CN105300848A - 一种脂质体人工皮肤膜及其制备方法和在外用制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

离体动物皮肤被广泛应用于外用制剂的体外透皮实验，但动物皮肤因种属、个体、部位、年龄、性别等因素导致差异，实验可控性和重现性不佳，且存在一定伦理学问题；而市售人工皮肤膜与真实皮肤的拟合度较低，导致实验结果可信度不高；鉴于此，本发明提供一种脂质体人工皮肤膜，其基于脂质体技术模拟皮肤角质层的组成和结构；制备方法包括脂质体制备、多孔膜与嵌套底部密封、脂质体与多孔膜结合、冻融循环等步骤。实验证实用本发明提供的脂质体人工皮肤膜透过不同极性药物成分，其透过行为与真实皮肤类似，且模拟程度优于市售人工皮肤膜，表明其能替代真实皮肤用于体外透皮吸收实验，为外用制剂、化妆品的研发提供有力的技术保障。

Description

一种脂质体人工皮肤膜及其制备方法和在外用制剂中的应用

技术领域

本发明涉及经皮给药技术领域，特别是涉及一种脂质体人工皮肤膜及其制备方法和在外用制剂中的应用。

背景技术

众所周知，经皮给药是除口服以外的主要给药途径之一，具有给药方便、可随时中止用药、能够避免口服给药的首过效应及胃肠道副作用等优点。但是，皮肤是人体最主要的屏障，大部分药物较难通过皮肤角质层，因此，不管是局部给药还是全身给药，经皮给药制剂处方的设计和优化都需要开展体外透皮吸收实验，以评价经皮渗透性能或优选制剂处方工艺。

由于人皮难以获得，长期以来，离体动物皮肤被广泛应用于外用制剂的体外透皮实验，但动物皮肤存在种属、个体、部位、年龄、性别等各种生物因素导致的差异，实验可控性和重现性不佳，并且动物皮肤的使用也存在一定伦理学问题。如能采用人工皮肤膜替代动物皮肤进行体外透皮实验，将有效地解决上述问题，无疑会为外用制剂包括化妆品的研发提供有力的技术保障。目前文献报道的人工皮肤膜主要是借助于简单的改性技术制备，与真实皮肤的拟合度较低，直接导致体外透皮实验结果可信度不高。脂质体是一种组成和结构类似于生物膜的微型载体，本发明基于脂质体技术，模拟皮肤角质层的组成和结构，并通过脂质体融合改性人工膜，致力于研发一种重现性好且能模拟真实皮肤的人工皮肤膜，能够替代动物皮肤在体外透皮试验中的应用。

发明方案

发明目的：本发明要解决的技术问题是研发一种能够代替真实皮肤进行体外透皮实验的人工皮肤膜。该人工膜应用了脂质体技术，模拟角质层的结构特征，从而模拟皮肤的屏障作用，可以替代真实皮肤应用到体外透皮吸收实验中，使体外透皮吸收实验结果具有较好的可控性和重现性。

技术方案：本发明提供一种用于模拟真实皮肤的脂质体人工皮肤膜，其包含两种粒径不同的脂质体，1份过孔径为800nm聚碳酸酯膜的脂质体，1～10份过孔径为400nm聚碳酸酯膜的脂质体。

作为本发明的进一步改进，所述脂质体采用磷脂材料制备所得，其中磷脂材料为重量比为1～8:1:0.2:0.6:2的卵磷脂，胆固醇，胆固醇硫酸酯、神经酰胺、棕榈酸。磷脂材料优选为重量比为8:1～1:1的卵磷脂和胆固醇。最优选为卵磷脂。

作为本发明的更进一步改进，所述两种粒径不同的脂质体，其组成为1份过孔径为800nm聚碳酸酯膜的脂质体，2份过孔径为400nm聚碳酸酯膜的脂质体。

作为本发明的更进一步改进，所述两种粒径不同的脂质体分层铺于多孔膜上(见图1)。

本发明同时提供上述脂质体人工皮肤膜的制备方法，包括脂质体的制备、多孔膜与嵌套底部的密封、脂质体与多孔膜的结合、冻融循环步骤。

作为本发明的进一步改进，所述脂质体采用被动载药法或主动载药法制备所得，其中被动载药法选自超声分散法、冷冻干燥法、复乳法、注入法、反相蒸发法、超临界法；主动载药法选自pH梯度法、硫酸铵梯度法、醋酸钙梯度法。优选为薄膜分散法。

