CN110455938A - 一种皮肤角质层中脂质的检测方法及其应用 - Google Patents

一种皮肤角质层中脂质的检测方法及其应用 Download PDF

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CN110455938A CN201910594120.1A CN201910594120A CN110455938A CN 110455938 A CN110455938 A CN 110455938A CN 201910594120 A CN201910594120 A CN 201910594120A CN 110455938 A CN110455938 A CN 110455938A
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周立武
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Abstract

本发明属于物质检测领域，公开了一种皮肤角质层中脂质的检测方法，包括以下步骤：采样、标准溶液的配置、构建标准曲线、计算滤液中脂质组分的浓度、计算受试者皮肤角质层中脂质组分的含量。与现有技术相比，本发明本对皮肤的采样属于无创伤的采样，且不使用有毒的氯仿，安全性更高；所述检测方法同时将神经酰胺、胆固醇、角鲨烯及亚油酸、油酸等组分分别高效的检测出来，节约耗材、试剂及时间成本。通过检测结果，推算出受试者皮肤中脂质组分的比例，从而指导化妆品中脂质组分的用量，更有利于受试者皮肤对化妆品中有益组分的吸收，达到更好的化妆效果。

Description

一种皮肤角质层中脂质的检测方法及其应用
技术领域
本发明属于物质检测领域，特别涉及一种皮肤角质层中脂质的检测方法及其应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，被覆于人的体表，是内环境的分界面，也是抵御外界刺激因素侵扰的第一道防线。皮肤的外观反应了机体的健康状况与年龄变化。
角质层位于表皮最外层，由大约50层已经死亡的偏平的角质细胞组成，承担着皮肤屏障功能，是化妆品作用的初始部位，也是化妆品渗透的主要限速部位。因此改善角质层对化妆品的通透性可以更好的促进皮肤对化妆品中的有益组分的吸收，保持皮肤活力和健康。其中，角质层中的脂质组分对化妆品的渗透吸收具有重要影响。
化妆品直接作用于皮肤，分析角质层中的脂质组分及含量，有利于制备得到适合皮肤吸收的化妆品。现有技术中提取皮肤角质层中的脂质，主要是通过医院渠道取得角质层碎屑，再进行有机溶剂提取分离，或是直接在皮肤表面用有机溶剂萃取脂质，或是直接刮取皮肤分泌物来分析脂质的组分，然后指导合成化妆品，从而有利于皮肤对化妆品中有益组分的吸收。但是这些方法的缺点是往往会造成皮肤角质层的物理损伤，降低了皮肤屏障功能。另外，所使用的萃取剂通常包含氯仿，氯仿属于易致毒易致爆试剂，存在安全隐患，且提取脂质组分的过程较为复杂，效率低。
现有技术中对脂质组分的分析方法有多种。随科技快速发展，脂质中的组分的检测分析方法也朝着更高灵敏度、更高选择性、更方便快捷的方向发展。目前主要是采用HPLC-MS(高效液相色谱-质谱联用)技术，这种技术可以直接鉴定脂类化合物(属于脂质中的组分)从而避免由于流动相的紫外吸收带来的影响，但在进行有机物定量分析时要经过一系列分离纯化操作，十分麻烦，而且，质谱仪耗资昂贵，使用成本很高，对操作技术人员要求很高，虽适用于科研机构。
因此，提供一种对皮肤屏障无损伤，萃取过程安全，定量、高效分析脂质组分的方法十分重要。将该方法用于指导制备个性化的化妆品也十分有意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种皮肤角质层中脂质的检测方法及其应用。所述方法对皮肤屏障无损伤，萃取过程安全，不使用氯仿有毒萃取剂，检测过程方便、高校且对脂质组分含量的检测灵敏度高。
根据所述检测方法可检测不同受试者皮肤中脂质组分的含量差异来达到指导个性化化妆品的制备，有利于皮肤对化妆品有益成分的吸收。
一种皮肤角质层中脂质的检测方法，包括以下步骤：
(1)采样：取胶带贴于受试者皮肤上，然后取下胶带浸入甲醇中，然后用超声波破碎仪(由广州市默菲仪器有限公司提供，型号为Biosafer 150-96)处理，取上清液，然后经过滤膜过滤，制得滤液，备用；
(2)标准溶液的配置：配置神经酰胺的标准溶液、胆固醇的标准溶液、亚油酸的标准溶液、角鲨烯的标准溶液、油酸的标准溶液，备用；
