CN104888217B - 用于癌症光动力学治疗的靶向纳米光药物 - Google Patents
用于癌症光动力学治疗的靶向纳米光药物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种含光敏剂的纳米颗粒,所述纳米颗粒包括:一种光敏剂,所述光敏剂通过至少一部分所述纳米颗粒共价键合到纳米颗粒基质材料上并以准聚集状态并入所述纳米颗粒基质中。本发明进一步涉及一种制备本发明纳米颗粒的方法、以及使用所述纳米颗粒进行光动力学治疗杀死癌细胞的方法。
Description
本申请是2012年02月13日递交的申请号为200980160922.6,发明名称为“用于癌症光动力学治疗的靶向纳米光药物”的分案申请。
技术领域
本发明涉及癌症治疗以及用于癌症治疗的治疗制剂。特别是,本发明涉及用于癌症光动力学治疗的纳米药物、以及制备所述纳米药物的方法。
背景技术
光动力学治疗(Photodynamic Therapy,PDT)是用于治疗许多类型癌症和各种非恶性疾病的新兴治疗方式。在光动力学治疗中,光敏药物的光活化可产生活性氧簇(Reactive Oxygen Species,ROS),诸如:单线态氧(1O2)、氧自由基或过氧化物,这些活性氧簇可以氧化破坏包括血浆、线粒体、溶酶体和细胞核膜在内的细胞区室,从而导致肿瘤细胞的不可逆损伤。在适当的条件下,光动力学治疗的优点是它是一种有效地、选择性地破坏病体组织而不损害相邻健康组织的方法。然而,尽管与目前的治疗方法(例如手术、放射疗法、和化学疗法)相比光动力学治疗具有其优点,但其作为癌症主流治疗手段的一般临床接受度仍然很低。这是因为目前光动力学治疗技术存在一些重要的限制因素,诸如由于光敏(Photosensitive, PS)药物的非特异性生物分布所造成的身体的过长光敏感性、药物对组织穿透较好的光谱范围的光吸收性低、光敏药物的疏水性导致的在血液循环中不可控的聚集和给药困难、亲水性药物的快速光漂白、非特异性的药物分布导致的在靶部位达不到药物的最佳浓度。
考虑到传统方法缺乏有效的靶向性,因而目前技术水平的光动力学治疗必须继续开发用于靶向光动力学治疗的结合物(该结合物将光敏剂与靶向配体,例如单克隆抗体、肽、叶酸等,结合到一起)。重要的是,注意到这些方法与靶向光学诊断结合物的开发紧密相关;靶向光学诊断结合物组合了小荧光分子,该小荧光分子与靶向光动力学治疗所用的相同的靶向配体相结合。然而,靶向光动力学治疗目前的技术水平具有一些重大挑战。(1)大部分有效的光敏剂本质上是疏水性的,具有固有的低水溶性,并且对脂类环境具有高亲和性。这会导致两种结果:第一,当在生理条件下注射光敏剂结合物时,光敏剂结合物形成与血浆蛋白结合的聚集体,并被细胞内网系统从宿主中清除。这限制了结合物在任何靶组织中可以达到的有效浓度。第二,当光敏剂结合物与靶细胞发生相互作用时,光敏剂的高亲脂性促进非特异性细胞摄取。此过程与活性靶向受体竞争,导致结合物在不表达靶受体的正常细胞中聚集。 (2)单个光敏剂分子连接在单个靶向配体上的事实,意味着并入具有有限数量受体的细胞中的光敏剂的量是有限的。虽然将多个光敏剂分子(或它们的前体)与单个靶向配体相连接已经做出很多的努力,但这仍然是个显著的问题。此外,自由光敏剂的一个重要特性是产生活性氧簇的同时其自身被破坏,在光敏剂-配体结合物中存在相似的作用。此作用限制了传送给组织的活性氧的总剂量。因此,在每个受体中达到光敏剂的高浓度是很重要的。
发明内容
本发明的第一方面提供了一种制备含光敏剂的纳米颗粒的方法,所述纳米颗粒适用于光动力学治疗,该方法包括:
提供纳米颗粒前体分子;
将光敏剂偶联到所述纳米颗粒前体分子,从而产生结合光敏剂的纳米颗粒前体;并且
利用所述纳米颗粒前体的溶液沉淀或者自组装,由所述结合光敏剂的纳米颗粒前体形成纳米颗粒。
在一个特别优选的实施例中,本发明提供了一种制备含光敏剂的纳米颗粒的方法,所述纳米颗粒适用于分子成像辅助靶向光动力学治疗,该方法包括:
提供纳米颗粒前体分子;
将光敏剂与所述纳米颗粒前体分子偶联,从而提供结合光敏剂的纳米颗粒前体;
将磁和/或光对比剂加入到光敏剂纳米颗粒前体结合物中;并且
利用溶液沉淀或者分子自组装,由含磁和/或光对比剂的所述光敏剂-纳米颗粒前体混合物形成纳米颗粒。
在所述方法的一个优选实施例中,所述纳米颗粒是由选自由金属硫酸盐、金属磷酸盐、金属氧化物、壳聚糖、羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl Chitosan,CMC)、聚乙烯醇(Polyvinyl Alcohol,PVA)、聚苯乙烯(Polystyrene,PS)、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone, PVP)、聚乳酸(Polylactic Acid,PLA)、聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)、乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(Lactic-co-Glycolic Acid),PLGA)、聚己内酯(Polycaprolactone,PCL)、聚乙二醇(Polyethelene Glycole,PEG)、以及其组合所组成的组的材料形成。
在所述方法的另一个优选实施例中,所述金属氧化物是二氧化硅,所述前体分子是正硅酸酯,所述纳米颗粒的形成是通过用溶胶-凝胶法形成硅酸盐粉末,使硅酸盐粉末在碱性pH 值以及超声条件下的水解和缩合过程而形成胶体二氧化硅纳米颗粒。
在所述方法的又一个优选实施例中,所述光敏剂选自:二氢卟吩e6(Ce6)、间-四(3-羟基苯基)二氢卟吩(m-THPC)、苯并卟啉衍生物单酸环A(BPD或者维替泊芬(verteporfin))、卟吩姆钠(photofrin)、替莫泊芬(temoporfin)()、玫瑰红、金属酞菁、以及其组合。
本发明的另一个方面,提供了一种含光敏剂的纳米颗粒,所述含光敏剂的纳米颗粒可通过如上所述的根据本发明的方法获得。
本发明的另一个方面,提供了一种含光敏剂的纳米颗粒;所述纳米颗粒包含:光敏剂,该光敏剂通过至少一部分所述纳米颗粒共价键合到纳米颗粒基质材料上并以单体分子与聚集体分子混合物的形式并入纳米基质材料中,其中,所述纳米颗粒的Q带吸收与索雷氏带 (Soret band)吸收的比值在0.05和1.0之间。
在本发明各方面的一个优选实施例中,所述纳米颗粒是由选自金属硫酸盐、金属磷酸盐、金属氧化物、壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乳酸(PLA)、聚乙烯亚胺(PEI)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、以及其组合所组成的组的材料形成。
在本发明的一个特别优选的实施例中,所述纳米颗粒是由金属氧化物构成,优选地,所述金属氧化物是二氧化硅。
