DE60025347T2

DE60025347T2 - Methoden zur vohersage eines schwangerschaftsergebnisses bei einer testperson mit hilfe eines hcg-tests

Info

Publication number: DE60025347T2
Application number: DE60025347T
Authority: DE
Inventors: John New Rochelle O'CONNOR; Steven Dumont BIRKEN; Galina New York KOVALEVSKAYA
Original assignee: Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 1999-05-13
Filing date: 2000-05-12
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2020-05-13
Also published as: US20080108089A1; US20110300557A1; US8420339B2; CA2372666C; WO2000070094A1; US8163508B2; IL146454A0; CA2372666A1; US6927034B2; EP1183390B1; US20130011858A1; EP1183390B8; AU778130B2; IL146454A; US20150010926A1; US7285391B2; US20030003597A1; US20050042702A1; US20110159526A1; DE60025347D1

Description

Die hierin offenbarte Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung der Vereinigten Staaten gemäß den National Institutes of Health Grant Nummern NIEHS ES-07589 und HD 15454 gemacht. Dementsprechend besitzt die US-Regierung bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
Hintergrund der Erfindung
Innerhalb dieser Anmeldung wird durch die Angabe von Autor und Datum auf verschiedene Publikationen verwiesen. Vollständige Literaturstellen dieser Publikationen können alphabetisch aufgelistet am Ende der Beschreibung, den Ansprüchen unmittelbar vorangestellt, gefunden werden.
Der Verlust der Frühschwangerschaft ("early pregnancy loss", EPL) ist ein weit verbreitetes, aber weitgehend nicht diagnostiziertes Problem. Um EPL angemessen zu diagnostizieren und Behandlungen dafür zu entwickeln, ist es unerlässlich, den Nachweis von EPL führen zu können sowie die Häufigkeit dessen Auftretens messen zu können. Dies ist in epidemiologischen Studien von entscheidender Bedeutung, von denen einige im Zusammenhang stehen mit Expositionen gegenüber bekannten oder mutmaßlichen, die Fortpflanzung beeinträchtigenden, Toxinen am Arbeitsplatz, in der Umwelt oder durch private Nutzung. Diese Verluste der Frühschwangerschaft werden von den Frauen oder den Ärzten oftmals nicht bemerkt und einzig durch die Messung von hCG im Urin im Zeitraum zwischen Nidation und erwarteter Menses nachgewiesen. Sie werden manchmal als "chemische Schwangerschaften" oder "verborgene Schwangerschaften" bezeichnet. Eine bahnbrechende epidemiologische Studie zeigte, dass die Inzidenz von EPL in einer Population von gesunden Frauen, die versuchten schwanger zu werden, 22 % betrug (Wilcox A. J., et al., 1988). In dieser Untersuchung kam ein sehr sensitiver (0,01 ng/ml hCG) Assay zum Einsatz, der nur das intakte hCG-Molekül mit dem vorhandenen spezifischen Beta-Untereinheit-carboxyterminalen-Peptid nachwies.
Es gibt viele wahrscheinliche Ursachen für EPL und klinisch spontane Fehlgeburt, zu denen genetische Anomalie, immunologische Dysfunktion, unbehandelte Infektion oder andere unbekannte physiologische Probleme gehören. Darüber hinaus können Verluste durch das Unvermögen des humanen Choriongonadotropins (hCG) bei seiner Zielstruktur, dem Corpus Luteum, eine angemessene Antwort zu induzieren, verursacht werden. Dies könnte auf unzureichende hormonelle Wirksamkeit zurückzuführen sein. "Nicking" der Beta-Untereinheit in der Loop-2-Region des Moleküls, insbesondere zwischen den Resten 44–49, kann die Biopotenz von hCG mindern. Gespaltene Peptidbindungen in diesem Bereich des Moleküls zeigen ebenfalls verminderte Biopotenz sowie verminderte immunologische Erkennung durch monoklonale Antikörper, die gegen das heterodimäre Hormon gerichtet sind (Cole, L. A., et al., 1991a; Cole, L. A., et al., 1991b; Puisieux, A., et al., 1990; Nishimura, R., et al., 1988; Nishimura, R. T., et al., 1989). Nicked-Formen des hCG wurden untersucht, ob sie möglicherweise in EPL-Situationen stärker vorherrschend und zumindest teilweise verantwortlich für den Verlust der Frühschwangerschaft sind. Leider sind viele der Berichte, die behaupten, dass beträchtliche Konzentrationen von nicked hCG während der Schwangerschaft, Verlusten oder erfolgreichen Schwangerschaften, produziert werden, infolge fehlerhafter Annahmen hinsichtlich der Assay-Spezifität nicht korrekt (Wilcox, A. J., et al., 1988). Carbohydrat-modifiziertes hCG kann ebenso verminderte Biopotenz aufweisen. Es ist bekannt, dass, wenn das hCG einen stark verminderten Gehalt an N-Acetylneuraminsäure aufweist und seine Carbohydratketten mit Galaktose abschließen, viel hCG durch den Leberrezeptor für solche modifizierten Glykoproteine beseitigt wird (Braun, J. R., et al., 1996; Kawasaki, T. and G. Ashwell, 1996). Die Kreislauf-Verweildauer von Asialo-hCG ist vermindert und seine in vivo-Potenz dadurch gering. Andere Carbohydrataustausche verändern ebenso die Kreislauf-Halbwertszeit; Glykoproteine, die mit Sulfat-N-Acetylgalaktosamin abschließen, werden ebenso durch einen spezifischen Leberrezeptor extrahiert und weisen eine verminderte Kreislauf-Verweildauer auf (Baenziger, J. U., 1994; Fiete, D., et al., 1991).
Mindestens zwei Faktoren beeinflussen die erhöhte Wirksamkeit von hCG. Erstens ist bekannt, dass ein größerer Stokescher Radius die Clearance durch den Nierenglomerulus vermindern wird, welcher normalerweise Proteine mit einer tatsächlichen Größe von über 70000 sehr langsam ausscheidet. Die tatsächliche Größe des aus Urin isolierten hCG liegt gerade bei dieser Größengrenze reduzierter Clearance. Üblicherweise vergrößert der zusätzliche Zuckergehalt den hydratisierten Radius von Glykoproteinen. Es wurde gezeigt, dass durch Zugabe des hCG-Beta-COOH-terminalen Peptids zu hFSH oder hLH deren Kreislauf-Verweildauer stark zunahm (Fares, F. A., et al, 1992; Matzuk, M., 1990). Von dieser Zunahme wurde angenommen, dass sie hauptsächlich durch den Carbohydratgehalt dieses Peptids und nicht einfach durch die zusätzliche Polypeptidgröße bedingt ist (Wilcox, A. J., et al., 1988). Zweitens wird eine erhöhte negative Ladung eines Proteins dessen Verweildauer im Kreislauf infolge der verminderten Clearance durch die Niere verlängern (Chmielewski, C., 1992; Quadri, K. H., et al., 1994; Maack, T., et al., 1985). Diese erhöhte negative Ladung kann durch eine zusätzliche N-Acetylneuraminsäure oder andere negative Gruppen bedingt sein, wozu auch Sulfat gehört, das beispielsweise auf hLH und auf der hypophysären Form des hCG vorhanden ist (Birken, S., et al., 1996b). Änderungen, die die Signaltransduktion am Rezeptor beeinflussen, können ebenso die Biopotenz von hCG beeinträchtigen. Es ist bekannt, dass deglykosiliertes hCG eine sehr stark verminderte Rezeptorpotenz aufweist (Ravindranath, N., et al., 1992; Sairam, M. R., und L. G., Jiang, 1992; Browne, E. S., et al., 1990; Sairam, M. R., 1989; Sairam, M. R., et al., 1988). hCG Formen mit vermindertem Carbohydratgehalt weisen ebenso eine verminderte Signaltransduktion auf (Amano, J., et al., 1990; Bahl, O. P., et al., 1995; Moyle, W. R., 1975).
Erfindungsgemäß ist EPL oder wiederkehrende spontane Fehlgeburt nicht durch eine abnormale hCG-Form mit verminderter Wirksamkeit, wie beispielsweise nicked hCG, bedingt. Stattdessen liefert die vorliegende Erfindung Beweise, dass bei erfolgreich ausgetragenen Schwangerschaften die Frauen üblicherweise hCG-Formen produzieren, die in sehr frühen Schwangerschaftsstadien hochwirksam waren; die hCG-Standard-Referenzpräparationen aus Harn stellen weniger wirksame Formen des später in der Schwangerschaft produzierten Hormons dar. Die erhöhte Wirksamkeit könnte durch eine Kombination von Faktoren, angefangen von Kreislauf-Halbwertszeit bis hin zu erhöhter Rezeptoraffinität oder Signaltransduktion oder all dem Vorhergehenden, verursacht werden. Da der hCG-Spiegel in der Frühschwangerschaft sehr niedrig ist, findet man auf molarer Basis folgerichtig eine wirksamere Form des hCG, um dessen Funktion abzufragen, bis die Produktionslevel dann mit Zunahme der Trophoplasten-Zellmasse ansteigen. Die vorliegende Erfindung beschreibt molekulare und immunologische Hilfsmittel und Verfahren, einschließlich eines Antikörpers, B152 (orig.: B1512), der hierin beschrieben ist und der die hochwirksamen, mit der Frühschwangerschaft assoziierten molekularen Isoformen des hCG erkennt. Die Bestimmung von Blut- und Harnprofilen für die B152 hCG-Isoformen über die gesamten gesunden Schwangerschaften hinweg kann das Muster der Isoformen in erfolgreichen Schwangerschaften darstellen. Diese Isoformen können allein durch Immunoassays gemessen werden, was das Erfordernis, komplexe Studien zur isoelektrischen Fokussierung oder andere Auftrennungstechniken durchzuführen, unnötig macht. Darüber hinaus sind die hierin beschriebenen Verfahren auf eine Vielzahl von Proben anwendbar.
Als Hintergrund lehrt WO99/41584 ein Verfahren zur Vorhersage einer Schwangerschaft in einem Subjekt durch einen hCG-Assay. Kovalevskaya et al. beschreiben im Journal of Endocrinology 1999, 161, 99–106, humane Choriongonadotropin (hCG)-Isoformen der Frühschwangerschaft, gemessen durch einen immunometrischen Assay für Chorionkarzinomähnliches hCG.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Feststellen einer Problemschwangerschaft in einem Subjekt bereit, umfassend die Schritte:

(a) (1) Inkontaktbringen einer ersten Menge einer Urin- oder Blutprobe von dem Subjekt mit einem B152-Antikörper, der von der Hybridom-Zelllinie produziert wird, die in der American Type Culture Collection unter der Kennzeichnungsnummer HB-12467 hinterlegt ist;
2) Inkontaktbringen der Probe, die aus (a) (1) resultiert, mit einem B207-Antikörper, der gleichzeitig mit dem 8 152-Antikörper an die hCG-Isoform bindet, die vom B 152-Antikörper erkannt wird;
(3) Messen der Menge an gebundenem B207-Antikörper in der Urin- oder Blutprobe, um dadurch die Menge der mittels B152 nachweisbaren hCG-Isoform in der Urin- oder Blutprobe zu bestimmen;
(b) (1) Inkontaktbringen einer zweiten Menge der Probe von dem Subjekt mit einem B109-Antikörper, welcher an intaktes, non-nicked hCG bindet, ohne wesentlich mit nicked hCG, freier hCGβ Untereinheit, hCGβcf, oder hLH zu kreuzreagieren;
(2) Inkontaktbringen der Probe, die aus (b) (1) resultiert, mit einem B108-Antikörper, der gleichzeitig mit dem B109-Antikörper an intaktes, non-nicked hCG bindet;
(3) Messen der Menge an gebundenem B108-Antikörper in der Probe, um dadurch die Menge an intaktem hCG in der Urin- oder Blutprobe zu bestimmen, mit der Maßgabe, dass die Schritte (a) und (b) in beliebiger Reihenfolge ausgeführt werden können;
(c) Bestimmen des Verhältnisses von mittels B152 nachweisbarem hCG zu intaktem hCG in der Probe aus den Messungen, die in (a) (3) und (b) (3) durchgeführt wurden; und
(d) Wiederholen der Schritte (a) bis (c) für Proben, die von dem Subjekt innerhalb der ersten 40 Tage der Schwangerschaft entnommen wurden, wobei das Fehlschlagen eine hinreichende Abnahme in dem in Schritt (c) bestimmten Verhältnis festzustellen verglichen mit der Menge an hCG, die in einem der Schritte (a) (3) oder (b) (3) bestimmt wurde, eine Problemschwangerschaft in dem Subjekt anzeigt, wobei eine derart hinreichende Abnahme durch den Schnittpunkt einer ersten und einer zweiten Kurve auf einem einzelnen Graphen nachgewiesen wird, wobei (i) der Graph eine x-Achse aufweist, die die Anzahl an Tagen seit dem Embryo-Übertragung, beginnend bei 0, anzeigt, einer ersten y-Achse, die die Konzentration von hCG anzeigt, dargestellt durch eine Kreatininkonzentration von zwischen 0,1 und 10 000 000 fmol/mg, und einer zweiten y-Achse, die das Verhältnis von mittels B152 nachweisbarem hCG zu intaktem hCG anzeigt, dargestellt durch einen logarithmischen Bereich von 0,1 bis 10, (ii) die erste Kurve das gemäß Schritt (c) bestimmte Verhältnis darstellt, (iii) die zweite Kurve die in einem der Schritte (a) (3) oder (b) (3) bestimmten Mengen an hCG darstellt, und (iv) nach dem Schnittpunkt die erste Kurve unter der zweiten Kurve verbleibt.

Vorzugsweise ist die Probe eine Urinprobe.
Vorzugsweise sind die B152- und B109-Antikörper an eine feste Matrix gebunden.
Vorzugsweise sind der B207- und B108-Antikörper mit einem radioaktiven Isotop, Enzym, Farbstoff, fluoreszierenden Molekül, magnetischen Bead oder Biotin markiert.
Vorzugsweise sind die B207- und B108-Antikörper mit dem radioaktiven Isotop I¹²⁵ markiert.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 Bioassay für Formen des hCG. Es handelt sich hierbei um Daten von rekombinanten CHO-Zellen, welche den LH/CG-Rezeptor exprimieren. Reaktionsgröße ist die cAMP-Produktion. Die X-Achse ist das Maß für eines von vier kalibrierten, reinen Hormonen, wie in den Figurenlegenden beschrieben. Exprimiertes hCG hat keine Nicks; Chorionkarzinom-hCG (C5) ist zu 100 % nicked; CR 127 wurde wie gezeigt in eine Nick-freie (non-nicked, intakte) und Nick-angereicherte Fraktion gereinigt.
2 Inzidenz (Panel A) und Expressionslevel (Panel B) von hCG-verwandten Molekülen in den Positiv-Proben für jede der gemessenen Analysen (in früher Normalschwangerschaft, n = 214; EPL-Zyklen, n = 49; und negativen Zyklen, n = 297).
3 Bindungskurven für drei hCG-Typen im B152-B207*-Assay (oberes Panel) und dem B109-B108*-Assay (unteres Panel).
4 Verhältnis von hCG-Isoformen, gemessen mit den B152-B207*- und B109-B108*-Assays in Urin von Normalschwangerschaft (n = 103) bei unterschiedlichen Schwangerschaftsstadien. (Regressionskurve und 95 % Konfidenzintervalle sind dargestellt, r² = 0,79). Ein Wendepunkt in der Kurve tritt nach etwa 29 Wochen ein.
5 Blockdiagramm des B152/B109-Verhältnisses für Schwangerschafts-Serum/Urin-Paare bei 5–6 Wochen andauernder Schwangerschaft (n = 12); oder bei 36–39 Wochen andauernder Schwangerschaft (n = 11) und in JAR-Zellüberstand. Die Box erstreckt sich bis zum 25. und 75. Perzentil. Die oberen und unteren Symbole zeigen den 90. bzw. 10. Perzentil an. Eine dicke Linie innerhalb der Box markiert den Wert des 50. Perzentils.
6 Verhältnis von hCG-Isoformen, gemessen mit B152-B207* und B109-B108* in Urin von künstlich befruchteten IVF-Patientinnen (n = 65). (Regressionskurve und 95 % Konfidenzintervalle sind dargestellt, r² = 0,59).
7 Immunoassayprofile von Fraktionen aus Superose 12-Säulenchromatographie eines gepoolten Urinkonzentrats von schwangeren Frauen.
8 Flüssigphase-Radioimmunoassays unter Verwendung des Antikörpers B151 (Panel A) und des Antikörpers B152 (Panel B). Radiomarkiertes Chorionkarzinom-hCG wurde als Tracer verwendet und kalibrierte (durch Aminosäureanalyse) Lösungen von Schwangerschafts-C5-ChorionCG, hCG CR 127, hCG CR 127 non-nicked und hCGn CR 127 wurden als Kompetitoren eingesetzt. Nicht-lineare Regressionsgeraden wurden in Logit-transformiertem Format gezeichnet.
9 Radioimmunometrischer (zweiseitiger) Assay unter Verwendung von Antikörper B152 als Capture- und B207 als radiomarkiertes Nachweisreagens. Bindungskurven wurden für die verschiedenen, in den Methoden und Ergebnissen aufgeführten, Kompetitoren gezeigt. Jedes Panel repräsentiert einen gesonderten Assay, wobei alle Liganden im selben Assay eingesetzt wurden. Punkte wurden durch gerade Linien verbunden, obwohl die Regressionsanalyse (4-Parameter-Logistik) ausgezeichnete Passform an logistische oder sigmoidale Kurvenformmodelle anzeigte. Panel A und B stellen zwei verschiedene Assays mit ähnlichen Ergebnissen dar. Es ist klar, dass dieser Assay die größte Erkennung des nicked Chorionkarzinom-hCG-Antigens hat, welches hyperglykosiliert ist und auf ähnliche Weise an nicked und non-nicked Formen des hCG bindet, welche die üblichen Mengen an Zuckern enthalten. Reagens MIA fehlt das meiste seiner Beta-COOH-terminalen Region, was darauf hinweist, dass dieser Bereich in der Bindungsstelle von B152 eine Rolle spielt (siehe Panel B und Diskussion im Text).
10 Enzymatisch-immunometrischer (zweiseitiger) Assay unter Verwendung von Antikörper B152 als Capture- und Peroxidase-markierter B4001 als Nachweisantikörper. Ein linear-linear Diagramm der molaren Quantitäten des zugegebenen Liganden ist gegen den Absorptionsgrad bei 492 nm aufgetragen, welche die Reaktionsgröße des Peroxidase-Nachweissystems darstellt. Wie in der Legende angezeigt, wurden acht verschiedene Hormonformen als Liganden innerhalb desselben Assays getestet. Die beiden hyperglykosilierten, von Chorionkarzinom stammenden, hCG-Isoformen sind die beiden wirksamsten Liganden (14). Die Wirksamkeit korrelierte gut mit der Hyperglykosilierung des Liganden (siehe 10 und Text).
11 Eigenschaften der zum Definieren der Antikörperspezifität verwendeten Reagenzien. Die Peptid- und Carbohydratstrukturen der verwendeten Reagenzien wurden bereits früher bestimmt (26). Der Prozentsatz (%) nicked β-Untereinheit bezieht sich auf den Anteil von Molekülen mit Spaltungen (fehlende Peptidbindungen) im Bereich β43 bis β48. Der Prozentsatz (%) Tetrasaccharid-Core entspricht dem Anteil an O-glykosidisch gebundenen Oligosacchariden mit Tetrasaccharid-(vs. Disaccharid-)Core-Struktur, und der Prozentsatz (%) N-Acetylneuraminsäure entspricht dem Anteil von O-glykosidisch gebundenen Strukturen mit Antennen, die mit N-Acetylneuraminsäureresten abschließen. Der Anteil an triantennären N-glykosidisch gebundenen Oligosacchariden in β-Untereinheiten ist angegeben, ebenso wie der der N-Acetylneuraminsäure.

^a % N-Acetylneuraminsäurereste pro Zuckerkette, N-glykosidisch gebundenen an β.
^b % N-Acetylneuraminsäurereste pro Zuckerkette, O-glykosidisch gebundenen an β.
^c Die "CR"-Reihen der hCG-Referenzpräparationen wurden an der Columbia University hergestellt und international als Referenzmaterialien für gereinigtes hCG verteilt. CR 119 ist ebenso bekannt als die 3. internationale Immunoassayreferenzpräparation für hCG.
^d ND wurde nicht gemacht; NA ist nicht anwendbar auf dieses Reagens.
^e In dieser Präparation ist weniger als 15 % der Beta-COOH-terminalen Region vorhanden.

12 Affinitätskonstanten^a, bestimmt durch Flüssigphase Kompetitionsassays unter Verwendung von C5 als Tracer-Ligand. ^aKa als L/M. ^bhCG CR 127 ist eine vom NIH verteilte, an der Columbia University hergestellte, hCG-Referenzpräparation.
13 Datenmatrizen für Bindungseigenschaften von verschiedenen Nachweisantikörperpaaren, unter Verwendung von B151 oder B152 als Capture-Antikörper.