作为本发明的进一步改进，本发明同时提供的脂质体人工皮肤膜的制备方法包括如下步骤：

1)脂质体的制备：称取作膜材用的磷脂材料5～10份，溶于50～120份无水乙醇或体积比为2:1的氯仿-甲醇混合溶液；减压蒸发除去溶剂，形成薄膜；再用50～120份含有5～15％乙醇的磷酸盐缓冲溶液室温水合，得到脂质体混悬液；最后将脂质体混悬液分别挤压过孔径为400nm和800nm的聚碳酸酯膜，得到两种粒径的脂质体；

2)多孔膜与膜嵌套底部的密封：将膜嵌套底部原有的膜去掉，将孔径为0.45μm的尼龙膜和膜嵌套底部150℃加热，使多孔膜与嵌套底部形成完全密封的小室；

3)脂质体与多孔膜的结合：将步骤1)制备所得过孔径400nm聚碳酸酯膜的脂质体1份，加入到步骤2)制得的嵌套中，2000rpm离心10min；将嵌套版旋转180°，再次加入步骤1)制备所得过孔径400nm聚碳酸酯膜的脂质体1份，2000rpm离心10min；然后将膜置于干燥箱中50℃加热至干燥；最后加入步骤1)制备所得过孔径800nm聚碳酸酯膜的脂质体1份，2000rpm离心10min，去除上清液，制得脂质体人工皮肤膜初品；

4)冻融循环：将步骤3)制备所得脂质体人工皮肤膜初品置于-70～-120℃冷冻0.5～1h，取出后50～75℃加热0.5～1h，如此循环冻融2～3次，即得脂质体人工皮肤膜。

本发明同时提供用上述方法制备所得的脂质体人工皮肤膜及其在外用药物制剂或化妆品中的应用，包括用于经皮途径的软膏剂、凝胶剂、乳膏剂、贴膏剂、贴剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、涂剂、搽剂、洗剂、膜剂、气雾剂、喷雾剂等剂型体外透皮吸收性质的评价。

本发明同时提供用上述方法制备所得的脂质体人工皮肤膜在考察或筛选透皮吸收促进剂的作用及机制中的应用。

有益效果

本发明提供的脂质体人工皮肤膜能够替代真实皮肤用于体外透皮吸收实验，不同极性药物成分透过行为与真实皮肤类似，并且模拟程度优于市售人工皮肤膜。

附图说明

图1脂质体人工皮肤膜示意图

图2模型药物在脂质体人工皮肤膜、市售人工皮肤膜和真实皮肤的体外透皮曲线(n＝5)；横坐标为透过时间、纵坐标为单位面积透过量

图3布洛芬通过人工皮肤膜与大鼠皮肤的透皮吸收曲线(n＝5)

图4采用偏最小二乘判别法(PLS-DA)模型，对脂质体人工皮肤膜组、市售Start-M膜组，及大鼠皮组透过数据进行多维统计分析得分图(scoreplot)

图5大鼠皮、脂质体人工皮肤膜、市售Start-M膜的红外测定结果

具体实施方式

下面将结合实施例进一步阐明本发明的内容，但这些实例并不限制本发明的保护范围。

实施例1：脂质体人工皮肤膜的制备

包括如下步骤：脂质体的制备、多孔膜与嵌套底部的密封、脂质体与多孔膜的结合、冻融循环，具体按如下步骤进行：

(1)脂质体的制备：称取卵磷脂460mg，胆固醇140mg，置于茄形瓶，用12ml无水乙醇溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含10％乙醇的磷酸盐缓冲溶液12ml水合，得到脂质体混悬液。将该脂质体混悬液分成两份，分别过400nm和800nm的聚碳酸酯膜，得到两种粒径的脂质体混悬液。