(3)构建标准曲线：将步骤(2)制备得到的标准溶液分别采用HPLC法测定，分别得到神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯和油酸的标准曲线，所述标准曲线建立起神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯和油酸的出峰面积与神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯和油酸的浓度之间的函数关系式；
(4)计算滤液中脂质组分的浓度：将步骤(1)制得的滤液采用HPLC法测定，得到神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯或油酸的出峰面积，再根据步骤(3)得到的标准曲线，即可计算得到步骤(1)制得的滤液中神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯或油酸的浓度；
(5)计算受试者皮肤角质层中脂质组分的含量：再根据W＝CV/S计算得到受试者皮肤中经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯或油酸的含量，其中C为神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯或油酸的出峰面积代入步骤(3)所述标准曲线计算得到的浓度，V为步骤(1)制得的滤液的进样HPLC的体积，S为步骤(1)中用胶带贴于受试者皮肤上时粘取的皮肤面积，W为受试者皮肤角质层中脂质组分的含量。
优选的，步骤(1)中所述皮肤为脸部皮肤。
优选的，步骤(1)所述胶带为透明的聚酯薄膜胶带(由Courage+Khazaka CologneGermany，即一家德国公司提供，产品型号为Corneofix)。
进一步优选的，步骤(1)所述胶带的面积为1.0-2.5cm2。
优选的，步骤(1)将胶带贴于受试者脸部皮肤上的时间为10-30s。
优选的，步骤(1)中的超声波破碎仪的参数设定为：振幅杆2号，每次破碎2s，每次间隔3s，功率比为20％，破碎总时间为10-30min。
优选的，步骤(1)所述甲醇可用甲醇与异丙醇的混合物替代，甲醇与异丙醇的体积比为70:30。
优选的，步骤(1)所用滤膜的孔径为0.22-0.45μm。
步骤(2)中标准溶液的配置如下：
神经酰胺的标准液的配制：精确称取神经酰胺标准品10mg于50mL容量瓶中，加无水乙醇溶解神经酰胺标准品，超声脱气机溶解混匀，加无水乙醇定容至50mL，制得神经酰胺储备液，然后用移液器分别吸取神经酰胺储备液12.5uL、25uL、62.5uL、125uL、250uL、500uL、1000uL，分别用无水乙醇定容至1mL，配制得到神经酰胺质量浓度为2.5mg/L、5mg/L、12.5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准系列。
胆固醇的标准溶液的配制：用移液枪吸取胆固醇标准品称取50mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解标准品，超声脱气溶解混匀，甲醇定容至50mL，制得胆固醇储备液，然后用移液枪准确吸取胆固醇储备液50uL、250uL、500uL、1000uL、2000uL，分别用甲醇定容至10mL，配制得到胆固醇质量浓度为5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准系列。
亚油酸的标准溶液的配制：精确称取亚油酸标准品50mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解亚油酸标准品，超声脱气溶解混匀，甲醇定容至50mL，制得亚油酸储备液，然后用移液器准确吸取亚油酸储备液50uL、250uL、500uL、1000uL、2000uL，分别用甲醇定容至10mL，配制得到亚油酸质量浓度为5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准系列。
角鲨烯的标准溶液的配制：精确称取角鲨烯标准品50mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解角鲨烯标准品，超声脱气溶解混匀，用甲醇定容至50mL，制得角鲨烯储备液，然后用移液器准确吸取角鲨烯储备液50uL、250uL、500uL、1000uL、2000uL，分别用甲醇定容至10mL，配制得到角鲨烯质量浓度为5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准系列。