A. Relative Kreuzreaktivitäten des zweiseitigen Assays unter Verwendung von B151 als Capture-Antikörper.
^a markierte Nachweisantikörper
^b out of low range – Nachweis
^c dieses besondere Assayformat wurde in O'Connor et al. (25) angewandt.
B. Relative Kreuzreaktivitäten des zweiseitigen Assays unter Verwendung von B152 als Capture-Antikörper.

Diejenige molare Quantität des Liganden wurde bestimmt, die benötigt wurde, um eine Bindung zu erzeugen, die 50 % der maximalen Bindung entsprach, welche durch CS erreicht wird. Die Kreuzreaktivität, welche in dieser Figur als Prozentsatz dargestellt ist, wurde mittels Teilen der molaren Quantität des Standards durch die molare Quantität des anderen Liganden bei 50 % der maximalen Bindungsdosis ermittelt.

^a markierte Nachweisantikörper
^b maximale Bindung stellt die Gesamtquantität des radiomarkierten Nachweisantikörpers dar, der an die Platte in dem beschriebenen System binden kann.
^c out of low range – Nachweis
^d dieses besondere Assayformat wurde in O'Connor et al. (25) angewandt.

14 Immunoreaktivität von Antigenen im B152 immunoradiometrischen Assay. Die Dosis-Antwortkurven, die verwendet wurden, um Daten für diese Figur bereitzustellen, sind in 9 gezeigt. Jede Kurve wurde mit 4–5 Punkten angepasst. Steigung und Bestimmtheitsmaß (R²) wurden unter Verwendung eines nicht-linearen Regressionsalgorithmus bestimmt. Steigungen wurden als Indikator für die Antigen-Potenz verwendet. Relative Wirksamkeit wurde abgeschätzt als die Steigung der Antigene relativ zu der Steigung von CS-Chorionkarzinom-hCG (das Antigen).

^a Steigungen stammen von 9 wie kalkuliert in Sigmaplot 4.01 durch lineare Regressionsanalyse. Steigungseinheiten sind pmol/ml Absorption bei 492 nm.

15(A–D) Isoformprofile aus Urin und Verhältnis bei normalen Ein-Kind-Schwangerschaften. ET-Tag ist ein Tag ab Embryotransfer.
16(A–C) Isoformprofile aus Urin und Verhältnis bei normaler Mehrlings-Schwangerschaft. ET-Tag ist ein Tag ab Embryotransfer.
17(A–E) Isoformprofile aus Urin und Verhältnis bei Verlust der Frühschwangerschaft. ET-Tag ist ein Tag ab Embryotransfer.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Verfahren zum Feststellen einer Problemschwangerschaft in einem Subjekt, umfassend die Schritte:

(a) (1) Inkontaktbringen einer ersten Menge einer Urin- oder Blutprobe von dem Subjekt mit einem B152-Antikörper, der von der Hybridom-Zelllinie produziert wird, die in der American Type Culture Collection unter der Kennzeichnungsnummer HB-12467 hinterlegt ist;
(2) Inkontaktbringen der Probe, die aus (a) (1) resultiert, mit einem B207-Antikörper, der gleichzeitig mit dem B152-Antikörper an die hCG-Isoform bindet, die vom B 152-Antikörper erkannt wird;
(3) Messen der Menge an gebundenem B207-Antikörper in der Urin- oder Blutprobe, um dadurch die Menge der mittels B 152 nachweisbaren hCG-Isoform in der Urin- oder Blutprobe zu bestimmen;
(b) (1) Inkontaktbringen einer zweiten Menge der Probe von dem Subjekt mit einem B109-Antikörper, welcher an intaktes, non-nicked hCG bindet, ohne wesentlich mit nicked hCG, freier hCGβ Untereinheit, hCGβcf, oder hLH zu kreuzreagieren;
(2) Inkontaktbringen der Probe, die aus (b) (1) resultiert, mit einem B108-Antikörper, der gleichzeitig mit dem B109-Antikörper an intaktes, non-nicked hCG bindet;
(3) Messen der Menge an gebundenem B108-Antikörper in der Probe, um dadurch die Menge an intaktem hCG in der Urin- oder Blutprobe zu bestimmen, mit der Maßgabe, dass die Schritte (a) und (b) in beliebiger Reihenfolge ausgeführt werden können;
(c) Bestimmen des Verhältnisses von mittels B152 nachweisbarem hCG zu intaktem hCG in der Probe aus den Messungen, die in (a) (3) und (b) (3) durchgeführt wurden; und
(d) Wiederholen der Schritte (a) bis (c) für Proben, die von dem Subjekt innerhalb der ersten 40 Tage der Schwangerschaft entnommen wurden, wobei das Fehlschlagen eine hinreichende Abnahme in dem in Schritt (c) bestimmten Verhältnis festzustellen verglichen mit der Menge an hCG, die in einem der Schritte (a) (3) oder (b) (3) bestimmt wurde, eine Problemschwangerschaft in dem Subjekt anzeigt, wobei eine derart hinreichende Abnahme durch den Schnittpunkt einer ersten und einer zweiten Kurve auf einem einzelnen Graphen nachgewiesen wird, wobei (i) der Graph eine x-Achse aufweist, die die Anzahl an Tagen seit dem Embryo-Übertragung, beginnend bei 0, anzeigt, einer ersten y-Achse, die die Konzentration von hCG anzeigt, dargestellt durch eine Kreatininkonzentration von zwischen 0,1 und 10 000 000 fmol/mg, und einer zweiten y-Achse, die das Verhältnis von mittels B152 nachweisbarem hCG zu intaktem hCG anzeigt, dargestellt durch einen logarithmischen Bereich von 0,1 bis 10, (ii) die erste Kurve das gemäß Schritt (c) bestimmte Verhältnis darstellt, (iii) die zweite Kurve die in einem der Schritte (a) (3) oder (b) (3) bestimmten Mengen an hCG darstellt, und (iv) nach dem Schnittpunkt die erste Kurve unter der zweiten Kurve verbleibt.

Das Hybridom, das den monoklonalen Antikörper B152 produziert, wurde am 3. Februar 1998 in der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, nach dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt. Dem Hybridom wurde die ATCC-Accession-Nummer HB-12467 zuerkannt.
Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die Probe eine Urinprobe.
Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die B152- und B109-Antikörper an eine feste Matrix gebunden.
Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die B207- und B108-Antikörper mit einem radioaktiven Isotop, Enzym, Farbstoff, Fluoreszenzmolekül, magnetischen Bead oder Biotin markiert. Die B207- und B108-Antikörper können mit dem radioaktiven Isotop I¹²⁵ markiert sein.
Diese Erfindung wird im folgenden Abschnitt der Experimentellen Details illustriert. Diese Abschnitte sind dargelegt, um beim Verständnis der Erfindung behilflich zu sein, wobei nicht beabsichtigt ist und dies auch nicht dahingehend ausgelegt werden soll, die in den im Anschluss daran folgenden Ansprüchen dargelegte Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.
EXPERIMENTELLE DETAILS FÜR DIE ERSTE REIHE VON EXPERIMENTEN
Beispiel 1: Antikörper gegen und Analyse von molekularen Isoformen des hCG in der Frühschwangerschaft und bei Verlust der Frühschwangerschaft
Einführung
Annähernd alle Untersuchungen zur Inzidenz von Verlust der Frühschwangerschaft (EPL) infolge von Exposition gegenüber putativen, die Fortpflanzung schädigenden Toxinen, entweder in normalen Populationen oder in Risikopopulationen (Hakim, R. B., et al., 1995; Lasley B. L., et al., 1995), verwenden Assays für heterodimäres, non-nicked hCG oder Kombinationsassays, welche die freie Beta-Untereinheit sowie das Beta-Core-Fragment von hCG beinhalten. Ein wichtiger Punkt der bei der Messung von EPL zu berücksichtigenden Formen des hCG wurde hinsichtlich des oben beschriebenen Nicking-Phänomens verstärkt. Da nicked hCG-Moleküle durch die in den meisten EPL-Studien eingesetzten Antikörper nicht nachgewiesen werden, ist die Inzidenz von EPL vermutlich um diejenige Menge unterbestimmt, die anteilsmäßig dem Ausmaß des Nicking in den Molekülen aus Urin entspricht. Ein anderes Anliegen von wesentlicher Bedeutung war eine Bestimmung der Art der "hCG-ähnlichen" Immunoreaktivität im Urin während des periovulatorischen Anschwellens im Menstruationszyklus (O'Connor J., et al., 1995). Neueste Berichte bestätigten die Existenz und dokumentierten die Struktur von einer in der Hypophyse produzierten sulfatierten Form des hCG (Birken, S., et al., 1996b). Sowohl bei Männern als auch bei nicht-schwangeren Frauen tritt eine pulsierende Sekretion von hCG auf (Odell, W. D.; Griffin, J., 1989 und Odell, W. D.; Griffin, J., 1987). Das Vorhandensein einer nichtschwangerschaftsassoziierten Form von sulfatiertem hCG hypophysären Ursprungs, die zum Zeitpunkt der Ovulation ihren Höhepunkt erreicht und in der Lutealphase vielleicht persistiert, könnte möglicherweise die korrekte Abschätzung von EPL beeinträchtigen.
Bislang nicht in Betracht gezogene Isoformen des sehr früh in der Schwangerschaft in Blut und Urin auffindbaren hCG können in vivo wirksamer sein als die später in der Schwangerschaft produzierten Formen des hCG. Die Abwesenheit solcher Isoformen kann eine mögliche Ursache des Verlusts der Frühschwangerschaft sein. Ein sensitives und spezifisches Immunoassaysystem wurde entworfen und hergestellt, um spezifische, mit früher Schwangerschaft assoziierte, molekulare Isoformen des hCG (EPMI) zu messen. Diese Isoformen, die sich wahrscheinlich durch ihre Carbohydratzusammensetzung unterscheiden, sind prädiktiv für ein erfolgreiches Austragen der Schwangerschaft. Wenn diese mit der Frühschwangerschaft assoziierten Isoformen des hCG abwesend oder nur in geringer Konzentration vorhanden sind, kann die Schwangerschaft sehr früh verloren und nur als "chemische" Schwangerschaft wahrgenommen werden. Diese hCG-Isoformen können den in einigen Chorionkarzinompatientinnen produzierten Formen des hCG ähneln, von denen das, wie hierin nachfolgend beschrieben, zur Produktion des monoklonalen Antikörpers B152 verwendete Antigen stammte. Die Isoformen ähneln denjenigen von Trophoplastenerkrankung nicht im Hinblick auf Nicking oder intakte Peptidketten, sondern wahrscheinlich im Carbohydratgehalt. Die vorliegende Erfindung beschreibt, dass das molare Verhältnis von B152- zu B109-Epitopen prädiktiv für eine erfolgreiche Schwangerschaft oder einen Verlust ist. Drei Gruppen schwangerer Patientinnen wurden analysiert: (a) normal schwangere Frauen, (b) Frauen, die wiederholt Fehlgeburten erlitten, (c) Frauen, die sich der Implantation eines Embryos unterzogen.
Es ist möglich, diejenigen hCG-Isoformen, die in Blut und Urin von Frauen mit wiederholten spontanen Fehlgeburten vorliegen, zu bestimmen, ebenso wie eine ähnliche Analyse bei Frauen möglich ist, die sich der Implantation eines Embryos unterzogen. Die kombinierte Häufigkeit von EPL und spontaner Fehlgeburt in gesunden Populationen beträgt 31 %. Subjekte, die drei aufeinander folgende, wiederholte spontane Fehlgeburten erlitten, tragen ein 32%-iges Risiko, eine weitere zu erleiden (Hill, J. A.; Anderson, D. J., 1990). Bei In Vitro-Fertilisations (IVF)-Schwangerschaft beträgt die Verlustrate 70 % bei Nicht-Spendersperma und 50 % bei Verwendung von Spendersperma. Die Abgrenzung der Schwangerschaften mit negativem Ausgang von Schwangerschaften mit positivem Ausgang kann auf Unterschieden in den Konzentrationen von EPMI-hCG-Isoformen (z. B. als Unterschiede im B152/B109-Verhältnis in Patientinnen) beruhen. Darüber hinaus können Proben von gestationsbedingter Trophoplastenerkrankung (GTD) verwendet werden, um zwischen GTD und Normalschwangerschaft zu unterscheiden.
Ergebnisse
In vitro-Bioassay für hLH/hCG
Ein hCG-Bioassay wurde konstruiert, in dem CHO-Zellen einsetzt werden, welche den funktionellen humanen LH/CG-Rezeptor exprimieren. Tabelle 1 zeigt die mittels dieses Assays gemessenen Unterschiede in vitro in biologischer Aktivität zwischen nicked und non-nicked hCG. Dieses System ist verwendet worden, um die Aktivität von hypophysärem und plazentalem hCG zu evaluieren (Birken, S., et al., 1996b). hCG-Präparationen wurden auf nicked und non-nicked molekulare Isoformen des hCG in einem zweiten rekombinanten Bioassaysystem getestet (Ho, H-H., et al., 1997). In beiden Systemen wurden ähnliche Ergebnisse erzielt.
Werte aus Normalschwangerschaft, verglichen mit EPL-Werten
Die Ergebnisse zeigten, dass nicked hCG kein wesentlicher molarer Bestandteil ist, weder von der Frühschwangerschaft noch von EPL. Die Daten zeigten, dass biologische Aktivität nicht mit nicked hCG korreliert ist, stattdessen jedoch einer Form des hCG zuzuordnen ist, welche durch den B152 monoklonalen Antikörper ATCC # HB-12467 erkannt wird, einer mit früher Schwangerschaft assoziierten molekularen Isoform des hCG (EPMI hCG). Es wurde festgestellt, dass mit EPL, verglichen mit früher Normalschwangerschaft, eine verminderte hCG-Bioaktivität assoziiert ist (Ho, H-H., et al., 1997). Demnach ist eine verminderte biologische Aktivität von hCG ein Faktor in EPL, welche eine Konsequenz einer bislang unbeachteten Isoform des hCG ist – einer mit der Frühschwangerschaft assoziierten molekularen Isoform des hCG.
hCG-Analyten aus Urin.
Metaboliten von hCG und hLH wurden in einer Vielfzahl verschiedener Stadien untersucht (Birken, S. et al., 1996a). Eine Studie zeigte einen 31%-igen Verlust der Schwangerschaft (Zinaman MJ, et al., 1996), während eine andere basierend auf hCG-Assays eine 17,4%-ige Häufigkeit des Verlusts der Frühschwangerschaft zeigte (Ellish, N. J., et al., 1996). Es ist bekannt, dass hCG und hCG Beta-Core sogar bei Fehlen der Nidation leicht vom Uterus in den Kreislauf transferiert werden können (Chang, P. L., 1997). Das molekulare Spektrum von hCG-Analyten aus Urin in EPL-Zyklen, normalen empfänglichen Zyklen und nicht-empfänglichen Zyklen ist evaluiert worden. Die Ausgestaltung der Studien und die Demographie der Untersuchung ist beschrieben worden (Ellish, N. J., et al., 1996).
Kurzgesagt, drei Urinproben pro Zyklus, entsprechend den Tagen 9, 10, 11 nach dem errechneten Tag des Eisprungs, wurden gesammelt und in einem Screening-Assay analysiert (dem "Combo"), welcher gleichzeitig intaktes, non-nicked hCG, hCG freie Beta-Untereinheit und hCG Beta-Core-Fragment detektiert. Einzelbestimmungen für jeden dieser Analyten sowie für nicked hCG und diejenige Form des intakten hCG, welche durch den monoklonalen Antikörper B152 (EPMI hCG) nachgewiesen wird, wurden mit diesen Proben durchgeführt. Darüber hinaus wurden die Level von intaktem hLH, hLH-freier Beta-Untereinheit und hLH Beta-Core-Fragment in normalen Schwangerschaftszyklen und den nicht-empfänglichen Zyklen bestimmt, da die Konzentration von Lutealphase-hLH Analyten aus Urin aufgrund der Kreuzreaktion in hCG-Assays ein Problem darstellt. Tabelle 1 fasst die Eigenschaften der angewandten immunometrischen Assays zusammen.
TABELLE 1. Assayformat und Spezifität

^a – (sofern nicht angegeben) hLH, freies Beta-hLH, hLH Beta-Core-Fragment, hCG, freies Beta-hCG, hCG Beta-Core-Fragment;
^b – (sofern nicht angegeben) das gleiche wie ^(a) plus nicked hCG und nicked freies Beta-hCG (Schwangerschaft).

