CN105954277A

CN105954277A - 一种评价皮肤刺激性的方法、装置及其应用

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Publication number: CN105954277A
Application number: CN201610406817.8A
Authority: CN
Inventors: 陈军; 张会; 马敏; 顾薇; 许海恒
Original assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Current assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Priority date: 2016-06-12
Filing date: 2016-06-12
Publication date: 2016-09-21
Anticipated expiration: 2036-06-12
Also published as: CN105954277B

Abstract

外用药物制剂和化妆品均需进行皮肤刺激性检查，传统方法采用活体动物涂抹受试产品后的皮肤反应来判断皮肤刺激性的程度，存在成本较高、试验周期长、个体差异大、动物伦理学问题等不足之处。鉴于此，本发明提供一种评价皮肤刺激性的装置：在脂质体中包封指示剂制备脂质体人工皮肤膜并结合到膜嵌套装置中。使用时，脂质体人工皮肤膜表面涂抹受试品后，由接受室的接受液中指示剂颜色判断皮肤刺激性强弱。此方法成本低、效率高、可控性和重现性高，且实验证实其测试结果与动物试验结果基本一致，从而能够替代动物实验，节约经济和时间成本，为外用药物制剂和化妆品的安全性评价提供有力的技术保障。

Description

一种评价皮肤刺激性的方法、装置及其应用

技术领域

本发明涉及外用药物制剂及化妆品领域，特别是涉及一种评价皮肤刺激性的方法、装置及其应用，可以有效替代目前的动物试验方法。

背景技术

在药物制剂领域，经皮给药由于其方便性，越来越受到重视；在化妆品领域，由于人们对生活质量的要求提高，其市场不断扩大，据估算，我国的外用药物制剂与化妆品的市场规模达到3000亿元/年。根据国家食药监总局颁布的《化妆品安全技术规范》、《药物非临床研究质量管理规范》等相关文件的规定，为了保证安全性，以上产品均需要开展皮肤刺激性评价。

目前常用的皮肤刺激性评价方法主要是借助于动物实验，将动物的部分皮肤暴露，分别涂抹受试产品和对照产品，通过观察皮肤的反应（如是否出现红肿、炎症等）进行评分，或通过处死动物取皮肤做病理切片检查进行评价。这种方法存在以下问题：第一，成本较高，以常用的动物兔子为例，一只兔子100元左右，只能进行一次实验，并且还存在饲养成本；第二，周期较长，动物本身有一个较长的成长周期，而且在目前的皮肤刺激性评价方法下，单次涂抹受试产品后一般需要24~72h观察刺激性试验结果；第三，存在一定的主观性，目前的皮肤反应主要还是通过人为评分进行的，因此不够客观；第四，差异较大，动物的种属、个体、性别、年龄的差异都会影响实验结果，因此重现性往往不佳。此外，动物的使用也存在一定伦理学问题，2013年3月，欧盟国家宣布全面禁止销售和进口经过动物测试的化妆品（含原料）和牙膏、肥皂等日化产品。

因此，如能采用体外装置快速替代动物试验快速评价皮肤刺激性，将有效地解决上述问题，无疑会为外用药物制剂以及化妆品的质量评价提供有力的技术保障。脂质体是一种组成和结构类似于生物膜的微型载体，本研究团队此前已经研制了用于皮肤渗透性试验的脂质体人工皮肤膜技术并申请了专利（申请号：201510818671.3），在此基础上，我们通过结合嵌套装置、优化脂质体制备工艺和载入指示剂进一步研制了一种新型的评价皮肤刺激性的装置（图1、图2、图3）和方法，可以有效替代目前的动物试验方法，用于外用药物制剂和化妆品的皮肤刺激性的快速评价。

发明方案

发明目的：本发明要解决的技术问题是研发一种能够代替活体动物试验的一种简单、快捷、可靠的皮肤刺激性试验方法。该方法采用评价皮肤刺激性的装置，通过接受液指示剂直观显色快速判断皮肤刺激性强弱，从而显著提高皮肤刺激性评价的效率，降低成本，并且显著提高试验的可控性和重现性，最终能够替代动物试验用于外用药物制剂和化妆品的质量控制。