油酸的标准溶液的配制：精确称取油酸标准品50mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解油酸标准品，超声脱气溶解混匀，用甲醇定容至50mL，制得油酸储备液，然后用移液器准确吸取油酸醇储备液50uL、250uL、500uL、1000uL、2000uL，分别用甲醇定容至10mL，配制得到油酸质量浓度为5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准系列。
标准品：神经酰胺(Sigma-Aldrich公司提供，质量分数大于等于99.7％)标准品，胆固醇(阿拉丁公司提供，质量分数大于等于99.7％，CAS57-88-5)标准品，角鲨烯(Sigma-Aldrich公司提供，98％，CAS 111-02-4)标准品，亚油酸(阿拉丁公司提供，99.0％，CAS 60-33-3)标准品。
优选的，步骤(3)中HPLC过程中采用的色谱柱是ZORBAX SB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)(由美国安捷伦科技有限公司提供)，甲醇-异丙醇作为流动相，检测波长为205nm。
优选的，步骤(3)中HPLC的过程中甲醇-异丙醇的体积比为甲醇:异丙醇＝60-80:40-20。
进一步优选的，步骤(3)中HPLC过程中甲醇-异丙醇的体积比为甲醇:异丙醇＝70:30。
进一步优选的，步骤(3)中HPLC过程中流动相的流速为0.8-1m/min，柱温为25-30℃。
进一步优选的，步骤(3)中HPLC过程中进样量为8-10μL。
进一步优选的，步骤(3)中HPLC过程中进样前，样品经过0.22-0.45μm滤膜过滤，取滤液。
通过本发明所述的检测方法可高效、准确检测出受试者皮肤中脂质组分的具体含量，从而指导个性化妆品的配制，使得化妆品更适合受试者，有利于受试者的皮肤对化妆品中有益组分的吸收，达到更好的化妆效果。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)本发明对皮肤的采样属于无创伤的采样；
(2)本发明步骤(1)中无需使用有毒的氯仿，步骤(1)中使用超声波破碎仪破碎细胞，就可以达到很好的提取效果。与现有技术相比，安全性提高，所用试剂成本减少，提取流程简便，提取效率提高；
(3)本发明采用HPLC法对有机化合物是一种有效的分离和分析方法，定量分析准确，且高效、快速、便捷；另外，与HPLC-MS相比，本发明所述方法仪器耗材成本相对较低，对操作技术人员要求不高，可以广泛应用，同时可以满足对皮肤中脂质含量的有效检测；
(4)本发明使用HPLC对皮肤中脂质组分的检测，通过同一种流动相(甲醇-异丙醇)和检测波长，同时将神经酰胺、胆固醇、角鲨烯及亚油酸、油酸等组分分别高效的检测出来，节约耗材、试剂及时间成本；现有技术中脂质组分的检测，一般采用梯度洗脱的方式检出，耗时很长，而且不同的脂质组分需要用不同的流动相及不同的检测波长检测；因此，要检测出脂质组分需要进行多次HPLC检测；
(5)指导配方上，根据检测出的皮肤中脂质成分含量，推算出受试者皮肤中脂质比例，得出一个达到等摩尔比的比例参数，从而指导化妆品中脂质组分的用量，更有利于皮肤对化妆品中有益组分的吸收，达到更好的化妆效果。
附图说明
图1为本发明实施例2的工艺流程图。
图2为本发明实施例2中200mg/L的神经酰胺的标准溶液HPLC图谱。
图3为本发明实施例2中神经酰胺的标准曲线。
图4为本发明实施例2中100mg/L的胆固醇的标准溶液HPLC图谱。
图5为本发明实施例2中胆固醇的标准曲线。
图6为本发明实施例2中25mg/L的亚油酸的标准溶液HPLC图谱。
图7为本发明实施例2中亚油酸的标准曲线。
图8为本发明实施例2中10mg/L的角鲨烯的标准溶液HPLC图谱。
图9为本发明实施例2中角鲨烯的标准曲线。
图10为本发明实施例2中10mg/L的油酸的标准溶液HPLC图谱。
图11为本发明实施例2中油酸的标准曲线。
图12为本发明实施例4皮肤类型为油性受试者的皮肤脂质样本的HPLC图谱。
图13为本发明实施例4皮肤类型为中性受试者的皮肤脂质样本的HPLC图谱。
图14为本发明实施例4皮肤类型为干性受试者的皮肤脂质样本的HPLC图谱。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
实施例1
一种皮肤角质层中脂质的检测方法，包括以下步骤：
(1)采样：取胶带贴于受试者脸部皮肤上，然后取下胶带浸入甲醇中，然后用超声波破碎仪处理，取上清液，然后经过滤膜过滤，制得滤液，备用；
(2)标准溶液的配置：配置神经酰胺的标准溶液、胆固醇的标准溶液、亚油酸的标准溶液、角鲨烯的标准溶液、油酸的标准溶液，备用；