(2)多孔膜与嵌套底部的密封：将尼龙膜(孔径0.45μm)和膜嵌套底部150℃高温加热25～30s，使之形成完全密封的小室。

(3)脂质体与多孔膜的结合：将小室置于六孔板中，先加入过400nm聚碳酸酯膜挤出的脂质体0.6ml，2000rpm，离心10min，再将小室水平旋转180°，加入过400nm聚碳酸酯膜挤出的脂质体0.6ml，2000rpm离心10min；然后将膜置于干燥箱中50℃加热使膜干燥；再加入过800nm聚碳酸酯膜挤出的脂质体0.6ml，2000rpm离心10min，去除上清液。

冻融循环：将载有脂质体的膜置于-80℃冷冻1h，再于真空干燥箱中65℃加热0.5h，完成一次冻-融，重复该冻融循环3次，即得脂质体人工皮肤膜。

实施例2：脂质体人工皮肤膜的制备

与实施例1不同的是，步骤(1)中称取卵磷脂360mg，胆固醇180mg置于茄形瓶，用10ml氯仿-甲醇(v/v＝2:1)溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含5％乙醇的磷酸盐缓冲溶液10ml水合，得到脂质体混悬液。步骤(4)中冻融循环条件为，-120℃冷冻0.5h，50℃加热1h，冻融循环重复次数为2次。

实施例3：脂质体人工皮肤膜的制备

与实施例1不同的是，步骤(1)中称取卵磷脂300mg和胆固醇300mg置于茄形瓶，用8ml无水乙醇溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含10％乙醇的磷酸盐缓冲溶液8ml水合，得到脂质体混悬液。步骤(4)中冻融循环条件为，-70℃冷冻1h，75℃加热0.5h，冻融循环重复次数为3次。

实施例4：脂质体人工皮肤膜的制备

与实施例1不同的是，步骤(1)中称取卵磷脂480mg和胆固醇60mg置于茄形瓶，用20ml无水乙醇溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含15％乙醇的磷酸盐缓冲溶液15ml水合，得到脂质体混悬液。步骤(4)中冻融循环条件为，-90℃冷冻0.5h，70℃加热1h，冻融循环重复次数为2次。

实施例5：脂质体人工皮肤膜的制备

与实施例1不同的是，步骤(1)中称取卵磷脂400mg和胆固醇100mg置于茄形瓶，用16ml氯仿-甲醇(2:1)溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含15％乙醇的磷酸盐缓冲溶液15ml水合，得到脂质体混悬液。步骤(4)中冻融循环条件为，-70℃冷冻1h，70℃加热1h，冻融循环重复次数为3次。

实施例6：脂质体人工皮肤膜的制备

与实施例1不同的是，步骤(1)中称取卵磷脂600mg置于茄形瓶，用12ml无水乙醇溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含15％乙醇的磷酸盐缓冲溶液12ml水合，得到脂质体混悬液。步骤(4)中冻融循环条件为，-90℃冷冻0.5h，55℃加热0.5h，冻融循环重复次数为3次。

实施例7：脂质体人工皮肤膜的制备

与实施例1不同的是，步骤(1)中称取卵磷脂500mg置于茄形瓶，用8ml氯仿-甲醇(2:1)溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含5％乙醇的磷酸盐缓冲溶液8ml水合，得到脂质体混悬液。步骤(4)中冻融循环条件为，-70℃冷冻1h，75℃加热0.5h，冻融循环重复次数为2次。

实施例8：脂质体人工皮肤膜的制备

与实施例1不同的是，步骤(1)中称取卵磷脂400mg置于茄形瓶，用15ml无水乙醇溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含10％乙醇的磷酸盐缓冲溶液12ml水合，得到脂质体混悬液。步骤(4)中冻融循环条件为，-120℃冷冻0.5h，55℃加热0.5h，冻融循环重复次数为3次。

实施例9：脂质体人工皮肤膜的制备

与实施例1不同的是，步骤(1)中称取卵磷脂700mg置于茄形瓶，用15ml无水乙醇溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含10％乙醇的磷酸盐缓冲溶液12ml水合，得到脂质体混悬液。步骤(4)中冻融循环条件为，-90℃冷冻1h，75℃加热0.5h，冻融循环重复次数为3次。

