CN101327189A - 具有标记和治疗双功能的纳米乙醇脂质体材料制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种纳米材料技术领域的具有标记和治疗双功能的纳米乙醇脂质体材料制备方法,选用在水溶液中直接合成的CdTe、CdSe或者CdSe◎ZnS核壳型半导体量子点,将5-FU和亲水性的量子点溶解和分散在磷酸盐缓冲溶液中。把磷脂超声溶解于无水乙醇中,在密闭容器中用恒压滴液漏斗以溪流状缓慢滴入含有5-FU和量子点的磷酸盐缓冲溶液,在搅拌下混合,滴加完毕,继续搅拌,室温冷却得5-FU和量子点分散在乙醇脂质体内部的混悬液,用薄膜挤出器分别通过聚碳酸酯膜,制备得到纳米乙醇脂质体。本发明为瘢痕和皮肤病的治疗提供了材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳米材料技术领域的脂质体制备方法,具体地说,涉及的是一种具有标记和治疗双功能的纳米乙醇脂质体材料制备方法。
背景技术
瘢痕是皮肤的一种难治性疾病,且易复发,常用的治疗瘢痕的方法有手术治疗和非手术治疗。到目前为止,这些治疗方法并不能达到理想的治疗效果。5-氟尿嘧啶(5-FU)在细胞内经过修饰成为酶的活性底物,与DNA整合后抑制DNA的合成,从而抑制成纤维细胞的增殖和成纤维细胞聚集的胶原蛋白网络的合成,起到治疗瘢痕的作用,是治疗瘢痕的常用药物。目前,5-FU主要是注射给药,该给药途径有诸多缺点,如注射治疗疼痛明显;无论采用什么样的注射方法,药物扩散范围均很小,一般呈线状分布,势必影响治疗效果;注射部位易形成钙化灶、组织感染破溃及坏死;使用局麻药可引起过敏反应,有时甚至引起自发性出血等。经皮给药虽有诸多优点,但因瘢痕致密的结构而受到限制。脂质体由磷酸卵磷脂和表面活性剂构成,内部至少有一个由脂双分子层构成的亲水性间隔,易于与水溶性药物5-FU结合,有较强的透皮能力。脂质体作为药物载体的优点:缓释、可生物降解、无毒、无免疫原性、生物相容性好,且具有靶向性。目前研究最多的是普通脂质体,另一种新型脂质体——乙醇脂质体作为药物载体也是研究的热点,与普通脂质体相比,乙醇脂质体具有更大的皮肤角质层透过量及皮肤滞留药量,大大提高了药物的靶向作用。多种药物制成含醇脂质体后,体内外透皮实验表明透皮吸收效果都优于普通脂质体制剂, 同时,乙醇脂质体本身无毒性,不产生皮肤刺激性,是皮肤给药较理想的载体。
量子点标记的荧光分析原理和检测技术与现有的荧光分析技术相似,但用传统的荧光有机染料如罗丹明红等标记生物物质,需要特定的波长和能量高的光源激发,发射光的光谱宽,并且红光区有拖尾,光稳定性差,检测本底高,灵敏度低;并且量子点光稳定性强。量子点标记的另外一个显著的优势是具有良好的光稳定性,在持续光照射下可以维持几个小时,荧光寿命长,通过控制时间来抑制天然物质自身的荧光干扰,灵敏度高。而对于瘢痕和皮肤病的治疗需要药物长时间保存在皮肤中,对其标记需要长时间的检测,量子点正是能满足这个需要。
经对现有技术的文献检索发现,中国专利(申请)号为200310109999.5的发明制备了油性的CdSe半导体纳米晶,合成复合油性纳米晶囊泡及通过改变pH值来调节表面电位从而使得囊泡与生物蛋白通过经典连接等步骤得到。该方法是将油性量子点包裹在脂质体囊泡中,以期对其生物相容性进行改进,并通过层析试纸进行免疫检测的方法。该方法主要目的是将油性的纳米晶通过囊泡包裹转为水相,且主要用于层析试纸条免疫检测,并不适用于透皮检测和治疗。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足,提供一种具有标记和治疗双功能的纳米乙醇脂质体制备方法,制备了同时含有量子点和5-FU的纳米级乙醇脂质体,提供一种具有标记和治疗双重作用的纳米复合材料,为瘢痕和皮肤病的治疗提供材料准备。
