CN115112781A - 一种定性定量分析皮肤角质层成分的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测分析技术领域，具体地，本发明涉及G01N1/28，更具体地，本发明涉及一种定性定量分析皮肤角质层成分的方法及其应用。定性定量分析皮肤角质层成分的方法，包括：皮肤使用贴膜进行取样后，将得到的取样贴膜置于提取瓶中使用提取溶剂进行超声提取1‑5min，提取液过滤后进行LCMS/MS分析；所述取样次数取样的次数大于等于1，定性定量分析皮肤角质层成分包括吡咯烷酮羧酸、尿刊酸和神经酰胺中一种或多种。本申请定性定量分析皮肤角质层成分的方法操作简单，使用范围广，同时不受皮肤状态的限制。
Description
技术领域
本发明涉及检测分析技术领域，具体地，本发明涉及G01N1/28，更具体地，本发明涉及一种定性定量分析皮肤角质层成分的方法及其应用。
背景技术
CN201610173275通过将化妆品样品进行离超声提取、过滤后采用离子迁移谱进行分析测定尿刊酸及其乙酯具有快速准确、灵敏度高，适用于化妆品的实际检验工作，然而其是对化妆品中的成分进行检测分析，取样较容易，采用该方法在对人体皮肤中化学物质进行检测分析时并不适用。CN201910811806通过对待测的血清进行高效液相色谱-串联质谱系统检测，其检测过程较为复杂，且同样不适用于对皮肤直接取样检测。
发明内容
针对现有技术中存在的一些问题，本发明第一个方面提供了一种定性定量分析皮肤角质层成分的方法，包括：皮肤使用贴膜进行取样后，将得到的取样贴膜置于提取瓶中使用提取溶剂进行超声提取1-5min，提取液过滤后进行LCMS/MS分析；所述取样的次数大于等于1，定性定量分析皮肤角质层成分包括吡咯烷酮羧酸、尿刊酸和神经酰胺中一种或多种。
在一种实施方式中，当定性定量分析皮肤角质层成分包括吡咯烷酮羧酸和/或尿刊酸时，所述取样的次数为1或2。
在一种实施方式中，当定性定量分析皮肤角质层成分包括神经酰胺时，所述取样的次数大于等于2，优选为2。
在一种实施方式中，当取样的次数为2时，所述定性定量分析皮肤角质层成分的方法包括：皮肤使用贴膜在同一位置进行连续2次取样后，将得到的第二次取样的取样贴膜置于提取瓶中使用提取溶剂进行超声提取1-5min，提取液过滤后进行LCMS/MS分析。
优选的，当取样的次数为2时，取样间隔为1-5s；更优选为3s。
申请人在实验中发现，采用常规的一次取样过程中，提取液使用LCMS/MS分析时神经酰胺无法检测出，申请人意外的发现，取样时在同一位置连续取样，且取样间隔为1-5s，将第一次取样的取样贴膜弃去，将第二次取样的取样贴膜至于提取瓶中进行提取的方法，可以有效检测神经酰胺的含量，提高皮肤角质层中神经酰胺的检测准确性，申请人认为可能的原因是神经酰胺作为柔性的分子在细胞膜中的结合性较强，经过连续2次取样，该过程能够在一定程度上减弱角化细胞之间的粘着力，还可能改变神经酰胺在角质层中形成的网状结构分布，降低角质层水分对取样的影响，增大神经酰胺和取样贴膜之间的作用力，避免较低含量而影响后续的提取以及后续的LCMS/MS分析。
在一种实施方式中，所述提取溶剂选自水、醇类、取代烷烃中一种或多种。
优选的，所述取代烷烃为卤素取代烷烃，进一步优选的，所述卤素取代烷烃为氯取代烷烃，更优选的，所述取代烷烃为三氯甲烷。
优选的，所述醇类为碳原子数为1-5的直链醇类，进一步优选的，所述醇类为甲醇。
在一种实施方式中，当定性定量分析皮肤角质层成分为吡咯烷酮羧酸和/或尿刊酸时，提取溶剂包括醇类和水，体积为1：(0.6-1.2)，优选为1：1。
在一种实施方式中，当定性定量分析皮肤角质层成分为神经酰胺时，提取溶剂为醇类和取代烷烃，体积比为(0.8-1.5)：1，优选为1：1。
在一种实施方式中，当需要定性定量分析皮肤角质层成分同时包括吡咯烷酮羧酸、尿刊酸和神经酰胺时，吡咯烷酮羧酸、尿刊酸和神经酰胺分别进行贴膜进行取样，并使用提取溶剂进行超声提取后进行后续的LCMS/MS分析。