(3)构建标准曲线：将步骤(2)制备得到的标准溶液分别采用HPLC法测定，分别得到神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯和油酸的标准曲线，所述标准曲线建立起神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯和油酸的出峰面积与神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯和油酸的浓度之间的函数关系式；
(4)计算滤液中脂质组分的浓度：将步骤(1)制得的滤液采用HPLC法测定，得到神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯或油酸的出峰面积，再根据步骤(3)得到的标准曲线，即可计算得到步骤(1)制得的滤液中神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯或油酸的浓度；
(5)计算受试者皮肤角质层中脂质组分的含量：再根据W＝CV/S计算得到受试者皮肤中经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯或油酸的含量，其中C为神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯或油酸的出峰面积代入步骤(3)所述标准曲线计算得到的浓度，单位g/L，V为步骤(1)制得的滤液的进样HPLC的体积，单位mL，S为步骤(1)中用胶带贴于受试者皮肤上时粘取的皮肤面积，单位cm2，W为受试者皮肤角质层中脂质组分的含量，W的单位为ug/cm2。
步骤(1)所述胶带为透明的聚酯薄膜胶带。
步骤(1)所述胶带的面积为2.25cm2。
步骤(1)将胶带贴于受试者脸部皮肤上的时间为20s。
步骤(1)中的超声波破碎仪的参数设定为：振幅杆2号，每次破碎2s，每次间隔3s，功率比为20％，破碎总时间为20min。
步骤(1)所用滤膜的孔径为0.4μm。
步骤(2)中标准溶液的配置如下：
神经酰胺的标准液的配制：精确称取神经酰胺标准品10mg于50mL容量瓶中，加无水乙醇溶解神经酰胺标准品，超声脱气机溶解混匀，加无水乙醇定容至50mL，制得神经酰胺储备液，然后用移液器分别吸取神经酰胺储备液12.5uL、25uL、62.5uL、125uL、250uL、500uL、1000uL，分别用无水乙醇定容至1mL，配制得到神经酰胺质量浓度为2.5mg/L、5mg/L、12.5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准系列。
胆固醇的标准溶液的配制：用移液枪吸取胆固醇标准品称取50mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解标准品，超声脱气溶解混匀，甲醇定容至50mL，制得胆固醇储备液，然后用移液枪准确吸取胆固醇储备液50uL、250uL、500uL、1000uL、2000uL，分别用甲醇定容至10mL，配制得到胆固醇质量浓度为5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准系列。
亚油酸的标准溶液的配制：精确称取亚油酸标准品50mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解亚油酸标准品，超声脱气溶解混匀，甲醇定容至50mL，制得亚油酸储备液，然后用移液器准确吸取亚油酸储备液50uL、250uL、500uL、1000uL、2000uL，分别用甲醇定容至10mL，配制得到亚油酸质量浓度为5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准系列。
角鲨烯的标准溶液的配制：精确称取角鲨烯标准品50mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解角鲨烯标准品，超声脱气溶解混匀，用甲醇定容至50mL，制得角鲨烯储备液，然后用移液器准确吸取角鲨烯储备液50uL、250uL、500uL、1000uL、2000uL，分别用甲醇定容至10mL，配制得到角鲨烯质量浓度为5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准系列。
油酸的标准溶液的配制：精确称取油酸标准品50mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解油酸标准品，超声脱气溶解混匀，用甲醇定容至50mL，制得油酸储备液，然后用移液器准确吸取油酸醇储备液50uL、250uL、500uL、1000uL、2000uL，分别用甲醇定容至10mL，配制得到油酸质量浓度为5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准系列。