Die Ergebnisse zeigen, dass aus nicked hCG keine signifikante Molefraktion der Harn-hCG-Immunoreaktivität resultiert, weder in EPL, noch in früher Normalschwangerschaft. Darüber hinaus findet man in einigen Subjekten, sowohl in Schwangerschaft als auch in EPL, eine beträchtliche Absonderung von hCG freier Beta-Untereinheit. Weiterhin exprimieren sowohl EPL- als auch Normalschwangerschaftszyklen alle der gemessenen Analyten variabel. Obwohl sowohl die Inzidenz als auch das Expressionslevel zwischen EPL und normaler Schwangerschaft unterschiedlich sind, gibt es keinen hCG-verwandten Analyten, der für einen von beiden Zuständen spezifischen ist. Allerdings bestand ein deutlicher Unterschied zwischen den hLH-assoziierten Analyten in der Kontrollpopulation (nicht-empfängliche Zyklen) und der Gruppe der Normalschwangerschaft. Nahezu alle der Nichtschwangerschaftszyklen exprimierten hLH freie Beta-Untereinheit sowie hLH Beta-Core-Fragment, während lediglich ein Drittel der empfänglichen Zyklen detektierbare Level beider Analyten aufwies. Intaktes hLH erwies sich als geringfügiger Bestandteil der hLH-Profile beider Gruppen.
Diese Ergebnisse veranschaulichen sowohl die Notwendigkeit der Messung von hCG Beta-Core-Fragment beim Nachweis von EPL, so wie sie sicherstellen, dass der hCG Beta-Core-Assay nicht mit Beta-Core-hLH kreuzreagiert, welches nachweislich in dem Teil der Lutealphase vorhanden ist, in dem EPL-Messungen durchgeführt werden. Die Daten sind in 2 zusammengefasst.
Aufgrund der innerhalb der Gruppen stark abweichenden Werte der hCG-Analyten wurden statistische Anlayse erst nach Transformation der Werte der Analyten zu Molefraktionen durchgeführt, um so eine besser verwendbare Analyse zu erzeugen. Die Daten der Molefraktionen wurden mittels Diskriminanzanalyse und mittels eines das LMP (Datum der letzten Menstruation) berücksichtigenden Modells der gemischten Effekte evaluiert. Die Diskriminanzanalyse wurde sowohl mit als auch ohne Ausblenden der "Ausreißer" (definiert als Werte größer als zweimal die Standardabweichung vom Mittelwert) durchgeführt. Beide Ansätze erzielten ähnliche Ergebnisse.
Eine quadratische Diskriminanzanalyse, basierend auf einem Kreuzvalidierungsverfahren, zur Minimierung des systematischen Fehlers, klassifizierte 91 % der Normalschwangerschaftssubjekte und 80 % der EPL-Subjekte.
Die Analyse der gemischten Effekte, welche auf Interaktionen zwischen Molefraktion der Analyten und Zeit seit LMP testete, zeigte keine signifikanten Zeit- oder Gruppen (EPL vs. normal)-Effekte im Assay mit intaktem hCG. Im Assay mit freier Beta-Untereinheit von hCG trat ein signifikanter Gruppeneffekt, jedoch keinen Zeittrend auf. Sowohl in der hCG Beta-Core-Fragmentmessung als auch in der B152-Messung unterschieden sich sowohl die Hormonlevel als auch der Zeittrend von LMP zwischen EPL und Schwangerschaftsgruppen signifikant. Aus dieser Studie ergaben sich mehrere wichtige Erkenntnisse. Sie definierte das Spektrum der Analyten sowohl für die Frühschwangerschaft als auch für EPL und klärte dabei die Frage, welche hCG-Analyten in epidemiologischen Studien zu messen sind, in denen EPL die Endpunktsbestimmung darstellt. Was noch wichtiger ist, sie verdeutlichte zum ersten Mal, dass signifikante Unterschiede sowohl in den Mustern der Analyten als auch im Zeitverlauf ihres Auftretens zwischen früher Normalschwangerschaft und EPL auftreten. Diese Beobachtung erleichtert die vorzeitige Prognose einer problematischen Schwangerschaft durch hCG-Messungen im Urin zu einem Zeitpunkt, der noch ein therapeutisches Eingreifen erlauben würde.
Immunoreaktivität von verschiedenen hCG-Formen in zwei IRMA's (B152-B207 und B109-B108)
Die relative Bindung von drei verschiedenen hCG-Formen (hCG aus Urin, hypophysäres hCG und Chorionkarzinom-hCG C5) wurde in den beiden hCG-Assays charakterisiert (3). Non-nicked hCG aus Urin und hypophysäres hCG werden nahezu gleichmäßig gut in den zwei IRMAs erkannt, während die C5-Erkennung völlig unterschiedlich ist. Der B152-B207*-Assay ist erwartungsgemäß sensitiver für C5, da der B152-Antikörper aufgrund seiner höheren Affinität zu C5 entwickelt und ausgewählt wurde. Non-nicked hCG aus Urin wird aus der CR127-Präparation des gepoolten Normalschwangerschafts-hCG gereinigt.
Umgekehrt wird C5 mit geringerer Affinität durch den B109-B108*-Assay erkannt, der primär eine Spezifität für die hCG-Isoformen der späten Schwangerschaft aufweist.
Wir haben ein Verfahren entwickelt, um Änderungen von hCG-Isoformen im Serum oder Urin während der gesamten Schwangerschaft direkt zu profilieren. Dazu werden zwei IRMAs für hCG eingesetzt, jeder basierend auf monoklonalen Antikörpern gegen unterschiedliche hCG-Epitope. Der B109-B108*-Assay ist ein häufig gebrauchter Assay für intaktes hCG gegen die heterodimär-abhängigen Epitope. Ein neuer Assay, B152-B207*, ist sehr wahrscheinlich sensitiv für den Carbohydratteil des hCG-carboxyterminalen Peptids. In beiden Assays wurde das gleiche Standard-non-nicked hCG verwendet. Non-nicked hCG wurde eingesetzt, da der B109-Assay nur schwach mit den nicked Formen des hCG reagiert, während der B152-Assay nicht zwischen nicked und non-nicked Formen des Hormons unterscheidet. Der B152-Assay weist mit stark erhöhter Sensitivität diejenigen hCG-Isoformen nach, die früher in der Schwangerschaft auftreten als die durch den B109-Assay gemessenen (O'Connor et al. 1998). Vor der Entwicklung des in diesem Bericht beschriebenen immunometrischen Assaysystems war ein einfaches Erkennen der Änderungen der hCG-Isoformen von sehr früher Schwangerschaft hin zur Mitte der Schwangerschaft nicht möglich. Das einzige verfügbare Verfahren zum Untersuchen dieser Änderungen war isoelektrisches Fokussieren jeder einzelnen Patientenprobe, gefolgt vom Immunoassay jeder fokussierten Fraktion (Berger et al., 1993; Ulloa-Aguirre et al. 1990). Das IEF-Muster spiegelt die Heterogenität des geladenen Zuckers, der N-Acetylneuraminsäure, wider, die mit den multiantennären Strukturen der Carbohydratteile, in denen N-Acetylneuraminsäure der terminale Zucker ist, variiert. Obwohl wir die genauen Eigenschaften der gemessenen Isoform-Epitope noch nicht kennen, basiert der Beweis für die Carbohydratdiskriminierung auf der hyperglykosilierten Struktur des Antigens, C5, welches verwendet wurde, um den B152 monoklonalen Antikörper zu entwickeln sowie auf der Reaktivität des Antikörpers mit den in der JAR-Chorionkarzinomzelllinie vorkommenden hCG-Isoformen. CS-hCG wurde aus einer Patientin isoliert, die an einem Chorionkarzinom litt und wurde sorgfältig hinsichtlich seines Protein- und Carbohydratgehalts sowie seiner Struktur charakterisiert (Elliott et al. 1997). Es wurde gezeigt, dass sich C5 (und hCG anderer Chorionkarzinomsubjekte) im Proteinteil hauptsächlich durch das Vorhandensein einer erhöhten Anzahl an nicked-Positionen sowie durch verstärkte Glykosilierung vom hCG der Normalschwangerschaft unterscheidet. Im Vergleich mit hCG der Normalschwangerschaft weist das von Chorionkarzinom stammende hCG eine verstärkte Fukosylierung der N-glykosidisch gebundenen, biantennären Oligosaccharide in der Beta-Untereinheit auf. Darüber hinaus weisen die O-glykosidisch gebundenen Oligosaccharide in der Präparation C5 (eine von einer einzelnen an einem Chorionkarzinom leidenden Patientin produzierte hCG-Form) ein 100%-Tetrasaccharid-Core am COOH-terminalen Bereich der Beta-Untereinheit auf. Normales Mittschwangerschafts-hCG weist nur 10–20 % dieser Struktur auf (Elliott et al. 1997). Diese Beobachtungen, unter Berücksichtigung unserer eigenen Feststellung, nämlich dass das von der JAR-Chorionkarzinom-Zelllinie synthetisierte hCG ein B152/B109-Isoformverhältnis ähnlich dem in der Frühschwangerschaft beobachteten aufweist, lässt uns zu dem Schluss kommen, dass in sehr früher Schwangerschaft die sich entwickelnden Trophoplasten eine hCG-Isoform sekretieren, die der in einem Chorionkarzinom produzierten ähnelt.
Wir haben ebenso die Erkennung von hypophysärem hCG getestet, da seine N-Asn-Carbohydrate sich etwas von denjenigen des plazentalen hCG unterscheiden, wobei sie eine größere Ähnlichkeit zu jenen von hLH aufweisen, welche sowohl N-Acteylneuraminsäure als auch Sulfatgruppen besitzen (Birken et al. 1996). Die Carbohydratstruktur des β-COOH-terminalen Teils von hypophysärem hCG ist noch nicht bekannt. Da B152 keine wesentlichen Unterschiede zwischen hypophysärem und plazentalem hCG erkennt (3), sind Unterschiede in der N-Asn-Erkennung unwahrscheinlich. In Bezug auf die COOH-terminalen Carbohydrate scheint es, dass hypophysäres und plazentales hCG (Mittschwangerschafts-Isoformen) ähnlich sind, weshalb angenommen wird, dass das O-glykosidisch gebundene Carbohydrat auf dem C5-Antigen Teil des Epitops von B152 ist.
Beispiel 2: Das B152/B109-Verhältnis sagt den Ausgang der Schwangerschaft vorher
Das in Urinproben über den gesamten Schwangerschaftsverlauf hinweg gemessene B152/B109-Verhältnis
Die relativen Konzentrationen von hCG-Isoformen in 103 Urinproben von Normalschwangerschaften (5–39 Wochen nach der letzten Monatsblutung – LMP) wurden durch zwei immunometrische Assays bestimmt (B152-B207* und B109-B108*). Sowohl aufgrund der selbst bei gleichlang andauernden Schwangerschaften in den einzelnen Proben stark gestreuten hCG-Konzentrationen, als auch aufgrund der Tatsache, dass keiner der Assays für die zwei (oder mehr) Familien der vorkommenden hCG-Isoformen absolut spezifisch ist, fanden wir heraus, dass das Darstellen der Ergebnisse als ein Verhältnis der zwei beobachteten Isoformgruppen die Änderung im Gehalt der Isoform während des zeitlichen Verlaufs der Schwangerschaft viel deutlicher beschreibt. Das errechnete Verhältnis ist in 4 gezeigt. In Woche 5–8 der Schwangerschaft schwankt das Verhältnis der B152/B109-Isoformen zwischen 6,2 und 1,3, wodurch eine Vorherrschaft der B152-Isoform(en) in der Frühschwangerschaft angezeigt wird. Während des Zeitraums von Woche 10 bis 12 schwankt das Verhältnis von 1–0,2, wodurch angezeigt wird, dass während des zeitlichen Verlaufs der Schwangerschaft eine Umkehr im Gehalt der hCG-Isoform auftritt. Diese Abnahme im Verhältnis setzt sich fort, indem sie im Zeitraum von Woche 15–18 zwischen 0,54–0,08 schwankt und nach 29 Wochen einen Wendepunkt erreicht. Zu diesem Zeitpunkt erreicht das Verhältnis einen Wert von etwa 0,06, nach dem das Verhältnis in Woche 37–39,5 der Schwangerschaft einen Anstieg auf einen Bereich von 0,2–0,07 erfährt.
Statistische Analysen schlossen das Anpassen der Log-transformierten Daten des Verhältnisses an polynominale Regressionsmodelle der zweiten und dritten Ordnung ein. Da der Term der dritten Ordnung nicht signifikant war (Wahrscheinlichkeitsverhältnis c²(1) = 1,32, P = 0,25), wurde das Modell der zweiten Ordnung verwendet (r² = 0,793). Basierend auf diesem Modell erreichte das Log-B152/B109-Verhältnis einen Wendepunkt bei LMP = 29 Wochen.
Die B152-B207*-Werte spiegeln eine Messung der B152-Isoform in Bezug auf hCG-Äquivalente der späten Schwangerschaft wider, allerdings nicht in absoluten Mengen. Es ist zu betonen, dass die Messung der "absoluten" Konzentrationen im B152-Assay auf einer äquimolaren Basis nicht mit den Ergebnissen des B109-Assays verglichen werden können, da im B152-Assay die Wirksamkeit der hyperglykosilierten Isoform gegenüber dem Standard, das heißt, dem hCG des späteren ersten Trimesters der Normalschwangerschaft, sehr viel höher ist. Die tatsächlichen molaren Werte dieser Isoform betragen größenordnungsmäßig zehnfach weniger als jene im Assay erfassten. Aus diesem Grund haben wir es vorgezogen, nicht die tatsächlichen molaren Mengen der zwei Analyten zu analysieren, sondern nur das Verhältnis aus beiden Messungen.
Sogar in Normalschwangerschaft variieren die erhaltenen hCG-Werte stark gemäß den Eigenschaften der eingesetzten immunologischen Reagenzien (Cole und Kardana, 1992; Cole et al. 1993). Wir stellen die Hypothese auf, dass die beiden in diesem Bericht beschriebenen Assays hCG-Isoformen primär an entgegengesetzten Enden dieses Spektrums detektieren, wobei jeder vornehmlich eine Teilmenge an eng verwandten Molekülen im Kontinuum der molekularen hCG-Formen von früher bis später Schwangerschaft erkennt.
Wir haben die Verwendung von Normalschwangerschafts-hCG als Standard im B152-B207*-Assay beibehalten, ungeachtet seiner in dieser Antikörperkonfiguration verminderten Affinität. Die Gründe hierfür liegen im beschränkten und unerneuerbaren Vorrat an C5 (welches aus dem Urin einer einzelnen Patientin isoliert wurde) sowie in der Variabilität der Daten, die aus Untersuchungen resultieren, bei denen verschiedene Standards verwendet werden. Die Konsequenzen dieser Auswahl sind diese, dass die hCG-Isoformen der frühen Schwangerschaft eine merklich erhöhte Immunopotenz gegenüber denjenigen der Normalschwangerschaft aufweisen und ihre molaren Quantitäten daher in diesem Assay überbestimmt sind. Wir nutzen diesen Affinitätsunterschied zu unserem Vorteil indem wir ein Verhältnis der molaren Ergebnisse aus zwei Assays (B152 und B109) zugrunde legen. Jeder Assay für sich genommen verschleiert aufgrund der in Normalschwangerschaft auftretenden starken Abweichung der hCG-Werte diese Abweichung.
Andere haben fortschreitende Änderungen in hCG-Isoformen über die gesamte Schwangerschaft hinweg dokumentiert. Skarulis et al. fanden, dass der Fukosegehalt von sowohl intaktem hCG als auch dessen freien Beta-Untereinheit im Verlauf der Schwangerschaft zunahm (Skarulis et al. 1992). Diaz-Cueto et al. fanden beim Untersuchen des isoelektrischen Fokussierungsmusters von zirkulierendem hCG über den Verlauf der gesamten Schwangerschaft hinweg, dass in der Frühschwangerschaft mehr als 80 % der hCG-Isoformen sauer waren. Diese Fraktion verringerte sich spät im dritten Trimester auf weniger als die Hälfte (47 %) (Diaz-Cueto et al. 1996). Im Gegensatz dazu fanden Wide und Hobson, dass das hCG der Frühschwangerschaft aufgrund seiner größeren biologischen Aktivität sich stärker "Chorionkarzinom-ähnlich" verhielt als das hCG der Normalschwangerschaft (Wide und Hobson, 1987). Fein et al. bestimmten in einer Studie, in der Gelfiltration eingesetzt wurde, dass hCG des ersten Trimesters eine größere Größe als jenes des dritten Trimesters aufwies. Behandlung mit Exoglykosidasen beseitigte den Größenunterschied, wodurch angezeigt wurde, dass das hCG des ersten Trimesters stärker glykosiliert war (Fein et al. 1980).
Das B152/B109-Verhältnis in aufeinander abgestimmten Serum/Urinproben im ersten und dritten Trimester der Schwangerschaft, verglichen mit hCG von JAR-Zellen.
Das B152/B109-Verhältnis in Serum ist analog dem in aufeinander abgestimmten Urinproben und erfährt bei fortschreitender Schwangerschaft eine ähnliche Änderung (5). Das B152/B109-Verhältnis im Zellüberstand von JAR-Zellen (einer von einem Chorionkarzinom abstammenden Zelllinie) ähnelte dem der Frühschwangerschaft.
Die B152/B109-Verhältnisse sowohl von Serum- als auch von Urin-hCG-Konzentrationen sind im ersten Trimester signifikant höher gegenüber denjenigen des dritten Trimesters von Normalschwangerschaften (Tabelle 2). Signifikante Unterschiede zwischen Serum- und Urin-hCG-Konzentrationsverhältnissen sowie log-transformierten Verhältnissen in früher (5–6 Wochen) und später (36–39 Wochen) Schwangerschaft wurden mittels gepaarter t-Tests evaluiert (Tabelle 3). Sowohl in den ersten als auch in den dritten Trimestern waren die B152/B109-Verhältnisse im Urin gegenüber den Serumverhältnissen signifikant erhöht, wodurch angezeigt wurde, dass dort eine bevorzugte Clearance der von B152 erkannten Isoform im Urin vorlag, ungeachtet der relativen Konzentrationen der zwei Isoformen.
TABELLE 2. Analyse des B152/B109-Verhältnisses in Serum und in Urin in ersten vs. dritten Trimestern der Schwangerschaft.
TABELLE 3. Analyse des B152/B109-Verhältnisses in Serum vs. Urin in den ersten und dritten Trimestern der Schwangerschaft.
In Urinproben von IVF-Patientinnen (1–4 Woche nach Embryotransfer-ET) lag das B152/B109-Verhältnis wiederum zwischen 2–8 und verringerte sich im Verlauf der Schwangerschaft (6), ähnlich dem bei natürlichen Empfängnissen beobachteten. Die Auswirkung der Schwangerschaftsdauer auf die Ergebnisvariablen kann am besten mittels einer linearen oder quadratischen Funktion dargestellt werden. ANCOVA-Modelle, einschließlich der zweiten Ordnungswoche, wurden an die allgemeine Gleichung angepasst: Ergebnis = (Zeiteffekt nach ET) + (Effekt der Diagnose). Nachdem ein geeignetes ANCOVA-Modell bestimmt wurde, wurden die kleinsten Quadratmittelwerte (angepasst an Woche nach ET-Effekt) zwischen Populationen mit Normalschwangerschaft, Bauchhöhlenschwangerschaft und spontaner Fehlgeburt verglichen (Tabelle 4). Die log-transformierten Werte von sowohl B109-B108*- als auch B152-B207*-gemessenen hCG-Formen unterschieden sowohl Bauchhöhlenschwangerschaft als auch spontane Fehlgeburten von Normalschwangerschaft (P = 0,0001). Das Verhältnis der log-transformierten Werte unterschied Fehlgeburt von Normalschwangerschaft (P = 0,016). Trotzdem unterschied weder das Verhältnis von B152/B109 noch der Log dieses Verhältnisses eine der beiden Schwangerschaftsstörungen von Normalschwangerschaft.
Bei IVF-Schwangerschaften tritt eine erhöhte Anzahl spontaner Fehlgeburten und Bauchhöhlenschwangerschaften auf. Wir fanden keinen Unterschied im Verhältnis der Isoformen zwischen einer der beiden Kategorien im Vergleich zu Kontrollen, was möglicherweise eine Folge der geringen statistischen Aussagekraft ist. Trotzdem wurde ein signifikanter Unterschied zwischen den B152 hCG-Isoformlevel in Normalschwangerschaft und spontaner Fehlgeburt gefunden. Dies stützt unsere bisherigen Erkenntnisse zum Verlust der Frühschwangerschaft, in dem verminderte oder abwesende Level der B152-Isoformen einen Verlust der Frühschwangerschaft kennzeichneten (O'Connor et al. 1998).
TABELLE 4. IVF-Patientinnen: Kovarianzanalyse von hCG-Isoformen zwischen Normalschwangerschaft (np), Bauchhöhlenschwangerschaft und spontaner Fehlgeburt als Funktion der Schwangerschaftsdauer.

^a – ANCOVA-Modell mit polynominalem Koeffizienten (oder Parameter) 2. Ordnung.
^b – ANCOVA-Modell mit einem Koeffizienten ausschließlich 1. Ordnung (linear).
^c – Angepasstes R² ist ein R², das die Anzahl an Koeffizienten an das ANCOVA-Modell derart anpasst, dass Vergleiche zweier R² mit verschiedenen ANOVA-Modellen bei unterschiedlicher Anzahl an Koeffizienten aussagekräftig ist.
^d – "Paarweise Abweichung" basiert auf dem t-Test Vergleich der geringsten Quadratmittelwerte der Ergebnisvariablen (nach Anpassen des Effekts der ET-Woche).
^e– Freiheitsgrad (df1, df2) für den F-Test beträgt (2,82) für ein Modell mit lediglich linearem Koeffizient und (2,81) für ein Modell mit sowohl linearem als auch Koeffizient 2. Ordnung.