本发明提供一种评价皮肤刺激性的装置，其包含膜嵌套装置和脂质体人工皮肤膜；其中膜嵌套装置由嵌套板、膜嵌套两部分组成，膜嵌套位于嵌套板的孔中，脂质体人工皮肤膜结合在膜嵌套上；

脂质体人工皮肤膜按如下步骤制备：

（1）含有指示剂的脂质体的制备：将磷脂材料溶解于有机溶剂中，指示剂溶解在50~120份含有5~15 %乙醇的磷酸盐缓冲液中，选择薄膜法、注入法或逆相蒸发法制备脂质体，得到的脂质体混悬液采用高压均质或者超声技术减小粒径，分别制得粒径为150~400nm的含指示剂小粒径脂质体和粒径为400~800nm的含指示剂大粒径脂质体。

其中所述磷脂材料包含重量比为1~8 : 1的卵磷脂，胆固醇；指示剂选自罗丹明B、钙黄绿素、羧基荧光素、依文思蓝或异硫氰酸荧光素；

（2）微孔滤膜与膜嵌套底部的密封：将孔径为0.45 μm的微孔滤膜和膜嵌套底部150 ℃加热，使微孔滤膜与嵌套底部形成完全密封的小室；

（3）脂质体与微孔滤膜的结合：将步骤（1）制备所得的1~10份粒径为150~400nm的含指示剂小粒径脂质体和1份粒径为400~800nm的含指示剂大粒径脂质体分别通过离心分层铺于微孔滤膜膜上；

（4）冻融循环；将步骤（3）中结合脂质体后的微孔滤膜置于-70~-120 ℃冷冻0.5~1 h，取出后50~75 ℃加热0.5~1 h，如此循环冻融2~3次，即得脂质体人工皮肤膜。

作为本发明的进一步改进，脂质体人工皮肤膜制备步骤（1）中所述磷脂材料为重量比为1~8 : 1 : 0.2 : 0.6 : 2的卵磷脂，胆固醇，胆固醇硫酸酯、神经酰胺、棕榈酸。

作为本发明的更进一步改进，脂质体人工皮肤膜制备步骤（1）中所述指示剂为罗丹明B。

本发明还提供一种评价皮肤刺激性的方法，将上述的评价皮肤刺激性的装置进行扩散试验，其操作步骤为：在评价皮肤刺激性的装置的脂质体人工皮肤膜表面涂抹受试品后，在接受室中加入磷酸盐缓冲液作为接受液，在0.25~4 h根据接受液中指示剂颜色即可快速判断受试产品的皮肤刺激性强弱。

本发明同时提供上述评价皮肤刺激性的方法在外用药物制剂或化妆品中的应用，包括用于经皮途径的软膏剂、凝胶剂、乳膏剂、贴膏剂、贴剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、涂剂、搽剂、洗剂、膜剂、气雾剂、喷雾剂等剂型的外用药物制剂或化妆品的皮肤刺激性评价。

有益效果

为了确保安全性，外用药物制剂和化妆品都需要进行皮肤刺激性检查，传统的方法是采用活体动物，通过涂抹受试产品后的皮肤反应来判断皮肤刺激性的程度，存在成本较高、试验周期长、动物伦理学问题等不足之处。鉴于此，本发明提供的体外皮肤刺激性测定方法和评价皮肤刺激性的装置能够替代动物试验用于皮肤刺激性检查，显著提高试验效率，降低成本，并且提高试验的可控性和重现性，替代动物试验，满足伦理学要求。实验证实本发明提供的评价皮肤刺激性的装置测试结果与动物试验结果基本一致，从而能够替代动物实验，节约经济和时间成本，为外用药物制剂和化妆品的安全性评价提供有力的技术保障。

附图说明

图1 评价皮肤刺激性的装置示意图，其中1.膜嵌套 2.给药室 3.脂质体人工皮肤膜 4.接受液 5.嵌套板

图2 评价皮肤刺激性的装置外观

图3 脂质体人工皮肤膜结构示意图，其中1.含有指示剂的大粒径脂质体 2.指示剂 3.微孔滤膜 4.含有指示剂的小粒径脂质体

图4 应用评价皮肤刺激性装置试验的结果，其中A使用罗丹明B作为指示剂，B使用钙黄绿素作为指示剂，C为使用羧基荧光素作为指示剂后对三种市售商品进行检测所得结果。

图5 皮肤组织病理学检查结果，其中A为布洛芬凝胶，B为含10%川芎油的布洛芬凝胶，C为含10%氮酮的布洛芬凝胶

图6 应用评价皮肤刺激性装置试验的结果。1.布洛芬凝胶，2.含10%川芎油的布洛芬凝胶，3.含10%氮酮的布洛芬凝胶。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步阐明本发明的内容，但这些实例并不限制本发明的保护范围。

