CN110031633A - 不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素ⅱ的表达试验方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，实验材料包括6只健康的12月龄绵羊，实验包括如下步骤：试验动物及样品采集；试验试剂的配制；白色和黑色绵羊皮肤组织总蛋白的提取；白色和黑色绵羊皮肤组织总蛋白浓度的测定；SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳及抗体孵育；不同毛色绵羊皮肤组织的包埋及切片制作；不同毛色绵羊皮肤组织的免疫组织化学方法；数据处理与统计分析。本发明采用免疫组织化学法对白色和黑色绵羊皮肤中AngII进行定位，免疫组织化学结果显示，AngII蛋白在黑色绵羊毛囊中真皮乳头和外根鞘部的表达量均高于白色皮肤，因此，验证了AngII蛋白参与绵羊被毛颜色的形成，为研究AngII蛋白在绵羊被毛颜色的形成中的作用提供了理论依据。

Description

不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法

技术领域

本发明涉及血管紧张素II的试验方法，特别涉及不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法。

背景技术

血管紧张素II(Angiotensin II，Ang II)是一种多肽物质，在血管紧张素转化酶的作用下由血管紧张素I水解产生。Ang II是肾素-血管紧张素系统中最为重要的生物活性物质。近年来，一些学者发现Ang II具有促进纤维化、促进生长增值和免疫调节等非血流动力学的作用。Ang II主要存在于肝细胞，包括一些其他的组织器官，如：肺、肾脏、睾丸、血管壁、心肌和皮肤等。有研究发现，Ang II能促进成纤维细胞胶原合成的增加，表明Ang II参与了皮肤的纤维化，进一步证实Ang II存在于人的皮肤中。之前的研究已经揭示Ang II的另一个作用就是可以调控皮肤的创伤愈合。有学者采用人的黑色素细胞，进行检测Ang II对黑色素合成的影响，结果发现皮肤创伤愈合的异常色素沉着与Ang II有一定的关系。

就目前的研究成果，仍然缺乏研究AngII蛋白在绵羊被毛颜色形成中的作用的思路及理论依据。

发明内容

本发明的目的在于提供不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，本发明验证了AngII蛋白参与绵羊被毛颜色的形成，为研究AngII蛋白在绵羊被毛颜色的形成中的作用提供了理论依据，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，实验材料包括6只健康的12月龄绵羊，实验包括如下步骤：

S1：试验动物及样品采集

将每只绵羊后臀部的被毛剪掉，并用剃毛刀小心刮净表皮，后用取皮器取绵羊皮肤样品快速放入液氮，用于下一步的试验；另取皮肤样品分别置于4％多聚甲醛固定液中，24h后，将固定的样品转移到70％的酒精溶液中，用于后续的试验；

S2：试验试剂的配制，

配置电泳缓冲液、转膜缓冲液、TBST缓冲液、5％的封闭液、4％浓缩胶、10％分离胶和12％分离胶；

S3：白色和黑色绵羊皮肤组织总蛋白的提取

将液氮中的绵羊皮肤组织置于研钵中充分研磨；称量研磨好的组织，根据重量加入500-1,000μL的组织提取裂解液，用力震荡后，将EP管置于冰上，充分裂解组织；约1h后，用4℃离心机以12 000r·min^-1离心5min后，小心吸取上清液，分装于新的EP管中，存放于-20℃；

S4：白色和黑色绵羊皮肤组织总蛋白浓度的测定

利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定提取的总蛋白的浓度；

S5：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及抗体孵育

配制10％的分离胶和4％的浓缩胶；根据每个样品的蛋白浓度，计算各样品的上样量，并加入5×Loading buffer，95℃，10min蛋白变性；将变性好的样品溶液和蛋白Marker加入孔中，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，80V电压跑至分离胶和浓缩胶的交界处，再换用120V电压跑至溴酚蓝到达距离分离胶底部约1cm处；100V恒压转膜1.5h；将标记好的NC膜放入封闭液中脱色摇床上封闭1h；用TBST稀释兔抗AngII多克隆抗体(1∶300)，4℃孵育，过夜；将NC膜放入二抗(1∶5,000)中，在37℃恒温摇床中孵育1h；二抗孵育结束后，将NC膜取出，用TBST洗10min×3次；待清洗完毕后，将NC膜放置于展开的保鲜膜上，将配制好的ECL发光液覆盖于整个膜上进行显定影，扫描采集图片；