HCG-Analysen von Proben von Trophoblastenerkrankung
Serum (17 Proben) sowie Urin (28 Proben) von Trophoblastenerkrankung wurden von post-Therapie-Patientinnen erhalten und wiesen demzufolge niedrige hCG-Level auf. Infolge der begrenzten Probenmenge wurden diese Proben in einer 1:10-Ausgangsverdünnung verwendet. hCG-Level in Serum waren niedrig. Die höchste hCG-Konzentration im Serum betrug 202 fmol/ml im B152-B207*-Assay, mit einem entsprechenden Wert von 148 fmol/ml in der B109-B108*-Bestimmung. Sechs von siebzehn Serumproben wiesen nachweisbare Level auf, wobei sich für 4/6 im B152-B207*-Assay ein höherer Wert ergab. Von den 15/28 positiven Urinproben wiesen jedoch 14/15 im B152-B207*-Assay höhere Level auf als im B109-B108*-Assay, wobei der höchste hCG-Wert 20000 fmol/ml im B152-B207*-Assay und 18715 fmol/ml im entsprechenden B109-B108*-Assay betrug. Aufgrund des geringen Probenumfangs wurden diese Daten keinem statistischen Verfahren unterzogen, allerdings betrug sogar bei diesen post-Therapie-Patientinnen das B152/B109-Verhältnis ≥ 1, was dem hCG-Isoform-Verhältnis der Frühschwangerschaft entspricht.
Die oben beschriebene Begrenzung der Probenmengen schließt jegliche definitive Schlussfolgerung aus der Analyse der Proben der Trophoblastenerkrankung aus. Allerdings scheint es, als könnte angenommen werden, dass beim Nachweis der hCG-Immunoreaktivität in Blut und Urin von Patientinnen, die an Trophoblastenerkrankung leiden, der B152-Assay gegenüber dem B109-Assay sensitiver ist, sogar nach Therapie.
Chromatographie des Schwangerschafts-Pools der ersten Schwangerschaftswoche
Um zu bestimmen, ob der B152-B207*-Assay zusätzlich zu den intakten hCG-Molekülen auch noch andere Formen hCG-assoziierter Immunoreaktivität erkennt, wurden die Proben gepoolt. FPLC auf Tandem Superose 12-Säulen, gefolgt von einem Immunoassay der Fraktionen aller charakterisierten hCG-Formen zeigte auf, dass lediglich das intakte hCG-Molekül (oder hCG freie Beta-Untereinheit) in diesem Assay ein Signal hervorrief (siehe 8). Durch den B152-B207*-Assay wurden keine Fragmente mit geringeren Molekulargewichten identifiziert. Der hCG freie Beta-Analyt wurde in den in 6 beschriebenen 159 Urinen gemessen und zeigte, dass er einen vernachlässigbaren Beitrag zur gesamten hCG-Immunoreaktivität in diesen Proben leistet.
Moleküle, die vom monoklonalen Antikörper B152 in Harn- und Hypophysenextrakten erkannt werden.
Um die Eigenschaften der hCG-Isoformen, die von B152 erkannt werden, zu definieren, wurden hoch auflösende Gelfiltrationssäulen von sowohl Hypophysenextrakten als auch postklimakterischen Urinkonzentraten verwendet (siehe 8). Der Grund für die Verwendung von Hypophysenextrakten lag darin, die kreuzreaktiven Moleküle zu bestimmen, insbesondere diejenigen, die glykosiliert sind und die in der Hypophyse, welche die gesamte Familie der Glykoprotein-Hormone, hLH, hTSH und hFSH sowie die freien Untereinheiten und die hypophysäre Form des hCG enthält, reichlich vorhanden sind. Zwei Höchstwerte werden in beiden dieser Fälle nachgewiesen. Lediglich ein Peak wurde, wie früher beschrieben, in ähnlichen Studien mit Harnkonzentraten aus Schwangerschaft nachgewiesen. In der Hypophyse ist es wahrscheinlich, dass das größere Molekül hypophysäres hCG (70K) ist, während das Molekül mit der geringeren Größe hLH ist. Da hLH verglichen mit hypophysärem hCG in etwa 100× häufiger vorhanden ist, zeigt die offensichtlich ähnliche Stärke der Immunoreaktivität an, dass B152 eine gegenüber hCG verminderte Kreuzreaktivität mit hLH aufweist. Ebenfalls kommen sowohl hCG als auch hLH in postklimakterischem Urin vor, wobei wiederum sehr viel mehr hLH als hCG vorhanden ist, ebenso wie das B152-Muster ähnlich dem des Hypophysenextrakts ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass B152, abgesehen von der Kreuzreaktivität mit hLH (wie anhand von Standard-Kreuzreaktionsstudien in Tabelle I gezeigt), generell hCG-spezifisch ist und dass seine Carbohydratspezifität sich sowohl auf den Proteinteil als auch auf die Carbohydratteile von hCG (und in einem geringeren Ausmaß von hLH) richtet, da er weder mit der Vielzahl der anderen in der Hypophyse vorhandenen glykosilierten Proteine noch mit denjenigen in postklimakterischem Urin, ausgenommen der hCG- oder hLH-verwandten Moleküle, reagiert.
Serum- und Urinproben wurden unter Verwendung von zwei Assays untersucht, B109-B108* und B152-B207*, welche den Unterschied der molekularen Isoformen des hCG erkennen. Siehe Tabelle I. Der in vitro Bioassay für hLH/hCG ist oben beschrieben. (Siehe 1). Die Ergebnisse sind in den 6–11 dargestellt. Im immunometrischen Assay wird die 96-Well Mikrotiterplattentechnologie eingesetzt. Der Coating-Antikörper wird in einer bestimmten Konzentration in Carbonatpuffer (0,2 M, pH 9,5) auf die Mikrotiter-Wells (Imulon IV, Dynatech Laboratories) appliziert, die so bestimmt wurde, dass sie die befriedigendste Kombination von Sensitivität und Schwankungsbreite liefert. Die Platten werden mit der Coating-Lösung bei 4 °C über Nacht inkubiert, anschließend abgesaugt, mit Waschlösung (0,05 % Tween, 0,15 N NaCl) gewaschen und mit einer 1%-igen BSA-Lösung geblockt (drei Stunden bei Raumtemperatur). Die BSA-Lösung wird abgesaugt und die geeigneten hCG-Standards (200 μL/Well) wurden entsprechend der jeweiligen Probenmatrix in Puffer B (PBS/0,1 % bovines IgG/0,1 % Natriumazid) oder in hCG-freiem Serum (Chemicon, Inc.) oder in hCG-freiem Urin ebenso wie die Proben zu den Wells gegeben. Die Platten wurden mit Plattenversiegeler versiegelt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Kontrollen, Proben und Standards wurden anschließend abgesaugt, die Platten 5-mal mit Waschlösung gewaschen und iodinierter Nachweisantikörper in Puffer B (200 μL/Well, 100000 cpm/Well) zugegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Wells wurden nochmals abgesaugt, 5-mal mit Waschlösung gewaschen, vereinzelt und gezählt (Packard Cobra gamma gezählt). Die Werte wurden von einer geglätteten Spline-Transformation der Zählerdaten interpoliert. Über dieses Assayverfahren sowie die Assayvalidierung wurde bereits vorher berichtet (O'Connor J. F., et al., 1988).
Die Kreatininanalyse wird, wenn die Urinwerte in Bezug auf Kreatinin normalisiert werden, in einem Miktrotiterplattenformat gemäß einer Modifikation des Taussky-Verfahrens durchgeführt (Taussky, H. H., 1954).
Beschreibende statistische und graphische Verfahren werden zur Messung von Serum- und Urinproben von normalen gesunden Schwangerschaften verwendet, um die Verteilungen a) zwischen den durchschnittlichen B152-Level, B109-Level und dem B152/B109-Verhältnis von Patientinnen im ersten Trimester; b) zwischen Patientinnenvariabilität zum Zeitpunkt, an dem das B152/B109-Verhältnis den Wert 1,00 erreicht; und c) zwischen der Patientinnenvariabilität zum Zeitpunkt, an dem das B152/B109-Verhältnis um 1/3 der Maximallevel des ersten Trimesters abfällt, zu bestimmen. Die Veränderlichkeit im Zeitpunkt der Überschneidung des Verhältnisses dieser zwei Analyten liefert eine empirische Basis, von der ausgehend die Wertigkeit dieser Marker als biochemische Signaturen für einen lebensfähigen Fötus im dritten Trimester abgeschätzt werden kann.
Aus der Gegenüberstellung des Assayprofils von gesunden Normalschwangerschaften und jenen aufgrund fehlgeschlagener IVF-Implantationen nicht-erfolgreichen Schwangerschaften ergeben sich zwei nicht-parametrische Hypothesen: 1) der Anteil an Schwangerschaften, in denen das B152/B109-Verhältnis unter 1,00 sinkt, unterscheidet sich in gesunden Normal- und nicht-erfolgreichen IVF-Schwangerschaften nicht; 2) der Anteil an Schwangerschaften, in denen das B152/B109-Verhältnis um 1/3 der Maximallevel des ersten Trimesters abfällt, unterscheidet sich in gesunden Normal- und nicht-erfolgreichen IVF-Schwangerschaften nicht. Diese Hypothese kann als eine Differenz zwischen zwei Proportionen überprüft werden. Beispielsweise zeigt eine Gegenüberstellung von Woche 14- vs. Woche 9-, Woche 13- vs. Woche 6-, Woche 12- vs. Woche 5- oder Woche 11- vs. Woche 4-Schwangerschaften eine Umkehr des B152/B109-Verhältnisses in gesunden Normalschwangerschaften bzw. nicht-erfolgreichen IVF-Implantationen. Die Aussagekraft der Analysen lässt sich auf ein Ergebnis anwenden, das als der Zeitpunkt definiert wird, zu dem das B152/B109-Verhältnis um 1/3 der Maximallevel des ersten Trimesters abfällt, obwohl dieses Ergebnis notwendigerweise das Fehlschlagen der Schwangerschaft früher anzeigen würde als es die Umkehr des B152/B109-Verhältnisses täte. Ergebnismuster, welche sich von diesen weniger stark unterscheiden, zeigen die Ablehnung des dichotomen Ergebnisses der Umkehr des B152/B109-Verhältnisses als einen klinisch bedeutsamen Marker für das Fehlschlagen einer Schwangerschaft an.
Alternativ können die gleichen zwei nicht-parametrischen Hypothesen durch Berücksichtigung des Zeitpunkts des biochemischen Ereignisses innerhalb des Assayprofils von gesunden Normalschwangerschaften und jene aufgrund fehlgeschlagener IVF-Implantation nicht-erfolgreichen Schwangerschaften in parametrische Hypothesen umgestaltet werden: 1) der Zeitpunkt, zu dem das B152/B109-Verhältnis unter 1,00 fällt, unterscheidet sich in gesunden Normal- und nicht-erfolgreichen IVF-Schwangerschaften nicht; 2) der Zeitpunkt, zu dem das B152/B109-Verhältnis um 1/3 der Maximallevel des ersten Trimesters abfällt, unterscheidet sich in gesunden Normal- und nicht-erfolgreichen IVF-Schwangerschaften nicht. Selbstverständlich besteht die Zielvorgabe darin, eine empirische Basis bereitzustellen von der ausgehend Kliniker ihre Patientinnen beraten können. Demnach ist es wichtig, ein logistisches Modell für diesen Teil der Datenanalyse einzuführen. Mit dem Erfolg der Schwangerschaft als Ergebnis erlauben die logistischen Modelle die Abschätzung der (symmetrischen) Hypothese der Risikozunahme des Fehlschlagens der Schwangerschaft für jede zusätzliche Woche, dort wo es entweder das B152/B109-Verhältnis unterlassen hat, um ein Drittel der Grundlinienmaximalwerte des ersten Trimesters abzusinken, oder es das B152/B109-Verhältnis unterlassen hat, unter den Wert 1,00 zu sinken (gemessen in Wochen). Das logistische Modell ermöglicht die Spezifizierung des Zeitpunkts an dem die Ergebnisse anzeigen, dass eine bestimmte Schwangerschaft eine a priori definierte Wahrscheinlichkeit des Fehlschlagens übersteigt, wobei die vorgegebenen Assaydaten während der Schwangerschaft regelmäßig abrufbar sind, und erlaubt die Einbeziehung anderer Risiken für das Fehlschlagen der Schwangerschaft im gleichen Datenanalysenetzwerk, um deren jeweiligen Beitrag zum drohendem Verlust der Schwangerschaft zu bewerten. Das Cox Proportional Hazard Modell kann verwendet werden, um die Anzeichen der Überschneidungsraten zu untersuchen. Modelle der gemischten Effekte können ebenso die im Verlauf der gesamten Zyklen vorgenommenen wiederholten Messungen der B152/B109-Verhältnisse analysieren. Diese Modelle sind besonders hilfreich, da sie die Einbeziehung unvollständiger und unsymmetrischer Daten erlauben (beispielsweise Daten mit fehlenden Werten und ungleichen Zeitpunkten der Datenerhebung), um die Effekte der sich im Zeitverlauf ändernden Kovariaten zu bewerten, die Abhängigkeitsstruktur der wiederholten Messungen zu modellieren sowie die mögliche Heterogenität der Verhältnismessungen innerhalb der einzelnen experimentellen Gruppe zu modellieren.
B152 hCG-Isoformen, die aus Urin der Frühschwangerschaft isoliert wurden, und Bestimmung ihrer Protein- und Carbohydratstrukturen.
Unter Verwendung des bereits entwickelten Schemas zur Konzentrierung und Immunaffinitätsextraktion aus Urin wurden hCG-Moleküle aus Urin, der von Frauen in der Frühschwangerschaft gesammelt wurde, sowohl für Protein- als auch für Carbohydratanalysen isoliert. Gemäß eines Ansatzes wurden die Moleküle aus HPLC-Fraktionen isoliert, vor und nach Reduktion der Disulfidbrücken mit Proteasen verdaut, die daraus resultierenden Peptide mittels Massenspektrometrie und/oder Sequenzanalyse untersucht, die Carbohydratteile nach Glykosydaseverdau isoliert und die Carbohydratstrukturen durch eine Kombination von spezifischen Glykosidasen und Rückhaltezeiten auf spezialisierten Anionenaustauschsäulen im Vergleich zu bekannten verzweigtkettigen Oligosaccharidstandards bestimmt. In einem ähnlichen Ansatz ist SDS-Gelelektrophorese die finale Reinigungsstufe der isolierten hCG-Formen. Sowohl Proteaseverdaus als auch Glykosidaseverdaus werden mit den geblotteten und ausgeschnittenen Banden ausgeführt. Dieses Verfahren führt zu einer höheren Proteinreinheit und zu einer geringeren Anzahl an Artefakten aufgrund von Kontamination durch Carbohydrate, die zwar nicht im gereinigten Protein vorkommen, sondern auf von außen stammende Kontaminanten zurückzuführen sind.
Carbohydratstrukturanalysen und Identifikationen der verzweigten Kette des Oligosaccharids.
Das MALDI TOF massenspektrometrische Verfahren kann verwendet werden, um die Oligosaccharidstrukturen durch Verwendung spezifischer Glykosidasen auf den Glykopeptiden und durch Bestimmen der Änderung des Molekulargewichts zu bestätigen, während die Zucker vom Glykopeptid abgedaut werden. Lediglich vom hCG beta COOH-Peptid kann erwartet werden, dass es O-glykosidisch gebundene Zuckerteile enthält. Dies ist von besonderem Interesse, da angenommen wird, dass B152 mit diesem Bereich signifikant reagiert. Die Strukturen dieses Bereichs können in einer ähnlichen Weise unter Verwendung von Enzymen, welche spezifisch O-glykosidisch gebundene Glykane freisetzen, bestimmt werden. Die O-glykosidisch gebundenen Strukturen wurden bereits früher unter Verwendung von Standard-Referenzschwangerschafts-hCG untersucht (Cole, L. A., et al., 1985). Die O-glykosidisch gebundene verzweigte-Kette-Struktur wird durch eine ähnliche Strategie unter Verwendung des Dionex-Chromatographiesystems und spezifischer Glykosidasen an den C-terminalen Glykopeptiden sowie Massenspektrometrie bestimmt. In einer Studie (Elliott, M. M., et al., 1997) werden diese Techniken verwendet, um die Carbohydratstrukturen von hCG-Präparationen der CR-Reihen (Standard-Schwangerschafts-hCG aus Urin) zu untersuchen, und sie mit den Strukturen von Patientenproben wie C5 zu vergleichen, welches das Antigen war, das zur Erzeugung des Antikörpers B152 eingesetzt wurde. Es wurde gefunden, dass C5 signifikant mehr mono- und triantennäre (2× mono- und 3× tri-Strukturen gegenüber den CR-Präparationen) an den N-Asn-Resten aufwies. Es wurde ebenso gefunden, dass an den hCG COOH-terminales-Peptid-O-Serin-Resten in der Chorionkarzinom-hCG-Isoform mehr Tetrasaccharidstrukturen vorhanden waren als in den CR-Präparationen.
Biologische Aktivität und metabolische Clearance von hCG-Isoformen
Biologische Aktivität ist eine Funktion von sowohl molekularer Struktur als auch der Kreislauf-Halbwertszeit, welche durch die Struktur beeinflusst werden kann. Von Änderungen im Carbohydrat-/N-Acetylneuraminsäuregehalt der Glykoproteinhormone wird angenommen, dass sie für die Änderungen der biologischen/immunologischen Aktivität von hCG verantwortlich sind, die während der Schwangerschaft beobachtet werden. Darüber hinaus wird die Signaltransduktion am Rezeptor durch den pI der hCG-Isoform sowie das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Carbohydrat beeinflusst. Daher ist es nützlich, sowohl die Rezeptorbindung als auch die biologische Aktivität in vitro zu untersuchen und, um den Wirkmechanismus zu bestimmen, zwischen Rezeptorbindung und Signaltransduktion sowie relativer Wirksamkeit der Signaltransduktion zusammen mit in vivo Determinanten der Bioaktivität, wie der Kreislauf-Halbwertszeit, zu unterscheiden. Studien, welche die Clearance-Raten einschließen, werden anhand von B152 hCG-Isoformen der frühen erfolgreichen Schwangerschaft, hCG der Schwangerschaft im dritten Trimester und der Referenz-hCG-Präparation aus Urin, CR 127, durchgeführt.
Beispiel 3: B152 und B151 Immunoreaktivität in nicht-trophoblastischen bösartigen Tumoren.
Mit Ausnahme der Trophoblastenerkrankung und Hodenkrebs wird hCG im Blut von etwa 20 % aller, an allen anderen Krebsarten leidenden Patienten exprimiert (Hussa, R. O., 1987).
HCG Beta-Core-Fragment im Urin weist ein signifikant höheres Expressionslevel auf, vornehmlich in gynäkologischen bösartigen Tumoren. Seitdem der B152-Antikörper gegen eine Form des hCG entwickelt wurde, welche in einem bösartigen Tumor produziert wird, war es von Interesse, die Expression von B152- und nicked hCG-Immunoreaktivität (B151) in nicht-trophoblastischen bösartigen Tumoren zu untersuchen. Demgemäß wurde Blut und Urin, das von Männern stammte, die sich einer Chemotherapie gegen Prostatakarzinom unterzogen oder von Frauen, die sich einer Chemotherapie gegen Eierstockkrebs unterzogen, auf die Expression der hCG-Isoformen in Plasma und Urin untersucht. Es ist bezeichnend, dass bei Prostatakarzinom B152-hCG-Immunoreaktivität in Blut und Urin von Prostatakarzinompatienten unter solchen Umständen gefunden wird, unter denen durch B109-B108* kein hCG nachweisbar ist. In untersuchten Patientinnen, die an Eierstockkrebs litten, gibt es Anzeichen auf nicked hCG im Blut, sogar bei Abwesenheit von sowohl B109- als auch B152-Immunoreaktivität. Bei Anwendung des Assays mit von Standard-Schwangerschaften stammenden hCG zeigte keine der oben genannten Gruppen eine hCG-Immunoreaktivität. Es ist beruhigend, herauszufinden, dass nicked hCG, dessen Existenz von mehreren Forschern gezeigt wurde, unter klinischen Bedingungen aufgefunden und zuverlässig gemessen werden kann.
Diskussion der Experimente
Im Verlauf dieser Untersuchungen wurde im Urin von Frauen, die sich in einer Frühschwangerschaft befanden, ein potenziell wichtiges, neues Signal beobachtet, nämlich ein Epitop einer Form des hCG, die den wahrscheinlichen Erfolg des Austragens einer Schwangerschaft anzeigen kann. Gleichermaßen kann die Abwesenheit dieses Signals das Eintreten von EPL anzeigen. Da EPL ein sehr sensitiver Marker für Umweltgifte sein kann (Hakim, R. B., et al., 1995) und häufig als epidemiologischer Marker der Exposition verwendet wird, stellt die Entdeckung dieses Epitops ein mächtiges Instrument für das Monitoring der Umweltsicherheit bereit. Darüber hinaus erleichtert dieser Assay die Zunahme der Erfolgsrate von IVF-Infertilitätsprogrammen, da der prädiktive Wert des neuen Messsystems sehr schnell erfolgreiche Ansätze anzeigen würde. Hierin ist das neue und überraschende Ergebnis beschrieben, dass erfolgreiche Schwangerschaften einen hohen Gehalt spezifischer hCG-Isoformen aufweisen, die während der ersten wenigen Wochen der Schwangerschaft aufrecht erhalten werden und sich anschließend, im weiteren Verlauf der Schwangerschaft, rasch vermindern. Aufgrund der Eigenschaften des Immunoassaysystems wird hypothetisiert, dass diese hCG-Isoformen hyperglykosiliert sein können. Es handelt sich hierbei um eine überraschende Beobachtung, die früher weder berichtet, geschweige denn jemals erwartet wurde. Carbohydratanalysen (Elliott, M., 1997) zeigen, dass CS-hCG, das als Antigen für den Antikörper B152 eingesetzt wurde, gegenüber den CR-Datenreihen des natürlichen Schwangerschafts-hCG aus Urin, das Zweifache des monoantennären Gehalts und das Dreifache des triantennären Gehalts der verzweigtkettigen Zucker enthält. Darüber hinaus sind die O-glykosidisch gebundenen Carbohydrate in C5, verglichen mit CR 127 hCG, meist ein Tetrasaccharid und kein Disaccharid (CR 127 hCG ähnelt der WHO-Präparation, dem dritten internationalen hCG-Standard, welcher CR 119 hCG war und vor 20 Jahren von Canfield und Birken hergestellt wurde und heute nach wie vor in Verwendung ist) (Birken, S., et al., 1991a). B152 erkennt C5 hCG sehr viel besser als nicked CR 127 hCG oder non-nicked CR 127 hCG (Birken, S., et al., 1993). Darüber hinaus ist vom hCG des JAR-Zelltyps bekannt, dass es eine ähnliche Anordnung an Carbohydratteilen aufweist. Es wird ähnlich den Isoformen der Frühschwangerschaft in gesunden Schwangerschaften durch B152 erkannt. Diese Beobachtung, nämlich dass die hCG-Isoform, die von JAR-Zellen in Kultur produziert wird (B152/B109-Verhältnis) ähnlich den in der Frühschwangerschaft gefundenen hCG-Isoformen ist, stützt die Hypothese, dass die Produktion eines hCG-Typs mit einem bestimmten Glykosilierungsmuster eine Voraussetzung für eine lebensfähige Schwangerschaft ist. Dieses Glykosilierungsmuster ist nicht typisch für das hCG der späteren Schwangerschaft.
Eine Vielfalt von Schwangerschaftsstörungen ist prüfbar. Eine Gruppe von Patientinnen besteht aus jenen Frauen, die häufig wiederkehrenden Fehlgeburten erlitt. Sogar in Populationen mit nicht bekannten Fertilitätsproblemen beträgt die Gesamthäufigkeit des Verlusts der Schwangerschaft 32 % (EPL plus klinisch erkannte Fehlgeburt) (Wilcox, A. J., et al., 1988). Das Risiko einer wiederkehrenden Fehlgeburt steigt mit der Anzahl spontaner Fehlgeburten, die in der Vergangenheit durchgemacht wurden, und erreicht eine Inzidenz von 32 % nach drei aufeinanderfolgenden Fehlgeburten. (Hill, J. A., und Anderson, D. J., 1990). Wahrscheinliche Ursachen der wiederkehrenden spontanen Fehlgeburt, einschließlich genetischer, infektiöser, hormoneller Unausgewogenheit oder immunologischer Faktoren können in weniger als 60 % aller spontanen Fehlgeburten nachgewiesen werden, was bedeutet, dass mehr als 40 % der spontanen Fehlgeburten mit einer vollständig unerkannten Ätiologie offen bleiben. Diese Fakten, zusammengenommen mit Berichten, die darlegen, dass die Verabreichung von exogenem hCG eine wirksame Therapie für jene Subjekte sein kann, die in der Vergangeheit wiederholt spontane Fehlgeburten erlitten (Quenby, S., und Farquharson, R. G., 1994; Harrison, R. F., 1985), stützt die Hypothese, dass die überproportionale Produktion der unwirksamen hCG-Isoformen in der Frühschwangerschaft ein kausaler Faktor sowohl bei frühem präklinischem Verlust als auch bei spontaner Fehlgeburt ist.