实施例1：评价皮肤刺激性的装置的制备

包括如下步骤：含指示剂脂质体的制备、微孔滤膜与嵌套底部的密封、脂质体与微孔滤膜的结合、冻融循环，具体按如下步骤进行：

含指示剂脂质体的制备：称取卵磷脂460 mg，胆固醇140 mg，置于茄形瓶，用12 ml无水乙醇溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含10 %乙醇和1%罗丹明B的磷酸盐缓冲溶液12 ml水合，得到脂质体混悬液。将该脂质体混悬液分成两份，分别探头超声，得到粒径分别为200nm和400nm的两种脂质体混悬液。

微孔滤膜与嵌套底部的密封：将尼龙膜（孔径0.45μm）和膜嵌套底部150 ℃高温加热25~30 s，使之形成完全密封的小室。

脂质体与微孔滤膜的结合：将小室置于24孔板中，先加入粒径为200nm的脂质体0.6 ml，2000 rpm，离心10 min，再将小室水平旋转180 °，加入粒径为550nm的脂质体0.6ml，2000 rpm离心10 min；然后将膜置于干燥箱中50 ℃加热使膜干燥；再加入粒径为550nm的脂质体0.6 ml，2000rpm离心10 min，去除上清液。

（4）冻融循环：将载有脂质体的膜置于-80 ℃冷冻1h，再于真空干燥箱中65 ℃加热0.5h，完成一次冻-融，重复该冻融循环2次，即得结合在膜嵌套上的脂质体人工皮肤膜，即评价皮肤刺激性的装置。

实施例2：评价皮肤刺激性的装置的制备

与实施例1不同的是，步骤（1）中称取卵磷脂360 mg，胆固醇180 mg置于茄形瓶，用10ml氯仿-甲醇（v/v=2:1）溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含5%乙醇和0.2%钙黄绿素的磷酸盐缓冲溶液10ml水合，得到脂质体混悬液。步骤（1）中制得的脂质体粒径分别为400nm和800nm。步骤（4）中冻融循环条件为，-120℃冷冻0.5h，50℃加热1h，冻融循环重复次数为3次。

实施例3：评价皮肤刺激性的装置的制备

与实施例1不同的是，步骤（1）中称取卵磷脂300 mg和胆固醇300mg置于茄形瓶，用8ml无水乙醇溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含10%乙醇和0.5%羧基荧光素的磷酸盐缓冲溶液8ml水合，高压均质，得到脂质体混悬液。步骤（1）中制得的脂质体粒径分别为150nm和750nm。步骤（4）中冻融循环条件为，-70℃冷冻1h，75℃加热0.5h，冻融循环重复次数为2次。

实施例4：评价皮肤刺激性的装置的制备

与实施例1不同的是，步骤（1）中称取卵磷脂480mg和胆固醇60mg置于茄形瓶，用20ml无水乙醇溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含15%乙醇和0.1%异硫氰酸荧光素的磷酸盐缓冲溶液15ml水合，得到脂质体混悬液。步骤（1）中制得的脂质体粒径分别为350nm和550nm。步骤（4）中冻融循环条件为，-80℃冷冻0.5h，70℃加热1h，冻融循环重复次数为3次。

实施例5：评价皮肤刺激性的装置的制备

与实施例1不同的是，步骤（1）中称取卵磷脂400mg和胆固醇100mg置于茄形瓶，加入16ml乙醚溶解，再加入磷酸盐缓冲溶液和2%伊文思蓝10ml，超声制备W/O乳剂，用旋转蒸发仪除去乙醚，高压均质，得到脂质体混悬液。步骤（1）中制得的脂质体粒径分别为250nm和500nm。步骤（4）中冻融循环条件为，-70℃冷冻1h，70℃加热1h，冻融循环重复次数为3次。