S6：不同毛色绵羊皮肤组织的包埋及切片制作

用取皮器取绵羊背部皮肤组织，用镊子将组织样品摊平，小心将其放入4％多聚甲醛固定液中，组织样品固定24h；将皮肤样品进行梯度脱水；

S7：不同毛色绵羊皮肤组织的免疫组织化学方法

提前将切好的片子放入烘箱，37℃恒温烘4-5h；切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水处理；用枸橼酸盐缓冲液对切片组织进行抗原热修复10min，PBS洗5min×2次；在组织样品上滴加适量的3％H₂O₂，37℃恒温孵育10min，PBS洗3次，每次3min，将组织切片放置在保湿盒中，滴加适量的封闭液，室温孵育30mia；滴加一抗(1∶50)，4℃过夜，用PBS做阴性对照；从4℃取出后，放置在37℃的烘箱中，孵育30min；滴加适量的二抗(辣根过氧化物酶-山羊抗兔IgG)，37℃恒温孵育30min；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37℃恒温孵育20min；滴加配制好的DAB显色试剂；用苏木精进行轻度复染，复染时间为10min；梯度酒精脱水和二甲苯透明处理，中性树脂封片处理；显微镜下观察，阳性为棕黄色，分别获取组织样品的阳性、阴性图像；

S8：数据处理与统计分析

所有数据使用SPSS 17.0软件进行分析，统计分析基于ANOVA，Duncan方法进行多重比较，使用SigmaPlot 12.5对数据转换成图表处理，结果用平均值±标准误差表示，Image Pro Plus 7.0图像分析软件用于处理免疫组织化学结果。

进一步地，龄绵羊分别为3只白色和3只黑色，均为雌性。

进一步地，电泳缓冲液、转膜缓冲液以及TBST缓冲液均由蒸馏水定容至1 000mL，4℃保存。

进一步地，4％浓缩胶的配方为H₂O 2mL、30％Acr-Bis 0.5mL、0.5mol/L Tris·HCl 0.5mL、10％SDS 40mL、10％过硫酸铵30mL、TEMED 4mL。

进一步地，10％分离胶的配方为H₂O 4mL、30％Acr-Bis 3.3mL、1.5mol/L Tris·HCl 2.5mL、10％SDS 0.1mL、10％过硫酸铵0.1mL、TEMED 4mL。

进一步地，12％分离胶的配方为H₂O 3.3mL、30％Acr-Bis 4mL、1.5mol/L Tris·HCl 2.5mL、10％SDS 0.1mL、10％过硫酸铵0.1mL、TEMED 4mL。