在根据本发明的纳米颗粒的又一个优选实施例中,所述光敏剂选自二氢卟吩e6(Ce6)、间-四(3-羟基苯基)二氢卟吩(m-THPC)、苯并卟啉衍生物单酸环A(BPD或者维替泊芬)、卟吩姆钠、替莫泊芬()、玫瑰红、金属酞菁、以及其组合。
在根据本发明的纳米颗粒的又一个优选实施例中,所述纳米颗粒用光对比剂和/或磁对比功能剂掺杂。
在又一个优选实施例中,光对比剂是用Mn、Cu-Al或Cu-卤素掺杂的ZnS的发光量子点。
在又一个优选实施例中,磁对比功能剂是通过用Gd3+、Fe3+或Mn2+掺杂纳米光药物而得到。
在又一个优选实施例中,所述纳米颗粒包含经共价键连接到最外层表面的癌症靶向配体。优选地,癌症-靶向配体是奥曲肽(octreotide)。
本发明的另一个方面,提供了一种可注射组合物或者用于口服的组合物,所述组合物包含如上所述根据本发明的纳米颗粒和药学上可接受的载体。
本发明的另一个方面,提供了一种利用光动力学治疗法杀死癌细胞的方法,该方法包括:使所述癌细胞与如上所述根据本发明的纳米颗粒接触,并用治疗有效量的光照射所述纳米颗粒,从而诱发所述纳米颗粒释放出单线态氧。
本发明的另一个方面,提供了一种利用成像辅助光动力学治疗法杀死癌细胞的方法;该方法包括:使所述癌细胞与如上所述根据本发明的纳米颗粒接触,并且用治疗有效量的光照射所述纳米颗粒,从而诱发所述纳米颗粒释放出单线态氧;其中所述纳米颗粒用光对比剂和 /或磁对比剂掺杂,所述照射的方向用成像技术来引导,其中所述光对比剂或磁对比剂被用作标记物,以指示癌细胞的位置、大小和扩散范围。
附图说明
图1示出了实施例1中所述实验的结果:基于二氧化硅的、大小为90-100nm的纳米光药物的透射电子显微照片;
图2示出了实施例1~3中所述实验的结果:基于二氢卟吩e6 @二氧化硅的纳米光药物的荧光激发光谱,表明与自由的光药物相比,由于特定的处理条件,NPM-1、NPM-2和NPM-3在654nm处的吸收系统地增加;
图3示出了实施例4中所述实验的结果:基于mTHPC@二氧化硅的纳米光药物的光致发光激发光谱,表明激发光谱完全改变,导致与自由mTHPC相比,基于mTHPC@二氧化硅的纳米光药物在红色吸收带的吸收增加约6倍;
图4示出了实施例5中所述实验的结果:将纳米光药物的光降解性质与具有几乎相同的初始荧光强度的自由二氢卟吩e6进行比较。由于光敏作用期间产生的单线态氧,自由Ce6显示出非常快速的光漂白性质,而NPM即使在10J的照射后仍显示出完全不同的非线性漂白特征,从而导致药物的光稳定性延长;
图5示出了实施例6中所述实验的结果:在激光照射(405nm,30秒,左图)下,自由二氢卟吩e6在癌细胞内快速光漂白的共聚焦显微图像,而在纳米光药物处理的细胞中,即使在延长照射(360秒,右图)后仍然显示药物的光活性;
图6示出了实施例7中所述实验的结果:(a)X-射线衍射,(b)光致发光(Photoluminescence,PL)光谱,和(c)照片,表明ZnS:Mn掺杂的量子点的纳米光药物的荧光发射;
图7示出了实施例10中所述实验的结果:振动样品磁强计数据,表明Gd3+掺杂的纳米光药物的顺磁性,与自由光药物(Ce6)的抗磁性相比,Gd3+掺杂的纳米光药物适合于磁共振成像;
图8示出了实施例10中所述实验的结果:参照水和自由Ce6,不同浓度的纳米光药物 (Nanophotomedicine,NPM)的磁共振虚拟图像;
图9示出了实施例11中所述实验的结果:共聚焦显微图像,表明sst2受体+ve癌细胞 (K562)对肽结合的纳米光药物的高效的细胞内摄取;
图10示出了实施例11中所述实验的结果:癌细胞的光动力学治疗数据,表明与相同浓度的自由二氢卟吩e6和对照纳米颗粒相比,用纳米光药物处理K562细胞中细胞死亡增加(低细胞存活率)。图10表明基于在654nm处的吸收,NPM的光动力学治疗效果更好。
具体实施方式
定义
本文中所用的术语“纳米颗粒”是指大小为约20~500nm、优选地50~200nm、最优选地为约100nm的微晶或者原始颗粒。该纳米颗粒可以是有机或无机的纳米颗粒,包括高分子纳米颗粒。该颗粒可制成干粉或液体分散体的形式。一般而言,具有较高附加值产品形式的纳米颗粒,需要进一步处理以形成浆体、薄膜或者器件。在本发明中,用作器件是可预见的。纳米颗粒可以是实心的或者多孔的,并且可以包括被一个或多个连续或准连续的壳所包围的内核,或者可以包括单个整体的颗粒。核和壳都可以是有机、无机或者高分子的。合适的用于制备纳米颗粒的纳米微粒材料是简单的金属氧化物,诸如氧化硅(SiO2)、氧化钛(TiO2)、氧化铝(Al2O3)、氧化铁(Fe3O4、Fe2O3)、氧化锌(ZnO)、氧化铈(CeO2)和氧化锆(ZrO2)。混合氧化物也是合适的,诸如氧化铟锡(In2O3-SnO2或者ITO(Indium-Tin Oxide))和氧化锑锡(Antimony-Tin Oxide,ATO)、硅酸盐(硅酸铝和硅酸锆)、以及钛酸盐(钛酸钡(BaTiO3))。其它类型的纳米颗粒,包括各种复合氧化物、半导体、非氧化物陶瓷(例如,碳化钨),以及金属也适用于某些实施例中。除半导电的氧化物之外,诸如TiO2和 ITO,半导体纳米晶(经常称为“量子点”)。用于制备纳米颗粒的其它技术包括树枝状大分子(高度支化的合成聚合物)或者其他聚合物的使用。通常将光敏剂联接到树枝状大分子的表面或者置于树枝状大分子内部的空隙中,从而实现靶位定向和可控传输、或者靶向与检测的组合。该纳米颗粒可合适地利用胶体合成法合成,并且可采用胶晶的形式。合适的纳米颗粒前体包括可聚合的单体,优选地,该单体具有2个,优选地大于2个,如3、4或5个用于分子间键合的位置,以便形成互相连接的网状前体,该网状前体聚集形成纳米颗粒。
本文中所用的术语“纳米载体器件”是指所发明的纳米颗粒形式的组合物,其中所述颗粒起到诸如光敏剂、以及可选择的成像剂和靶向配体等化合物载体的作用。
本文中所用的术语“光敏剂”是指如二氢卟吩e6(Ce6)、m-THPC等化合物。
本文中所用的术语“纳米光药物”是指与纳米颗粒复合的光敏剂。
本文中所用的术语“掺杂的纳米光药物”是指用磁共振对比剂和/或光对比剂掺杂的纳米光药物。
本文中所用的术语“掺杂的”表示有意地将少量(大约1-15%)的另一种物质(在这里,指光对比剂和/或磁对比剂)加入纳米颗粒晶体中。
本文中所用的术语“纳米光药物结合物”是指与靶向配体结合的纳米光药物。
本文中所用的术语“掺杂的纳米光药物结合物”是指与靶向配体结合并用磁共振(MR) 对比剂和/或光对比剂掺杂的掺杂纳米光药物。
本发明人已发现了一种提高光动力学治疗效果的纳米光药物制剂。所发明的纳米光药物制剂包括:基于金属硫酸盐、金属磷酸盐、金属氧化物的纳晶的纳米颗粒,或者基于壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乳酸(PLA)、聚乙烯亚胺(PEI)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、或其它合适的聚合物、以及其组合的纳米颗粒;例如:具有金属氧化物核和聚合物壳的颗粒、或者具有金属氧化物壳的聚合物核、或者上述的任意其它组合,包括陶瓷构造的核或壳,其中,所述纳米颗粒,或者其壳或核,是用光敏剂分子掺杂,并且其中,所述光敏剂分子以准聚集状态分散于所述纳米颗粒材料中。