在一种优选的实施方式中，当需要定性定量分析皮肤角质层成分同时包括吡咯烷酮羧酸、尿刊酸和神经酰胺时，所述定性定量分析皮肤角质层成分的方法包括下面步骤：
(1)咯烷酮羧酸成分分析：皮肤使用贴膜在同一位置进行连续2次取样后，取样间隔为1-5s，将得到的第二次取样的取样贴膜置于提取瓶中使用提取溶剂A进行超声提取1-5min，提取液过滤后进行LCMS/MS分析；
(2)尿刊酸成分分析：皮肤使用贴膜在同一位置进行连续2次取样后，取样间隔为1-5s，将得到的第二次取样的取样贴膜置于提取瓶中使用提取溶剂A进行超声提取1-5min，提取液过滤后进行LCMS/MS分析；
(3)神经酰胺成分分析：皮肤使用贴膜在同一位置进行连续2次取样后，取样间隔为1-5s，将得到的第二次取样的取样贴膜置于提取瓶中使用提取溶剂B进行超声提取1-5min，提取液过滤后进行LCMS/MS分析。
优选的，所述提取溶剂A包括醇类和水，体积为1：(0.6-1.2)，更优选为1：1。
优选的，所述提取溶剂B包括醇类和取代烷烃，体积比为(0.8-1.5)：1，优选为1：1。
优选的，所述贴膜的材质为聚酯。
本申请所述贴膜购自北京金宏帆有限公司，型号为D100。
在进一步优选的实施方式中，当需要定性定量分析皮肤角质层成分同时包括吡咯烷酮羧酸、尿刊酸和神经酰胺时，所述定性定量分析皮肤角质层成分的方法包括下面步骤：
(1)咯烷酮羧酸成分分析：皮肤清洁干净后，静待2h，使用贴膜在距离下眼皮2.2cm的同一位置进行连续2次取样后，取样间隔为3s，每次取样压力为250g/cm2，每次取样时间为30s，将得到的第二次取样的取样贴膜置于提取瓶中使用1mL提取溶剂A进行超声提取2min，提取液经0.45μm滤膜过滤后进行LCMS/MS分析；
(2)尿刊酸成分分析：皮肤清洁干净后，静待2h，使用贴膜在距离下眼皮2.2cm的同一位置进行连续2次取样后，取样间隔为3s，每次取样压力为250g/cm2，每次取样时间为30s，将得到的第二次取样的取样贴膜置于提取瓶中使用1mL提取溶剂A进行超声提取2min，提取液经0.45μm滤膜过滤后进行LCMS/MS分析；
(3)神经酰胺成分分析：皮肤清洁干净后，静待2h，使用贴膜在距离下眼皮2.2cm的同一位置进行连续2次取样后，取样间隔为3s，每次取样压力为250g/cm2，每次取样时间为30s，将得到的第二次取样的取样贴膜置于提取瓶中使用1mL提取溶剂B进行超声提取2min，提取液经0.45μm滤膜过滤后进行LCMS/MS分析。
申请人在实验中发现，当需要定性定量分析皮肤角质层成分同时包括吡咯烷酮羧酸、尿刊酸和神经酰胺时，使用现有技术中的常规提取溶剂进行提取后使用LCMS/MS分析时，每次分析得到的含量偏差较大，申请人在实验中意外的发现，将吡咯烷酮羧酸、尿刊酸和神经酰胺分别进行取样分析，且当提取溶剂A包括醇类和水，体积比为1：(0.6-1.2)，提取溶剂B包括醇类和取代烷烃，体积比为(0.8-1.5)：1，尤其是醇类为甲醇，取代烷烃为三氯甲烷时，此时多次分析得到的吡咯烷酮羧酸、尿刊酸和神经酰胺含量偏差小，申请人认为可能的原因是当一次使用水、甲醇和三氯甲烷进行提取时，此时提取液中吡咯烷酮羧酸、尿刊酸分子中存在的含氮杂环具有的刚性阻碍了柔性神经酰胺在提取溶剂中的分布，此外，吡咯烷酮羧酸、尿刊酸与神经酰胺在提取溶剂中相容性差，吡咯烷酮羧酸、尿刊酸和神经酰胺分子之间分布两极化，影响后期的LCMS/MS分析准确度。
在一种实施方式中，咯烷酮羧酸、尿刊酸成分分析过程中，LCMS的条件如下：色谱柱为T3柱，1.8μm，2.1×100mm；实验室温度为18-25℃；湿度小于60％；柱温：35℃；扫描方式为MRM；流动性为体积比为1：1的甲醇和0.05wt％％氨水的混合液；流速为0.2mL/min；进样量为5-10μL；电离方式为ESI-；毛细管电压为-3.0KV；源温度为150℃；脱溶剂气及流速为氮气，800L/hr；脱溶剂温度为400-450℃；锥孔气流速为50L/hr。