实施例10：脂质体人工皮肤膜的制备

与实施例1不同的是，步骤(1)中称取卵磷脂400mg，胆固醇100mg，胆固醇硫酸酯20mg，神经酰胺60mg，棕榈酸200mg，置于茄形瓶，用15ml无水乙醇溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含10％乙醇的磷酸盐缓冲溶液12ml水合，得到脂质体混悬液。步骤(4)中冻融循环条件为，-80℃冷冻0.5h，65℃加热0.5h，冻融循环重复次数为2次。

实施例11：脂质体人工皮肤膜的制备

与实施例1不同的是，步骤(1)中称取卵磷脂800mg，胆固醇100mg，胆固醇硫酸酯20mg，神经酰胺60mg，棕榈酸200mg，置于茄形瓶，用10ml氯仿-甲醇(2:1)溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含15％乙醇的磷酸盐缓冲溶液10ml水合，得到脂质体混悬液。步骤(4)中冻融循环条件为，-70℃冷冻1h，50℃加热0.5h，冻融循环重复次数为2次。

实施例12：脂质体人工皮肤膜的制备

与实施例1不同的是，步骤(1)中称取卵磷脂100mg，胆固醇100mg，胆固醇硫酸酯20mg，神经酰胺60mg，棕榈酸200mg，置于茄形瓶，用20ml氯仿-甲醇(2:1)溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含5％乙醇的磷酸盐缓冲溶液20ml水合，得到脂质体混悬液。步骤(4)中冻融循环条件为，-100℃冷冻0.5h，55℃加热1h，冻融循环重复次数为3次。

实施例13：脂质体人工皮肤膜的制备

与实施例1不同的是，步骤(1)中称取卵磷脂500mg，胆固醇100mg，胆固醇硫酸酯20mg，神经酰胺60mg，棕榈酸200mg，置于茄形瓶，用12ml无水乙醇溶解，用旋转蒸发仪除去溶剂，成膜。成好的膜置于真空干燥箱过夜除去残余溶剂。加入含12％乙醇的磷酸盐缓冲溶液10ml水合，得到脂质体混悬液。步骤(4)中冻融循环条件为，-80℃冷冻1h，65℃加热1h，冻融循环重复次数为3次。

实施例14：脂质体人工皮肤膜在体外透皮试验中的应用。

脂质体人工皮肤膜按实施例1方法制备。

(1)渗透装置，选用改良Franz扩散池，TK-12D型透皮扩散试验仪，扩散面积为3.14cm²。

(2)接受液的制备：20％乙醇水溶液(v/v)。

(3)模型药物的选择：本发明选用了5个具有不同理化性质的模型药物，分别为芍药苷、芍药内酯苷、阿魏酸、四氢非洲防己碱、延胡索乙素。这5个模型药物的性质参见表1，将这5个成分按照一定的比例(14:31:12:1:1)溶解在20％乙醇水溶液中，制备成供给液。

表1模型药物性质

(4)体外透皮试验：将脂质体人工皮肤膜夹在Franz扩散池上，有脂质体的一面朝上。加入一定体积的接受液，置于透皮扩散试验仪中，37℃恒温水浴，用磁力搅拌500rpm，平衡30min，除去气泡；在供给室中加入2ml的供给液，分别于0、1、2、4、6、8、10、12h吸取0.2ml接受液，用HPLC法测定接受液中药物的浓度用HPLC法测定接受液中药物的浓度，并计算各个时间点的单位面积透过量。

(5)除脂质体人工皮肤膜外，同时以大鼠皮和市售Strat-M人工皮肤膜(默克密理博(MerckMillipore)公司)按照上述步骤(1)～(4)所述的步骤进行体外透皮试验，作为对照。