本发明是通过以下技术方案实现的,本发明选取亲水性的半导体量子点,将水性的量子点和治疗药物包裹在具有双亲基团并且生物相近的磷脂类化合物中,制备成乙醇脂质体,再通过不同孔径的聚碳酸酯膜,得到具有标记和治疗双重功能的纳米乙醇脂质体。
本发明包括如下步骤:
第一步,将0.1%~0.5%(重量/体积,w/v)5-FU和0.005%~0.03%(重量/体积,w/v)亲水性的量子点溶解在磷酸盐缓冲溶液中,得到水相混合物。
所述量子点选用在水溶液中直接合成发射不同波长、水溶性的CdTe、CdSe或者CdSe◎ZnS核壳型半导体量子点。本发明通过选用不同种类和不同粒径的半导体量子点得到荧光发射波长从488nm到605nm之间的多种颜色的标记材料。
所述磷酸盐缓冲溶液,其pH为7.4。
第二步,将1%~5%(重量/体积,w/v)的磷脂超声溶解于乙醇中,在密闭容器中用恒压滴液漏斗以溪流状缓慢滴入第一步的水相混合物中,持续搅拌混合,滴加完毕,继续搅拌。
所述磷脂为卵磷脂PC、磷脂酰胺PE、磷脂酰甘油或者磷脂酰肌醇PI。
所述乙醇,其体积百分比为30%。
所述持续搅拌混合,是指在700r/min条件下持续搅拌混合。
所述继续搅拌,其时间为1小时。
所述第二步的制备过程保持温度在30℃-50℃。
第三步,室温冷却得到5-FU和量子点分散在乙醇脂质体内部的混悬液,用薄膜挤出器分别通过设定孔径的聚碳酸酯膜,得到具有标记和治疗双重作用的纳米乙醇脂质体。
所述设定孔径的聚碳酸酯膜,是指50nm、100nm、200nm孔径的聚碳酸酯膜,得到的纳米乙醇脂质体平均粒径分别为65±10nm,108±12nm和226±15nm。
将瘢痕或者皮肤有效去除皮下脂肪组织,确保表皮完整无损,置于-25℃冰箱内储存备用。透瘢痕或者透皮肤前,将瘢痕组织或者皮肤取出解冻并切成直径约2cm的圆形,用磷酸盐缓冲液冲洗干净,滤纸吸干,备用。
采用改进的Franz药物透皮扩散试验仪进行体外透皮实验,接收池容积6.5ml,透皮扩散面积2.8cm2,以PBS(pH 7.4)为扩散介质。将瘢痕或者皮肤固定,角质层朝上,真皮层接触扩散介质,分别均匀涂布不同粒径的载有量子点和5-FU的纳米乙醇脂质体溶液1ml,于200r/min、(37±0.5)℃进行试验,不同透皮时间取样测试。将体外透皮后的瘢痕从透皮仪上取下,用去离子水反复冲洗,然后浸泡于4%的多聚甲醛中过夜,再浸入30%的蔗糖溶液中过夜,之后在冰冻切片机上制成纵向冰冻切片,厚约10微米,将制作好的切片在荧光显微镜下观测载有量子点和5-FU的纳米乙醇脂质体在瘢痕中的渗透深度及荧光强度。
本发明主要是将水溶性的量子点和具有治疗作用的药物同时包裹在磷脂等双亲性的分子内形成具有透皮性能的纳米乙醇脂质体,通过采用扩散池进行体外透皮实验检验所制备双功能纳米复合材料对皮肤和瘢痕的透过深度,利用量子点的标记作用,通过荧光显微镜直接观察材料的透皮深度。为透皮药物及瘢痕治疗提供了材料。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
1.选用发射波长为488nm水中分散的CdTe量子点。配制0.1%(w/v)5-FU和0.005%(w/v)亲水性CdTe半导体量子点的磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH 7.4)中得到水相混合物。