标准品：神经酰胺(Sigma-Aldrich公司提供，质量分数大于等于99.7％)标准品，胆固醇(阿拉丁公司提供，质量分数大于等于99.7％，CAS57-88-5)标准品，角鲨烯(Sigma-Aldrich公司提供，98％，CAS 111-02-4)标准品，亚油酸(阿拉丁公司提供，99.0％，CAS 60-33-3)标准品。
步骤(3)中HPLC过程中采用的色谱柱是ZORBAX SB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，甲醇-异丙醇作为流动相，检测波长为205nm。
步骤(3)中HPLC过程中甲醇-异丙醇的体积比为甲醇:异丙醇＝80:20。
步骤(3)中HPLC过程中流动相的流速为1m/min，柱温为30℃。
步骤(3)中HPLC过程中每次进样量为10μL。
步骤(3)中HPLC过程中进样前，样品经过0.45μm滤膜过滤，取滤液。
实施例2
一种皮肤角质层中脂质的检测方法，包括以下步骤：
(1)采样：取胶带贴于受试者脸部皮肤上，然后取下胶带浸入甲醇与异丙醇的混合物替中，甲醇与异丙醇的体积比为70:30，然后用超声波破碎仪处理，取上清液，然后经过滤膜过滤，制得滤液，备用；
(2)标准溶液的配置：配置神经酰胺的标准溶液、胆固醇的标准溶液、亚油酸的标准溶液、角鲨烯的标准溶液、油酸的标准溶液，备用；
(3)构建标准曲线：将步骤(2)制备得到的标准溶液分别采用HPLC法测定，分别得到神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯和油酸的标准曲线，所述标准曲线建立起神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯和油酸的出峰面积与神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯和油酸的浓度之间的函数关系式；
(4)计算滤液中脂质组分的浓度：将步骤(1)制得的滤液采用HPLC法测定，得到神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯或油酸的出峰面积，再根据步骤(3)得到的标准曲线，即可计算得到步骤(1)制得的滤液中神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯或油酸的浓度；
(5)计算受试者皮肤角质层中脂质组分的含量：再根据W＝CV/S计算得到受试者皮肤中经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯或油酸的含量，其中C为神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯或油酸的出峰面积代入步骤(3)所述标准曲线计算得到的浓度，单位g/L，V为步骤(1)制得的滤液的进样HPLC的体积，单位mL，S为步骤(1)中用胶带贴于受试者皮肤上时粘取的皮肤面积，单位cm2，W为受试者皮肤角质层中脂质组分的含量，W的单位为ug/cm2。
步骤(1)所述胶带为透明的聚酯薄膜胶带。
步骤(1)所述胶带的面积为2.5cm2。
步骤(1)将胶带贴于受试者脸部皮肤上的时间为10s。
步骤(1)中的超声波破碎仪的参数设定为：振幅杆2号，每次破碎2s，每次间隔3s，功率比为20％，破碎总时间为20min。
步骤(1)所用滤膜的孔径为0.45μm。
步骤(2)中标准溶液的配置如下：
神经酰胺的标准液的配制：精确称取神经酰胺标准品10mg于50mL容量瓶中，加无水乙醇溶解神经酰胺标准品，超声脱气机溶解混匀，加无水乙醇定容至50mL，制得神经酰胺储备液，然后用移液器分别吸取神经酰胺储备液12.5uL、25uL、62.5uL、125uL、250uL、500uL、1000uL，分别用无水乙醇定容至1mL，配制得到神经酰胺质量浓度为2.5mg/L、5mg/L、12.5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准系列。
胆固醇的标准溶液的配制：用移液枪吸取胆固醇标准品称取50mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解标准品，超声脱气溶解混匀，甲醇定容至50mL，制得胆固醇储备液，然后用移液枪准确吸取胆固醇储备液50uL、250uL、500uL、1000uL、2000uL，分别用甲醇定容至10mL，配制得到胆固醇质量浓度为5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准系列。