体外透皮曲线结果见图2，横坐标为透过时间、纵坐标为单位面积透过量，从中可以看出本发明制备的脂质体人工皮肤膜比市售人工皮肤膜(Strat-M膜)更接近大鼠皮的透过结果。表2的结果比较了5种不同性质成分通过人工皮肤膜与大鼠皮的相关系数，即将某一时间点通过脂质体人工皮肤膜或市售人工皮肤膜(Strat-M膜)的单位面积透过量与同一时间点通过大鼠皮的单位面积透过量进行相关并计算相关系数，可见，与市售人工皮肤膜相比脂质体人工皮肤膜与大鼠皮的相关系数更高，透皮效果更加接近。

以上结果说明本发明制备的脂质体人工皮肤膜可以代替真实皮肤进行体外透皮实验。

表2五种成分通过两种人工皮肤膜分别与通过大鼠皮的单位面积透过量的相关系数

实施例15：脂质体人工皮肤膜在体外透皮试验中的应用

脂质体人工皮肤膜按实施例6方法制备。

除真实皮肤采用小鼠皮以外，其余方法同实施例14。脂质体人工皮肤膜与市售人工皮肤膜(Strat-M膜)与小鼠皮单位面积透过量的相关系数结果如表3所示。可见，与市售人工皮肤膜相比，脂质体人工皮肤膜与小鼠皮的相关系数更高，透皮效果更加接近。

以上结果说明本发明制备的脂质体人工皮肤膜可以代替真实皮肤进行体外透皮实验。

表3五种成分通过两种人工皮肤膜分别与通过小鼠皮的单位面积透过量的相关系数

实施例16：脂质体人工皮肤膜在体外透皮试验中的应用

脂质体人工皮肤膜按实施例10方法制备。

除真实皮肤采用裸鼠皮以外，其余方法同实施例14。脂质体人工皮肤膜与市售人工皮肤膜(Strat-M膜)与裸鼠皮单位面积透过量的相关系数结果如表4所示。可见，与市售人工皮肤膜相比，脂质体人工皮肤膜与裸鼠皮的相关系数更高，透皮效果更加接近。

以上结果说明本发明制备的脂质体人工皮肤膜可以代替真实皮肤进行体外透皮实验。

表4五种成分通过两种人工皮肤膜分别与通过裸鼠皮的单位面积透过量的相关系数

实施例17：脂质体人工皮肤膜在体外透皮试验中的应用

脂质体人工皮肤膜按实施例2方法制备。

(1)渗透装置，选用改良Franz扩散池，TK-12D型透皮扩散试验仪，扩散面积为3.14cm²。

(2)接受液的制备：35％乙醇水溶液(v/v)。

(3)模型药物的选择：本发明选用了布洛芬，为脂溶性药物，是常用的解热镇痛药，有市售外用制剂(如布洛芬乳膏、布洛芬凝胶等)。

(4)体外透皮试验：将制备好的脂质体人工皮肤膜从嵌套上取下，夹在Franz扩散池上，有脂质体的一面朝上。加入一定体积的接受液，置于透皮扩散试验仪中，37℃恒温水浴，用磁力搅拌500rpm，平衡30min，除去气泡；在供给室中加入布洛芬凝胶(布洛芬含量为6mg)，分别于0.5、1、2、4、6、10、18、24、36、48h吸取0.2ml接受液，用HPLC法测定接受液中药物的浓度，并计算各个时间点的单位面积透过量。

(5)除脂质体人工皮肤膜外，同时以大鼠皮和市售Strat-M人工皮肤膜按照上述步骤(1)～(4)所述的步骤进行体外透皮试验，作为对照。

体外透皮吸收结果见图3，可见在各个时间点，与市售人工皮肤膜Strat-M膜相比，脂质体人工皮肤膜的透皮吸收结果均更接近于大鼠皮。

实施例18：脂质体人工皮肤膜在体外透皮试验中的应用

脂质体人工皮肤膜按实施例7方法制备。

(1)渗透装置，选用改良Franz扩散池，TK-12D型透皮扩散试验仪，扩散面积为3.14cm²。

(2)接受液的制备：生理盐水溶液。

(3)模型药物的选择：选用罗丹明B，是一种常用的水溶性荧光探针。

(4)体外透皮试验：将制备好的脂质体人工皮肤膜从嵌套上取下，夹在Franz扩散池上，有脂质体的一面朝上。加入一定体积的接受液，置于透皮扩散试验仪中，37℃恒温水浴，用磁力搅拌500rpm，平衡30min，除去气泡；在供给室中加入罗丹明B生理盐水溶液(罗丹明B含量为0.05mg)，于12h后取接受液，用荧光分光光度计测定接受液中药物的浓度，并计算累积透过量，与供给室中加入的药物总量相比，计算累积透过百分率。