本文中所用的术语“准聚集状态”表示光敏剂存在于纳米载体(纳米颗粒)中的聚集程度不同,亦即,既有聚集体的形式也有自由光敏剂(单体单元)的形式。
在本发明中,纳米颗粒内的光敏剂的独特状态是半(准)聚集状态。这种状态可以定义为,与光敏剂在紫外-可见光谱的Soret带中的吸收相比,光敏剂在Q带区域的吸收增加。更具体地,(稳定的)半聚集状态的Q带吸收与Soret带吸收的比值(Q/S)优选地为≥0.05至 1。
Soret带是任何光敏剂以单体形式存在时的主要吸收,但是Soret带处于蓝色区域内,蓝色区域对组织的穿透性低。Q带是红色-近红外区域(具有更好的组织穿透性)的伴随带,但是光敏剂在该区域的吸收性较低。通常,各单体的Q/S值约为0.05。
在本发明中,通过控制光敏剂分子与纳米颗粒基质的胺化程度(连接程度)获得了较高的Q带吸收。例如,正如下面实施例中更详细的说明,NPM-1的胺化程度低于NPM-2,而NPM-2的胺化程度低于NPM-3。如这些具体的NPM的实例中所示,根据氨基丙基三乙氧基硅烷(Aminopropyl Triethoxysilane,APTS)和正硅酸四乙酯(Tetraethyl Orthosilicate,TEOS) 的浓度以及其它反应参数,可以通过控制Ce6中羧基胺化的程度获得NPM在Q-带654nm 处不同的吸收水平(参见图2,NPM1-2和3是指在654nm处不同程度的吸收)。例如,NPM-1 的Q/S值约为0.3的,NPM-2的Q/S值约为0.5,NPM-3的Q/S值约为0.7,NPM-4的Q/S 值约为1(最大值,其中Q带吸收被最大化)。
因此,本发明涉及包含光敏药物的金属硫酸盐、金属磷酸盐或(优选地)金属氧化物或者高分子纳米颗粒的纳米颗粒,所述纳米颗粒的Q/S值至少为0.05、更优选地至少为0.1、更优选地至少为0.3。这个值与谱峰最大值无关(Q带的最大值是在大约600-900nm之间的某处,S带的最大值是在350-500nm之间的某处)。
本发明人已发现,与别的纳米粒子相比,这种纳米颗粒提供高度改善的光稳定性。
在优选实施例中,所述纳米晶体是无毒性的,并且可适当地发光。这为将针对癌症的靶向配体优选地连接到此复合结构的外表面作好了准备。
在本发明的另一个实施例中,此光敏剂-纳米颗粒-靶向配体结合物尤其克服了现有技术中的如下问题:(1)光敏剂的聚集/亲脂性;(2)每个靶向配体的光敏剂浓度低;(3)光敏剂在可见光谱红色区域内的吸收性低;(4)光敏剂的非特异性累积、(5)光敏剂分子在血液循环中的不可控聚集;(6)难以利用光敏剂自身的荧光性质测量剂量;以及(7)缺乏非侵入式分子成像引导的剂量测量和药物代谢动力学估计。
纳米颗粒结合物的表面化学是这样的:避免在生理环境中的聚集、结合物不被细胞内网系统隔离、以及对正常细胞的非特异性靶向最小化。也发现,可以将(非常)高浓度的光敏剂装载入纳米颗粒中而形成准聚集状态。纳米颗粒内的光敏剂的量是合适的。
不同于聚集状态的自由光敏剂,处于准聚集状态的光敏剂分子高效率地吸收光,从而高效率地产生活性氧簇。此结果是出乎意料的,可以用光敏剂在纳米颗粒内的特定构像来解释。
不希望受到理论的约束,认为纳米颗粒内的光敏作用的过程导致药物的可控原位单体化,由此在延长的时段内可控地释放出单线态氧。
除纳米颗粒结合物的光动力学组分以外,本发明的组合物还可以额外地将光对比剂加入纳米颗粒(的核或壳)中。合适的光对比剂包括:发光标记物,例如ZnS:Mn2+量子点;荧光标记物,例如吲哚菁绿(Indocyanine Green,ICG);及光学染料,例如亚甲蓝(MethyleneBlue,MB)。这些标记物使光学图像引导的局部药物传输成为可能,光学图像引导的局部药物传输可显著提高对某些形式癌症的疗效。基于掺杂纳米颗粒的总重量,纳米颗粒中合适的光对比剂含量为约0.0001~15wt%、优选为0.0005~5wt%。
除了纳米颗粒结合物的光动力学成分以外,本发明组合物还可以额外地将磁对比剂加入纳米颗粒(的核或壳)中。这使得磁共振成像成为可能。在临床应用中,用磁共振成像来确定结合物的系统药物代谢动力学参数具有明显的优势,光的穿透性决定了不能用光来测定。基于掺杂纳米颗粒的总重量,合适的磁对比剂含量约0.0001~15wt%、优选为0.0005~5wt%。
如上所述,本发明显著改善了光敏药物和光动力学治疗当前的诸多局限。这些改善是由于所述纳米光药物制剂的特定性质所致。与常规的自由药物相比,这种新纳米制剂的主要优点之一是,光敏分子以准聚集方式(一种介于单体分子和聚集体分子之间的状态,即其中单体分子和聚集体分子共存)与载体器件复合。一般而言,在溶液或粉末的形式下,由于范德华力之类的分子间吸引力,使得单个(单体)光敏染料分子易于发生聚集。这种聚集是有效应用光动力学治疗的一个关键障碍,因为在分子的聚集状态下,该药物的荧光效力和单线态氧的产率显著降低。
光敏药物的聚集是由分子间相互作用的程度所决定的,因此光敏药物的聚集是分子在溶剂介质中的浓度的函数。光动力学治疗中所使用的大部分光药物本质上是疏水性的,因此在生理条件下易于发生聚集。因此,当使用自由药物时,为维持光分子在循环中的单体状态,通常只能用非常低的浓度。另一方面,药物完全的单体形式还具有对穿透组织的红色光的吸收性低的缺点。此外,单体单元经历快速的光漂白,由于光分子浓度下降至低于有效水平,导致治疗的提前结束。
现在已发现,可以实现完全单体化和聚集之间的折中,由此改善并延长光动力学治疗的应用。
因此,本发明提供了使光药物分子向纳米载体器件基质(纳米颗粒基质)的可控复合。可控复合通过以下方式实现:提供具有官能团的纳米载体器件,所述纳米载体器件可以共价连接作为单体单元的单个光药物分子和准聚集簇,使得单体单元和被纳米颗粒基质中的官能团所分离的聚集簇共存。实现此目的一个合适方式是:由结合光敏剂的纳米颗粒前体制备纳米颗粒。如此方法得到的结构中,单体单元在激光照射时开始释放单线态氧簇,部分单线态氧活泼地分解光药物分子的准聚集聚合体,从而增加新的单体单元。因此,将为长时间的激光治疗连续地提供光活性的单体单元。最重要地,本发明的纳米颗粒制剂在固体状态(粉末形式)下或者在水性/生物化学介质中生理化学稳定,因此在生理条件下光物理性质基本上保持不变。这具有如下优点:不存在药物在血液中聚集和与之相关的药物的药物代谢动力学问题。
本发明的另一个优点是:纳米光药物的独特构造和光药物的复合可显著提高光药物在可见光谱的红色和近红外区(在此区域光辐射的组织穿透性更高)的光吸收。此性质对于提高光治疗的疗效非常重要,因为与电磁光谱的紫外区域或蓝色区域(Soret谱带)相比,大部分的自由光药物分子在红色区域(即,Q带)吸收最小。这限制了自由光药物的使用,因为需要利用具有高组织穿透性的光辐射(如红色光)对整个肿瘤内部区域的药物进行光敏化。因此,需要改善光药物在红色区域(即Q-带)的吸收性质。因此,本发明提供了一种在Q带的光吸收显著较高的,是在Soret谱带吸收的许多倍的光药物纳米制剂。这种吸收性质的改善是所述纳米制剂所特有的,吸收性质的改善是通过准聚集药物分子与纳米载体器件的可控超分子相互作用而实现的。