Eine zweite Gruppe umfasst Frauen, die sich einem Embryotransfer unterzogen. Diese Patientinnen weisen mehrere verschiedene Vorteile auf: Die sich diesem Eingriff unterziehenden Patientinnen sind nicht mit unaufbereiteten hCG-Präparationen behandelt, was die Messung der hCG-Isoformen einfach und eindeutig macht, da alle hCG-Formen vom Embryo selbst und keine von irgendwelchen injizierten hCG-Präparationen stammen. Der zweite Vorteil besteht in der Gelegenheit, die Beschaffenheit der Isoformen ausgehend von Tag 9 einer erfolgreichen Schwangerschaft zu überwachen. Der dritte Vorteil besteht in der Gelegenheit, große Urinvolumina zum Reinigen der Isoformen der Frühschwangerschaft zu erhalten, um deren Strukturen zu bestimmen. Viertens, da der Verlust der Schwangerschaft in dieser Population 50 % bis 70 % beträgt, kann der Verlust als ein auf den Mangel an essentieller hCG-Isoform, welche von B152 erkannt wird, oder auf andere Ursachen zurückzuführender, definiert werden. Aus dem Vergleich von Frühschwangerschaften in Populationen von Frauen, die sich keinem In Vitro-Fertilisationseingriff unterzogen, mit jenen, die sich einer Embryoimplantation unterzogen, kann folglich ergeben, ob verschiedene Schwangerschaftsverlustsituationen während dieses Prozesses ähnliche oder unterschiedliche Muster von hCG-Isoformen aufweisen. Der Mechanismus des Verlusts der Schwangerschaft in der allgemeinen Population kann sich von der sehr viel größeren Häufigkeit des Embryoverlusts in NF-Programmen unterscheiden. Des Weiteren wurde festgestellt, dass das in Chorionkarzinom produzierte hCG Unterschiede in Carbohydratstrukturen, N-Acetylneuraminsäuregehalt und biologischer Aktivität aufweist (Wide, L., und Hobson, B., 1987; Elliott, M., et al., 1997; Hussa, R. A., 1987). Da sowohl die B151-B604*- als auch die B152-B207*-Assays monoklonale Antikörper beinhalten, die gegen ein Antigen, das von einem Chorionkarzinom stammt, gerichtet sind, können Proben von Patientinnen mit gestationsbedingter Trophoblastenerkrankung untersucht werden, um zu bestimmen, ob die obigen Assays das unter diesen Bedingungen produzierte hCG mit größerer Sensitivität und Spezifität erkennen, wie das offensichtlich beim hCG, das bei Hoden- oder Eierstockkrebs produziert wird, der Fall ist.
Es liegen wenige Berichte über Änderungen des Carbohydratgehalts von hCG-verwandten Molekülen während der Schwangerschaft vor. Blithe und Kollegen untersuchten die freie Alpha-Untereinheit von hCG, deren Carbohydratgehalt sich vom Alpha innerhalb des hCGs durch zusätzliche Carbohydratantennen und Fukose unterscheidet. Das Carbohydrat des freien Alpha wird im Verlauf der Schwangerschaft zunehmend komplex in Bezug auf weitere Verzweigungen und höheren Gehalt. Weiterhin wurde berichtet, dass die Menge an Fukose sowohl in hCG als auch in freiem Alpha mit fortschreitender Schwangerschaft zunimmt (Skarulis, M. C., et al., 1992). Demnach zeigt die Literatur einen zunehmenden Gehalt sowie Carbohydratkomplexität von hCG und freien Alpha-Untereinheiten an. Allerdings implizieren die unter Verwendung des B152 monoklonalen Antikörpers erzeugten immunologischen Daten eine Entwicklung in Richtung eines einfacheren Carbohydratgehalts während der Schwangerschaft. Da die O-glykosidisch gebundenen Carbohydrate der Beta-COOH-Region von dem von B152 erkannten Epitop umfasst sein können, ist es denkbar, dass die Carbohydratstrukturen dieses Bereichs nach verschiedenen Mustern von den N-glykosidisch gebundenen Glykanen, welche von Blithe und Kollegen untersucht wurden, abgeändert werden (Skarulis, M. C., et al., 1992; Blithe, D. L., und Iles, R. K., 1995). Die Ergebnisse von Skarulis et al. zeigen an, dass heterodimäres hCG zusätzliche Fukose enthalten kann, stellen jedoch keine Daten zur Verfügung, ob dieses hCG der Spätschwangerschaft hyperglykosiliert wird, wie es das freie Alpha tut.
Andere Studien zeigen an, dass sich die hCG-Formen während EPL wahrscheinlich in biologischer Aktivität von jenen hCG-Isoformen in erfolgreichen Schwangerschaften unterscheiden (Ho, H.-H., et al., 1997). Die in jenen Studien eingesetzten in vitro-Bioassays sind für Großversuche ungeeignet und nicht so zuverlässig wie die hierin beschriebenen Immunoassays. Weiterhin ist es wahrscheinlich, dass in vivo-Assays unterschiedliche Ergebnisse liefern können, da in vitro- und in vivo-Assays manchmal vollkommen verschiedene Ergebnisse liefern. In diesem Fall sind in vivo- und Clearance-Assays am wichtigsten, um zu bestimmen, ob die hCG-Isoformen im gesamten Lebewesen tatsächlich wirksamer sind und um die Gründe für die erhöhte Wirksamkeit zu ermitteln. Demnach sind in vitro- und in vivo-Bioaktivitäten der hCG-Isoformen der Frühschwangerschaft sehr wesentlich.
Carbohydratunterschiede stellen eine weitläufig akzeptierte Erklärung für Schwankungen in der biologischen gegenüber der immunologischen Relation dar, wie diese bei verschiedenen Untersuchungen von bei EPL beobachteten Formen auftraten (Ho, H.-H., et al., 1997). Verschiedene Studien (Grotjan, H. R. J., und Cole, L. A., 1989; Hoermann, R., 1997; Stanton, P. G., et al., 1993; Szkudlinksi, M. W., et al., 1995; Thotakura, N. R., et al., 1994; Szkudlinski, M. W., et al., 1993) haben gezeigt, dass Unterschiede in der N-Acetylneuraminsäure eine mögliche Erklärung für eine solche Heterogenität der biologischen Aktivitäten von Glykoproteinhormonen darstellen. Diese Untersuchungen haben ebenso das Dogma bestätigt, dass in vitro-biologische Aktivitäten aufgrund der in den letztgenannten Untersuchungen veränderten metabolischen Clearanceraten im Vergleich zu in vivo-Studien gegenteilige Ergebnisse erbringen können. Demnach sind saurere (stärker sialysierte) Formen von Gonadotropin aufgrund der verlängerten Kreislauf-Halbwertszeiten im gesamten Lebewesen biologisch wirksamer. Die gleichen Moleküle können in in vitro-Assays aufgrund der höheren Azidität und des stärker verminderten N-Acetylneuraminsäuregehalts weniger wirksam erscheinen. Hoermann et al. (Hoermann, R., et al., 1997) zeigten die Inhibition vieler der sauren zirkulierenden Hormonformen aus dem Urin und verlängerten dadurch ihre Halbwertszeiten. Das pI-Muster von Normalschwangerschafts- sowie Trophoblastenkrebs-hCG in Serum unterscheidet sich vollständig von dem in Urin. Da die hierin beschriebenen Untersuchungen anzeigen, dass EPL-hCG-Isoformen eine verminderte in vitro biologische Aktivität aufweisen, können diese Erkenntnisse nicht allein darüber erklärt werden, was über die biologische Aktivität und den N-Acetylneuraminsäuregehalt bekannt ist. Frühschwangerschafts-Isoformen, die vom monoklonalen Antikörper B152 erkannt werden, können in vivo wirksamer sein und aufgrund einer verlängerten Halbwertszeit dann ebenso eine erhöhte Signaltransduktion am Rezeptor hervorrufen. Dies kann anhand einer hyperglykosolierten Form von hCG erklärt werden, welche nicht hypersialysiert ist. In diesem Fall würde der zusätzliche Zuckeranteil helfen, die Halbwertszeit einer basischeren pI-Form von hCG zu verlängern, welche ebenso eine erhöhte in vitro-Bioaktivität aufweist.
Beispiel 4: Diagnose von gestationsbedingter Trophoblastenerkrankung.
Eine wichtige Anwendung der hierin vorstehend beschriebenen B152 (frühe hCG-Isoform)/B109 (späte hCG-Isoform)-Verhältnisanalyse ist bei der sehr frühen (und einfachen) Diagnose von gestationsbedingter Trophoblastenerkrankung. Beispiele gestationsbedingter Trophoblastenerkrankung schließen Chorionkarzinom oder Blasenmole ein. In der Normalschwangerschaft verringert sich der Quotient aus B152/B109 der beiden hCG-Isoformen schnell, kehrt sich eventuell sogar um. In gestationsbedingter Trophoblastenerkrankung, einschließlich Chorionkarzinom oder Blasenmole, ist der Quotient zunächst größer als der in normaler Schwangerschaft gefundene, verringert sich allerdings während des Verlaufs der Scheinschwangerschaft nicht. Dieser Ansatz stellt einen hochsensitiven und spezifischen diagnostischen Marker für gestationsbedingte Trophoblastenerkrankung bereit.
Andere Schwangerschaftsstörungen, in denen hCG-Level abnormal hoch oder abnormal niedrig sind schließen Down-Syndrom oder andere aneuploide Schwangerschaften, Bauchhöhlenschwangerschaft, Präeklampsie sowie intrauterine Wachstumsretardierung ein. Da die hCG-Produktion unter diesen Bedingungen verglichen mit Normalschwangerschaften mengenmäßig abnormal ist, kann ein verändertes Verhältnis der durch B152 (frühe hCG-Isoform) und B109 (späte hCG-Isoform) nachgewiesenen hCG-Isoformen detektiert werden. Demnach stellt die duale Isoformanalyse (B152/B109) weiterhin ein Verfahren zum Diagnostizieren von Schwangerschaftsstörungen und gestationsbedingter Trophoblastenerkrankung bereit.
Material und Methoden
Hormone
Das aus der CR127-Präparation des hCG isolierte, non-nicked hCG wurde in beiden Assays als Standard verwendet (Birken et al., 1993). Das hypophysäre hCG wurde wie beschrieben isoliert (Birken et al., 1996). C5, ein zu 100%-nicked hCG, das sowohl an N- als auch an O-glykosidisch gebundenen Carbohydratteilen zusätzliche Zucker aufweist, und das aus dem Urin einer an einem Chorionkarzinom erkrankten Patientin gereinigt wurde (Elliott et al. 1997), wurde durch Dr. Laurence Cole (Yale University School of Medicine) zur Verfügung gestellt. Obwohl das C5-Antigen, das für die Entwicklung des B152-Antikörpers verwendet wurde, eine zu 100%-nicked hCG-Isoform war (d. h. Spaltungen im Peptidrückgrat von Loop 2 der b-Untereinheit aufwies), unterschied der Antikörper nicht zwischen nicked oder non-nicked hCG (O'Connor et al. 1998).
Für die Charakterisierung der Bindung wurden in hCG-Assays die gleichen seriellen Verdünnungen von non-nicked hCG, hypophysärem hCG und C5 verwendet. Hormonkonzentrationen von initialen Stock-Standardlösungen wurden durch Aminosäureanalysen bestimmt.
Immunoradiometrische Assays (IRMA)
Die beim Aufbau und der Validierung des B109-B108*-Assays angewandte Methodik wurde anderweitig vollständig beschrieben (O'Connor et al. 1988). Der B152-B207*-Assay wurde ebenso beschrieben (O'Connor et al. 1998). Beide Assays wurden mit leichten Modifikationen der publizierten Vorgehensweisen durchgeführt: der Capture-Antikörper wurde auf den Wells von Mikrotiterplatten (Immulon IV, Dynatech, Chantilly, VA) durch Inkubieren einer 5 μg/ml-Lösung (B109-B108*-Assay) oder einer 25 mg/ml-Lösung (B152-B207*-Assay) in Beschichtungspuffer (0,2 M Bicarbonat, pH 9,5) über Nacht bei 4 °C adsorbiert. Die den Beschichtungsantikörper enthaltende Lösung wurde abgesaugt, die Platten gewaschen (Waschlösung: 0,9 % NaCl, 0,05 % Tween 20) und mit einer 1%-igen Lösung von BSA in PBS mit 0,1 % Natriumazid geblockt. Im Anschluss an die Inkubation mit BSA-Lösung (mindestens 3 Stunden bei Raumtemperatur) wurde die Blocking-Lösung entfernt, die Wells wiederum mit Waschlösung gewaschen, und 200 ml/Well der geeigneten hCG-Standards wurden in Phosphatpuffer B (PBS mit 0,1 % bovinem Gammaglobulin und 0,1 % Natriumazid) zugegeben. Nach Inkubation über Nacht bei 4 °C wurden die Platten wiederum abgesaugt und gewaschen. Die 200 ml (50000 cpm–100000 cpm) des ¹²⁵I-markierten Antikörpers wurden zu den Wells gegeben, welche wiederum für 24 Stunden bei 4 °C inkubiert wurden. Der Tracer wurde abgesaugt, die Platten mit Waschlösung gewaschen, die einzelnen Wells in Glastubes platziert und die Radioaktivität in einem Packard Cobra Gamma Counter bestimmt. Die Dosen wurden durch Interpolierung von einer geglätteten Spline-Transformation der Datenpunkte ermittelt.
Alle Proben wurden vor dem Assay gefroren bei –20 °C gelagert. Da Extremwerte des Proben-pH mit der Antikörperbindung interferieren können, wurde der pH des Urins mit 1,0 M Tris (pH 9,0), 50 μl/ml Urin, vor dem Assay so eingestellt, dass der finale pH im Bereich von 7–7,4 lag (O'Connor et al. 1988). Die Assay-interne Variation betrug für beide Assays 6 %, während die Zwischen-Assay-Variation 12 % für B109-B108*- und 13 % für B152-B207*-Assays betrug. Sensitivität (geringste nachweisbare Dosis), definiert als +2SD vom Nullkalibrator, betrug 1 fmol/ml für den B109-B108*-Assay und 2,2 fmol/ml für den B152-B207*-Assay.
Proben von Patientinnen
Urinproben von IVF-Patientinnen wurden freundlicher Weise von Dr. L. Cole bereitgestellt. Sie beinhalteten spontane Fehlgeburt (n = 14, Bereich der Schwangerschaftsdauer von 1,8–4,1 Wochen nach ET-Embryotransfer), Bauchhöhlenschwangerschaften (n = 7, Schwangerschaftsdauer 2,3–4 Wochen) und Normalschwangerschaftskontrollen (n = 65, umfassend den Bereich von 0,6–4,5 Wochen nach ET). Einige der über den gesamten Schwangerschaftsverlauf entnommenen Urinproben von Normalschwangerschaft wurden ebenso von Dr. Cole erhalten. Andere wurden aus der klinischen Praxis kollaborierender Ärzte am Columbia Presbyterian Medical Center (CPMC) erhalten (insgesamt n = 103). Aufeinander abgestimmte Serum-Urin-Proben der ersten (n = 12) und dritten (n = 11) Trimester wurden durch Dr. Amalia Kelly am CPMC zur Verfügung gestellt. Trophoblastenerkrankungs-Serum- (n = 17) und Urin- (n = 28) Proben wurden zwar von Dr. Cole erhalten, diese jedoch von Dr. Edward Newlands (Charing Cross Hospital, London, UK) gesammelt. Alle Protokolle der Probenkollektion wurden durch eine entsprechende institutionelle Aufsichtsbehörde genehmigt.
Statistische Analyse
Polynominale Regressionsmodelle von log-transformierten Hormonverhältnissen wurden verwendet, um die Beziehung zwischen der Änderung im Verhältnis als eine Funktion der Schwangerschaftsdauer in der Normalschwangerschaft zu beschreiben. Ein gepaarter t-Test wurde verwendet, um die Beziehung zwischen aufeinander abgestimmten Serum- und Urin-Hormonverhältnissen zu evaluieren. Kovarianzanalyse (ANCOVA) wurde verwendet, um die zeitlich aufeinander abgestimmte Beziehung von Hormonwerten bei Bauchhöhlenschwangerschaft und spontaner Fehlgeburt gegenüber jener von Normalschwangerschaft zu beschreiben.
Urinaufbereitung.
Vierundzwanzig-Stunden-Urinproben werden von Frauen, die sich einem Embryotransfer unterzogen sowie von Frauen in früher natürlicher Schwangerschaft gesammelt. Der Urin wird während des Sammelns gekühlt. Nach Auslieferung des Urins an das Laboratorium wird pro Liter 1 g Natriumazid zugegeben. Frauen, die sich einem in vitro-Embryotransfer unterziehen, werden nicht mit hCG vorbehandelt. Demnach stammt alles hCG, das in deren Blut oder Urin vorkommt, vom Embryo (mit Ausnahme der geringen Mengen an hypophysärem hCG, welches bei allen Menschen vorkommt). Roher Urin wird von Partikeln durch Zentrifugation gefolgt von Pellicon-Filtration durch eine 0,45-Mikrometer-Membran getrennt. Im nächsten Verfahrensschritt ist der Urin mit einem Pellicon-(Millipore) System zu konzentrieren, welches über Nacht (4 °C) bei Verwendung einer 3000-MW-Cutoff-Membran etwa 30 Liter auf 500 ml konzentriert. Geringere Volumina können in weniger als zwei Stunden konzentriert werden. Als nächstes wird der Urin via Passage durch ein großes Volumen Sephadex G25 in 0,1 M Ammoniumbicarbonat entsalzt und delipidiert. Dieser Schritt erhöht die Bindung von CG an Immunoaffinitätssäulen sehr stark. Das entsalzte Urinkonzentrat wird als nächstes auf der Pharmacia HiLoad Superdex 200 größenfraktioniert und die Peaks von hCG und hCG-Untereinheit werden mittels spezifischer Immunoassays identifiziert (O'Connor, J. F., et al., 1994), und die geeigneten Fraktionen werden gepoolt und getrocknet. Das hCG und die hCG-Untereinheiten werden wie beschrieben vom gelgefilterten Urinkonzentrat mittels Immunoaffinität über ungelöste hCG-Antikörper-Säulen gereinigt, allerdings unter Verwendung von entweder 4 M Guanidin (0,1 Tris-Azetat, pH 5) oder Ammoniumthiocyanat als Elutionsmittel, um den Verlust der N-Acetylneuraminsäure vom Hormon zu mindern. Alternativ wird hCG mittels konventioneller Chromatographieverfahren gereinigt, nämlich Anionenaustausch und hydrophobischer Chromatographie. Die Untereinheiten werden nach Inkubation in 4 M Guanidin, 0,1 M Tris-Azetat, pH 5, über Reverse Phase HPLC unter Verwendung eines 0,01 M-Natriumphosphat-pH 5-Puffers und Acetonitril abgetrennt. Ein drittes Verfahren stellt die finale Reinigung und Abtrennung der hCG-Untereinheiten mittels SDS PAGE Elektrophorese, gefolgt von Elektro-Blotting auf PVDF dar. Die PVDF-Bande kann einem Proteaseverdau unterzogen werden, um Peptide und Glykopeptide freizusetzen, welche wiederum über Reverse Phase-HPLC in neutralen pH 5-Puffern abgetrennt werden können.
Trennung er Glykopeptide von isolierten hCG-Untereinheiten.
Um die Isolierung der Glykopeptide von den hCG-Untereinheiten zu vereinfachen, werden die Untereinheiten sowohl tryptisch verdaut als auch die Produkte des Verdaus über Reverse Phase-HPLC (unter Verwendung eines pH 5-Puffers) abgetrennt. Diese Vorgehensweise resultiert in der Entfernung des großen Beta-COOH-terminalen Peptids, welches O-glykosidisch gebundene Zucker enthält. Sie setzt ebenso kleine, nicht-Glykopeptide von beiden Untereinheiten frei (Pollak, S., et al., 1990, Birken, S., et al., 1987; Birken, S., et al., 1986). Als nächstes wird der wichtigste Disulfid-gebundene Core jeder hCG-Untereinheit reduziert und carboxymethyliert und über Reverse Phase-HPLC bei pH 5 abgetrennt. In diesem Stadium werden große Peptide, einschließlich Glykopeptide, isoliert. Jedes abgetrennte Glykopeptid wird wieder mit Trypsin verdaut und über HPLC bei pH 5 nochmals abgetrennt. Diese Glykopeptide werden im Anschluss in zwei verschiedenen Verfahren zur Analyse der Zuckerketten eingesetzt. Ein Verfahren besteht in dem Ansatz der Freisetzung der Oligosaccharide durch enzymatische Verdaus unter Verwendung von PNGase F für die N-glykosidisch gebundenen Glykane. Die freigesetzten Glykane können von den Peptiden durch Ethanolpräzipitation abgetrennt werden, mit Neuraminadase desialysiert und direkt über eine Dionex Carbopac PA-100-Säule aufgetrennt werden. Oligosaccharidstandards zum Kalibrieren der Säulenelutionszeiten für verschiedene Glykane sind über Dionex, Oxford Glycosystems sowie andere Firmen erhältlich (Hardy, M. R., und Townsend, R. R., 1994, Rohrer, J. S., et al., 1993, Weitzhandler, M., et al., 1993; Townsend, R. R., et al., 1989). Bestätigung der freigesetzten Strukturen erfolgt mittels Durchführung von Analysen der Carbohydratstruktur der eluierten Glykan-Peaks sowie mittels Durchführung von Verdaus mit spezifischen Glykosidasen und nochmaligem Chromatographieren des modifizierten Glykans über das Dionex-System (Hardy, M. R., und Townsend, R. R., 1994; Rohrer, J. S., et al., 1993; Weitzhandler, M., et al., 1993; Townsend, R. R., et al., 1989; Townsend, R. R., et al., 1991; Townsend, R. R., et al., 1989; Hardy, M. R., und Townsend, R. R., 1989; Townsend, R. R., et al., 1988; Hardy, M. R., et al., 1997; Hardy, M. R., und Townsend, R. R., 1988; Dionex, 1997; Spellman, M. W., 1990; Kumarasamy, R., 1990). Es kann beobachtet werden, dass das neu modifizierte Glykan gleichzeitig mit dem geeigneten Standard-Oligosaccharid eluiert und zudem, dass auch das freigesetzte Monosaccharid häufig identifiziert werden kann (Dionex, 1997). Die Strukturbestimmung wird durch die Verwendung spezifischer Glykosidasen für die Spaltung der verzweigten Ketten ebenso wie durch den Abdau der einzelnen Zucker von jeder der verzweigten Ketten vereinfacht. Zum Beispiel spaltet Endo H den High-Mannose-Typ sowie Hybrid-Oligosaccharidketten, während die Glykosidase Endo F2 biantennäre Komplextypen und PNAse F tri- und tetraantennäre Ketten bis auf die N-Asn-Bindung hinab spaltet.
Kompetitive Rezeptorbindung und in vitro-Bioassay.
Die Bioassays werden mit rekombinant veränderten CHO-Zellen durchgeführt, die mit dem humanen Rezeptor für LH/CG transfiziert sind. Die Zellen werden in Ham's F-12-Medium, 4 mM Glutamin, 400 μg/ml G418 (Gibco), 5 % fötalem Kälberserum, 100 IE/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin kultiviert. Die Zellen werden nur durch Versen von der Flaschenoberfläche entfernt.
Ein kompetitiver Rezeptorassay ist wie folgt aufgebaut: das Rezeptorbindungsassay-Gemisch enthält 100 μl einer geeigneten Verdünnung von Serum-/Urinproben oder hCG-Verdünnungen für Standardkurven, 100 μl von ¹²⁵-I-hCG (50000–100000 cpm) in Puffer A (PBS/0,1 % BSA) und 100 μl CHO-Zellen (2 × 10⁵ Zellen in PBS). Das Gemisch wird bei 37 °C unter leichtem Schütteln inkubiert, gefolgt von 10-minütigem Zentrifugieren bei 750 × g. Der Überstand wird abgesaugt und das Zellpellet im Gamma-Zähler gezählt.
In vitro-Bioassay.
Transfizierte CHO-Zellen werden in einer 24-Well-Platte in Kulturmedium ausgesät (200000 Zellen/Well) und für 2–3 Tage inkubiert, bis die Zellen Konfluenz erreichen. Nicht-transfizierte Zellen werden eingesetzt, um die unspezifische Antwort zu kontrollieren. Das Medium wird entfernt und durch Medium ersetzt, welches 1 mM Isobutylmethylxanthin mit geeigneten Verdünnungen des getesteten Serums oder Urins enthält. Die Platten werden bei 37 °C für zwei Stunden inkubiert. Der Überstand wird entfernt und die Wells werden mit Hank's balanced Salzlösung gewaschen. Das intrazelluläre cAMP wird mit 95%-igem Ethanol, das 1:5 verdünnt ist (oder bis zu 1:40, abhängig vom cAMP-Gehalt), in dem mit dem cAMP-Kit (New England Nuclear) bereitgestellten Assaypuffer extrahiert. Der cAMP-Assay wird nach Anweisung des Herstellers durchgeführt. Die Antwort wird auf Proteingehalt pro Well normiert (BCA-Proteinassay-Kit, Pierce, Rockford, IL).
In vivo-Bioassay