2.将1%(w/v)的卵磷脂PC超声溶解于30%(v/v)乙醇中,在密闭的容器中用恒压滴液漏斗以溪流状缓慢滴入上述含有5-FU和量子点的磷酸盐缓冲溶液中,在700r/min条件下持续搅拌混合,滴加完毕,继续搅拌1小时,制备过程保持温度在30℃。
3.室温冷却即得到5-FU和量子点分散在乙醇脂质体内部的混悬液。之后使用薄膜挤出器(型号:LiposoFast-Basic,加拿大)分别通过50nm、100nm、200nm孔径的聚碳酸酯膜,用激光粒度仪测得所制备的纳米脂质体平均粒径63nm,102nm和218nm。
4.分别取处理好的瘢痕和皮肤样品,采用改进的Franz药物透皮扩散试验仪进行体外透皮实验。将瘢痕或者皮肤固定,角质层朝上,真皮层接触扩散介质,分别均匀涂布上述制备得到的63nm,102nm和218nm的载有量子点和5-FU的纳米乙醇脂质体溶液1ml,于200r/min、(37±0.5)℃进行试验,透皮时间8小时。将透皮后的瘢痕或者皮肤从透皮仪上取下,用去离子水反复冲洗,然后浸泡于4%的多聚甲醛中过夜,再浸入30%的蔗糖溶液中过夜,之后在冰冻切片机上制成纵向冰冻切片,厚约10μm,将制作好的切片在荧光显微镜下观测载有量子点和5-Fu的纳米乙醇脂质体在瘢痕和皮肤中的渗透深度及荧光强度,可以看出在瘢痕和皮肤中有明显的绿色荧光,并且随着双功能纳米脂质体粒径的减小,其透皮的深度增加,荧光强度更强。
实施例2
1.选用发射波长为530nm水中分散的CdSe量子点。配制0.5%(w/v)5-FU和0.03%(w/v)亲水性CdSe半导体量子点的磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH 7.4)中得到水相混合物。
2.将5%(w/v)的磷脂酰肌醇PI超声溶解于30%(v/v)乙醇中,在密闭的容器中用恒压滴液漏斗以溪流状缓慢滴入上述含有5-FU和量子点的磷酸盐缓冲溶液,在700r/min条件下持续搅拌混合,滴加完毕,继续搅拌1小时,制备过程保持温度在40℃。
3.室温冷却即得到5-FU和量子点分散在乙醇脂质体内部的混悬液。之后使用薄膜挤出器分别通过50nm、100nm、200nm孔径的聚碳酸酯膜,用透射电子显微镜观察得到的纳米脂质体平均粒径70nm,116nm和238nm。
4.分别取处理好的瘢痕和皮肤样品,采用改进的Franz药物透皮扩散试验仪进行体外透皮实验。将瘢痕或者皮肤固定,角质层朝上,真皮层接触扩散介质,分别均匀涂布上述制备得到的70nm,116nm和238nm的载有量子点和5-FU的纳米乙醇脂质体溶液1ml,于200r/min、(37±0.5)℃进行试验,透皮时间8小时。将透皮后的瘢痕或者皮肤从透皮仪上取下,用去离子水反复冲洗,然后浸泡于4%的多聚甲醛中过夜,再浸入30%的蔗糖溶液中过夜,之后在冰冻切片机上制成纵向冰冻切片,厚约10μm,将制作好的切片在荧光显微镜下观测载有量子点和5-FU的纳米乙醇脂质体在瘢痕和皮肤中的渗透深度及荧光强度,可以看出在瘢痕和皮肤中有明显的黄色荧光,并且随着双功能纳米脂质体粒径的减小,其透皮的深度增加,荧光强度更强。
实施例3
1.选用发射波长为605nm水中分散的CdSe◎ZnS核壳型半导体量子点。配制0.2%(w/v)5-FU和0.01%(w/v)亲水性CdSe◎ZnS核壳型半导体量子点的磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH 7.4)得到水相混合物。.