亚油酸的标准溶液的配制：精确称取亚油酸标准品50mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解亚油酸标准品，超声脱气溶解混匀，甲醇定容至50mL，制得亚油酸储备液，然后用移液器准确吸取亚油酸储备液50uL、250uL、500uL、1000uL、2000uL，分别用甲醇定容至10mL，配制得到亚油酸质量浓度为5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准系列。
角鲨烯的标准溶液的配制：精确称取角鲨烯标准品50mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解角鲨烯标准品，超声脱气溶解混匀，用甲醇定容至50mL，制得角鲨烯储备液，然后用移液器准确吸取角鲨烯储备液50uL、250uL、500uL、1000uL、2000uL，分别用甲醇定容至10mL，配制得到角鲨烯质量浓度为5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准系列。
油酸的标准溶液的配制：精确称取油酸标准品50mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解油酸标准品，超声脱气溶解混匀，用甲醇定容至50mL，制得油酸储备液，然后用移液器准确吸取油酸醇储备液50uL、250uL、500uL、1000uL、2000uL，分别用甲醇定容至10mL，配制得到油酸质量浓度为5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准系列。
标准品：神经酰胺(Sigma-Aldrich公司提供，质量分数大于等于99.7％)标准品，胆固醇(阿拉丁公司提供，质量分数大于等于99.7％，CAS57-88-5)标准品，角鲨烯(Sigma-Aldrich公司提供，98％，CAS 111-02-4)标准品，亚油酸(阿拉丁公司提供，99.0％，CAS 60-33-3)标准品。
步骤(3)中HPLC过程中采用的色谱柱是ZORBAX SB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，甲醇-异丙醇作为流动相，检测波长为205nm。
步骤(3)中HPLC过程中甲醇-异丙醇的体积比为甲醇:异丙醇＝70:30。
步骤(3)中HPLC过程中流动相的流速为1m/min，柱温为25-30℃。
步骤(3)中HPLC过程中进样量为10μL。
步骤(3)中HPLC过程中进样前，样品经过0.45μm滤膜过滤，取滤液。
图1为本发明实施例2的工艺流程图。
图2为发明实施例2中200mg/L的神经酰胺的标准溶液HPLC图谱，由图2可知，神经酰胺的出峰时间分别为3.274min、3.578min、3.842min、4.228min、5.110min、5.529min、6.200min、6.754min。图2中HPLC谱图横坐标是时间，单位min；纵坐标是响应值，单位是mAU。每个浓度检测后会得到相应的响应值，根据这个响应值以及其对应的浓度，可以做出相应标准曲线；然后通过标准曲线，来计算出试样中该物质的含量。
人体皮肤中的神经酰胺是一类物质，一共有11个亚类，也就是说神经酰胺是一类物质的总称；神经酰胺的标准溶液配制过程采用的神经酰胺来源于人体皮肤，所以在检测时会存在神经酰胺亚类的多个峰型。
神经酰胺的出峰时间较稳定，能够与其他脂质物质角鲨烯、亚油酸、胆固醇等很好的分开，因此检出性较好。
图3为发明实施例2中神经酰胺的标准曲线，所述神经酰胺的标准曲线为y＝4.37084x+14.5844，R2＝0.99968，具有良好的线性关系(图3中的纵坐标表示峰面积)。
图4为发明实施例2中100mg/L的胆固醇的标准溶液HPLC图谱，由图可知，胆固醇的出峰时间为3.846min。
图5为发明实施例2中胆固醇的标准曲线，所述胆固醇的标准曲线为y＝5.86625x-0.85031，R2＝0.99977，具有良好的线性关系。
图6为发明实施例2中25mg/L的亚油酸的标准溶液HPLC图谱，由图可知，亚油酸的出峰时间为3.391min。
图7为发明实施例2中亚油酸的标准曲线，所述亚油酸的标准曲线为y＝13.11763x-6.92134，R2＝0.99869，具有良好的线性关系。
图8为发明实施例2中10mg/L的角鲨烯的标准溶液HPLC图谱，由图可知，角鲨烯的出峰时间为5.795min。
