter Erhalten des monoklonalen Antikörpers 229 gereinigt. Die Ausbeute an monoklonalem Antikörper 229 betrug 3,5 mg je 1 ml Flüssigkeit.
Der Isotyp dieses monoklonalen Antikörpers wurde gemäß dem Ouchterlony-Verfahren als IgG&sub1; bestimmt. Dessen Reaktivität wurde durch Testen auf Überkreuzreaktivität mit sowohl dem β-Kern, hCG-β als auch Chorion- und Hypophysen-Glycoprotein-Hormone gemäß einem EIA bestimmt.
Die Ergebnisse werden in Fig. 1 dargestellt. Der monoklonale Antikörper reagiert mit dem β-Kern und hCG-β mit fast derselben Intensität und reagiert kaum mit menschlichem Choriongonadotropin. Auf der anderen Seite ruft der monoklonale Antikörper 233, der mittels des Hybridoms 233 auf dieselbe Weise erhalten wird, in dem vorstehenden EIA keine kompetitive Reaktion hervor, selbst wenn er zusammen mit dem monoklonalen Antikörper 229 zugesetzt wird. Es wird daher angenommen, daß der monoklonale Antikörper 233 ein Epitop eines β-Kerns erkennt, das von dem durch den monoklonalen Antikörper 229 erkannten verschieden ist.

Beispiel 3

Herstellung eines Kits

(1) Herstellung eines immobilisierten Antikörpers Polystyrolkugeln (¼ Zoll Durchmesser; hergestellt von Precision Plastic Ball Company, Chicago, USA) (50 Kugeln) wurden in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0, 7,5 ml) verbracht und ein monoklonaler anti-β-Kern-Antikörper (monoklonaler Antikörper 229) wurde hinzugesetzt. Man ließ das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Die Polystyrolkugeln wurden mit Phosphatpuffer gewaschen. 0,1% Natriumazid wurden zugesetzt und die Kugeln wurden in einem Kühlschrank gelagert.
(2) Herstellung eines durch ein Enzym markierten Antikörpers hCG-β (20 mg) und Rinderserum-Thyroglobulin (20 mg) wurden in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,5) gelöst und Glutaraldehyd wurde der Lösung so zugesetzt, daß deren Endkonzentration 0,2% wurde. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 4ºC umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 4ºC drei Mal gegen destilliertes Wasser (2 Liter) dialysiert und lyophilisiert, um einen hCG-β-Rinderserum- Thyroglobulin-Komplex (35 mg) zu erhalten.
Kaninchen wurden mit dem vorstehenden Komplex (1 mg auf 1 Kaninchen) zusammen mit Freundschem kompletten Adjuvans alle zwei Wochen 6 Mal an ihrem Rücken subkutan immunisiert. Eine Entblutung wurde zum Erhalten von anti-hCG-β-Kaninchenserum aus den Karotisarterien ausgeführt.
Ammoniumsulfat wurde anti-hCG-β-Kaninchenserum (10 ml) so zugesetzt, daß die Endkonzentration zum Ausführen des Aussalzens 1,64 M wurde. Das Gemisch wurde 10 Minuten bei 10000 Upm zentrifugiert und der Niederschlag wurde in 0,02 M Boratpuffer (pH 8,0, 5 ml) gelöst. Die Lösung wurde gegen denselben Puffer dialysiert. Der Überstand wurde auf eine Säule (2,0 x 4,8 cm) aufgebracht, die mit hCG-β-bindender Sepharose 4B, die mit demselben Puffer äquilibriert war, gepackt war, und mit 0,2 M Glycin-HCl-Puffer (pH 2,3) unter Erhalten gereinigten anti-hCG- β-Antikörpers (20 mg) eluiert.
Dem auf diese Weise erhaltenen anti-hCG-β-Antikörpers (20 mg) wurde Pepsin aus der Tunica mucosa ventriculi des Schweins (0,4 mg) zugesetzt und das Gemisch wurde in 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,5) 16 Stunden bei 37ºC umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde neutralisiert und auf eine Säule (1,9 x 90 cm) aufgebracht, die mit Ultragel AcA-44 gepackt war und wurde mit 0,1 M Boratpuffer (pH 8,0) unter Erhalten von F(ab')&sub2; (10 mg) eluiert. Dieses F(ab')&sub2; (10 mg) wurde in 2 mM EDTA enthaltendem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0) gelöst. Der Lösung wurde 2-Mercaptoethylamin zugesetzt und das Gemisch wurde 90 Minuten bei 37ºC umgesetzt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch auf eine Säule (1 x 30 cm) aufgebracht, die mit Sephadex G-25 gepackt war, und mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0), der 2 mM EDTA enthielt, unter Erhalten von Fab' (7 mg) eluiert.
Meerrettichperoxidase (10 mg) wurde in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,8, 1,4 ml) gelöst. Der Lösung wurde eine Lösung von in N,N- Dimethylformamid (80 ul) gelöstem 4-(Maleimidomethyl)cyclohexancarbonsäure-N-succinimidester (9,7 mg) zugesetzt und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 30ºC umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert und der sich daraus ergebende Überstand wurde auf eine Säule (1 x 30 cm) aufgebracht, die mit Sephadex G-25 gepackt war, und wurde mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,8) unter Erhalten einer maleimidierten Peroxidase (7 mg) eluiert.
Das vorstehende Fab' (7 mg) und maleimidierte Peroxidase (7 mg) wurden in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,5, 1 ml) 20 Stunden bei 4ºC umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine Säule (1,5 x 90 cm) aufgebracht, die mit AcA-44 gepackt war, und wurde mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,5) eluiert. Auf diese Weise wurde das gewünschte, mit Peroxidase markierte anti-hCG-β-Fab' (etwa 9 mg) erhalten.