wird in Anlehnung an das Verfahren von Wide und Hobson durch den Gebärmuttergewichts-Assay mit nicht geschlechtsreifen weiblichen Mäusen durchgeführt (Wide, L., Hobson, B., 1987). Die Mäuse werden an drei aufeinanderfolgenden Tagen mit einem Drittel der gesamten Gonadotropindosis subkutan injiziert und 72 Stunden nach der ersten Injektion getötet. Die Gebärmütter werden von Gekröse, Fett und Eileitern freipräpariert, abgetupft, um intrauterine Flüssigkeit zu entfernen, und auf 0,1 mg genau gewogen. Fünf bis zehn Mäuse werden für jede dieser Dosislevel verwendet. Die verwendete hCG-Standardpräparation ist nicked hCG. Dieses Material kann gleichzeitig mit den aus dem ersten und dritten Trimester der Schwangerschaft isolierten Proben getestet werden. Schein-Salzinjektion kann als Kontrolle verwendet werden. Das Antwortsignal ist der Log des Gewichts der Maus-Gebärmutter.

Clearance von hCG-Isoformen.
Die Clearance von hCG wird in Ratten bestimmt. Blut (200 μl/Probe) wird nach 0, 120, 240, 360 und 490 Minuten nach Injektion über einen Dauerkatheter in einer katheterisierten äußeren Halsvene nach dem von Newman et al. (Newman, C. B., et al., 1985) und Brown und Hedge (Brown, M. R., und Hedge, G. A., 1972) beschriebenen Verfahren erhalten. Kurzgesagt, adulten männlichen Sprague-Dawley-Ratten (Charles River Laboratories, Wilmington MA), Gewicht: 172–225 g, stehen unbegrenzte Mengen an Futter und Wasser zur Verfügung. Den Ratten wird für eine Woche nach Ankunft Gelegenheit zur Akklimatisierung gegeben, und mehreren Tage vor der hCG-Infusion werden den Ratten unter Pentobarbital-Anästhesie Kanülen gelegt. Eine Kanüle aus rostfreiem Edelstahl der Größe 21 wird in eine der äußeren Halsvenen eingeführt. Die Platzierung des Katheters erlaubt das Sammeln von Blut aus den uneingeengten, ungestressten Ratten. Nachdem sich die Tiere vom Einsetzen der Kanülen erholt haben, wird eine hCG-Isoform über die Kanüle in der Vene injiziert (10 μg/ml sterile Saline). Zu den vier oben aufgelisteten Zeitintervallen werden Blutproben gewonnen. Man lässt das Blut gerinnen, das Serum sich absetzen und lagert es bei –80 °C für immunometrische Assays, die spezifisch für verschiedene hCG-Isoformen sind.
Die Clearance-Rate der hCG-Isoformen aus dem Kreislauf der Ratte werden bestimmt durch computergesteuertes Anpassen der Konzentrationsdaten an eine Gleichung der allgemeinen Formel: Konzentration = Ae^–αt + Be^–βt zum Zeitpunkt t: A und α sind Parameter der schnellen Komponente und B und β sind Parameter der langsamen Komponente. Die metabolische Clearancerate (MCR) wird als MCR = Dosis/(A/α + B/β) berechnet und das anfängliche Verteilungsvolumen wird aus V_d = Dosis/(A + B) errechnet. Die MCR wird für statistische Analysen auf Körpergewicht normiert, was mittels Verwendung von ANOVA mit Duncan's Range Test für die Bestimmung der Signifikanz erfolgt (Cassals, J. W., et al., 1989).
Mäuse.
Bei den in den hierin beschriebenen Experimenten verwendeten Maus-Spezies handelt es sich um 12–20 Wochen alte Balb/c-Mäuse sowie erwachsene Sprague-Dawley-Ratten beiderlei Geschlechts. Mäuse werden wie beschrieben für die Produktion monoklonaler Antikörper mittels Aszites sowie für die Bestimmung der in vivo biologischen Aktivität verwendet. Balb/c-Mäuse werden deshalb verwendet, weil die Hybridoma-Zelllinien unter Verwendung von Balb/c-Splenozyten entwickelt wurden.
EXPERIMENTELLE DETAILS FÜR DIE ZWEITE REIHE VON EXPERIMENTEN
Humanes Choriongonadotropin kommt in Blut und Urin in einer Vielzahl von Isoformen vor, von denen eine, bezeichnet als nicked hCG (hCGn), gespaltene Peptidbindungen innerhalb des Loop 2 ihrer Beta-Untereinheit aufweist. Diese hCG-Isoform scheint im Urin von Patienten mit bestimmten bösartigen Tumoren sowie möglicherweise in einigen Schwangerschaftsstörungen weiter verbreitet. Bis jetzt konnten nur indirekte Immunoassays zur Quantifizierung von hCGn verwendet werden. Wir schildern die Entwicklung von zwei monoklonalen Antikörpern gegen eine Form des hCGn, welche aus Patientinnen mit Chorionkarzinom isoliert wurde. Diese hCG-Isoform war nicht nur zu 100 % nicked, sondern enthielt darüber hinaus 100 % Tetrasaccharid-Core-O-glykosidisch gebundene Carbohydratteile in ihrer Beta-COOH-terminalen Region. Zweiseitige immunometrische Assays sind entwickelt worden, in denen diese neuen Antikörper, B151 und B152, verwendet werden. Der erstgenannte zeigt gute Spezifitäten für hCGn, unabhängig von der Quelle für das hCGn, nämlich sowohl für die von Chorionkarzinom-Patientinnen ausgeschiedene Form als auch für die hCGn-Form von Normalschwangerschaften. Der letztgenannte Antikörper, B152, ist sensitiv für die Carbohydratteile und möglicherweise auch für andere Unterschiede in den hCG-Isoformen, allerdings nicht für das Nicking der Beta-Untereinheit. Diese beiden immunometrischen Assays stellen leistungsstarke, neue diagnostische Instrumente für die direkte Messung von hCG-Isoformen bereit, welche früher, vor Entwicklung der diese neu erzeugten Antikörper verwendenden Assays, nicht genau quantifiziert werden konnten.
Humanes Choriongonadotropin (hCG) ist ein von Trophoblastenzellen der Plazenta produziertes Glykoproteinhormon. Die Messung dieses Hormons in Blut oder Urin ist die Basis aller Schwangerschaftstests. Es wird von den Trophoblasten sehr früh zu Beginn der Schwangerschaft sekretiert und dient der Aufrechterhaltung der Steroid-Produktion durch das Corpus Luteum, bis später in der Schwangerschaft die Plazenta diese Funktion übernimmt (1). Die Messung des Hormons oder seiner Untereinheiten oder Fragmente erfreut sich gegenwärtig eines großen Interesses, allerdings zu anderen Zwecken als für die Diagnose von Schwangerschaften, wie Monitoring der Therapie von hCG-sekretierenden bösartigen Tumoren (1), für Tests zum Anzeigen von Down-Syndrom oder anderer genetisch-anomaler Schwangerschaften (2–11), von Bauchhöhlenschwangerschaften (12), etc. HCG erscheint im Urin in einer Vielfalt von Formen, einschließlich freier Untereinheiten, heterodimärem hCG mit gespaltenen Peptidbindungen in Loop 2 seiner Beta-Untereinheit (bekannt als nicked hCG), freien nicked Beta-Untereinheiten und dem Beta-Core-Fragment (13–16). Von der nicked-Form des heterodimären hCG ist berichtet worden, dass sie in Blut sowie in Urin vorkommt, und es ist bekannt, dass sie eine sehr stark verminderte immunochemische Erkennung durch einige, gegen heterodimäres hCG gerichtete Antikörper aufweist, ebenso wie sie eine verminderte biologische Aktivität aufweist (13, 16–17). Es liegen Berichte über Zusammenhänge zwischen erhöhtem Nicking von hCG und bestimmten hCG-sekretierenden bösartigen Tumoren vor (18, 19).
Es stehen keine zufriedenstellenden direkten Immunoassays zur Verfügung, weder für die nicked-Form des hCG, noch für die nicked-Form der freien hCG-Beta-Untereinheit. Bis dato wurden alle Messungen mit subtraktiven Assayverfahren oder Immunoassays, welche Scavenger-Antikörper enthalten, ausgeführt (20–22). Wir schildern hier die Entwicklung von zwei Antikörpern unterschiedlicher Spezifität, wobei als Antigen jene Form des hCG verwendet wird, welche von einem einzelnen Individuum mit Chorionkarzinom produziert wird. Diese besondere hCG-Isoform war zu 100 % nicked und sowohl in ihren N- als auch O-glykosidisch gebundenen Carbohydratteilen hyperglykosiliert. Ein resultierender Antikörper, B151, zeigt signifikante Präferenz für die Bindung an sein Chorionkarzinom-hCG-Antigen und erkennt nicht die nicked-Ausprägungsform. Immunoassays, die unter Verwendung von B152 entwickelt werden, sind aufgrund ihrer verstärkten Erkennung der in Präeklampsie und Down-Syndrom weit verbreiteten hCG-Isoformen von besonderem Interesse (23, 24). B152 scheint ebenso eine hCG-Isoform zu erkennen, die mit gesunden Schwangerschaften assoziiert ist, während im Vergleich dazu jene Schwangerschaften, die bestimmt sind, früh fehlzuschlagen, wenig dieser Isoform aufweisen (25).
Ergebnisse:
Eigenschaften der Antikörper
Eine Vielfalt von hCG-Isoformen wurde eingesetzt, um die in diesem Bericht beschriebenen neuen Antikörper zu charakterisieren, sowohl die Nomenklatur als auch die Eigenschaften jeder verwendeten Reagenzie ist in 11 zusammengefasst. Die Carbohydratgruppen in diesen hCG-Isoformen sowie der Prozentsatz des Nicking wurden in früheren Studien analysiert (26) und sind direkt maßgeblich für das Definieren der Beschaffenheit dieser neuen Antikörper in diesem Bericht.
Zwei Antikörper, bezeichnet als B151 und B152, wurden ausgewählt durch die Verwendung von radioaktiv markierten hCG-Isoformen, Chorion-CG C5 und Schwangerschafts-hCG CR127. Jeder wies bevorzugte Bindung an C5 gegenüber CR 127 auf, da dies das Selektionskriterium war. Allerdings wurde bei der Durchführung der Flüssigphase-Immunoassays und der Berechnung der Affinitätskonstanten deutlich, dass diese zwei Antikörper in ihrer Spezifität sehr unterschiedlich waren (8). Es wurde gefunden, dass Antikörper B151 eine um eine Größenordnung höhere Affinität sowohl für C5, welches das nicked und hyperglykosilierte Chorionkarzinom-hCG ist, als auch für CR127-hCGn (813) gegenüber CR 127-hCG oder nick-freiem CR 127 (814) aufwies (siehe 11 für die Beschreibung der Reagenzien). B151 war eindeutig ein Antikörper mit einer starken Präferenz für die Bindung an verschiedene Formen des nicked hCG. Antikörper B152 unterschied sich insofern, als dass er, obwohl er eine um eine Größenordnung höhere Präferenz für CS-hCG gegenüber CR 127-hCG aufwies, die nicked- und non-nicked-Formen des CR 127-hCG und hCG, welche von Normalschwangerschaften stammten, in gleichem Umfang erkannte.
Flüssigphase-Assayss
8 zeigt Vergleiche der Wirksamkeit von Flüssigphase-Immunoassays von sowohl B151- als auch B152-Antikörpern im Vergleich zu Kompetitoren: 1. Standard-CR 127-Schwangerschafts-hCG (welches einen 20%-igen Gehalt an nicked hCG aufweist); 2. C5-Chorion-CG (100 % nicked und hyperglykosiliert); 3.813, rucked CG, hergestellt aus CR 127 durch Reinigung; und 4. 814, non-nicked hCG, abgeleitet von CR 127. Der markierte Ligand war CS-Chorion-CG. Es ist offensichtlich, dass B151 (8A) eine Präferenz für die nicked-Formen des hCG zeigt. C5-Chorion-CG oder 813 hCGn binden mit ähnlichen Affinitäten. Die leicht schwächere Wirksamkeit von 813-hCGn kann seiner 20%-igen Kontamination mit non-nicked hCG zugeschrieben werden. B152 allein zeigt eine Präferenz zu C5, dem hyperglykosilierten Chorion-CG (8B). 813-hCGn ist kein wirksamerer Kompetitor als nick-freies 814-hCG.
Immunometrische zweiseitige Assays
Eine Vielzahl von zweiseitigen Antikörperformaten wurde getestet. 9 zeigt diese Ergebnisse. Es ist offensichtlich, dass B151 weder gleichzeitig mit Antikörpern (von uns bezeichnet als eine Stelle IV) (27) an die Beta-Untereinheit und den Beta-Untereinheit-Core (B201 und B204) binden kann, noch mit Antikörpern, die auf die Determinante gerichtet sind, welche in heterodimärem hCG vorkommt, wie repräsentiert durch Antikörper B109 (Stelle III, zu der A109 ebenfalls gehört) (27). Im Gegensatz dazu bindet ein universeller Beta-Antikörper, der an die geläufigste und wirksamste hCG-Antigenstelle bindet, die von uns zuvor als Stelle II bezeichnet wurde (B108 oder B207) sehr gut gleichzeitig sowohl mit B151- als auch mit B152-Antikörpern. B152 bindet gleichzeitig an alle getesteten Antikörper mit Ausnahme jener gegen die Beta-COOH-terminale Region (CTP) (28), im Gegensatz zu B151, der sehr gut an CTP-Antikörper bindet. B151 kann ein neu entdecktes hCG-Epitop repräsentieren, das, wie in diesem Manuskript berichtet, nur auf nicked hCG vorkommt.
Die Verwendung von B152 als Capture- und B207 oder B108 als Nachweis-Antikörper erzeugt einen Assay, welcher alle Normalschwangerschaftsformen des hCG (sowohl intaktes als auch nicked und Beta-Untereinheit) in ähnlichem Umfang misst, aber dennoch die Bindung an diejenige Form des hCG oder der Beta-Untereinheit seines Antigens, C5, bevorzugt. Wie bereits früher anhand der Flüssigphaseuntersuchungen vorausgesagt, bevorzugt dieser Assay nicht die nicked-Formen des hCG, sondern die hyperglykosilierten Formen des hCG, wie C5. B152 und CTP 104 sowie mehrere andere monoklonale Antikörper gegen den COOH-terminalen Bereich von HCG-Beta können nicht gleichzeitig an C5 binden, was impliziert, dass dieser Bereich ein Teil von oder sehr nahe dem Epitop von B152 lokalisiert ist. Diese Daten, zusammengenommen mit der offensichtlichen B152-Präferenz für hyperglykosiliertes hCG, implizieren, dass das Carbohydrat des CTP-Bereichs ein Teil des B152 sein kann. Weitere Studien über das Verhalten von B152 in zweiseitigen Assays bestätigen diese Hypothese wie im Folgenden ausgeführt.
Eigenschaften des B152-B207-I¹²⁵-radioimmunometrischen zweiseitigen Assays
Um besser zu verstehen, was dieser Assay misst, verglichen wir, wie in 9 gezeigt, die relativen Bindungspotenzen einer Reihe von hCG-Isoformen (siehe ebenso Methoden): 1. C5, Chorionkarzinom-hCG. 2. 814, non-nicked hCG. 3. 813, nicked hCG (80 % nicked). 4. von M4 Mole-stammendes hCG, 98 % nicked hCG mit vernachlässigbarer Glykosilierung. 5. MIA-hCG, non-nicked und nicht signifikant hyperglykosiliert, wobei allerdings 80 % des hCG-Beta-COOH-Terminus fehlen. Der zweiseitige B152-Assay bevorzugt es an C5, sein Antigen, zu binden, zeigt aber annähernd gleiche Erkennung von sowohl 813 als auch 814, dem nicked und non-nicked hCG der Normalschwangerschaft. Dies bestätigt, dass B152 keine signifikante Präferenz für die nicked-Form des hCG aufweist, sondern eher für die Form mit den Carbohydratunterschieden. Dies wird ebenso bestätigt durch die Wirksamkeit von M4, welches wie C5 ebenso zu 100 % nicked, aber nicht hyperglykosiliert ist und eine Wirksamkeit ähnlich dem CR127-hCG, unerheblich ob nicked oder non-nicked, anzeigt. M1A ist der am wenigsten wirksame Ligand und ist der einzige, dem am meisten seines Beta-COOH-terminalen Peptids fehlt, wodurch wiederum die Funktion dieses Bereichs im B152-Epitop bestätigt wird.
Um die Beschaffenheit der B152-Bindungsstelle weiter zu untersuchen, wurde ein kommerziell erhältlicher Peroxidase-markierter Universal-hCGβ-Antikörper (4001) als Nachweisantikörper in einem zweiseitigen Enzym-immunometrischen System eingesetzt. Acht unterschiedliche hCG-Formen wurden in diesem, in 14 illustrierten, System evaluiert. Die Ergebnisse wurden bezogen auf die relative Immunopotenz (basierend auf der Steigung der Regressionsgeraden) in 10 analysiert.
Eine lineare Regressions-Korrelations-Analyse wurde durchgeführt, um die Beziehung der Immunopotenzen der Präparationen 814, C5, M4, C7 und P8 eine nach der anderen mit den Carbohydratunterschieden sowie mit den Nicking-Unterschieden zwischen den 5 heterodimären hCG-Isoformen zu vergleichen. Die Korrelationsergebnisse für jeden Vergleich lauten wie folgt. 1. Tetrasaccharid, O-glykosidisch gebundener Core: R²= 0,9147, P = 0,0108, signifikant; 2. Triantennär verzweigte Teile, N-glykosidisch gebunden an β: R2 = 0,8853, P = 0,0171, signifikant; 3. N-Acetylneuraminsäure, O-glykosidisch gebunden: R² = 0,3062 P = 0,3332, nicht signifikant; 4. N-Acetylneuraminsäure, N-glykosidisch gebundenen an β: R² = 0,2289 P = 0,4149, nicht signifikant; 5. Prozent Nicking in β-Untereinheit: R² = 0,0984 P = 0,6072, nicht signifikant.
Zusammenfassend wird für diese Analyse festgestellt, dass die in einem zweiseitigen Assay mit B152 als Capture-Antikörper gemessene Immunopotenz der hCG-Isoformen am besten mit hyperglykosilierten Core-Teilen von sowohl O- als auch N-glykosidisch gebundenen Aminosäuren korreliert, nicht jedoch mit N-Acetylneuraminsäureresten und nicht mit dem Nicking-Grad der β-Untereinheit.
Diskussion
Die verschiedenen Isoformen des hCG haben während der letzten Jahre eine erhöhte Aufmerksamkeit hinsichtlich ihres potenziellen diagnostischen Werts in Problemschwangerschaften wie Down-Syndrom, Präeklampsie, Trophoblastenerkrankungen und Verlust der Frühschwangerschaft erfahren. Nicked hCG wurde in hohen Konzentrationen mit Trophoblastenerkrankung und anderen anomalen Zuständen der hCG-Produktion in Zusammenhang gebracht. Obwohl nicked hCG mittels einer Vielzahl qualitativer Techniken wie Immunoblotting sowie mittels direkter Isolierung und Sequenzanalyse solcher hCG-Isoformen aus Urin gemessen wurde, gelang es erst kürzlich einigen Forschern, nicked-Formen des hCG mittels einer Vielzahl von subtraktiven Immunoassays oder nicht-spezifischen hCG-Assays mit dem Zusatz von Scavenger-Antikörpern zu messen, da direkte, verhältnismäßig spezifische Antikörper nicht verfügbar waren (22; 29). Wir haben früher gezeigt, dass unser gebräuchlicher Antikörper B109 gegen heterodimäres hCG nur sehr schwach mit den nicked-Formen des hCG reagiert, und dieser Antikörper wurde von anderen Gruppen in subtraktiven Verfahren beim Versuch eingesetzt, den Gehalt an nicked hCG in Blut oder Urin zu quantifizieren (22; 29).
In diesem Bericht beschreiben wir die Entwicklung von zwei Antikörpern, die unter Verwendung eines von einem Chorionkarzinom stammenden nicked hCG als Antigen hergestellt wurden. Dies führte zu einem direkten Assay für nicked hCG. Durch Einsatz einer nicked, hyperglykosilierten Form des hCG, die von einer einzelnen Chorionkarzinom-Patientin stammte, haben wir zwei Antikörper mit unterschiedlichen Spezifitäten entwickelt. Ein Antikörper (B151) bevorzugt die Bindung an nicked-Formen des hCG, ungeachtet des Ursprungs des hCG-Moleküls (Normalschwangerschaft oder Chorionkarzinom). Nick-freies CR127-hCG weist die geringste Affinität zu diesem Antikörper auf, wie dies für einen auf Nick gerichteten Antikörper erwartet werden würde. Während B151 auf ein von der Spaltung der Peptidbindung in Beta-Loop 2 abhängiges Epitop gerichtet war, wurde die B152-Bindung nicht durch Spaltungen der Peptidbindung innerhalb dieses Loops beeinträchtigt. Da der Hauptunterschied zwischen CS-hCG und CR 127-hCGn in der Hyperglykosilierung des erstgenannten lag, wurde daraus gefolgert, dass B152 hauptsächlich ein auf Carbohydrat gerichteter Antikörper war. Wenn B151 als Capture-Antikörper und praktisch jeder Universal-Beta-Antikörper als Nachweisantikörper in einem zweiseitigen Assay verwendet wird, ist eine geringfügige Kreuzreaktion mit hLH zu beobachten. B151 kann weder gleichzeitig mit Antikörpern binden, die hauptsächlich gegen die hCG-Beta-Core-Region (Stelle IV, wie B201 und B204) binden, noch kann der Antikörper mit Stelle III-Antikörpern binden, die gegen heterodimäres hCG. gerichtet sind, wie B103 oder A109, sondern er kann gleichzeitig mit Antikörpern gegen die Beta-COOH-Region binden. B151 kann ein neues hCG-Epitop repräsentieren, welches nach dem Nicking des Beta-Loops 2 zum Vorschein kommt. Die Erzeugung neuer Epitope durch Nicking des hCG-Moleküls wurde von anderen berichtet (30).
Der zweite Antikörper, B152, bindet bevorzugt jene Art von Carbohydrat-Modifikationen, die in Chorionkarzinom-CG C5 vorherrschend sind, ungeachtet des Nicking-Zustands der Polypeptidkette. Dies wurde durch die Messung der relativen Immunopotenzen mehrerer gut charakterisierter hCG-Formen im Vergleich zu ihrem Gehalt an N- und O-glykosidisch gebundenen Carbohydratteilen, N-Acetylneuraminsäure und Nicking-Prozentsätzen gezeigt. Eine signifikante Korrelation von B152-Bindung mit hyperglykosilierten hCG-Isoformen wurde gezeigt, allerdings nicht mit jenen mit N-Acetylneuraminsäure- oder Nicking-Unterschieden. Antikörper B152 scheint zumindest eine partielle Spezifität hinsichtlich der hCG-Beta-COOH-terminalen Region aufzuweisen. Dies wurde durch das Unvermögen eines monoklonalen Antikörpers gezeigt, gleichzeitig mit Beta-COOH-terminalen Antikörpern wie CTP 104 zu binden. In Untersuchungen zu B152 in einem zweiseitigen Assay wurde gezeigt, dass die hCG-Isoform MIA, welcher der größte Teil ihres COOH-terminalen Bereichs fehlt, nur sehr schwach an B152 bindet.
Jeder Antikörper weist gemäß seiner Spezifität eine unterschiedliche Anwendbarkeit auf. Bis zum jetzigen Zeitpunkt standen zum Quantifizieren von nicked hCG nur indirekte Assays, wie subtraktive Assays oder Assays, denen Scavenger-Antikörper hinzuzufügen sind, zur Verfügung. Die Entwicklung von B151 erlaubte die Formulierung direkter Assays für nicked hCG, welche in Untersuchungen zur frühen Schwangerschaft Anwendung fanden (25, 31). Diese Messtechniken können diagnostische Anwendung finden in bestimmten Krebsarten (18–19) sowie im Down-Syndrom-Nachweis (22). Die Anwendung des B152-Antikörpers resultiert in der Entwicklung von Assays, welche Unterschiede im Carbohydratanteil von hCG nachweisen können. Die wichtigsten Anwendungen dieser Antikörper schließen den Nachweis von Down-Syndrom (23) sowie die Erkennung von Schwangerschaften ein, welche für den Verlust der Frühschwangerschaft bestimmt sind (25, 32). Dieser Antikörper ist ungewöhnlich, da es bei Carbohydrat-unterscheidenden Antikörpern selten vorkommt, dass sie gegen hCG entwickelt werden. Die einzige frühere derartige Entwicklung betraf Antikörper gegen die hCG-Beta-COOH-terminale Region mittels Verwendung des an Träger gebundenen isolierten Peptids (28, 33). Es ist von Interesse, dass mindestens ein Teil des Epitops von B152 ebenfalls auf die Beta-COOH-terminale Region gerichtet ist. Wie früher berichtet, war die CS-Chorionkarzinom-Form von hCG das einzige derartige hCG, das 100 % Hexasaccharidstruktur an seinen O-Serin-gebundenen Carbohydratteilen in der Beta-COOH-terminalen Region aufwies. Dies kann zur Produktion dieses seltenen Antikörpers geführt haben. Eine zweite, aus einem Chorionkarzinom stammende hCG-Isoform, C7, wies 69 % der gleichen O-glykosidisch gebundenen Core-Hexasaccharidstruktur auf und bewies ähnliche Wirksamkeit wie C5 mit dem B152-Epitop.
Zusammengefasst haben wir zwei neue monoklonale Antikörper mit potenziellem klinischem Nutzen hergestellt: B151, der verwendet werden kann, um nicked-Formen des hCG mit besserer Spezifität als jeder bislang beschriebene Antikörper zu messen. B152, der ein spezifischer Antikörper gegen die Chorionkarzinom-Form des hCG ist und hyperglykosiliertes von Standard-Schwangerschafts-hCG unterscheiden kann.
Material und Methoden
Hormone
Nick-freies hCG (814) und nicked hCG (813) wurden aus gepooltem Urin-Standard-hCG (Batch CR 127) durch hydrophobe Chromatographie wie zuvor beschrieben präpariert (14).
C8-hCG wurde von einem Individuum mit normaler Schwangerschaft gereinigt, M1- und M4-hCG wurden beide von Individuen mit gestationsbedingter Trophoblastenerkrankung (Blasenmole) und C5- und C7-hCG von Individuen mit maligner Trophoblastenerkrankung (Chorionkarzinom) wie anderweitig beschrieben gereinigt (16, 26). Die N-terminalen Peptidsequenzen der abgetrennten α- und (3-Untereinheiten von CR127-; P8-, M1-, M4-, C5- und C7-hCG sowie vollständige N- und O-glykosidisch gebundenen Oligosaccharidstrukturen wurden kürzlich veröffentlicht (26). Während der Reinigung der hCG-Präparation M1 mittels Sephacryl S100 HR-Chromatographie wurden zwei Peaks beobachtet. Der Peak der in der Position von Standard-hCG (M1) eluiert, und der später eluierende Peak (MIA) wurden getrennt gereinigt. M1- und M4-hCG wurden beide aus Individuen mit Blasenmole gereinigt. Sie wurden isoliert wie früher beschrieben (16).
Antigene
Chorionkarzinom-hCG, bezeichnet als C5, wurde wie früher beschrieben aus einer einzelnen Patientin isoliert (16), und seine vollständige Carbohydratanalyse erschien kürzlich (26).
Immunisierung der Mäuse
Mäuse wurden intraperitoneal mit der Chorionkarzinom-hCG-Präparation C5, verdünnt in Saline (600 μg/Maus) und 1:1 gemischt mit Freund'schem Adjuvans, immunisiert. Nach drei aufeinanderfolgenden Immunisierungen (50 μg/Maus) in 3-4-wöchigen Intervallen wurden die Mäuse nach 3 Monaten wieder getestet und anschließend eine intraperitoneale Booster-Immunisierung gegeben (34). Zehn Tage nach dem letzten Booster wurde das Serum der Mäuse auf Bindung (in Flüssigphase-Radioimmunoassays) an sowohl iodiniertes CR 127-hCG als auch an iodiniertes CS-hCG getestet.
Flüssigphase-Assays
Flüssigphase-Assays wurden ausgeführt unter Verwendung einer Lösung von 80 μl 0,3 M PBS mit 0,02 % Natriumazid, 50 μl Tracer, 20 μl normalem Mausserum, 50 μl 1%-igem Pferdeserum, frei von Gammaglobulin, für Titrationen (bei Durchführung kompetitiver Untersuchungen wurden 50 μl Kompetitorlösung substituiert, um Dosis/Antwort oder Scatchard-Kurven zu erzeugen), 100 μl verdünntem Serum, gefolgt von Inkubation für 1 h bei 37 °C, und anschließend über Nacht bei 4 °C. Am nächsten Tag wurden 100 μl Kaninchen-Anti-Maus-Seren zugegeben, inkubiert für 10 Min. bei 37 °C, anschließend für 1 h bei Raumtemperatur, anschließend zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und die Pellets gezählt. Die Mäuse, deren Antiseren die größte Diskriminierung zwischen der Bindung von radiomarkiertem C5 und radiomarkiertem CR 127-hCG aufwiesen, wurden getötet und ihre Milzen zur Hybridomaproduktion verwendet. Die für die Fusionsarbeit verwendeten Methoden und Materialien wurden früher beschrieben (27; 34).
Charakterisierung der Antikörper
Die klonierten monoklonalen Antikörper B151 und B152 wurden jeder in Flüssigphasekompetitivem Radioimmunoassay unter Verwendung von C5 als radiomarkiertem Liganden und C5 und CR127-hCG als Kompetitoren untersucht. Die Vorgehensweise entspricht derjenigen unter Flüssigphase-Assayverfahren beschriebenen. Affinitätskonstanten wurden durch Scatchard-Plots wie früher beschrieben errrechnet (35–37).
Zweiseitiger Assay
Zweiseitige Assayuntersuchungen wurden an der Yale University (enzymimmunometrisch) und an der Columbia University (radioimmunometrisch) wie früher beschrieben ausgeführt (24,37). Kurzgesagt, Immulon Mikrotiter-Wells wurden mit Capture-Antikörper bei einem Titer beschichtet, der so bestimmt wurde, dass er die bestmögliche Kombination von Sensitivität und Schwankungsbreite gewährleistete. Die Platten wurden anschließend gewaschen und anschließend mit 1 % BSA in PBS geblockt. Nach einem weiteren Waschstandard wurden klinische Proben und Kontrollen zu den beschichteten Wells gegeben (200 μl/Well). Die Platten wurden inkubiert, anschließend die Proben entfernt und die Platten gewaschen. Markierter Antikörper (entweder radiomarkiert oder Peroxidase-markiert) wurde anschließend zugegeben und die Platten weiter inkubiert. Die Antwortvariable wurde, je nach Anwendbarkeit, durch einen Gammazähler (Packard Instruments Cobra) oder durch Absorptionsspektrophotometrie erzeugt. Für Standardwerte wurde eine kubische Spline-Kurve erzeugt, und Probenwerte wurden von dieser Kurve abgelesen. Regressionsgeraden und alle Graphen wurden unter Verwendung von Sigmaplot 4.01 von SPSS Software, Chicago, Ill. erzeugt. Lineare Regressionsanalyse der Immunopotenz im Vergeich zu jedem der Carbohydratunterschiede und Nicking-Unterschiede der hCG-Isoformen wurde in Instat 1998, GraphPad Software, Inc. San Diego, California, USA, ausgeführt.
Die oberen experimentellen Beispiele lehren nicht jeden Schritt der vorliegenden Erfindung wie beansprucht und lehren insbesondere nicht den Schritt, der das Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit einer hinreichenden Abnahme im Verhältnis von B152-nachweisbarem hCG zu intaktem hCG in Blut oder Urin eines Subjekts über die Zeit während der ersten vierzig Tage der Schwangerschaft umfasst.
Dritte Reihe an Experimenten
Die in den 15, 16 und 17 dargestellten Ergebnisse stammten von IVF-Patientinnen, die täglich, beginnend mit dem Tag des Embryotransfers, ihren Morgenurin gesammelt hatten. Diese Subjekte hatten an der "Spenderei"-Variante der IVF-Therapie teilgenommen; das heißt, die Empfängerinnen erhielten kein exogenes hCG.
Insgesamt wurden 22 Zyklen evaluiert. Bei 10 dieser Zyklen wurde kein hCG nachgewiesen, wodurch angezeigt wird, dass das Einnisten der Blastozyste im Endometrium fehlschlug. Es lagen fünf frühe Verluste der Schwangerschaft vor, bei denen sich eine Schwangerschaft etablierte, diese jedoch nicht bis zum Ende ausgetragen wurde. Es lagen drei Normalschwangerschaften mit multiplen (2–3) Föten und vier Ein-Kind-Schwangerschaften vor.
Mehrlingsschwangerschaften produzierten erwartungsgemäß größere Mengen an hCG als die Ein-Kind-Schwangerschaften. Allerdings lag in beiden Kategorien der erfolgreichen Schwangerschaften eine eindeutige Umkehr des B152/B109-Isoformverhältnisses vor, während in den fehlgeschlagenen Schwangerschaften dieses Verhältnis erhöht blieb, wodurch angezeigt wird, dass die relative Persistenz die B152-hCG-Isoform ist und nicht B109 die prädominante Isoform ist.
Die ständige statistische Analyse richtet sich insbesondere auf die Bestimmung der Minimumskonstellation der Bestimmungen, die nötig ist, um eine klinisch verwendbare Diskriminanzfunktion für den Nachweis von Problemschwangerschaften an einem Punkt zu entwickeln, an dem unterschliedliche Intervention (durchaus durch Verabreichung von exogenem hCG möglich) wirksam sein würde.
Der Verlust von Patientin #10 (17D) veranschaulicht dies am besten; sie verlor ihre Schwangerschaft erst nach Beendigung der Probensammlung. Und auf der Basis von hCG-Konzentration konnte man keine Problemschwangerschaft vorhersagen – aber mit dem Vergleich des Verhältnisses mit den Konzentrationen würde bei scheinbarer Normalität anderer Indikatoren das Problem vorhergesagt werden können.
Literaturangaben für die erste Reihe von Experimenten