进一步地，S4包括如下步骤：

S401：20mg BSA中加入0.8mL蛋白标准配制液，充分溶解，将其配成25mg/mL的蛋白标准溶液，备用；

S402：取适量的蛋白标准溶液(25mg/mL)，利用PBS溶液将其稀释成终浓度成0.5mg/mL，备用按照50∶1配制BCA工作液；

S403：根据本试验样品量，取2.5mL BCA试剂A加50μL BCA试剂B配制成2.55mL的BCA工作液；

S404：将标准品按照0、1、2、4、8、12、16、20μL加入到96孔板的标准品孔中；将各孔分别加入200μL的BCA工作液中，37℃孵育30min；

S405：利用自动酶联检测仪中测定A570，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

进一步地，S6的脱水流程包括如下步骤：

S601：依次经过70％乙醇、80％乙醇、85％乙醇、90％乙醇、95％乙醇I、95％乙醇II、无水乙醇I、无水乙醇II、二甲苯I、二甲苯II脱水；

S602：浸蜡：将皮肤样品放入已经融好的蜡锅里进行浸蜡处理，浸蜡条件为60℃，2.5h，包埋、切片、展片和烤片处理，将烤好的片子放入切片盒内保存，用于后续的试验。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提出的不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，本发明利用Western blot技术分析白色和黑色绵羊皮肤中血管紧张素II(AngII)蛋白的表达差异，免疫组织化学法对白色和黑色绵羊皮肤中AngII进行定位，结果显示，血管紧张素II(AngII)蛋白存在于白色和黑色绵羊皮肤中，且为上调差异蛋白；在黑色绵羊皮肤的表达量显著高于白色绵羊皮肤(P＜0.05)；免疫组织化学结果显示，AngII蛋白在白色和黑色绵羊皮肤毛囊中的毛乳头和外根鞘表达，且AngII蛋白在黑色绵羊毛囊中真皮乳头和外根鞘部的表达量均高于白色皮肤(P＜0.05)，因此，验证了AngII蛋白参与绵羊被毛颜色的形成，为研究AngII蛋白在绵羊被毛颜色的形成中的作用提供了理论依据。

附图说明

图1为本发明免疫印迹检测AngII蛋白在白色和黑色绵羊皮肤中的表达量示意图；

图2为本发明免疫组织化学检测AngII蛋白在白色和黑色绵羊皮肤中的表达定位分析图；

图3为本发明AngII蛋白在白色和黑色绵羊皮肤中的平均光密度值柱形图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，实验材料包括6只(3只白色和3只黑色)健康的12月龄绵羊，均为雌性，实验包括如下步骤：

步骤1：试验动物及样品采集

将每只绵羊后臀部的被毛剪掉，并用剃毛刀小心刮净表皮(谨防出血)，后用取皮器取绵羊皮肤样品(直径8mm)快速放入液氮，用于下一步的试验；另取皮肤样品分别置于4％多聚甲醛固定液中，24h后，将固定的样品转移到70％的酒精溶液中，用于后续的试验；

步骤2：试验试剂的配制

配置电泳缓冲液((蒸馏水定容至1,000mL，4℃保存，可反复使用4～5次)：Tris(MW121.14)：3.04g；甘氨酸(MW75.07)：18.78g；SDS：1g)。

转膜缓冲液(蒸馏水定容至1,000mL，4℃保存，可反复使用4～5次)：Tris(MW121.14)：5.8g；甘氨酸(MW75.07)：2.9g；SDS：0.37g甲醇：200mL。

TBST缓冲液(蒸馏水定容至1,000mL，4℃保存)：NaCl：8.8g；1mol/L Tris·HCl(pH7.5)：10mL；20％Tween 20：2.4mL。

5％的封闭液(现配现用)：脱脂奶粉：5g；TBST：100mL。

4％浓缩胶、10％分离胶和12％分离胶配方如表1。

表1 浓缩胶和分离胶的配方

步骤3：白色和黑色绵羊皮肤组织总蛋白的提取

将液氮中的绵羊皮肤组织置于研钵中充分研磨；称量研磨好的组织，根据重量加入500-1,000μL的组织提取裂解液，用力震荡后，将EP管置于冰上，充分裂解组织；约1h后，用4℃离心机以12,000r·min^-1离心5min后，小心吸取上清液，分装于新的EP管中，存放于-20℃；

步骤4：白色和黑色绵羊皮肤组织总蛋白浓度的测定

利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定提取的总蛋白的浓度，具体步骤如下：20mg BSA中加入0.8mL蛋白标准配制液，充分溶解，将其配成25mg/mL的蛋白标准溶液，备用；取适量的蛋白标准溶液(25mg/mL)，利用PBS溶液将其稀释成终浓度成0.5mg/mL，备用按照50∶1(50体积的BCA试剂A加1体积的BCA试剂B)配制BCA工作液。根据本试验样品量，取2.5mL BCA试剂A加50μL BCA试剂B配制成2.55mL的BCA工作液；将标准品按照0、1、2、4、8、12、16、20μL加入到96孔板的标准品孔中。将各孔分别加入200μL的BCA工作液中，37℃孵育30min。利用自动酶联检测仪中测定A570，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度；