Beispiel 4

Krebsdiagnose

(1) Bestimmung

Eine Probe oder eine β-Kern-Standardlösung (100 ul) und 0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,5, 200 ul), der 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, wurde in ein Reagenzglas (12 x 75 mm) verbracht und ein immobilisierter Antikörper (Polystyrolkugel) wurde hinzugesetzt. Das Reagenzglas wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur (20 bis 30ºC) stehen lassen. Nach zwei Mal Waschen mit gereinigtem Wasser (4 ml), wurde das Reaktionsgemisch mit 0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,5, 300 ul), der anti-hCG-β-Fab'-Peroxidase (etwa 50 ng) und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, gemischt und eine Stunde bei Raumtemperatur (20 bis 30ºC) stehen lassen. Der Lösungsteil wurde entfernt und die Polystyrolkugel wurde zwei Mal auf dieselbe Weise wie die vorstehend beschriebene gewaschen. Die Kugel wurde in ein weiteres Reagenzglas überführt. Die an die Kugel gebundene Peroxidaseaktivität wurde mittels OPD als Substrat in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid und Messen der Absorption bei 492 nm nach 30 Minuten Stehen bei Raumtemperatur an einem dunklen Ort bestimmt.
Bei dem enzymatischen immunologischen Bestimmungsverfahren der vorliegenden Erfindung betrug die Überkreuzreaktivität gegenüber hCG-β auf molarer Grundlage etwa 100% und es wurde fast die gleiche Überkreuzreaktivität gegenüber dem β-Kern beobachtet. Auf der anderen Seite waren die Überkreuzreaktivitäten gegenüber Glycoproteinhormonen, wie etwa menschliches Choriongonadotropin, menschliches luteinisierendes Hormon, menschliches Follikelstimulierendes Hormon und menschliches Thyroidea-stimulierendes Hormon, sehr niedrig, wie etwa 2,2%, 0,29%, weniger als 0,01% beziehungsweise weniger als 0,01%. Die Ergebnisse werden in Fig. 2 dargestellt.
Das Verfahren besitzt eine sehr hohe Empfindlichkeit, wie etwa eine Nachweisgrenze des β-Kerns von 2 pg (0,13 fMol)/Röhrchen (20 pg/ml) (siehe Fig. 2).
Die Reaktivität des durch das Hybridom 281 produzierten monoklonalen Antikörpers 281, welcher die hCG-β-Kernregion erkennt und durch Verwenden des gereinigten β-Kerns als Immunogen erhalten wird, wurde mit der Reaktivität des monoklonalen Antikörpers 229 der vorliegenden Erfindung verglichen. Wenn die Reaktivitäten gegenüber verschiedenen Proteinhormonen gemäß einem Sandwichverfahren unter Verwenden jedes monoklonalen Antikörpers als immobilisierter Antikörper verglichen wurden, zeigte der monoklonale Antikörper 229 fast dieselben Reaktivitäten sowohl gegenüber dem β-Kern als auch dem hCG-β-Kern. Auf der anderen Seite betrugen im Fall des monoklonalen Antikörpers 281, wenn seine Reaktivität gegenüber dem β-Kern als 100% angenommen wurde, seine Reaktivitäten gegenüber hCG-β und hCG 14.0% beziehungsweise 1,2%. Jede Reaktivität gegenüber menschlichem luteinisierendem Hormon, menschlichem Follikel-stimulierendem Hormon oder menschlichem Thyroidea-stimulierendem Hormon betrug 0,01% oder weniger. Gemäß diesen Versuchsergebnissen wird angenommen, daß der monoklonale Antikörper 229, in dem das Immunogen hCG-β ist, und der monoklonale Antikörper 281, in dem das Immunogen der β-Kern ist, verschiedene Epitope in der β-Kernregion erkennt.