在一种实施方式中，神经酰胺成分分析过程中，LCMS的条件如下：色谱柱为C8柱，2.1*50mm,1.7μm；实验室温度为18-25℃；湿度小于60％；柱温：35℃；扫描方式为MRM；流动性为体积比为1：1的乙腈和0.1wt％％甲酸的混合液；流速为0.4mL/min；进样量为4-10μL；电离方式为ESI+；毛细管电压为3.0KV；源温度为150℃；脱溶剂气及流速为氮气，800L/hr；脱溶剂温度为400-450℃；锥孔气流速为50L/hr。
在一种实施方式中，咯烷酮羧酸、尿刊酸成分分析过程中，色谱分析的色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3柱。
申请人意外的发现，咯烷酮羧酸、尿刊酸成分分析过程中，当质谱的色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3柱时，此时得到的成分含量稳定，精度高，可能的原因是咯烷酮羧酸、尿刊酸的极性较强，同时在特定体积比的甲醇和水的提取溶剂中其分子链充分伸展，避免了尿刊酸脂肪分子链对吡咯烷酮羧酸造成的空间位阻而影响吡咯烷酮羧酸在ACQUITYUPLC HSS T3柱上保留性。
在一种实施方式中，咯烷酮羧酸、尿刊酸成分分析过程中，色谱分析的流动相：水相为3-6mol/L的乙酸铵溶液，有机相为甲醇；优选为水相为5mol/L的乙酸铵溶液，有机相为甲醇。
申请人在实验中意外的发现，当水相为3-6mol/L的乙酸铵溶液，有机相为甲醇时，此时对咯烷酮羧酸、尿刊酸的保留性较好。
在一种实施方式中，咯烷酮羧酸、尿刊酸成分分析过程中，色谱分析中梯度洗脱的条件如下：0-2.5min，0.1-0.5mL/min流速，5wt％甲醇和95w％乙酸铵溶液；2.5-4.5min，0.1-0.5mL/min流速，95wt％甲醇和5w％乙酸铵溶液；4.5-6min，0.1-0.5mL/min流速，5wt％甲醇和95w％乙酸铵溶液。
优选的，咯烷酮羧酸、尿刊酸成分分析过程中，色谱分析中梯度洗脱的条件如下：0-2.5min，0.3mL/min流速，5wt％甲醇和95w％乙酸铵溶液；2.5-4.5min，0.3mL/min流速，95wt％甲醇和5w％乙酸铵溶液；4.5-6min，0.1-0.5mL/min流速，5wt％甲醇和95w％乙酸铵溶液。
在一种实施方式中，神经酰胺成分分析过程中，色谱分析的色谱柱为ACQUITYUPLC BEH C18柱。
申请人在实验中意外的发现，在神经酰胺成分分析过程中，色谱分析的色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱时，保留较好，同时相较于T3柱较易洗脱。
在一种实施方式中，神经酰胺成分分析过程中，色谱分析的流动相为：水相为0.1wt％甲酸，有机相为甲醇。
在一种实施方式中，神经酰胺成分分析过程中，色谱分析中梯度洗脱的条件如下：0-0.5min，0.1-0.5mL/min流速，90wt％乙腈和10w％甲酸；0.5-10min，0.1-0.5mL/min流速，98wt％乙腈和2w％甲酸；10-15min，0.1-0.5mL/min流速，90wt％乙腈和10w％甲酸。
优选的，神经酰胺成分分析过程中，色谱分析中梯度洗脱的条件如下：0-0.5min，0.4mL/min流速，90wt％乙腈和10w％甲酸；0.5-10min，0.4mL/min流速，98wt％乙腈和2w％甲酸；10-15min，0.4mL/min流速，90wt％乙腈和10w％甲酸。
在一种实施方式中，咯烷酮羧酸成分分析过程中，质谱条件为：母离子127.5m/z，子离子83.5m/z，锥孔电压35V，碰撞能12V。在一种实施方式中，尿刊酸成分分析过程中，质谱条件为：母离子136.84m/z，子离子65.58m/z，锥孔电压27V，碰撞能20V；子离子92.96m/z，锥孔电压27V，碰撞能12V。