本发明的又一个重要特征涉及纳米载体器件内的光药物的较高稳定性,光药物的较高稳定性可延长细胞毒性单线态氧的释放。一般而言,单体自由光药物,特别是亲水性分子(如二氢卟吩e6),由于受分子自身所产生的单线态氧的攻击而发生快速光漂白。这使得在病体部位难以获得充分浓度的光药物,因而限制了在破坏癌症中的药物疗效。为使分子对光漂白稳定而对分子进行的直接修饰,会影响单线态氧产生的量子产率,是不可取的。因此,重要的是制备保持单线态氧的产率同时发生较少光漂白的光药物制剂。
因此,本发明提供了一种纳米光药物制剂,其中药物的单体单元没有暴露在全激光的漂白作用下。相反,作为单体单元与准聚集单元的稳定的混合物,光药物与纳米载体基质复合到一起,如此,在激光照射时,由单体产生的单线态氧使准聚集单元解聚集,以致连续地提供毒性浓度的单线态氧,即使是在长时间照射和/或高光剂量下。
本发明某些实施例的又一个优点是:在实施光治疗之前或实施光治疗期间,纳米光药物能够提供病体部位的磁和光对比成像。成像引导的放射治疗是临床实践中的新兴领域,其中对癌症的精确位置、大小和扩散范围(血管生成/转移)进行检测并用来指导放射治疗。这是通过,在治疗前和治疗期间,使药物在体内的实际成像坐标(通过计算机断层扫描或磁共振成像显示出)与照射治疗计划一致而实现。这种成像辅助光治疗在有效控制癌症方面具有很大优势。因此,能够提供具有荧光标记物和/或磁对比剂的本发明的纳米光药物,并且使用由此掺杂的纳米光药物连同治疗剂是本发明的一个重要方面。
在本发明各方面的又一个实施例中,给纳米光药物结构提供特异性地靶向病体部位(如癌症)的性质。这可以通过给纳米光药物表面提供靶向部分(如受体-配体)而实现。这有助于实现癌症的靶向光动力学治疗。基于纳米颗粒的总重量,靶向配体合适的含量为大约 0.00001~1wt%。
为了证明这个概念,本发明人已制备了包含光敏剂、纳米颗粒和靶向配体的纳米光药物。选择间-四羟基苯基二氢卟吩(m-THPC/Foscan)和二氢卟吩e6(Ce6)作为光敏药物,选择纳米微粒的二氧化硅作为纳米颗粒,选择奥曲肽作为靶向配体。奥曲肽是合成的生长抑素类似物。许多神经内分泌肿瘤和(活化的)免疫细胞都表达高密度的生长抑素受体(sst)。本领域技术人员明白可以改变对光敏剂、纳米颗粒和靶向配体的选择。为证实该方法的有效性,在实验室阶段,本发明人已将用如此方法制备的靶向纳米光药物应用于各种水性介质和体外 sst阳性(K562细胞,人类骨髓细胞系)以及野生型细胞中。以下实施例中所述的,结合物的体外吸收和激发光谱、单线态氧量子产率数据和细胞增殖测定证实了这些纳米光药物表现出所期望的疗效。重要的是注意到本发明人设想可以采用相似的方法来靶向其它受体,并且对光敏剂和纳米颗粒的选择并不挑剔。
本发明提供了一种新型的纳米光药物,该药物能够在体内靶向癌细胞、利用双模荧光和磁共振成像来增强肿瘤对比度、以及在可见光照射下通过可控传输的活性氧簇来破坏癌细胞。
本发明的一个特征是将光敏剂以期望的准聚集方式与纳米颗粒结合,以及发现这改变了光敏剂的物理化学性质,使得光敏剂适用于有效的靶向光动力学治疗。此结合可产生准聚集状态的光敏剂。与自由非结合药物相比,该准聚集状态的光敏剂能更好地吸收穿透组织波长的光,以及在光照射时,容许可控地释放活性氧簇,这个发现是出乎预料的。本发明的治疗组合物可以与靶向配体和磁对比功能剂相结合,这样可以支持成像辅助光动力学治疗的应用,这是本发明的一个特殊的优势。
制备本发明纳米光药物的方法
根据纳米颗粒的类型、以及光敏剂和纳米颗粒基质(用于制备纳米颗粒的材料)的化学性质,本发明的纳米光药物可以采用许多不同方式来制备。
至关重要的是,光敏剂以准聚集状态与纳米颗粒相结合。正如本文中所示,可以通过在低温(例如20-80℃)下使前体材料从溶液中沉淀成为纳晶或者通过高温(热)处理而获得合适的纳米颗粒。优选地,通过从溶液或者胶体中沉淀获得纳米颗粒。在合适的条件下发生沉淀形成纳米颗粒的合适的前体材料包括但不限于:金属硫化物、金属磷酸盐和金属氧化物、以及其组合,诸如硅酸盐和磷酸钙。一种特别优选的方法是本领域已知的用于制备胶体二氧化硅颗粒的方法。颗粒可以是无定形结晶或者完全晶化。金属硫化物、金属磷酸盐和/或金属氧化物颗粒可以单纯地使用或者覆盖或结合高分子材料形成陶瓷使用。本发明的纳米颗粒掺杂有光敏剂、发光材料和磁性材料,优选地是在形成颗粒期间包含进去。
优选地,光敏剂以共价键与纳米颗粒相结合。因此,制备二氧化硅纳米颗粒的话,适当地(并且优选地)制备硅酸盐反应性的光敏剂。硅烷偶联剂非常适于用作光敏剂与硅酸盐之间的交联剂。氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)非常适于用作与硅酸盐反应的化合物,以产生具有胺官能团的硅酸盐。
在纳米颗粒是硅酸盐的一个实施例中,制备本发明纳米光药物的方法中的一个步骤是提供氨反应性光敏剂。为了达到此目的,通常在溶剂DMSO中,使光敏剂与摩尔数过量的碳二亚胺(如EDC(EDAC))反应,优选在丁二酰亚胺(如磺基NHS)存在下,适当地活化含羧基的光敏剂(每个Ce6分子具有三个羧基)。在此反应中,使光敏剂上的羧基活化,生成氨反应性中间体,如氨反应性磺基-NHS酯类。合适地,活化反应容许进行约为1~10小时,通常约为4小时,而产生氨反应性光敏剂。可选地,利用凝胶过滤法对该产物进行纯化。
在这种实施例中制备的第二步骤合适地是使氨反应性光敏剂与氨基丙基三乙氧基硅烷 (APTS)反应而产生硅酸盐反应性光敏剂(官能化的光敏剂)。合适地,此偶联反应在暗处、室温下进行3~4小时。由此步骤所形成的化合物的一个例子是Ce6-APTS。
在下一个步骤中,使硅酸盐反应性光敏剂,例如Ce6-APTS,与用于利用溶胶-凝胶法合成纳米结构二氧化硅粉末的正硅酸酯前体物,诸如正硅酸四乙酯(四乙氧基硅烷,TEOS) 和正硅酸四甲酯(Tetramethyl Orthosilicate,TMOS)(四甲氧基硅烷)反应,而产生结合光敏剂的正硅酸酯(例如Ce6-TEOS或者Ce6-TMOS)。适合地,此结合反应在99%乙醇中进行 2~3小时。结合光敏剂的正硅酸酯形成纳米颗粒器件的前体,其中埋入硅烷偶联的准聚集光敏剂,而形成本发明的纳米光药物。通过在溶胶-凝胶反应中使用这些结合光敏剂的正硅酸酯前体而获得本发明的纳米颗粒。
溶胶-凝胶反应中的初始阶段涉及正硅酸酯前体的专一性水解,以及水解产物的缩合而形成小(3~4个硅)颗粒,该小颗粒聚集而形成较大的胶体氧化硅颗粒,较大胶体氧化硅颗粒可最终缩合而形成硅胶。然而,优选地这后一阶段不是本发明方法的一部分。该颗粒具有大约90~100nm的最终尺寸,并且在缺酸的条件下通常不缩合形成凝胶。结合光敏剂的正硅酸酯前体(例如结合Ce6-的TEOS和/或TMOS前体)的水解和缩合产生纳米大小的氧化硅粉末,其中光敏剂共价键合在氧化硅基质上。