(2) Urin-β-Kernwert in normalen, gesunden Personen

Wenn der β-Kernwert im Urin normaler, gesunder Personen (n = 231) mittels des Reagenzes der vorliegenden Erfindung bestimmt wurde, betrug er im Durchschnitt 0,05 ng/ml und im Fall der Addition von 2 Standardabweichungen betrug er 0,18 ng/ml. Wenn der monoklonale Antikörper 281 verwendet wurde, betrug er im Durchschnitt 0,01 ng/ml und im Fall der Addition von 2 Standardabweichungen betrug er 0,03 ng/ml.

(3) Bestimmung von Urin und Serum von Patienten mit verschiedenen Krankheiten

β-Kern- und/oder hCG-β-Werte (ng/ml) im Urin und Serum von Patienten mit verschiedenen Krankheiten wurden durch Verwenden des Reagenzkits der vorliegenden Erfindung bestimmt. Weiter wurden als Kontrolle β-Kernwerte durch Verwenden des monoklonalen Antikörpers 281 als immobilisiertem Antikörper bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Urin Serum Probe Nr. Krankheit Best. Kontrolle Lungenkrebs Eierstockkrebs Dickdarmkrebs Magenkrebs Gebärmutterkrebs Speiseröhrenkrebs oder weniger Tabelle 1 (forsetzung) Urin Serum Probe Nr. Krankheit Best. Kontrolle Eierstockkrebs Hysteromyon Schwangerschaft Magenkrebs Chorionkarzinom Gebärmutterkrebs oder weniger Pankreaskrebs Nierenkrebs Colitis Dickdarmkrebs Gastritis
Wie aus Tabelle 1 zu ersehen ist, werden, was die Urinproben betrifft, im Fall von Schwangerschaft hohe Werte beobachtet und bei Patienten mit unterschiedlichem Krebs zeigten von 17 Fällen 12 Fälle (etwa 71%) höhere Werte als etwa 0,2 ng/ml, was als Grenzwert hinsichtlich des Wertes normaler, gesunder Personen angesehen und die als positiv bestimmt wurden. Wenn im Gegensatz dazu β-Kernwerte mittels des monoklonalen Antikörpers 281 als Kontrolle bestimmt wurden, zeigten nur 9 Fälle von 17 Fällen (etwa 53%) höhere Werte als 0,03 ng/nl, was als Grenzwert hinsichtlich des Wertes normaler, gesunder Personen angesehen wurde.
Was auf der anderen Seite die Serumproben betrifft, zeigten bei Patienten mit unterschiedlichem Krebs 8 Fälle von 17 Fällen (etwa 47%) höhere Werte als 0,2 ng/ml und wurden als positiv bestimmt. Dieses positive Verhältnis von Serumproben im Vergleich zu dem zuvor im Stand der Technik veröffentlichten sehr hoch, etwa 10 bis 20%, ist.
Weiter werden die Ergebnisse von Urin von Patienten mit obstetrischen und gynäkologischen Krankheiten in Fig. 3 dargestellt. Sehr hohe positive Ergebnisse wurden bei Patienten mit Eierstockkrebs, Gebärmutterkrebs und Chorionkarzinom erhalten.

Claims

1. Hybridom 229, das die Zugangsnummer FERM BP-2614 besitzt und zum Produzieren eines monoklonalen Antikörpers zum Erkennen der hCG-β-Kernregion und der hCG-β-Untereinheit fähig ist, welches durch Zellfusion einer Milzzelle einer mit der hCG-β-Untereinheit immunisierten Maus und einer Mäuse-Myelomzellinie erhalten wird.

2. Monoklonaler Antikörper zum Erkennen der hCG-β-Kernregion und der hCG-β-Untereinheit, welcher von dem Hybridom gemäß Anspruch 1 produziert wird.

3. Immunologisches Bestimmungsverfahren, welches das Erkennen der hCG-β-Kernregion oder der hCG-β-Untereinheit oder beider mit dem monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 2 umfaßt.

4. Verfahren zum Diagnostizieren von Krebs in vitro, welches das Erkennen der hCG-β-Kernregion in einer Probe mit dem monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 2 umfaßt.