Amano, J., R. Nishimura, S. Sato und A. Kobata. 1990. Glycobiology. 1: 45–50.
Armstrong, E. G., P. H. Ehrlich, S. Birken, J. P. Schlatterer, E. Siris, W. C. Hembree und R. E. Canfield. 1984. J. Clin. Endocrinol. Metab. 59: 867–874.
Baenziger, J. U. 1994. FASEB J. 8: 1019–1025.
Bahl, O. P., L. Marz und W. R. Moyle. 1995. S. 125–44. In Anonymous In: Dufau ML, Means AR, Hrsg. Hormone binding and target cell activation in the testis. New York, Plenum Press, 1974.
Berger, P., Schwarz, S., Spottl, G., Wick, G. und Mann, K. (1993) Variants of human chorionic gonadotropin from pregnant women and tumor patients recognized by monoclonal antibodies. J. Clin. Endocrinol. Metab. 77, 347–351.
Birken, S., M. A. Kolks, S. Amr, B. Nisula und D. Puett. 1987. Endocrinology 121: 657–666.
Birken, S., Gawinowicz, MA, Kardana, A., Cole, LA. 1991. Endocrinology 129: 1551–1558.
Birken, S., Kovalevskaya, G., O'Connor, J. Mol. Cell Endocrinol., 1996, 125: 121–131.
Birken, S., M. A. Gawinowicz Kolks, S. Amr, B. Nisula und D. Puett. 1986. J. Biol. Chem. 261: 10719–10727.
Birken, S., Y. Chen, M. Gawinowicz, J. W. Lustbader, S. Pollak, G. Agosto, R. Buck und J. O'Connor. 1993. Endocrinology 133: 1390–1397.
Birken, S., Y. Maydelman, M. A. Gawinowicz, A. Pound, Y. Liu und A. S. Hartree. 1996b. Endocrinology 137: 1402–1411.
Blithe, D. L. und R. K. Iles. 1995. Endocrinology 136: 903–910.
Braun, J. R., T. E. Willnow, S. Ishibashi, G. Ashwell und J. Herz. 1996. J. Biol. Chem. 271: 21160–21166.
Brown, M. R. und G. A. Hedge. 1972. Neuroendocrinology 9: 158–174.
Browne, E. S., M. V. Flasch, M. R. Sairam und V. K. Bhalla. 1990. Biochim. Biophys. Acta 1033: 226–234.
Cassals, J.W., Mann, K., Blithe, D.L., Nisula, B.C., Wehmann, R.E. 1989. Cancer 64: 2313–2318.
Chang, P.L., Canfield, R.E., Ditkoff E.C., O'Connor, J.F., Sauer, M.V., 1997. Fertil. Steril., 1998, 69: 412–414.
Chmielewski, C. 1992. ANNA. J. 19: 34–38.
Cole, L. A., A. Kardana, P. Andrade-Gordon, M. A. Gawinowicz, J. C. Morris, E. R. Bergert, J. O'Connor und S. Birken. 1991a. Endocrinology 129: 1559–1567.
Cole, L. A., A. Kardana, F. C. Ying und S. Birken. 1991b. Yale J. Biol. Med. 64: 627–637.
Cole, L. A., A. Kardana, S. Y. Park und G. D. Braunstein. 1993. J. Clin. Endocrinol. Metab. 76: 704–710.
Cole, L. A., S. Birken und F. Perini. 1985. Biochem. Biophys. Res. Commun. 126: 333–339.
Diaz-Cueto, L., Barrios-de-Tomasi, J., Timossi, C., Mendez, J. P. und Ulloa-Aguirre, A. (1996) More in-vitro bioactive, shorter-lived human chorionic gonadotrophin charge isoforms increase at the end of the first and during the third trimesters of gestation. Mol. Hum. Reprod. 2: 643–650.
Dionex. 1997. Technical Note 42
Elliott, M. M., A. Kardana, J. W. Lustbader und L. A. Cole. 1997. Endocrine, 7: 15–32.
Ellish, N. J., Saboda, K., O'Connor, J., Nasca, P. C., Stanek, EF, Boyle, C. Hum. Reprod. 1996. 11: 406–412.
Fares, F. A., N. Suganuma, K. Nishimori, P. S. LaPolt, A. J. Hsueh und I. Boime. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 4304–4308.
Fein, H. G., Rosen, S. W. und Weintraub, B. D. (1980). Increased glycosylation of serum human chorionic gonadotropin and subunits from eutopic and ectopic sources: comparison with placental and urinary forms. J. Clin. Endocrinol. Metab. 50, 1111–1120.
Fiete, D., V. Srivastava, O. Hindsgaul und J. U. Baenziger. 1991. Cell 67: 1103–1110.
Grotjan, H. R. J. und L.A. Cole. 1989. In Microheterogeneity of Glycoprotein Hormones. H. R. J. Grotjan und L. A. Cole, Herausgeber. CRC Press, Boca Raton. 219–237.
Hakim, R. B., R. H. Gray und H. Zacur. 1995. Am. J. Obstes. Gynecol. 172: 1510–1517.
Hardy, M. R. und R. R. Townsend. 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85: 3289–3293.
Hardy, M. R., R. R. Townsend und Y. C. Lee. 1997. Anal. Biochem. 1988 Apr; 170(1): 54–62.
Hardy, M. R. und R. R. Townsend. 1989. Carbohydr. Res. 188: 1–7.
Hardy, M. R. und R. R. Townsend. 1994. Methods Enzymol. 230: 208–225.
Harrison, R. F. 1985. Europ. J. Obstet. Gynec. reprod. Biol. 20: 159–168.
Hill, J. A. und D. J. Anderson. 1990. Archsm. Immun. Ther. Exp. 38: 111–119.
Ho, H-H, O'Connor, JF, Overstreet, JW, Lasley, BL. Early Pregnancy: Biology and Medicine, 1997, 3: 153–163.
Hoermann, R., G. Spoettl, M. Grossmann, B. Saller und K. Mann. 1997. J. Clin. Invest. 71: 953–960.
Hoermann, R., P. Berger, G. Spoettl, F. Gillesberger, A. Kardana, L. A. Cole und K. Mann. 1994. Clin. Chem. 40: 2306–2312.
Hussa, R. O. 1987. The Clinical Marker hCG. Praeger, New York.
Kagimoto, A., R. Sakakibara, N. Fukushima, N. Ikeda und M. Ishiguro. 1995. Biol. Pharm. Bull. 18: 810–817.
Kardana, A., G. D. Braunstein und L. A. Cole. 1996. Oncol. Res. 8: 13–16.
Kardana, A. und L. A. Cole. 1992. Clin. Chem. 38: 26–33.
Karlsson, F. A., P. Burman, O. Kampe, J. E. Westlin und L. Wide. 1993. Acta Endocrinol. (Copenh) 129: 291–295.
Kawasaki, T. und G. Ashwell. 1976. J. Biol. Chem. 251: 1296–1302.
Kovalevskaya, G., Birken, S., O'Connor, J., Schlatterer, J., Maydelman, Y, Canfield, R. Endocrine, 1995, 3: 881–887.
Kumarasamy, R. 1990. J. Chromatogr. 512: 149–155.
Lasley, B. L., P. Lohstroh, A. Kuo, E. B. Gold, B. Eskenazi, S. J. Samuels, D. R. Stewart und J. W. Overstreet. 1995. Am. J. Ind. Med. 28: 771–781.
Maack, T., C. H. Park und M. J. F. Camargo. 1985. In The kidney: Physiology and pathophysiology. D. W. Seldin und G. Giebisch, Herausgeber. Raven Press, New York. 1773–1803.
Matzuk, M. M., A. J. Hsueh, P. Lapolt, A. Tsafriri, J. L. Keene und I. Boime. 1990. [Veröffentlichtes Erratum erscheint in Endocrinology 1990 Apr; 126 (4): 2204]. Endocrinology 126: 376–383.
Moyle, W. R., O. P. Bahl und L. Marz. 1975. Journal of Biological Chemistry 250: 9163–9169.
Newman, C. B., S. L. Wardlaw und A. G. Frantz. 1985. Life Sci. 36: 1661–1668.
Nishimura, R., T. Kitajima. K. Hasegawa, K. Takeuchi und M. Mochizuki. 1989. Jpn. J. Cancer Res. 80: 968–974.
Nishimura, R., T. Utsunomiya, K. Ide, T. Kitajima, H. C. Chen, J. L. Strobel, R. O. Hussa und M. Mochizuki. 1987. Jpn. J. Cancer Res. 78: 833–839.
Nishimura, R., K. Ide, T. Utsunomiya, T. Kitajima, Y. Yuki und M. Mochizuki. 1988. Endocrinology 123: 420–425.
O'Connor, J., G. Kovalevskaya, S. Birken, J. P. Schlatterer, D. Schechter, D. McMahon und R. E. Canfield. 1998. Hum. Reprod. 13: 826–835.
O'Connor, J. F., S. Birken, J. W. Lustbader, A. Krichevsky, Y. Chen und R. E. Canfield. 1994. Endocr. Rev. 15: 650–683.
O'Connor, J. F., J. P. Schlatterer, S. Birken, A. Krichevsky, E. G. Armstrong, D. McMahon und R. E. Canfield. 1988. Cancer Res. 48: 1361–1366.
Odell, W. D. und J. Griffin. 1989. J. Clin. Endocrinol. Metab. 69: 528–532.
Odell, W. D. und J. Griffin. 1987. N. Engl. J. Med. 317: 1688–1691.
Pollak, S., S. Halpine, B. T. Chait und S. Birken. 1990. Endocrinology 126: 199–208.
Puisieux, A., D. Bellet, F. Troalen, A. Razafindratsita, C. Lhomme, C. Bohuon und J. M. Bidart. 1990. Endocrinology 126: 687–694.
Quadri, K. H., J. Bernardini, A. Greenberg, S. Laifer, A. Syed und J. L. Holley. 1994. Am. J. Kidney Dis. 24: 416–420.
Quenby, S. und R. G. Farquharson. 1994. Fertil. Steril. 62: 708–710.
Ravindranath, N., N. S. Srilatha, M. R. Sairam und N. R. Moudgal. 1992. Indian J. Exp. Biol. 30: 982–986.
Rohrer, J. S., G. A. Cooper und R. R. Townsend. 1993. Anal. Biochem. 212: 7–16.
Sairam, M. R. und L. G. Jiang. 1992. Mol. Cell Endocrinol. 85: 227–235.
Sairam, M. R. 1989. FASEB J. 3: 1915–1926.
Sairam, M. R., J. Linggen und G. N. Bhargavi. 1988. Biosci. Rep. 8: 271–278.
Skarulis, M. C., R. E. Wehmann, B. C. Nisula und D. L. Blithe. 1992. J. Clin. Endocrinol. Metab. 75: 91–96.
Spellman, M. W. 1990. Anal. Chem. 62: 1714–1722.
Stanton, P. G., G. Poznek, P. G. Burgon, D. M. Robertson und M. T. W. Hearn. 1993. J. Endocrinol. 138: 529–543.
Szkudlinski, M. W., N. R. Thotakura, I. Bucci, L. R. Joshi, A. Tsai, J. East-Palmer, J. Shiloach und B. D. Weintraub. 1993. Endocrinology 133: 1490–1503.
Szkudlinski, M. W., N.R. Thotakura, J. E. Tropea, M. Grossmann und B. D. Weintraub. 1995. Endocrinology 136: 3325–3330.
Taussky, H. H. 1954. J. Biol. Chem. 208: 853–861.
Thotakura, N. R., M. W. Szkudlinski und B. Weintraub. 1994. Glycobiology. 4: 525–533.
Townsend, R. R., M. Hardy, J. D. Olechno und S. R. Carter. 1988. Nature 335: 379–380.
Townsend, R. R., P. H. Atkinson und R. B. Trimble. 1991. Carbohydr. Res. 215: 211–217.
Townsend, R. R., M. R. Hardy und Y. C. Lee. 1989. Methods Enzymol. 179: 65–76.
Townsend, R. R., M. R. Hardy, D. A. Cumming, J. P. Carver und B. Bendiak. 1989. Anal. Biochem. 182: 1–8.
Ulloa-Aguirre, A., Mendez, J. P., Cravioto, A., Grotjan, E., Damian-Matsumura, P. und Espinoza, R. (1990). Studies on the microheterogeneity of chorionic gonadotrophin secreted by the human cytotrophoblast in culture. Hum. Reprod. 5, 661–669.
Weitzhandler, M., D. Kadlkecek, N. Avdalovic, J. G. Forte, D. Chow und R. R. Townsend. 1993. J. Biol. Chem. 268: 5121–5130.
Wide, L. und B. Hobson. 1987. Acta Endocrinol. (Copenh) 116: 465–472.
Wilcox, A. J., C. R. Weinberg, J. F. O'Connor, D. D. Baird, J. P. Schlatterer, R. E. Canfield, E. G. Armstrong und B. C. Nisula. 1988. N. Engl. J. Med. 319: 189–194.
Zinaman, MJ, Clegg, ED, Brown, CC, O'Connor, J, Selevan, SG. Fertil Steril., 1996, 65: 503–509.