在一种实施方式中，神经酰胺成分分析过程中，质谱条件为：母离子650.67m/z，子离子264.34m/z，锥孔电压30V，碰撞能30V；子离子532.67m/z，锥孔电压30V，碰撞能30V。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
(1)本申请定性定量分析皮肤角质层成分的方法操作简单，使用范围广，同时不受皮肤状态的限制；
(2)本申请采用特定的连续取样方法，可以有效检测神经酰胺的含量，提高皮肤角质层中神经酰胺的检测准确性；
(3)当需要定性定量分析皮肤角质层成分同时包括吡咯烷酮羧酸、尿刊酸和神经酰胺时，分别取样分析，并采用本申请中特定的提取溶剂，使得得到的各物质测定相对标准偏差小；
(4)咯烷酮羧酸、尿刊酸成分分析过程中，色谱分析的色谱柱为ACQUITY UPLC HSST3柱，此时得到的成分含量稳定，精度高；
(5)咯烷酮羧酸、尿刊酸成分分析过程中，色谱分析的水相为3-6mol/L的乙酸铵溶液，有机相为甲醇时，此时对咯烷酮羧酸、尿刊酸的保留性较好；
(6)神经酰胺成分分析过程中，色谱分析的色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱，保留较好，同时相较于T3柱较易洗脱。
附图说明
图1为本发明实施例1定性定量分析皮肤角质层成分的方法中吡咯烷酮羧酸的色谱图；
图2为本发明实施例2定性定量分析皮肤角质层成分的方法中吡咯烷酮羧酸的色谱图；
图3为本发明实施例1定性定量分析皮肤角质层成分的方法中尿刊酸的色谱图；
图4为本发明实施例2定性定量分析皮肤角质层成分的方法中尿刊酸的色谱图；
图5为吡咯烷酮羧酸的线性回归曲线；
图6为尿刊酸的线性回归曲线；
图7为神经酰胺的线性回归曲线；
图8为吡咯烷酮羧酸的检出限谱图；
图9为尿刊酸的检出限谱图。
具体实施方式
实施例
实施例1
本发明的实施例1提供了一种定性定量分析皮肤角质层成分的方法，定性定量分析皮肤角质层成分同时包括吡咯烷酮羧酸、尿刊酸和神经酰胺，具体步骤如下：
(1)咯烷酮羧酸成分分析：皮肤清洁干净后，静待2h，使用贴膜在距离下眼皮2.2cm的同一位置进行连续2次取样后，取样间隔为3s，每次取样压力为250g/cm2，每次取样时间为30s，将得到的第二次取样的取样贴膜置于提取瓶中使用1mL提取溶剂A进行超声提取2min，提取液经0.45μm滤膜过滤后进行LCMS/MS分析；
(2)尿刊酸成分分析：皮肤清洁干净后，静待2h，使用贴膜在距离下眼皮2.2cm的同一位置进行连续2次取样后，取样间隔为3s，每次取样压力为250g/cm2，每次取样时间为30s，将得到的第二次取样的取样贴膜置于提取瓶中使用1mL提取溶剂A进行超声提取2min，提取液经0.45μm滤膜过滤后进行LCMS/MS分析；
(3)神经酰胺成分分析：皮肤清洁干净后，静待2h，使用贴膜在距离下眼皮2.2cm的同一位置进行连续2次取样后，取样间隔为3s，每次取样压力为250g/cm2，每次取样时间为30s，将得到的第二次取样的取样贴膜置于提取瓶中使用1mL提取溶剂B进行超声提取2min，提取液经0.45μm滤膜过滤后进行LCMS/MS分析。
提取溶剂A为体积比为1：1的甲醇和水，提取溶剂B为体积比为1：1的甲醇和三氯甲烷。所述贴膜的材质为聚酯，贴膜购自北京金宏帆有限公司，型号为D100。
其中，咯烷酮羧酸、尿刊酸成分分析过程中，LCMS的条件如下：色谱柱为T3柱，1.8μm，2.1×100mm；实验室温度为18-25℃；湿度小于60％；柱温：35℃；扫描方式为MRM；流动性为体积比为1：1的甲醇和0.05wt％％氨水的混合液；流速为0.2mL/min；进样量为5μL；电离方式为ESI-；毛细管电压为-3.0KV；源温度为150℃；脱溶剂气及流速为氮气，800L/hr；脱溶剂温度为450℃；锥孔气流速为50L/hr。