(5)除脂质体人工皮肤膜外，同时以兔皮和市售Strat-M人工皮肤膜按照上述步骤(1)～(4)所述的步骤进行体外透皮试验，作为对照。

体外透皮吸收结果见表5，可见，与兔皮相比，通过市售人工皮肤膜Strat-M膜的累积透过率有显著差异(P<0.01，t检验)，而脂质体人工皮肤膜的累积透过率却与兔皮没有显著差异，说明脂质体人工皮肤膜的透皮结果均更接近于兔皮。

表5罗丹明B透过不同皮肤的累积透过率(n＝5)

与兔皮组比较，**P<0.01

实施例19：脂质体人工皮肤膜在中药复方体外透皮试验中的应用

1仪器与材料

TSQVantage型串联三重四级杆质谱仪，美国ThermoFisher公司；Ultimate3000型超高效液相色谱，美国BeckmanCoulter公司；TK-12D透皮扩散试验仪，上海锴凯科技贸易有限公司；TGL-20BR高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；赛多利斯BSA-124S分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；S-210C酸度计，梅特勒公司；EP-ED超纯水机，南京易普易达科技发展有限公司；FD-1A-50冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；KH5200E型超声波清洗机，昆山禾创超声仪器有限公司；DKZ-2电热恒温振荡水浴槽，上海精宏实验设备有限公司。

Start-M人工皮肤膜，当归为伞形科当归属植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根、川芎为伞形科藁本属植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根茎、白芍为毛茛科芍药属植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根、熟地黄为玄参科地黄属植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch.的块根的炮制加工品、木香为菊科植物AucklandialappaDecne.的干燥根、香附为莎草科莎草属植物莎草CyperusrotundusL.的干燥根茎、延胡索为罂粟科紫堇属植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥块茎，药材饮片均购自安徽纪淞堂中药饮片有限公司，批号20150101，药材经南京中医药大学段金廒教授鉴定，药材质量均符合《中国药典》2010年版一部规定，标本收藏于南京中医药大学药学院药物制剂研究室；D101大孔树脂，购自西安蓝晓科技有限公司；甲酸，色谱纯，Aladdin；乙腈、甲醇，色谱纯，Tedia；其余试剂均为分析纯。

2方法和结果

2.1BW(香附四物汤效应部位)的制备

取当归、川芎、白芍、熟地、木香、香附、延胡索(6∶3∶3∶8∶2∶3∶3)药材饮片2.1kg，加10倍量水浸泡12h后连续煎煮2次，合并2次药液，加热浓缩至生药质量浓度为1g/mL，加入95％乙醇至药液达到80％酒精度(V/V)，静置24h后取上清液浓缩至无醇味，浓缩液经大孔吸附树脂以水、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇梯度洗脱，收集60％乙醇洗脱部位(得率为0.366％)，冷冻干燥后即得BW粉末。精密称取BW粉末适量，用50％甲醇超声溶解并定容，19000r/min离心10min，精密量取上清液100μL，加入100μL内标溶液，混匀，得BW供试液，用于UPLC-MS/MS分析。

其中内标溶液为克拉霉素甲醇溶液，具体配制方法如下：精密称取克拉霉素对照品适量于量瓶中，用甲醇溶解配置成内标储备液，再取适量储备液用甲醇稀释至质量浓度为16.06ng/mL的内标工作液。

2.2体外透皮吸收研究

2.2.1离体皮肤的制备取大鼠，麻醉后用刀片将腹部毛剔除干净，24h后脱颈处死，剥离腹部皮肤，除去皮下血管及组织，于-20℃保存。实验前将皮肤自然解冻，用20％乙醇水溶液清洗干净备用。