步骤5：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及抗体孵育

按表1所示配制10％的分离胶和4％的浓缩胶；根据每个样品的蛋白浓度，计算各样品的上样量，并加入5×Loading buffer，95℃，10min蛋白变性。将变性好的样品溶液和蛋白Marker加入孔中，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，80V电压跑至分离胶和浓缩胶的交界处，再换用120V电压跑至溴酚蓝到达距离分离胶底部约1cm处。100V恒压转膜1.5h；将标记好的NC膜放入封闭液(5％的脱脂奶粉)中脱色摇床上封闭1h；用TBST稀释兔抗AngII多克隆抗体(1∶300)，4℃孵育，过夜。将NC膜放入二抗(1∶5,000)中，在37℃恒温摇床中孵育1h。二抗孵育结束后，将NC膜取出，用TBST洗10min×3次。待清洗完毕后，将NC膜放置于展开的保鲜膜上，将配制好的ECL发光液(A∶B按照1∶1的比例)覆盖于整个膜上进行显定影，扫描采集图片；

步骤6：不同毛色绵羊皮肤组织的包埋及切片制作

用取皮器取绵羊背部皮肤组织，用镊子将组织样品摊平，小心将其放入4％多聚甲醛固定液中，组织样品固定24h；将皮肤样品进行梯度脱水；脱水流程为：70％乙醇(2h)→80％乙醇(2h)→85％乙醇(2h)→90％乙醇(1h)→95％乙醇I(1h)→95％乙醇II(1h)→无水乙醇I(45min)→无水乙醇II(45min)→二甲苯I(30min)→二甲苯II(30min)；浸蜡：将皮肤样品放入已经融好的蜡锅里进行浸蜡处理，浸蜡条件为60℃，2.5h，包埋、切片、展片和烤片处理，将烤好的片子放入切片盒内保存，用于后续的试验。

步骤7：不同毛色绵羊皮肤组织的免疫组织化学方法

提前将切好的片子放入烘箱，37℃恒温烘4-5h；切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水处理；用枸橼酸盐缓冲液对切片组织进行抗原热修复10min，PBS洗5min×2次；在组织样品上滴加适量的3％H₂O₂，37℃恒温孵育10min，PBS洗3次，每次3min，将组织切片放置在保湿盒中，滴加适量的封闭液，室温孵育30min；滴加一抗(1∶50)，4℃过夜，用PBS做阴性对照；从4℃取出后，放置在37℃的烘箱中，孵育30min；滴加适量的二抗(辣根过氧化物酶-山羊抗兔IgG)，37℃恒温孵育30min；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37℃恒温孵育20min；滴加配制好的DAB显色试剂；用苏木精进行轻度复染，复染时间为10min；梯度酒精脱水和二甲苯透明处理，中性树脂封片处理；显微镜下观察，阳性为棕黄色，分别获取组织样品的阳性、阴性图像；

步骤8：数据处理与统计分析

所有数据使用SPSS 17.0软件进行分析。统计分析基于ANOVA(方差分析)，Duncan方法进行多重比较。使用SigmaPlot 12.5对数据转换成图表处理。结果用平均值±标准误差(S.E.)表示。Image Pro Plus 7.0图像分析软件用于处理免疫组织化学结果。P＜0.05具有统计学意义。

以下进行本发明的结果与分析

(1)不同毛色绵羊皮肤中AngII蛋白表达

通过Western blot检测不同毛色绵羊皮肤中AngII蛋白的相对表达量。如图1a所示，白色和黑色绵羊皮肤组织分别存在能与AngII抗体结合的蛋白条带，分子量为53kDa，表明在不同毛色皮肤组织中AngII蛋白均有不同程度的有表达；经统计分析发现，AngII在黑色绵羊皮肤中的相对表达量均高于在白色皮肤中的表达量(图1b)，*P＜0.05。

(2)AngII蛋白在不同毛色绵羊皮肤中的定位分析

利用免疫组织化学染色，对AngII蛋白在不同毛色皮肤中的表达进行定位分析，如图2G、H和I显示，AngII蛋白主要分布在黑色皮肤中毛囊的毛乳头和外根鞘部位；而在白色绵羊皮肤中的毛囊几乎没有表达(图2A-C)，在阴性对照组中没有阳性表达，说明AngII蛋白在白色和黑色绵羊皮肤毛囊中的表达存在一定的差异。光密度值分析显示(图3)，**P＜0.01，AngII蛋白在黑色绵羊皮肤中的毛乳头部和外根鞘的表达量极显著高于在白色绵羊(P＜0.01)，说明AngII蛋白在白色和黑色绵羊皮肤中的表达量存在一定的差异。