通过向乙醇介质中加入少量的水和强碱,如NH4O4或其它胺源或者NaOH,可实现结合 Ce6的TEOS和/或TMOS前体在水溶液中的水解。接着,对此水溶液进行超声波处理,例如以2分钟为间隔进行10分钟的超声波处理,超声波处理导致与氧化硅基质复合的准聚集光敏剂的纳米颗粒沉淀。然后,可通过离心将如此沉淀出的纳米光药物颗粒从水性介质(通常是乙醇/水/胺的混合物)中分离出来,并且可选地,用水清洗并再分散于PBS或水中。
尽管在上述实施例中,原则上APTS改性的硅酸盐前体可以与氨反应性光敏剂发生反应,但优选的是使偶联APTS的光敏剂与硅酸盐前体反应,因为这导致光敏剂以更有利的准聚集的状态并入生长中的纳米颗粒中。
因此,优选地,给光敏剂提供与纳米颗粒前体共价连接的官能团,从而产生官能化的光敏剂。本领域技术人员对于使分子(如光敏剂)与纳米颗粒前体结合的可能性是熟知的。这些技术一般包括将氨基-、硅烷-、巯基-、羟基-和/或环氧基官能团引入光敏剂,以及随后将光敏剂与纳米颗粒前体结合,可选地使用交联剂。当更一般地提及光敏剂的氨基烷基硅烷化的这种实施例时,制备与根据本发明一个实施例的纳米颗粒前体共价结合的官能化光敏剂的方法,也可描述成使用起连接剂作用的双官能单体,将光敏剂与纳米颗粒前体物相连接。
非常合适地,双官能单体可具有两种不同的化学官能团,以便一种官能团能够与纳米颗粒前体反应,而另一种官能团能够与光敏剂的官能化基团反应。
在如下条件下,将官能化的光敏剂与纳米颗粒前体混合在溶液或悬浮液中:(i)容许光敏剂以共价键与纳米颗粒前体共价连接从而形成结合光敏剂的纳米颗粒前体,以及(ii)能够经由所述纳米颗粒前体的分子间连接形成纳米颗粒前体复合物,所述纳米颗粒前体复合物聚集并通过随后的缩合和聚集步骤而形成纳米颗粒。优选地,步骤(i)可在步骤(ii)之前发生。这导致光敏剂以准聚集状态与纳米颗粒结合。
另外,在制备结合光敏剂的纳米颗粒期间或之后,可用发光标记物和/或磁对比标记物掺杂结合光敏剂的纳米颗粒。优选地以如下所述方式实施该结合步骤。
发光量子点-掺杂的纳米光药物
用发光材料掺杂纳米颗粒的方法通常是按如下方式实施。首先,以如上所述方法制备结合光敏剂的纳米颗粒前体。在此前体的水解和缩合期间,通过将标记物添加至水解和缩合溶液中,而将发光标记物掺杂入纳米基质中。然后,施加条件以通过所述纳米颗粒前体的分子间缩合形成纳米颗粒前体复合物,且所述纳米颗粒前体复合物聚集以形成纳米颗粒。在正硅酸酯前体的情况下,这些包括提供例如1~5%的NH4O4。适当量的发光标记物是例如在沉淀溶液中的0.01μM ZnS:Mn2+。10分钟的超声波处理导致与准聚集的Ce6和ZnS:Mn2+量子点 (仍然埋在纳米颗粒基质内)复合的二氧化硅纳米颗粒发生沉淀。通过离心将沉淀出的掺杂纳米光药物从介质中分离出来,并且优选地清洗并储存在PBS中。就本发明纳米光药物的给药而言,优选将该器件悬浮于PBS中。
掺杂磁对比剂的纳米光药物
用磁对比剂掺杂纳米颗粒的方法与上述发光标记物的方法基本相同。首先,以如上所述方法制备结合光敏剂的纳米颗粒前体。将磁对比剂的前体例如0.001~10%Gd3+(GdNO3)或 0.001~10%(Mn2+)MnCl2或0.001~10%Fe3+(FeCl3)加入至形成纳米颗粒的水解和缩合溶液中。例如,在适当的条件下,使用硝酸钆导致与准聚集光敏剂结合并掺杂有Gd3+(仍然埋在纳米颗粒基质非晶相内)的纳米颗粒的沉淀。通过离心将沉淀出的纳米颗粒从介质中分离出,并且优选地在使用前对纳米颗粒进行清洗。
本发明的应用
靶向治疗是药物的中心目的,对靶向治疗部位周围正常组织的损伤最小化是非常重要的。实际上,光动力学治疗可以应用于体内的任何部位。虽然,光照后,光动力学治疗会引起系统免疫反应,但活性氧簇的作用半径远远小于单个细胞的半径。实际上,光敏剂结合物没有暗毒性,因此局部选择性(在光照范围内)提供显著的机会。没有细胞或组织对高浓度活性氧簇有抵抗力或者是已经表现出形成抵抗力。本发明可以克服现有技术靶向光动力学治疗的许多显著缺点。现有技术中的缺点是:光敏剂结合物具有有限的生物药效率、非特异性摄取、以及每个靶向配体产生活性氧簇的能力有限。如本文中所述,利用sst2表达细胞来证明本发明方法的原理。本发明可以用来靶向其他受体并且可以用于其他光敏剂。癌症的分子靶体是分布广泛的并且对不同肿瘤类型具有特异性。有明显的理由应对乳腺、前列腺、肺、大脑肿瘤以及消化道癌症的靶向光动力学治疗受体进行研究。也可以对其他非恶性疾病进行靶向。例如,类风湿关节炎患者的患病关节中的免疫细胞活化后会表达高密度的生长抑素 (Somatostatin,SS)受体(sst)。靶向光动力学治疗可以是治疗此疾病(类风湿关节炎)的理想候选方法。
现在,将通过以下非限制性实施例来更详细地说明本发明。
实施例
以下各实施例描述了制备纳米光药物(NPM)的方法,将两个独立的具有代表性的光敏剂(即二氢卟吩e6(Ce6)或mTHPC)以适当的准聚集状态共价地埋入纳米尺寸(50~150nm) 的二氧化硅或壳聚糖的载体器件内,最终结构具有期望的在Q-带(红色-近红外)区域(在该光谱范围内,光的组织穿透性较好)的光吸收性质。在各实施例中描述了:用适用于光成像的第二成分荧光量子点以及适用于磁共振对比成像的第三成分顺磁离子掺杂这些纳米光药物从而形成掺杂的纳米光药物和/或与活性癌症靶向肽配体结合从而形成(掺杂的)纳米光药物结合物、新型光漂白特征、到癌细胞的传输、以及使用所述纳米光药物的光动力学治疗。
用于制备纳米光药物的试剂包括:正硅酸四乙酯(TEOS,Sigma 98%)或正硅酸四甲酯 (TMOS)、氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS,Sigma 98%)、氨水(25%溶液,SigmaAldrich), 1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDAC或EDC)、N-羟基磺基丁二酰亚胺(磺基 -NHS)、N,N'-二丁二酰亚胺基碳酸酯(DSC,Sigma,98%)、乙醇(99%,Sigma)、2-(N- 吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲液(Sigma)、磷酸盐缓冲的盐水(PBS)、二氢卟吩e6、间-四羟基苯基二氢卟吩(mTHPC)、ZnS:Mn量子点(QD)、硝酸钆(Gd3+)(99%,Sigma)、和二甲基亚砜(DMSO,Sigma),所有试剂都是分析纯级,使用时没有进一步纯化。
在该合成方法中,不同于现有技术(美国第7364754号专利),我们使用了无表面活性剂的非胶束介质,该介质含有简单、低成本的乙醇或DMSO与水均相混溶的溶剂体系。
实施例1:用Ce6作为光敏剂制备纳米光药物NPM-1
在此实施例中介绍了基于光敏剂二氢卟吩e6(Ce6)的纳米光药物(即,NPM-1)的制备,该纳米光药物的最终结构在Q带(654nm)区域的光吸收度是自由Ce6的大约3倍。