实施例6：评价皮肤刺激性的装置的制备

与实施例1不同的是，步骤（1）中称取卵磷脂600mg置于茄形瓶，用12ml无水乙醇溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含15%乙醇和0.1%罗丹明B的磷酸盐缓冲溶液12ml水合，得到脂质体混悬液。步骤（1）中制得的脂质体粒径分别为200nm和800nm。步骤（4）中冻融循环条件为，-90℃冷冻0.5h，55℃加热0.5h，冻融循环重复次数为2次。

实施例7：评价皮肤刺激性的装置的制备

与实施例1不同的是，步骤（1）中称取卵磷脂500mg置于茄形瓶，用8ml氯仿-甲醇（2:1）溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含5%乙醇和2.5%罗丹明B的磷酸盐缓冲溶液8ml水合，得到脂质体混悬液。步骤（1）中制得的脂质体粒径分别为250nm和450nm。步骤（4）中冻融循环条件为，-70℃冷冻1h，75℃加热0.5h，冻融循环重复次数为3次。

实施例8：评价皮肤刺激性的装置的制备

与实施例1不同的是，步骤（1）中称取卵磷脂400mg置于茄形瓶，用15ml无水乙醇溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含10%乙醇的磷酸盐缓冲溶液和0.5%罗丹明B12ml水合，得到脂质体混悬液。步骤（1）中制得的脂质体粒径分别为350nm和600nm。步骤（4）中冻融循环条件为，-120℃冷冻0.5h，55℃加热0.5h，冻融循环重复次数为3次。

实施例9：评价皮肤刺激性的装置的制备

与实施例1不同的是，步骤（1）中称取卵磷脂400mg，胆固醇100mg，胆固醇硫酸酯20mg，神经酰胺60mg，棕榈酸200mg，置于茄形瓶，用15ml无水乙醇溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含10%乙醇和0.2%罗丹明B的磷酸盐缓冲溶液12ml水合，得到脂质体混悬液。步骤（4）中冻融循环条件为，-80℃冷冻0.5h，65℃加热0.5h，冻融循环重复次数为2次。

实施例10：评价皮肤刺激性的装置的制备

与实施例1不同的是，步骤（1）中称取卵磷脂800mg，胆固醇100mg，胆固醇硫酸酯20mg，神经酰胺60mg，棕榈酸200mg，置于茄形瓶，用10ml氯仿-甲醇（2:1）溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含15%乙醇和0.5%钙黄绿素的磷酸盐缓冲溶液10ml水合，得到脂质体混悬液。步骤（1）中制得的脂质体粒径分别为250nm和750nm。步骤（4）中冻融循环条件为，-70℃冷冻1h，50℃加热0.5h，冻融循环重复次数为3次。

实施例11：评价皮肤刺激性的装置的制备

与实施例1不同的是，步骤（1）中称取卵磷脂500mg，胆固醇100mg，神经酰胺60mg，棕榈酸200mg，置于茄形瓶，用12ml无水乙醇溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含5%乙醇和0.2%伊文思蓝的磷酸盐缓冲溶液10ml水合，得到脂质体混悬液。步骤（1）中制得的脂质体粒径分别为400nm和800nm。步骤（4）中冻融循环条件为，-80℃冷冻1h，65℃加热1h，冻融循环重复次数为3次。

实施例12：皮肤刺激性检查

评价皮肤刺激性的装置按实施例1方法制备。

采用兔为受试动物，试验前24h在背部脱毛，分别在兔背部一侧涂抹2%氮酮和10%氮酮，以上均以生理盐水作为溶剂，另一侧涂抹生理盐水作为对照，24h后观察皮肤反应并评分，评分标准见表1。生理盐水、2%氮酮和10%氮酮分别评分为0.5分、2分和5分。

表1 皮肤刺激反应评分标准

将以上受试品采用评价皮肤刺激性的装置进行检测，结果如图4-A所示，通过颜色可以判断生理盐水基本没有刺激性，2%氮酮显示轻度刺激性，10%氮酮显示出重度刺激性，即与动物试验检查的结果相吻合。

实施例13：皮肤刺激性检查

评价皮肤刺激性的装置按实施例2方法制备。

动物试验评价皮肤刺激性的方法同实施例12，受试品为2%和10%的十二烷基硫酸钠（SDS）。生理盐水和2%、10%SDS的评分分别为0、1.5分和5分。

将以上受试品采用评价皮肤刺激性的装置进行检测，结果如图4-B所示，通过颜色可以判断生理盐水基本没有刺激性，2%SDS显示轻度刺激性，10%SDS显示出重度刺激性，即与动物试验检查的结果相吻合。