2.将3%(w/v)的磷脂酰胺(PE)超声溶解于30%(v/v)乙醇中,在密闭的容器中用恒压滴液漏斗以溪流状缓慢滴入上述含有5-FU和量子点的磷酸盐缓冲溶液,在700r/min条件下持续搅拌混合,滴加完毕,继续搅拌1小时,制备过程保持温度在50℃。
3.室温冷却即得到5-FU和量子点分散在乙醇脂质体内部的混悬液。之后使用薄膜挤出器分别通过50nm、100nm、200nm孔径的聚碳酸酯膜,用透射电子显微镜观察得到的纳米脂质体平均粒径67nm、108nm和250nm。
4.分别取处理好的瘢痕和皮肤样品, 采用改进的Franz药物透皮扩散试验仪进行体外透皮实验。将瘢痕或者皮肤固定,角质层朝上,真皮层接触扩散介质,分别均匀涂布上述制备得到的67nm,108nm和250nm的载有量子点和5-FU的纳米乙醇脂质体溶液1ml,于200r/min、(37±0.5)℃进行试验,透皮时间8小时。将透皮后的瘢痕或者皮肤从透皮仪上取下,用去离子水反复冲洗,然后浸泡于4%的多聚甲醛中过夜,再浸入30%的蔗糖溶液中过夜,之后在冰冻切片机上制成纵向冰冻切片,厚约10μm,将制作好的切片在荧光显微镜下观测载有量子点和5-FU的纳米乙醇脂质体在瘢痕和皮肤中的渗透深度及荧光强度,可以看出在瘢痕和皮肤中有明显的红色荧光,并且随着双功能纳米脂质体粒径的减小,其透皮的深度增加,荧光强度更强。
Claims (9)
1、一种具有标记和治疗双功能的纳米乙醇脂质体材料制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
第一步,将重量/体积为0.1%~0.5%的5-FU和0.005%~0.03%的亲水性的量子点溶解在磷酸盐缓冲溶液中,得到水相混合物;
第二步,将重量/体积为1%~5%的磷脂超声溶解于乙醇中,在密闭容器中用恒压滴液漏斗以溪流状缓慢滴入第一步的水相混合物中,持续搅拌混合,滴加完毕,继续搅拌;
第三步,室温冷却得到5-FU和量子点分散在乙醇脂质体内部的混悬液,用薄膜挤出器分别通过设定孔径的聚碳酸酯膜,得到具有标记和治疗双重作用的纳米乙醇脂质体。
2、根据权利要求1所述的具有标记和治疗双功能的纳米乙醇脂质体材料制备方法,其特征是,所述量子点选用水相中直接合成的、荧光发射波长从488nm到605nm之间的CdTe、CdSe或者CdSe◎ZnS核壳型半导体量子点中的一种。
3、根据权利要求1所述的具有标记和治疗双功能的纳米乙醇脂质体材料制备方法,其特征是,所述磷酸盐缓冲溶液,其pH为7.4。
4、根据权利要求1所述的具有标记和治疗双功能的纳米乙醇脂质体材料制备方法,其特征是,所述磷脂为卵磷脂PC、磷脂酰胺PE、磷脂酰甘油或者磷脂酰肌醇PI。
5、根据权利要求1所述的具有标记和治疗双功能的纳米乙醇脂质体材料制备方法,其特征是,所述乙醇,其体积百分比为30%。
6、根据权利要求1所述的具有标记和治疗双功能的纳米乙醇脂质体材料制备方法,其特征是,所述持续搅拌混合,是指在700r/min条件下持续搅拌混合。
7、根据权利要求1所述的具有标记和治疗双功能的纳米乙醇脂质体材料制备方法,其特征是,所述继续搅拌,其时间为1小时。
8、根据权利要求1所述的具有标记和治疗双功能的纳米乙醇脂质体材料制备方法,其特征是,所述第二步的制备过程保持温度在30℃-50℃。
9、根据权利要求1所述的具有标记和治疗双功能的纳米乙醇脂质体材料制备方法,其特征是,所述设定孔径的聚碳酸酯膜,是指50nm、100nm、200nm孔径的聚碳酸酯膜,得到的纳米乙醇脂质体平均粒径分别为65±10nm、108±12nm和226±15nm。
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