在5ml的99%DMSO中,1μM浓度的Ce6(市售,购自例如Porphyrin Products(洛根,犹他州))与10~15倍摩尔过量的EDAC和10~15摩尔过量的磺基-NHS反应。反应4小时后,利用凝胶过滤法对结合产物进行纯化,得到氨反应性光敏剂,该氨反应性光敏剂进一步与200μL的硅烷偶联剂APTS反应。偶联反应在暗处、室温下进行3~4小时,得到化合物Ce6-APTS。在下一步骤中,在10ml的99%乙醇介质中,Ce6-APTS与600μL(大约600mg) 的TEOS或TMOS反应2~3小时,形成硅烷偶联的准聚集光敏剂的前体。加入3ml的水和600μL NH4O4,以2分钟为间隔,进行10分钟超声波处理,对此前体进行水解,产生与氧化硅基质复合的准聚集Ce6的纳米颗粒的沉淀。通过离心(6000rpm,5分钟)将沉淀出的NPM-1从溶剂介质中分离出,用蒸馏水清洗后,再分散入PBS。
透射电子显微镜照片(图1)显示形成了大小为90~100nm的均匀球状纳米颗粒。NPM-1 的荧光激发光谱(图2)显示在654nm处的光吸收对应于导致单线态氧产生的三重态电子跃迁,和/或该结构的荧光强度是自由光敏剂荧光强度的大约3倍。这表明,纳米光药物结构内的光敏剂不再是自由形式,而是利用由氨基丙基硅烷基所提供酰胺键而共价连接的复合统一体。
实施例2:具有Ce6作为光敏剂的纳米光药物NPM-2的特征
在此实施例中,说明了Q带光吸收比自由Ce6增加大约4倍的纳米光药物(NPM-2)的工艺。
在5ml的99%乙醇中,1μM浓度的Ce6与10~15倍摩尔过量的EDAC和10~15摩尔过量的磺基-NHS反应。在反应约4小时后,利用凝胶过滤法对结合物进行纯化,得到氨反应性光敏剂,该光敏剂与300μL的硅烷偶联剂APTS反应。偶联反应在暗处、室温下进行 3~4小时,得到化合物Ce6-APTS。在下一个步骤中,在10ml的99%乙醇介质中,Ce6-APTS 与800μL的TEOS或TMOS反应3小时,生成NPM-2的前体。加入3ml的水和600μL的 NH4O4,以2分钟为间隔,进行15分钟超声波处理,对此前体进行水解,从而产生NPM-2 纳米光药物的沉淀,其中Ce6以较高的水平准聚集并且仍然通过酰胺键以共价键埋入于纳米颗粒基质内。通过离心将沉淀出的NPM-2颗粒从乙醇介质中分离出,并用蒸馏水清洗后再分散入PBS中。图2中所示NPM-2的荧光激发光谱显示,在654nm处的Q带吸收与自由药物相比增加了约4倍。Soret带区域内的吸收大体上保持不变。与自由光敏剂的情况相比, Q带的吸收增加可以导致在更深的组织深度处产生单线态氧。
实施例3:用Ce6作为光敏剂制备纳米光药物NPM-3
在又一个实施例中,说明了Q带区域的吸收比自由Ce6增加大约7倍的纳米光药物(NPM-3)的制备。
在5ml的99%乙醇中,1μM浓度的Ce6与10~15倍摩尔过量的EDAC和10~15摩尔过量的磺基-NHS反应。反应4小时后,利用凝胶过滤法对该结合产物进行纯化,得到氨反应性Ce6,氨反应性Ce6与600μL硅烷偶联剂APTS反应。偶联反应在暗处、室温下进行3~ 4小时,得到化合物Ce6-APTS。在下一个步骤中,在10ml的99%乙醇介质中,Ce6-APTS 与1000μL的TEOS或TMOS反应2~3小时,从而形成硅烷偶联的准聚集光药物的前体。加入3ml的水和800μLNH4O4,以2分钟为间隔,进行20分钟超声波处理,对此前体进行水解,导致与进一步准聚集的Ce6(仍然埋在纳米颗粒基质内)复合的NPM-3纳米颗粒发生沉淀。通过离心将沉淀出的NPM-3颗粒从乙醇介质中分离出来,用蒸馏水清洗后再分散入 PBS待用。
NPM-3的荧光激发光谱(图2)显示在654nm区域处更高的光吸收,比自由药物的光吸收高将近7倍,且大约是相同结构的Soret带吸收的75%。
本发明的重要成就是:利用化学修饰的程度来可控地增加纳米光药物的Q带吸收、以及最重要的使纳米载体器件内纳米光药物稳定。所述纳米载体器件保护光敏剂分子在水中、或 PBS中、或者由于血液中蛋白质的影响、或者在病体部位积聚后,不再进行任何进一步的不可控的聚集。因此,本发明克服了一个最大难题:从自由光敏剂中所观察到的光敏剂不可控聚集和光敏性的丧失。
实施例4:用mTHPC作为光敏剂制备纳米光药物NPM-4
在此实施例中,说明了用另一种重要的光敏剂mTHPC制备纳米光药物(NPM-4)。该产品显示光吸收性质从Soret带100%转移至在652nm处的Q带,同时保持其高荧光和光敏剂活性。
1μM浓度的氨反应性mTHPC与600μL硅烷偶联剂APTS在暗处反应24小时。24小时后,在10ml的99%乙醇介质中,mTHPC-APTS结合物与1000μL的TEOS或TMOS反应6小时,形成硅烷偶联的准聚集纳米光药物的前体(mTHPC)。加入6ml的水和800μL NaOH,以2分钟为间隔,进行20分钟超声波处理,对此前体进行水解,从而产生与准聚集 mTHPC复合的NPM-4纳米颗粒的沉淀。
如图3中所示,此产物显示与自由m-HPC完全不同的吸收/激发特征。发现在大约400nm 处的Soret带吸收完全消失,而光治疗所需重要的在Q带的吸收增加了70~80%。Q带吸收与自由光敏剂的Soret带吸收同样高,这导致光动力学治疗期间疗效的显著增加。此结构克服了自由光敏剂的主要缺点之一,亦即在光谱红色区域内的低吸收。
实施例5:纳米光药物NPM-3的离体光物理性质
在此实施例中,说明了在实施例3中所制备纳米光药物(NPM-3)的光物理性质。显示了,在光动力学治疗中,与自由药物相比该产物具有显著的改善。
药物的光稳定性对于疾病(如癌症)的长时间治疗是非常重要的。然而,光药物,特别是水溶性药物(如Ce6),经历非常快速的光降解,因为光药物受到药物自身产生的单线态氧的降解。由于药物在病体部位浓度不足,导致治疗提前结束。在此实施例中,显示纳米光药物如何克服此问题。
利用荧光光谱仪,对具有几乎相同的初始荧光强度(与药物浓度相关)的自由Ce6与纳米光药物(NPM-3)的光漂白特征进行了比较。两个产物的样品,在相同条件下(10J/cm2的总剂量),进行激光照射。图4示出了两个样品的荧光发射特征的变化。自由Ce6显示典型的快速漂白,从而导致在2.5J/cm2的较低光照强度下药物的失活,而NPM-3结构显示独特的非线性特征,以及埋入药物的光稳定性,即使在接受10J/cm2的光剂量照射后。NPM-3 的光漂白曲线显示包括药物荧光发射的增加和减少的多种状态。这揭示了埋入药物与光发生相互作用时空间多样化的本质(准聚集的),并且表明该药物的原位单体化以及之后的漂白重复发生。实际上,这导致药物结构内的长期稳定性,即使在延长治疗的时间后。
实施例6纳米光药物NPM-3的体内光物理性质
在此实施例中,对纳米光药物在癌细胞内的细胞内光稳定性进行了测试,并且与自由光敏剂的光稳定性进行了比较。