2.2.2供给液与接收液的制备

(1)BW混悬液的制备：精密称取BW粉末适量置于量瓶，用20％乙醇水溶液超声溶解，最终BW质量浓度为2.06mg/mL。

(2)接收液的制备：20％乙醇水溶液，使用前37℃预热并超声除去气泡。

2.2.3体外透皮吸收试验用实施例1～13中方法制备脂质体人工皮肤膜，每种方法平行制备2份；采用改良Franz扩散池(扩散面积为3.14cm²，接收室体积为7.0mL)进行透皮实验，将脂质体人工皮肤膜/离体腹部皮肤固定于扩散池上，角质层向上，接收室加入接收液，将装好膜/皮肤与接收液的扩散池放入透皮扩散仪，37℃，500r/min，平衡1h。精密量取BW混悬液2.0mL于供给室；在12h吸取0.2mL接收液，接收液样品用甲醇稀释，加入内标物木糖醇，19000r/min离心10min，精密量取上清液100μL，进行UPLC-MS/MS分析。

2.3UPLC-MS/MS条件

2.3.1液相条件色谱柱为HibarHRC₁₈柱(100mm×2.1mm，2μm)；流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液。0～1min，10％乙腈；1～5min，10％～30％乙腈；5～6min，30％～75％乙腈；6～8min，75％～10％乙腈；8～11min，10％乙腈；体积流量0.4mL/min；进样体积4μL；柱温35℃。

2.3.2质谱条件离子源：ESI源；扫描方式：多反应监测(MRM)方式；气化管温度：450℃；毛细管温度：350℃；喷雾电压：负离子(3500V)，正离子(3184V)。

2.4模式识别分析采用实施例1～13制备所得脂质体人工皮肤膜、市售Start-M膜，及大鼠皮为膜材按“2.2”项下方法进行BW透皮实验，再按“2.3”项下方法对接受液进行质谱分析，所得总离子流图采用解卷积，并以同一保留时间下同一质荷比的峰视为同一种化合物，化合物峰面积均采用内标归一化方法进行数据标准化处理，最后采用偏最小二乘判别法(PLS-DA)模型，对脂质体人工皮肤膜组、市售Start-M膜组，及大鼠皮组透过数据进行多维统计分析，分析结果用得分图(scoreplot)表示(图4)。

拟合所得模型包含2个主成分，其拟合参数为R2X＝92.7％，Q2＝95.4％，说明模型的稳定性和预测率较高。由图4可见，脂质体人工皮肤膜组距大鼠皮组更近，而市售膜组距大鼠皮组较远，说明BW经脂质体人工皮肤膜透皮后的成分群与经大鼠皮透皮后的成分群相近，而BW经市售Start-M膜透皮的成分群与大鼠皮有着显著差异。由此模拟多成分同时透过膜的透过效果，可见脂质体人工皮肤膜与大鼠皮的透过行为更为相似。

实施例20：脂质体人工皮肤膜的红外测定

脂质体人工皮肤膜1和2分别按实施例1和6方法制备。

检测方法：傅里叶变换衰减全反射红外光谱(ATR-FTIR)

仪器型号：光谱仪FTIR-230，采样附件ATR-500/M

实验步骤：取适宜大小的大鼠皮，脂质体人工皮肤膜1，脂质体人工皮肤膜2和市售Strat-M膜，将测试面直接放在锗晶体上，旋转OMNI采样器固定钮，压住样品。硒化锌作为发生全反射的晶体材料，入射光角度为45°，扫描范围为4000cm^-1～650cm^-1，分辨率4为cm^-1，扫描次数为64。结果如图5所示，角质层特征峰波数如表6所示，可见，脂质体人工皮肤膜1和2的红外吸收光谱更接近于真实大鼠皮。

表6红外特征吸收峰的波数(特征峰/cm^-1)

以上所有实施例中市售Strat-M人工皮肤膜均采购于默克密理博(MerckMillipore)公司。

Claims (12)