Literaturangaben für die zweite Reihe von Experimenten

1. Hussa, R. O. (1987) The clinical Marker hCG, Praeger, New York.
2. Forest, J. C., Masse, J., Rousseau, F., Moutquin, J. M., Brideau, N. A. und Belanger, M. (1995) Clin. Biochem. 28, 443–449.
3. Spencer, K., Macri, J. N., Carpenter, P., Anderson, R. und Krantz, D. A. (1993) Clin. Chem. 39, 1064–1068.
4. Spencer, K., Aitken, D. A., Macri, J. N. und Buchanan, P. D. (1996) Prenat. Diagn. 16, 605–613.
5. Spencer, K., Muller, F. und Aitken, D.A. (1997) Prenat. Diagn. 17, 31–37.
6. Valerio, D., Aiello, R., Altieri, V. und Fagnoni, P. (1996) Minerva. Ginecol. 48, 169–173.
7. Wald, N. J., Kennard, A. und Smith, D. (1994) Ann. Med. 26, 23–29.
8. Wald, N. J., Densem, J. W., Smith, D. und Klee, G. G. (1994) Prenat. Diagn. 14, 707–716.
9. Zimmermann, R., Reynolds, T. M., John, R., Spencer, K., Bartels, I., Coombes, E. und Trevor, S. (1996) Prenat. Diagn. 16, 79–82.
10. Bogart, M. H., Pandian, M. R. und Jones, O. W. (1987) Prenat. Diagn. 7, 623–630.
11. Bogart, M. H., Golbus, M. S., Sorg, N. D. und Jones, O. W. (1989) Prenat. Diagn. 9, 379–384.
12. Cole, L.A., T. Isozaki und E. E. Jones. (1997) Fetal Diagn. Ther. 12: 336–339.
13. Birken, S., Gawinowicz, M. A., Kardana, A. und Cole, L. A. (1991) Endocrinology 129, 1551–1558.
14. Birken, S., Chen, Y., Gawinowicz, M. A., Lustbader, J. W., Pollak, S., Agosto, G., Buck, R. und O'Connor, J. (1993) Endocrinology 133, 1390–1397.
15. Birken, S., Kovalevskaya, G. und O'Connor, J. (1996) Mol. Cell. Endocrinol. 125, 121–131.
16. Kardana, A., Elliot, M. M., Gawinowicz, M. A., Birken, S. und Cole, L. A. (1991) Endocrinology 129, 154 1550.
17. Cole, L. A., Kardana, A., Andrade-Gordon, P., Gawinowics, M. A., Morris, J. C., Bergert, E. R., O'Connor, J. und Birken, S. (1991) Endocrinology 129, 1559–1567.
18. Puisieux, A., Bellet, D., Troalen, F., Razafindratsita, A., Lhomme, C., Bohuon, C. und Bidart, J.M. (1990) Endocrinology 126, 687–694.
19. Nishimura, R., Utsunomiya, T., Ide, K., Kitajima, T., Chen, H. C., Strobel, J. L., Hussa, R. O. und Mochizuki, M. (1987) Jpn. J. Cancer Res. 78, 833–839.
20. Kardana, A. und Cole, L. A. (1992) Clin. Chem. 38, 26–33.
21. Kardana, A. und Cole, L.A. (1994) J. Clin. Endocrinol. Metab. 79, 761–767.
22. Rotmensch, S., Liberati, M., Kardana, A., Copel, J. A., Ben-Rafael, Z. und Cole, L. A. (1996) Am. J. Obstet. Gynecol. 174, 609–611.
23. Cole, L. A., Cermik, D. und Bahado-Singh, R. (1997) Prenat. Diagn. 17, 1180–1190.
24. Cole, L. A. und Omrani, A. Cermik E. Mahoney R. (1998) Prenat. Diagn. 18, 926–933.
25. O'Conner, J., Ellish, N. J., Schlatterer, J. und Kovalevskaya, G. (1998) Prenat. Diagn. 18, 1232–40.
26. Elliott, M. M., Kardana, A., Lustbader, J. W. und Cole, L. A. (1997) Endocrine 7, 15–32.
27. Krichevsky, A., Armstrong, E. G., Schlatterer, J., Birken, S., O'Connor, J., Bikel, K., Silverberg, S., Lustbader, J. und Canfield, R. (1988) Endocrinology 123, 584–593.
28. Krichevsky, A., Birken, S., O'Connor, J., Acevedo, H. F., Bikel, K., Lustbader, J., Hartree, A., und Canfield, R. E. (1994) Endocrinology 134, 1139–1145.
29. Cole, L. A., Kardana, A., Park, S. Y. und Braunstein, G. D. (1993) J. Clin. Endocrinol. Metab. 76, 704–710.
30. Hoermann, R., Berger, P., Spoettl, G., Gillesberger, F., Kardana, A., Cole, L. A. und Mann, K. (1994) Clin. Chem 40, 2305–2312.
31. Kovalevskaya, G., Birken, S., Kakuma, T., Schlatterer, J. und O'Connor, J. F. (1999) Clin. Chem. 45, 68–77.
32. Kovalevskaya, G., Birken, S., Kakuma, T. und O'Connor, J.F. (1999) J. Endocrinol. 161: 99–106.
33. Birken, S., Agosto, G., Amr, S., Nisula, B., Cole L., Lewis, J. und Canfield, R. (1988) Endocrinology 122, 2054–2063.
34. Ehrlich, P. H., Moustapha, Z., Birken, S., Moyle, W. R. und Canfield, R. (1985) Am. J. Reprod. Immunol. Microbiol. 8, 48–54.
35. Scatchard, G. (1949) Ann. NY. Acad. Sci. 51, 660.
36. Moyle, W. R., Ehrlich, P. H. und Canfield, R. E. (1988) in Oxford Reviews of Reproductive Biology (Finn, C. A. Hrsg.), S. 123. Clarendon Press, Oxford.
37. O'Connor J. F., Schlatterer J. P., Birken S., Krichevsky A., Armstrong E. G., McMahon D., Canfield R. E. (1988) Cancer Res. 48, 1361–1366.

Claims

Verfahren zum Feststellen einer Problemschwangerschaft in einem Subjekt, umfassend die Schritte: (a) (1) Inkontaktbringen einer ersten Menge einer Urin- oder Blutprobe von dem Subjekt mit einem B152-Antikörper, der von der Hybridom-Zelllinie produziert wird, die in der American Type Culture Collection unter der Kennzeichnungsnummer HB-12467 hinterlegt ist; (2) Inkontaktbringen der Probe, die aus (a) (1) resultiert, mit einem B207-Antikörper, der gleichzeitig mit dem 8 152-Antikörper an die hCG-Isoform bindet, die vom B152-Antikörper erkannt wird; (3) Messen der Menge an gebundenem B207-Antikörper in der Urin- oder Blutprobe, um dadurch die Menge der mittels B152 nachweisbaren hCG-Isoform in der Urin- oder Blutprobe zu bestimmen; (b) (1) Inkontaktbringen einer zweiten Menge der Probe von dem Subjekt mit einem B109-Antikörper, welcher an intaktes, non-nicked hCG bindet, ohne wesentlich mit nicked hCG, freier hCGβ Untereinheit, hCGβcf oder hLH zu kreuzreagieren; (2) Inkontaktbringen der Probe, die aus (b) (1) resultiert, mit einem B108-Antikörper, der gleichzeitig mit dem B109-Antikörper an intaktes, non-nicked hCG bindet; (3) Messen der Menge an gebundenem B108-Antikörper in der Probe, um dadurch die Menge an intaktem hCG in der Urin- oder Blutprobe zu bestimmen, mit der Maßgabe, dass die Schritte (a) und (b) in beliebiger Reihenfolge ausgeführt werden können; (c) Bestimmen des Verhältnisses von mittels B152 nachweisbarem hCG zu intaktem hCG in der Probe aus den Messungen, die in (a) (3) und (b) (3) durchgeführt wurden; und (d) Wiederholen der Schritte (a) bis (c) für Proben, die von dem Subjekt innerhalb der ersten 40 Tage der Schwangerschaft entnommen wurden, wobei das Fehlschlagen eine hinreichende Abnahme in dem in Schritt (c) bestimmten Verhältnis festzustellen verglichen mit der Menge an hCG, die in einem der Schritte (a) (3) oder (b) (3) bestimmt wurde, eine Problemschwangerschaft in dem Subjekt anzeigt, wobei eine derart hinreichende Abnahme durch den Schnittpunkt einer ersten und einer zweiten Kurve auf einem einzelnen Graphen nachgewiesen wird, wobei (i) der Graph eine x-Achse aufweist, die die Anzahl an Tagen seit dem Embryo-Übertragung, beginnend bei 0, anzeigt, einer ersten y-Achse, die die Konzentration von hCG anzeigt, dargestellt durch eine Kreatininkonzentration von zwischen 0,1 und 10 000 000 fmol/mg, und einer zweiten y-Achse, die das Verhältnis von mittels B152 nachweisbarem hCG zu intaktem hCG anzeigt, dargestellt durch einen logarithmischen Bereich von 0,1 bis 10, (ii) die erste Kurve das gemäß Schritt (c) bestimmte Verhältnis darstellt, (iii) die zweite Kurve die in einem der Schritte (a) (3) oder (b) (3) bestimmten Mengen an hCG darstellt, und (iv) nach dem Schnittpunkt die erste Kurve unter der zweiten Kurve verbleibt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe eine Urinprobe ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die B152- und B109-Antikörper an eine feste Matrix gebunden sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die B207- und B108-Antikörper mit einem radioaktiven Isotop, Enzym, Farbstoff, fluoreszierenden Molekül, magnetischem Bead, oder Biotin markiert sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die B207- und B108-Antikörper mit dem radioaktiven Isotop I¹²⁵ markiert sind.