实施例14：皮肤刺激性检查

评价皮肤刺激性的装置按实施例3方法制备。

动物试验评价皮肤刺激性的方法同实施例12，受试品分别为某品牌洗面奶和卸妆水。生理盐水和洗面奶、卸妆水的评分分别为0、0.5分和2分。

将以上受试品采用评价皮肤刺激性的装置进行检测，结果如图4-C所示，通过颜色可以判断生理盐水没有刺激性，洗面奶基本没有刺激性，卸妆水显示出轻度刺激性，即与动物试验检查的结果相吻合。

实施例15：皮肤刺激性检查

评价皮肤刺激性的装置按实施例6方法制备。

动物试验评价皮肤刺激性的方法同实施例12，受试品分别为布洛芬凝胶、含有10%肉桂油的布洛芬凝胶和含10%氮酮的布洛芬凝胶。

称取 0.4 g 卡波姆细粉，均匀撒于30 mL纯水中，充分溶胀后，用三乙醇胺（0.4g）调节 pH 至 6.6，加纯水至40.0 g，搅拌均匀，作为空白凝胶基质。从中称取4.0 g加入布洛芬溶液（60 mg 布洛芬溶于400 µL无水乙醇），搅拌均匀。含10%肉桂油和10%氮酮的布洛芬凝胶分别加入600mg肉桂挥发油或氮酮（溶于600 µL无水乙醇），全部加入空白基质至6.0g凝胶，即得含1 %布洛芬、10%中药挥发油或氮酮的布洛芬凝胶。

将SD大鼠腹部脱毛，正常饲养18 h后，腹腔注射水合氯醛麻醉，固定，于相同面积（3.14cm2）的皮肤上分别给予等体积（1 g）受试品。给药24 h后将大鼠处死，取下给药后的皮肤，经10 %福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片厚4～5µm，HE染色，如图5所示，组织病理学检查表明，布洛芬凝胶没有皮肤刺激性，含10%川芎油的布洛芬凝胶有轻度皮肤刺激性，而10%氮酮的布洛芬凝胶有中度皮肤刺激性（角质层明显变薄，皮肤附件明显减少）。

将以上受试品采用评价皮肤刺激性的装置进行检测，结果如图6所示，通过颜色可以判断洛芬凝胶没有皮肤刺激性，含10%川芎油的布洛芬凝胶有轻度皮肤刺激性，而10%氮酮的布洛芬凝胶有中度皮肤刺激性，即与组织病理学检查的结果相吻合。

Claims

1.一种评价皮肤刺激性的装置，其特征在于：包含膜嵌套装置和脂质体人工皮肤膜；其中膜嵌套装置由嵌套板、膜嵌套两部分组成，膜嵌套位于嵌套板的孔中，脂质体人工皮肤膜结合在膜嵌套上；

脂质体人工皮肤膜按如下步骤制备：

2.如权利要求1所述评价皮肤刺激性的装置，其特征在于：所述脂质体人工皮肤膜制备步骤（1）中所述磷脂材料为重量比为1~8 : 1 : 0.2 : 0.6 : 2的卵磷脂，胆固醇，胆固醇硫酸酯、神经酰胺、棕榈酸。

3.如权利要求1或2所述评价皮肤刺激性的装置，其特征在于：所述脂质体人工皮肤膜制备步骤（1）中所述指示剂为罗丹明B。

4.一种评价皮肤刺激性的方法，其特征在于：用权利要求1~3中任一项所述的评价皮肤刺激性的装置进行扩散试验，其操作步骤为：在评价皮肤刺激性的装置的脂质体人工皮肤膜表面涂抹受试品后，在接受室中加入磷酸盐缓冲液作为接受液，在0.25~4 h根据接受液中指示剂颜色即可快速判断受试产品的皮肤刺激性强弱。

5.权利要求4中所述评价皮肤刺激性的方法在外用药物制剂或化妆品中的应用，包括用于经皮途径的软膏剂、凝胶剂、乳膏剂、贴膏剂、贴剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、涂剂、搽剂、洗剂、膜剂、气雾剂、喷雾剂等剂型的外用药物制剂或化妆品的皮肤刺激性评价。