将白血病细胞K562以800.000个细胞/孔接种于12孔组织培养板中,并且用相同浓度的光敏剂制备的自由Ce6(1μM)和纳米光药物(NPM-3)进行处理。在利用共聚焦显微镜进行成像之前,将细胞在37℃下培养3小时。通过利用405nm激光激发被细胞摄入的光敏剂或纳米光药物,进行荧光成像。为了记录癌细胞的细胞内区域中的光漂白(与治疗效果具有显著相关性),在规定的激光照射周期(1~360秒)后进行成像。
图5a示出了用自由Ce6处理的细胞的共聚焦显微图像,其中发现该药物在激光照射30 秒后的区域中被完全漂白,而在图5b中用纳米光药物处理的细胞显示甚至高达360秒的稳定的荧光性。这就证实了如实施例5中所述观察到的光谱特征在生物细胞内(即在体内)也是存在的。纳米光药物的这种独特特征对于延长癌症光治疗时间是关键的,因为保持药物的荧光活性对于光治疗非常重要。
实施例7:发光量子点-掺杂的纳米光药物的制备
在此实施例中,说明了用ZnS:Mn2+的发光量子点掺杂的纳米光药物NPM-5的制备,从而形成掺杂的纳米光药物。
发光量子点对包括癌症在内的疾病的体内成像是有前途的候选者。然而,通常所使用的发光量子点组成中(CdS、CdSe、CdTe等)含有毒重金属镉。这就限制了该量子点以及用该量子点掺杂的纳米器件在人临床应用中的使用。相反,本发明使用完全无毒的、基于金属 (Cu或Al)或过渡金属(Mn)所掺杂的ZnS的、用于并入纳米光药物的量子点,该量子点可用于NPM的体内光学成像而不影响埋入的光敏剂的荧光和产生单线态氧的性质。
因此,在一个典型的制备中,在5ml的99%乙醇中,1μM Ce6与10~15倍摩尔过量的EDAC和10~15摩尔过量的磺基-NHS反应。反应2~4小时后,利用凝胶过滤法对结合的产物进行纯化,得到氨反应性“活化的”光敏剂,该光敏剂与600μL的硅烷偶联剂APTS 反应。在暗处、室温下反应3~4小时,得到化合物Ce6-APTS-1。3~4小时后,在10ml的 99%乙醇介质中,Ce6-APTS-1与1000μL的TEOS或TMOS反应2~3小时,从而形成硅烷偶联的准聚集的光敏剂的前体。量子点在此前体的水解和缩合期间掺杂进纳米基质中。加入 3ml含0.01μM ZnS:Mn2+量子点的水以及800μL NH4O4,进行10分钟超声波处理,对此前体进行水解和缩合,导致与准聚集的Ce6和ZnS:Mn2+量子点(仍然埋入纳米颗粒基质中)复合的二氧化硅的纳米颗粒的沉淀。通过离心将沉淀出的掺杂的纳米光药物从乙醇介质中分离出,用蒸馏水清洗后再分散于PBS中待用。
图6a示出了埋入纳米光药物内的ZnS量子点的X射线衍射图案,图6b和图6c示出了在600nm处的荧光发射光谱以及水分散样品的照片,水分散样品中,埋入的ZnS:Mn发射出橙色,从而证实了量子点成功掺杂入掺杂的纳米光药物内。
在掺杂的纳米光药物定位于靶组织之后,可利用光纤激发和发射器件而将来自量子点的荧光发射用于体内的癌症成像。这有助于改善光动力学剂量测量的现有方法,现有方法依赖于自由光敏剂的荧光性质。将量子点用于癌症检测和剂量测量,有助于在不使光敏剂发生光漂白(破坏)的情况下达到这些目的。
实施例8:钆(Gd3+)掺杂的纳米光药物的制备
在此实施例中,描述了用磁对比剂钆(Gd3+)掺杂的NPM-5的制备,从而形成掺杂的纳米光药物。
在5ml的99%乙醇中,1μM浓度的Ce6与10~15倍摩尔过量的EDAC和10~15摩尔过量的磺基-NHS反应。反应2~4小时后,利用凝胶过滤法对结合的产物进行纯化,得到氨反应性“活化的”光药物,该光药物与600μL的硅烷偶联剂APTS反应。反应在暗处、室温下进行3~4小时,得到化合物Ce6-APTS-1。3~4小时后,在10ml的99%乙醇介质中,使Ce6-APTS-1与1000μL的TEOS或TMOS反应2~3小时,从而形成硅烷偶联的准聚集的纳米光药物的前体。磁对比剂在此前体水解和缩合期间掺杂入纳米基质中。加入3ml含 0.01M硝酸钆的水,接着加入800μL NH4O4,进行10分钟超声波处理,使此前体水解和缩合,从而产生与准聚集Ce6复合且用Gd3+(仍然埋在纳米颗粒基质的非晶相中)掺杂的二氧化硅纳米颗粒的沉淀。通过离心将沉淀出的纳米颗粒从乙醇介质中分离出,用蒸馏水清洗后再分散入PBS。
使用振动样品磁强计进行的磁研究显示了与自由Ce6的抗磁反应相比,Gd3+掺杂的纳米光药物具有顺磁性质(图7)。此外,用1.5T临床磁共振,对在24孔板中用掺杂的纳米光药物处理过的一批大约80.000个癌细胞进行成像,显示此体系在磁共振成像中的适用性。图8 示出了用不同浓度的掺杂的纳米光药物处理过的细胞、以及对照细胞(未经处理的细胞)、和用自由Ce6处理过的细胞的T1加权对比成像。可以看出,随着纳米光药物浓度的增加对比度增加,从而证实本发明中所述的掺杂的纳米光药物可以用于基于磁共振成像的诊断以及光动力学治疗。这对预治疗计划、利用完全非侵入技术进行施用药物的药代动力学探究和治疗后的疗效分析具有重要意义。
实施例9:锰(Mn2+)-掺杂的纳米光药物的制备
在此实施例中,描述了用磁对比剂锰(Mn2+)掺杂的NPM-6的制备,从而形成掺杂的纳米光药物。
在5ml的99%乙醇中,1μM浓度的Ce6与10~15倍摩尔过量的EDAC和10~15摩尔过量的磺基-NHS反应。反应2~4小时后,利用凝胶过滤法对结合的产物进行纯化,得到氨反应性“活化的”光药物,该药物与600μL硅烷偶联剂APTS反应。反应在暗处、室温下进行3~4小时,得到化合物Ce6-APTS-1。3~4小时后,在10ml的99%乙醇介质中,使 Ce6-APTS-1与1000μL的TEOS或TMOS反应2~3小时,从而形成硅烷偶联的准聚集纳米光药物的前体。磁对比剂在此前体的水解和缩合期间掺杂入纳米基质中。加入3ml含0.01M 硫酸锰的水,接着加入800μL的NH4O4,进行10分钟超声处理,使此前体水解和缩合,从而导致与准聚集的Ce6复合且用Mn2+(仍然埋在纳米颗粒基质的非晶相内)掺杂的二氧化硅纳米颗粒的沉淀。通过离心将沉淀出的纳米颗粒从乙醇介质中分离出,用蒸馏水清洗后再分散入PBS。
实施例10:铁(Fe3+)掺杂的纳米光药物的制备
在此实施例中,描述了用磁对比剂铁(Fe3+)掺杂的NPM-5的制备,从而形成掺杂的纳米光药物。
在5ml的99%乙醇中,1μM浓度的Ce6与10~15倍摩尔过量的EDAC和10~15摩尔过量的磺基-NHS反应。反应2~4小时后,利用凝胶过滤法对结合的产物进行纯化,得到氨反应性“活化的”光药物,该光药物与600μL的硅烷偶联剂APTS反应。反应在暗处、室温下进行3~4小时,得到化合物Ce6-APTS-1。3~4小时后,在10ml的99%乙醇介质中,使Ce6-APTS-1与1000μL的TEOS或TMOS反应2-3小时,从而形成硅烷偶联的准聚集纳米光药物的前体。磁对比剂在此前体的水解和缩合期间掺杂入纳米基质中。加入3ml含0.01 M三氯化铁(FeC13)的水,接着加入800μL的NH4O4,进行10分钟的超声处理,使此前体水解和缩合,从而导致与准聚集Ce6复合且用Fe3+(仍然埋在纳米颗粒基质的非晶相内) 掺杂的二氧化硅的纳米颗粒的沉淀。通过离心将沉淀出的纳米颗粒从乙醇介质中分离出,用蒸馏水清洗后再分散入PBS。