图9为发明实施例2中角鲨烯的标准曲线，所述角鲨烯的标准曲线为y＝98.57779x-162.62828，R2＝0.9998，具有良好的线性关系。
图10为发明实施例2中10mg/L的油酸的标准溶液HPLC图谱，由图可知，油酸的出峰时间为3.955min。
图11为发明实施例2中油酸的标准曲线，所述油酸的标准曲线为y＝1.90644x-1.00795，R2＝0.99753，具有良好的线性关系。
实施例3
按照实施例2所述的方法，分别以皮肤类型分别为油性、中性、干性的受试者227名，年龄18-50岁，性别不限，对受试者的右脸颊和额头处采样，经过HPLC检测最后计算得到三种皮肤类型的受试者脂质中的角鲨烯、脂肪酸(W脂肪酸＝(W亚油酸/0.25)/2，另外，所述脂肪酸的含量也可以通过油酸的含量推算得到)、胆固醇的平均值，结果如表1所示。
表1：
表1中所述角鲨烯平均值和脂肪酸平均值的含量对斑点或痘痘的影响如下：对角鲨烯平均值而言，0.65及以下表示，0.65-0.9表示有斑点潜能，1.0-1.3表示有斑点，1.4-2.0表示有痘潜能，2.0以上表示有痘痘；脂肪酸平均值而言，0.076及以下表示严重斑点，0.12-0.24表示有潜在斑点，0.24-0.37表示健康，0.4及以上表示有潜在炎症，另外，从表1中可以看出三种性质的皮肤中脂肪酸的平均值相差不大。
表1中是通过227个受试者样本，探究角鲨烯、脂肪酸及胆固醇对皮肤斑点问题的指征及量化。
实施例4
按照实施例2所述的方法，分别以皮肤类型分别为油性、中性、干性的三位受试者，性别分别为女、女、男，年龄分别为28、25、29；三位受试者脸部皮肤按照实施例2所述的方法计算得到三位受试着脂质组分中的胆固醇、神经酰胺、脂肪酸(由亚油酸的含量可推出脂肪酸的含量，即W脂肪酸＝(W亚油酸/0.25)/2)的含量如表2所示。
表2：
从表2中检测出的胆固醇、神经酰胺、脂肪酸的含量，从而用来指导制定适合每个受试者的化妆品，往每位受试者的化妆品中添加的胆固醇、神经酰胺、脂肪酸比例如表2中所示，所制得的化妆品更适合每位受试者的皮肤，达到更好的化妆效果。另外，当胆固醇、神经酰胺、脂肪酸三者的摩尔比为1:1:1时为最佳的添加比例(例如干性的受试者皮肤中检测的胆固醇、神经酰胺、脂肪酸三者的摩尔比为0.75:0.53:1.3，然后添加胆固醇、神经酰胺、脂肪酸三者的摩尔比为2.25:2.47:1.7，最后胆固醇、神经酰胺、脂肪酸三者的摩尔比为3:3:3，达到最佳效果)。
图12、图13、图14分别为皮肤类型油性、中性、干性三位受试者的皮肤脂质样本的HPLC图谱(图12、图13、图14说明本发明所述方法可以检测到这三类皮肤中的脂类物质，而且三类皮肤中各脂类物质含量也存在差别，所以后期化妆品中添加脂质的比例也存在差异)。

Claims (10)

1.一种皮肤角质层中脂质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采样：取胶带贴于受试者皮肤上，然后取下胶带浸入甲醇中，用超声波破碎仪处理，取上清液，然后过滤，制得滤液，备用；
(2)标准溶液的配制：分别配置神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯、油酸的标准溶液，备用；
(3)构建标准曲线：分别将步骤(2)制备得到的标准溶液采用HPLC法测定，得到神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯和油酸的标准曲线，标准曲线分别建立起神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯和油酸的出峰面积与神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯和油酸的浓度之间的函数关系式；
(4)计算滤液中脂质组分的浓度：将步骤(1)制得的滤液采用HPLC法测定，得到神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯或油酸的出峰面积，再根据步骤(3)得到的标准曲线，即可计算得到步骤(1)制得的滤液中神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯或油酸的浓度；