图2中，(A，B；G，H)：AngII蛋白在白色和黑色皮肤毛囊中毛乳头的阳性表达；(C，I)：AngII蛋白在白色和黑色皮肤毛囊中外根鞘的阳性表达；(D，E；J，K)：AngII蛋白在白色和黑色皮肤毛囊中毛乳头的阴性表达；(F，L)：AngII蛋白在白色和黑色皮肤毛囊中外根鞘的阴性表达；蓝色箭头表示毛乳头；红色箭头表示外根鞘；黑色箭头表示黑色素颗粒；(bar＝100μm)。

图3中，(a)：AngII蛋白在白色和黑色绵羊毛囊中的毛乳头部的相对表达量；(b)：AngII蛋白在白色和黑色绵羊毛囊中的外根鞘部的相对表达量；**P＜0.01。

通过iTRAQ技术检测，发现AngII蛋白存在于白色和黑色绵羊皮肤中，且为上调差异蛋白；进一步做分析验证发现与iTRAQ技术检测的结果相一致，即AngII蛋白在黑色绵羊皮肤中的表达量高于白色绵羊皮肤；免疫组织化学结果显示，AngII蛋白在黑色绵羊皮肤毛囊中真皮乳头和外根鞘部的表达量均高于白色绵羊皮肤毛囊中；因此，初步推测AngII蛋白可能参与绵羊被毛颜色的形成。

综上所述，本发明提出的不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，本发明利用Western blot技术分析白色和黑色绵羊皮肤中血管紧张素II(AngII)蛋白的表达差异，免疫组织化学法对白色和黑色绵羊皮肤中AngII进行定位，结果显示，血管紧张素II(AngII)蛋白存在于白色和黑色绵羊皮肤中，且为上调差异蛋白；在黑色绵羊皮肤的表达量显著高于白色绵羊皮肤(P＜0.05)；免疫组织化学结果显示，AngII蛋白在白色和黑色绵羊皮肤毛囊中的毛乳头和外根鞘表达，且AngII蛋白在黑色绵羊毛囊中真皮乳头和外根鞘部的表达量均高于白色皮肤(P＜0.05)，因此，验证了AngII蛋白参与绵羊被毛颜色的形成，为研究AngII蛋白在绵羊被毛颜色的形成中的作用提供了理论依据。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，其特征在于，实验材料包括6只健康的12月龄绵羊，实验包括如下步骤：

S1：试验动物及样品采集

将每只绵羊后臀部的被毛剪掉，并用剃毛刀小心刮净表皮，后用取皮器取绵羊皮肤样品快速放入液氮，用于下一步的试验；另取皮肤样品分别置于4％多聚甲醛固定液中，24h后，将固定的样品转移到70％的酒精溶液中，用于后续的试验；

S2：试验试剂的配制

配置电泳缓冲液、转膜缓冲液、TBST缓冲液、5％的封闭液、4％浓缩胶、10％分离胶和12％分离胶；

S3：白色和黑色绵羊皮肤组织总蛋白的提取

将液氮中的绵羊皮肤组织置于研钵中充分研磨；称量研磨好的组织，根据重量加入500-1,000μL的组织提取裂解液，用力震荡后，将EP管置于冰上，充分裂解组织；约1h后，用4℃离心机以12,000r·min^-1离心5min后，小心吸取上清液，分装于新的EP管中，存放于-20℃；

S4：白色和黑色绵羊皮肤组织总蛋白浓度的测定

利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定提取的总蛋白的浓度；

S5：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及抗体孵育

配制10％的分离胶和4％的浓缩胶；根据每个样品的蛋白浓度，计算各样品的上样量，并加入5×Loading buffer，95℃，10min蛋白变性；将变性好的样品溶液和蛋白Marker加入孔中，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，80V电压跑至分离胶和浓缩胶的交界处，再换用120V电压跑至溴酚蓝到达距离分离胶底部约1cm处；100V恒压转膜1.5h；将标记好的NC膜放入封闭液中脱色摇床上封闭1h；用TBST稀释兔抗AngII多克隆抗体(1∶300)，4℃孵育，过夜；将NC膜放入二抗(1∶5,000)中，在37℃恒温摇床中孵育1h；二抗孵育结束后，将NC膜取出，用TBST洗10min×3次；待清洗完毕后，将NC膜放置于展开的保鲜膜上，将配制好的ECL发光液覆盖于整个膜上进行显定影，扫描采集图片；