使用振动样品磁强计进行的磁研究显示了与自由Ce6的抗磁反应相比,Gd3+掺杂的纳米光药物具有顺磁性(图7)。此外,通过使用1.5T临床磁共振成像对在24孔板中用掺杂的纳米光药物处理的一批大约80.000个癌细胞进行成像,而显示此体系在磁共振成像中的适用性。图8示出了用不同浓度的掺杂的纳米光药物处理过的细胞、以及对照细胞(未经处理的细胞)和用自由Ce6处理过的细胞的T1加权对比成像。可以看出,随着纳米光药物浓度的增加对比度增加,从而证实本发明中所述的掺杂的纳米光药物可以用于基于磁共振成像的诊断以及光动力学治疗。这对预治疗计划、利用完全非侵入式技术进行施用药物的药物代谢动力学探究和治疗后的疗效分析具有重要意义。
实施例11
在此实施例中,描述了将肽结合的纳米光药物传输到癌细胞、以及用红色激光(发射波长为652nm)使结合的纳米光药物敏化的光动力学治疗。
将白血病细胞K562以800.000个细胞/孔接种于96孔微量滴定板中,并用自由Ce6(1 μM)、具有与自由光敏剂相等浓度的光敏剂的纳米光药物(NPM-3)0.05mg/ml、和作为对照的裸露的二氧化硅纳米颗粒0.05mg/ml进行处理。在37℃下将细胞在5%CO2中培养3小时。接着,将未结合的自由光敏剂、纳米光药物和二氧化硅纳米颗粒从孔板中除去,并用新鲜介质清洗2次。
使用测试样品来研究肽结合的纳米光药物的细胞摄取。图9示出了癌细胞对结合的纳米光药物的明显的亚细胞摄取,从而证实了成功的药物传输。
随后,利用固态激光器进行光动力学治疗,该固体激光器发射652nm的相干光,该光通过光纤照射器耦合,固体激光器将均匀的激光功率传输给96孔板的所有孔上。用激光功率计测得的所施用的总光剂量是20J/cm2。在4000秒的时段内输送5mW量的激光功率,而获得20J/cm2的总剂量。
在光动力学治疗后,将细胞进一步培养72天,利用标准测定(罗氏细胞增殖试剂WST-1,罗氏诊断有限公司,曼海姆,德国(Roche Cell Proliferation Reagent WST-1,Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany))来评价处理过的细胞的细胞存活率和增殖能力,其中应用了甲臜晶体的光吸收(光密度)(480nm),甲臜晶体是由于这些细胞的代谢作用而在活细胞的线粒体内形成。因此,此试验提供了关于由于光动力学治疗法所造成细胞死亡/存活的直接信息。
图10示出了WST测定的结果。这些数据清楚地表明:与自由光敏剂相比,所有三种纳米光药物结构都显示具有较高的治疗效果(杀死癌细胞)。这证实了所述结构在光动力学治疗中的有利性质。
Claims (12)
1.一种含光敏剂的纳米颗粒的制备方法,其特征在于,所述纳米颗粒适用于分子成像辅助靶向光动力学治疗,所述方法包括:
(a)提供纳米颗粒基质前体分子;
(b)将光敏剂偶联到所述纳米颗粒基质前体分子,从而产生结合光敏剂的纳米颗粒基质前体,其中,硅烷偶联剂用作所述光敏剂和所述纳米颗粒基质前体分子之间的交联剂;
(c)可选地将磁和/或光对比剂加入所述光敏剂-纳米颗粒基质前体结合物中,从而产生光敏剂-纳米颗粒基质前体混合物;以及
(d)通过溶液沉淀或者分子自组装,由步骤(b)中所产生的所述结合光敏剂的纳米颗粒基质前体或由步骤(c)中所产生的所述光敏剂-纳米颗粒基质前体混合物形成纳米颗粒,
其中,所述纳米颗粒基质前体分子选自由硅酸盐、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、聚乙烯醇、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乳酸、聚乙烯亚胺、乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚乙二醇、以及其组合所组成的组;以及
其中,所述光敏剂选自:二氢卟吩e6、间-四(3-羟基苯基)二氢卟吩、苯并卟啉衍生物单酸环A、卟吩姆钠、玫瑰红、金属酞菁、以及其组合。
2.一种含光敏剂的纳米颗粒,其特征在于,所述纳米颗粒通过根据权利要求1所述的方法获得。
3.一种通过根据权利要求1所述的方法获得的含光敏剂的纳米颗粒,其特征在于,所述纳米颗粒包括:光敏剂,所述光敏剂通过至少一部分所述纳米颗粒共价键合到纳米颗粒基质材料上,并以单体分子与聚集体分子混合物的形式并入所述纳米颗粒基质材料中,其中,所述纳米颗粒的Q带吸收与索雷氏带吸收的比值至少为0.1,所述纳米颗粒基质由纳米颗粒基质前体分子形成,该纳米颗粒基质前体分子为选自由羧甲基壳聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙二醇、以及其组合所组成的组中的材料;
所述光敏剂选自:二氢卟吩e6、间-四(3-羟基苯基)二氢卟吩、苯并卟啉衍生物单酸环A、卟吩姆钠、玫瑰红、金属酞菁、以及其组合;且
其中,硅烷偶联剂用作所述光敏剂和所述纳米颗粒基质前体分子之间的交联剂。
4.根据权利要求2或3所述的纳米颗粒,其特征在于,所述纳米颗粒用光对比剂和/或磁对比功能剂掺杂。
5.根据权利要求4所述的纳米颗粒,其特征在于,所述光对比剂是用Mn2+、Cu+-Al3+或Cu+-卤素或其组合掺杂的ZnS的发光量子点。
6.根据权利要求4所述的纳米颗粒,其特征在于,所述磁对比功能剂是通过用Gd3+、Fe3+或Mn2+掺杂纳米光药物而得到。
7.根据权利要求2或3所述的纳米颗粒,其特征在于,所述纳米颗粒包含经共价键连接到最外层表面的癌症-靶向配体。
8.根据权利要求7所述的纳米颗粒,其特征在于,所述癌症-靶向配体是奥曲肽或奥曲肽酸或者它们的羧酸酯。
9.根据权利要求8所述的纳米颗粒,其特征在于,所述癌症-靶向配体是靶向于生长抑素2型受体的DTPA-Tyr3-奥曲肽、DOTA-Tyr3-奥曲肽、DTPA-Tyr3-奥曲肽酸或者DOTA-Tyr3-奥曲肽酸。
10.一种可注射组合物或者用于口服的组合物,其特征在于,所述组合物包含根据权利要求2至9中任一项所述的纳米颗粒以及药学上可接受的载体。
11.根据权利要求2至9中任一项所述的纳米颗粒在制备利用光动力学治疗法杀死癌细胞的方法中所用药品中的应用,其特征在于,所述方法包括:使所述癌细胞与根据权利要求2至9中任一项所述的纳米颗粒接触,并用治疗有效量的光照射所述纳米颗粒,从而诱发所述纳米颗粒释放出单线态氧。
12.根据权利要求2至9中任一项所述的纳米颗粒在制备利用成像辅助光动力学治疗法杀死癌细胞的方法中所用药品中的应用,其特征在于,所述方法包括:使所述癌细胞与根据权利要求2至9中任一项所述的纳米颗粒接触,并且用治疗有效量的光照射所述纳米颗粒,从而诱发所述纳米颗粒释放出单线态氧,其中所述纳米颗粒用光对比剂和/或磁对比剂掺杂,所述照射的方向用成像技术来引导,其中所述光或磁对比剂被用作标记物,以指示癌细胞的位置、大小和扩散范围。
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