(5)计算受试者皮肤角质层中脂质组分的含量：再根据W＝CV/S计算得到受试者皮肤中经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯或油酸的含量，其中C为神经酰胺、胆固醇、亚油酸、角鲨烯或油酸的出峰面积代入步骤(3)所述标准曲线计算得到的浓度，V为步骤(1)制得的滤液的进样的体积，S为步骤(1)中用胶带贴于受试者皮肤上时粘取的皮肤面积，W为受试者皮肤角质层中脂质组分的含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述胶带为透明的聚酯薄膜胶带；所述胶带的面积为1.0-2.5cm2。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中超声波破碎仪每次破碎2s，每次间隔3s，破碎的总时间为10-30min。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述过滤的过程采用孔径为0.22-0.45μm的滤膜进行过滤。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中各标准溶液的配置如下：神经酰胺标准液配制：称取神经酰胺10mg于50mL容量瓶中，加无水乙醇溶解神经酰胺，混合，加无水乙醇定容至50mL，制得神经酰胺储备液，然后分别吸取神经酰胺储备液12.5uL、25uL、62.5uL、125uL、250uL、500uL、1000uL，分别用无水乙醇定容至1mL，配制得到神经酰胺质量浓度为2.5mg/L、5mg/L、12.5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准系列；
胆固醇的标准溶液的配制：取胆固醇50mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解，混合，然后甲醇定容至50mL，制得胆固醇储备液，然后吸取胆固醇储备液50uL、250uL、500uL、1000uL、2000uL，分别用甲醇定容至10mL，配制得到胆固醇质量浓度为5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准系列；
亚油酸的标准溶液的配制：称取亚油酸50mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解亚油酸，混合，再用甲醇定容至50mL，制得亚油酸储备液，然后吸取亚油酸储备液50uL、250uL、500uL、1000uL、2000uL，分别用甲醇定容至10mL，配制得到亚油酸质量浓度为5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准系列；
角鲨烯的标准溶液的配制：称取角鲨烯50mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解角鲨烯，混合，然后用甲醇定容至50mL，制得角鲨烯储备液，然后吸取角鲨烯储备液50uL、250uL、500uL、1000uL、2000uL，分别用甲醇定容至10mL，配制得到角鲨烯质量浓度为5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准系列；
油酸的标准溶液的配制：称取油酸50mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解油酸，混合，然后用甲醇定容至50mL，制得油酸储备液，然后吸取油酸醇储备液50uL、250uL、500uL、1000uL、2000uL，分别用甲醇定容至10mL，配制得到油酸质量浓度为5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的标准系列。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中HPLC的过程中采用的色谱柱是ZORBAX SB-C18柱，甲醇-异丙醇作为流动相，检测波长为205nm。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中HPLC的过程中甲醇-异丙醇的体积比为甲醇:异丙醇＝60-80:40-20。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中HPLC的过程中流动相的流速为0.8-1m/min，柱温为25-30℃。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中HPLC的过程中每次的进样量为8-10μL。
10.一种确定化妆品中脂质成分添加量的方法，其特征在于，根据权利要求1-9中任一项所述的检测方法得知的检测结果，添加化妆品中的脂质成分用量。
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