S6：不同毛色绵羊皮肤组织的包埋及切片制作

用取皮器取绵羊背部皮肤组织，用镊子将组织样品摊平，小心将其放入4％多聚甲醛固定液中，组织样品固定24h；将皮肤样品进行梯度脱水；

S7：不同毛色绵羊皮肤组织的免疫组织化学方法

提前将切好的片子放入烘箱，37℃恒温烘4-5h；切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水处理；用枸橼酸盐缓冲液对切片组织进行抗原热修复10min，PBS洗5min×2次；在组织样品上滴加适量的3％H₂O₂，37℃恒温孵育10min，PBS洗3次，每次3min，将组织切片放置在保湿盒中，滴加适量的封闭液，室温孵育30min；滴加一抗(1∶50)，4℃过夜，用PBS做阴性对照；从4℃取出后，放置在37℃的烘箱中，孵育30min；滴加适量的二抗，37℃恒温孵育30min；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃恒温孵育20min；滴加配制好的DAB显色试剂；用苏木精进行轻度复染，复染时间为10min；梯度酒精脱水和二甲苯透明处理，中性树脂封片处理；显微镜下观察，阳性为棕黄色，分别获取组织样品的阳性、阴性图像；

S8：数据处理与统计分析

所有数据使用SPSS 17.0软件进行分析，统计分析基于ANOVA，Duncan方法进行多重比较，使用SigmaPlot 12.5对数据转换成图表处理，结果用平均值±标准误差表示，ImagePro Plus 7.0图像分析软件用于处理免疫组织化学结果。

2.根据权利要求1所述的不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，其特征在于，12月龄绵羊分别为3只白色和3只黑色，均为雌性。

3.根据权利要求1所述的不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，其特征在于，电泳缓冲液、转膜缓冲液以及TBST缓冲液均由蒸馏水定容至1 000mL，4℃保存。

4.根据权利要求1所述的不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，其特征在于，4％浓缩胶的配方为H₂O 2mL、30％Acr-Bis 0.5mL、0.5mol/L Tris·HCl 0.5mL、10％SDS 40mL、10％过硫酸铵30mL、TEMED 4mL。

5.根据权利要求1所述的不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，其特征在于，10％分离胶的配方为H₂O 4mL、30％Acr-Bis 3.3mL、1.5mol/L Tris·HCl 2.5mL、10％SDS 0.1mL、10％过硫酸铵0.1mL、TEMED 4mL。

6.根据权利要求1所述的不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，其特征在于，12％分离胶的配方为H₂O 3.3mL、30％Acr-Bis 4mL、1.5mol/L Tris·HCl 2.5mL、10％SDS 0.1mL、10％过硫酸铵0.1mL、TEMED 4mL。

7.根据权利要求1所述的不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，其特征在于，S4包括如下步骤：

S401：20mg BSA中加入0.8mL蛋白标准配制液，充分溶解，将其配成25mg/mL的蛋白标准溶液，备用；

S402：取适量的蛋白标准溶液(25mg/mL)，利用PBS溶液将其稀释成终浓度成0.5mg/mL，备用按照50∶1配制BCA工作液；

S403：根据本试验样品量，取2.5mL BCA试剂A加50μL BCA试剂B配制成2.55mL的BCA工作液；

S404：将标准品按照0、1、2、4、8、12、16、20μL加入到96孔板的标准品孔中；将各孔分别加入200μL的BCA工作液中，37℃孵育30min；

S405：利用自动酶联检测仪中测定A570，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

8.根据权利要求1所述的不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，其特征在于，S6的脱水流程包括如下步骤：

S601：依次经过70％乙醇、80％乙醇、85％乙醇、90％乙醇、95％乙醇I、95％乙醇II、无水乙醇I、无水乙醇II、二甲苯I、二甲苯II脱水；

S602：浸蜡：将皮肤样品放入已经融好的蜡锅里进行浸蜡处理，浸蜡条件为60℃，2.5h，包埋、切片、展片和烤片处理，将烤好的片子放入切片盒内保存，用于后续的试验。