色谱分析的条件如下：色谱柱为ACQUITY UPLC HSST3柱；流动相：水相为5mol/L的乙酸铵溶液，有机相为甲醇；梯度洗脱的条件如下：0-2.5min，0.3mL/min流速，5wt％甲醇和95w％乙酸铵溶液；2.5-4.5min，0.3mL/min流速，95wt％甲醇和5w％乙酸铵溶液；4.5-6min，0.1-0.5mL/min流速，5wt％甲醇和95w％乙酸铵溶液。LC运行时间为6min，MS运行时间为6min。吡咯烷酮羧酸成分分析过程中，质谱条件为：母离子127.5m/z，子离子83.5m/z，锥孔电压35V，碰撞能12V；尿刊酸成分分析过程中，质谱条件为：母离子136.84m/z，子离子65.58m/z，锥孔电压27V，碰撞能20V；子离子92.96m/z，锥孔电压27V，碰撞能12V。
神经酰胺成分分析过程中，LCMS的条件如下：色谱柱为C8柱，2.1*50mm,1.7μm；实验室温度为18-25℃；湿度小于60％；柱温：35℃；扫描方式为MRM；流动性为体积比为1：1的乙腈和0.1wt％％甲酸的混合液；流速为0.4mL/min；进样量为4μL；电离方式为ESI+；毛细管电压为3.0KV；源温度为150℃；脱溶剂气及流速为氮气，800L/hr；脱溶剂温度为450℃；锥孔气流速为50L/hr。色谱分析的条件如下：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱；流动相为：水相为0.1wt％甲酸，有机相为甲醇；梯度洗脱的条件如下：0-0.5min，0.4mL/min流速，90wt％乙腈和10w％甲酸；0.5-10min，0.4mL/min流速，98wt％乙腈和2w％甲酸；10-15min，0.4mL/min流速，90wt％乙腈和10w％甲酸。LC运行时间为15min，MS运行时间为15min。质谱条件为：母离子650.67m/z，子离子264.34m/z，锥孔电压30V，碰撞能30V；子离子532.67m/z，锥孔电压30V，碰撞能30V。
实施例2
本发明的实施例2提供了一种定性定量分析皮肤角质层成分的方法，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于，咯烷酮羧酸、尿刊酸成分分析过程中，色谱分析时，水相为0.05wt％氨水，有机相为甲醇。
图1为本发明实施例1定性定量分析皮肤角质层成分的方法中吡咯烷酮羧酸的色谱图；图2为本发明实施例2定性定量分析皮肤角质层成分的方法中吡咯烷酮羧酸的色谱图；图3为本发明实施例1定性定量分析皮肤角质层成分的方法中尿刊酸的色谱图；图4为本发明实施例2定性定量分析皮肤角质层成分的方法中尿刊酸的色谱图；从图中可以看出，使用氨水作为水相时，吡咯烷酮羧酸和尿刊酸的保留较弱。
实施例3
本发明的实施例3提供了一种定性定量分析皮肤角质层成分的方法，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于，神经酰胺成分分析过程中，色谱分析时，水相为0.1wt％甲酸，有机相为乙腈。
当有机相为乙腈时，神经酰胺出峰较差，而甲醇做有机相时峰形较好。
性能评估
1.系统适用性分析试验：按照实施例1中记载的LCMS/MS分析条件依次将平行制备的标准溶液进行分析检测，记录各物质峰面积，结果见表1。
表1
2.线性分析：准确称取约0.1g(精确至0.1mg)的吡咯烷酮羧酸于100mL容量瓶中，用甲醇:水＝1:1(体积比)的溶剂适当溶解，并定容至刻度，摇匀，得到吡咯烷酮羧酸浓度为1000mg/L的标准储备液；用同样的方法配制尿刊酸浓度为1000mg/L的标储备液。使用200 L的移液枪精密吸取两种1000mg/L的标准储备液各100L于1.0mL安捷伦小瓶中，加入甲醇:水＝1:1(体积比)的试剂进行定容，配制成含化合物100mg/L的混合标准储备液，以混合标准储备液为母液，甲醇:水＝1:1(体积比)为稀释液，逐级稀释标准工作点，分别配置浓度为0.001-10mg/L的吡咯烷酮羧酸和尿刊酸混合标准溶液。