1.一种脂质体人工皮肤膜，其特征在于：包含两种粒径不同的脂质体，1份过孔径为800nm聚碳酸酯膜的脂质体，1~10份过孔径为400nm聚碳酸酯膜的脂质体。

2.如权利要求1中所述脂质体人工皮肤膜，其特征在于：所述脂质体采用磷脂材料制备所得，其中磷脂材料为重量比为1~8:1:0.2:0.6:2的卵磷脂，胆固醇，胆固醇硫酸酯、神经酰胺、棕榈酸。

3.如权利要求1中所述脂质体人工皮肤膜，其特征在于：所述脂质体采用磷脂材料制备所得，其中磷脂材料为重量比为8:1~1:1的卵磷脂和胆固醇。

4.如权利要求1中所述脂质体人工皮肤膜，其特征在于：所述脂质体采用磷脂材料制备所得，其中磷脂材料为卵磷脂。

5.如权利要求1~4中任一项所述脂质体人工皮肤膜，其特征在于：所述两种粒径不同的脂质体，其组成为1份过孔径为800nm聚碳酸酯膜的脂质体，2份过孔径为400nm聚碳酸酯膜的脂质体。

6.如权利要求1~4中任一项所述脂质体人工皮肤膜，其特征在于：所述两种粒径不同的脂质体分层铺于多孔膜上。

7.如权利要求5中所述脂质体人工皮肤膜，其特征在于：所述两种粒径不同的脂质体分层铺于多孔膜上。

8.权利要求1~7中任一项所述脂质体人工皮肤膜的制备方法，包括脂质体的制备、多孔膜与嵌套底部的密封、脂质体与多孔膜的结合、冻融循环步骤。

9.如权利要求8中所述脂质体人工皮肤膜的制备方法，其特征在于：所述脂质体采用被动载药法或主动载药法制备所得，其中被动载药法选自超声分散法、冷冻干燥法、复乳法、注入法、反相蒸发法、超临界法；主动载药法选自pH梯度法、硫酸铵梯度法、醋酸钙梯度法。

10.如权利要求8中所述脂质体人工皮肤膜的制备方法，其特征在于：所述脂质体采用薄膜分散法制备所得。

11.如权利要求8~10中任一项所述脂质体人工皮肤膜的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

脂质体的制备：称取作膜材用的磷脂材料5~10份，溶于50~120份无水乙醇或体积比为2:1的氯仿-甲醇混合溶液；减压蒸发除去溶剂，形成薄膜；再用50~120份含有5~15%乙醇的磷酸盐缓冲溶液室温水合，得到脂质体混悬液；最后将脂质体混悬液分别挤压过孔径为400nm和800nm的聚碳酸酯膜，得到两种粒径的脂质体；

多孔膜与膜嵌套底部的密封：将膜嵌套底部原有的膜去掉，将孔径为0.45μm的尼龙膜和膜嵌套底部150℃加热，使多孔膜与嵌套底部形成完全密封的小室；

脂质体与多孔膜的结合：将步骤1）制备所得过孔径400nm聚碳酸酯膜的脂质体1份，加入到步骤2）制得的嵌套中，2000rpm离心10min；将嵌套版旋转180°，再次加入步骤1）制备所得过孔径400nm聚碳酸酯膜的脂质体1份，2000rpm离心10min；然后将膜置于干燥箱中50℃加热至干燥；最后加入步骤1）制备所得过孔径800nm聚碳酸酯膜的脂质体1份，2000rpm离心10min，去除上清液，制得脂质体人工皮肤膜初品；

冻融循环：将步骤3）制备所得脂质体人工皮肤膜初品置于-70~-120℃冷冻0.5~1h，取出后50~75℃加热0.5~1h，如此循环冻融2~3次，即得脂质体人工皮肤膜。

12.权利要求5中所述脂质体人工皮肤膜在外用药物制剂或化妆品中的应用，包括用于经皮途径的软膏剂、凝胶剂、乳膏剂、贴膏剂、贴剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、涂剂、搽剂、洗剂、膜剂、气雾剂、喷雾剂等剂型体外透皮吸收性质的评价。