准确称取约0.1g(精确至0.1mg)的神经酰胺于100mL容量瓶中，用三氯甲烷适当溶解，加入甲醇定容至刻度，摇匀，得到神经酰胺浓度为1000mg/L的标准储备液，使用200L的移液枪精密吸取神经酰胺的标准储备液100L于1.0mL安捷伦小瓶中，用甲醇定容，配制成含化合物100mg/L的二级标准储备液，以二级标准储备液为母液，甲醇为稀释液，逐级稀释标准工作点，分别配置浓度为0.001-10mg/L的的神经酰胺溶液。分别按照实施例1中记载的LCMS/MS分析条件进行分析，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。计算并报告拟合方程、范围、相关系数，结果见表2。
表2
其中，图5为吡咯烷酮羧酸的线性回归曲线；图6为尿刊酸的线性回归曲线；图7为神经酰胺的线性回归曲线，从图中可以看出吡咯烷酮羧酸在0.05mg/L-5mg/L范围内线性关系良好，尿刊酸在0.01mg/L-0.2mg/L范围内线性关系良好，神经酰胺在0.005mg/L-10mg/L范围内线性关系良好，标准曲线相关系数均满足R2≥0.998，说明标准曲线拟合度良好。
3.检出限：分别按照上述线性分析测试方法进行检出限的测定，将3倍信噪比定义为仪器检出限，测试结果见表3，图8为吡咯烷酮羧酸的检出限谱图；图9为尿刊酸的检出限谱图。
表3
4.定性定量分析：使用实施例1中定性定量分析皮肤角质层成分的方法对2名志愿者的咯烷酮羧酸和尿刊酸成分进行分析，使用下式(1)计算目标物含量，
其中，Xi—试样中物质的含量，单位为mg/片；C—根据线性分析中得到的标准曲线得出的试液中待测物质的浓度，单位为mg/L；C0—根据线性分析中标准曲线得出的空白溶液中待测物质的浓度，单位为mg/L；V—试液定容体积，单位为mL；f—试液稀释倍数；m—取样数量，单位为片。测试结果见表4。
表4
表中N.D.代表低于仪器检出限。
Claims (10)
1.一种定性定量分析皮肤角质层成分的方法，其特征在于，包括：皮肤使用贴膜进行取样后，将得到的取样贴膜置于提取瓶中使用提取溶剂进行超声提取1-5min，提取液过滤后进行LCMS/MS分析；所述取样的次数大于等于1，定性定量分析皮肤角质层成分包括吡咯烷酮羧酸、尿刊酸和神经酰胺中一种或多种。
2.根据权利要求1所述定性定量分析皮肤角质层成分的方法，其特征在于，当定性定量分析皮肤角质层成分包括吡咯烷酮羧酸和/或尿刊酸时，所述取样的次数为1或2。
3.根据权利要求1所述定性定量分析皮肤角质层成分的方法，其特征在于，当定性定量分析皮肤角质层成分包括神经酰胺时，所述取样的次数大于等于2，优选为2。
4.根据权利要求2或3所述定性定量分析皮肤角质层成分的方法，其特征在于，当取样的次数为2时，所述定性定量分析皮肤角质层成分的方法包括：皮肤使用贴膜在同一位置进行连续2次取样后，将得到的第二次取样的取样贴膜置于提取瓶中使用提取溶剂进行超声提取1-5min，提取液过滤后进行LCMS/MS分析。
5.根据权利要求4所述定性定量分析皮肤角质层成分的方法，其特征在于，当取样的次数为2时，取样间隔为1-5s。
6.根据权利要求1-3任一项所述定性定量分析皮肤角质层成分的方法，其特征在于，所述提取溶剂选自水、醇类、取代烷烃中一种或多种。
7.根据权利要求6所述定性定量分析皮肤角质层成分的方法，其特征在于，所述取代烷烃为卤素取代烷烃，优选为氯取代烷烃。
8.根据权利要求6所述定性定量分析皮肤角质层成分的方法，其特征在于，所述醇类为碳原子数为1-5的直链醇类。
9.根据权利要求7或8所述定性定量分析皮肤角质层成分的方法，其特征在于，当定性定量分析皮肤角质层成分为吡咯烷酮羧酸和/或尿刊酸时，提取溶剂包括醇类和水，体积为1：(0.6-1.2)。
10.一种根据权利要求1-9任一项所述定性定量分析皮肤角质层成分的方法在对油性皮肤以及中性皮肤检测分析中的应用。
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