CN101344528B - 一种牛血清胆固醇标准物质及其应用 - Google Patents
一种牛血清胆固醇标准物质及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种血清胆固醇的标准物质及其应用。其通过如下方法制备:a)选择澄清透明的牛血清,采用胆固醇酶法测定初始值;根据测值将牛血清归类;b)采用超速离心法制备高浓度胆固醇浓缩液,采用胆固醇酶法测定初始值;c)预设配制浓度;e)按照需要的配制量及根据牛血清的分类,计算配比比例进行配制;d)加入防腐剂;e)过滤分装。其中防腐剂为叠氮钠,其用量按重量体积比为0.1%,过滤利用0.2μm的石棉滤板除菌过滤。利用本发明得到的牛血清胆固醇标准物质进行了一系列实验,结果表明该标准物质基质效应小,可以在部分系统中通用,均匀性、稳定性良好。
Description
技术领域
本发明属于检测领域,更具体地,本发明公开一种血清胆固醇的标准物质。
背景技术
测定血清胆固醇是营养研究的重要指标,提高血清胆固醇测定的准确性有赖于建立和推行标准化分析体系,20世纪80年代美国推出国家胆固醇教育计划(NCEP),在国际上,尤其在美国,胆固醇是参考系统最完整,标准化工作开展最早、成效最显著的临床检验指标。在我国,卫生部北京老年医学研究所生化实验室进行胆固醇测定标准化研究已经十多年,建立了较完整的胆固醇参考系统。
目前胆固醇参考物质国际上有胆固醇纯度标准物质SRM911b,血清标准物质有NIST的SRM909及CDC的定值人血清;在我国,卫生部北京老年医学研究所、国家标准物质研究中心研制了胆固醇纯度标准物质(GBWO9203a和GBWO9203b),人血清胆固醇标准物质(GBWO9138和GBWO9145)。胆固醇测定标准化必须具备高纯度的胆固醇标准物质,但目前实验室测定胆固醇大都使用酶法,由于血清中的70%胆固醇以酯化状态存在,且不同基质对反应有明显影响,所以酶法测定胆固醇最好采用血清基质的校准品,而不宜用纯胆固醇标准液。血清胆固醇标准物质为酶法测定胆固醇提供合适的标准品,提高胆固醇测定的准确性,为在中国推行胆固醇测定标准化准备了必要条件。但人血清胆固醇标准物质存在血源获得难、安全性差,价格高等问题。(王抒,李培瑛,陈文祥等.血清胆固醇标准参考物质的研制,中华医学检验杂志,1996年,19(4):217~219.;标准物质及其应用技术(第二版),全浩,韩永志.中国标准出版社,2003年,北京.;)
发明内容
为了解决上述问题,本发明的发明人用牛血清代替人血清达到了本发明的目的。
更具体地,本发明公开了一种牛血清胆固醇标准物质,通过如下方法制备:
a)选择澄清透明的牛血清,采用胆固醇酶法测定初始值;根据测值将牛血清归类;
b)采用超速离心法制备高浓度胆固醇浓缩液,采用胆固醇酶法测定初始值;
c)预设配制浓度;
按照需要的配制量及根据牛血清的分类,通过以下公式1-2或公式3-4计算配比比例进行配制,其中A、B、D分别表示浓度范围在<50mg/dL、50~205mg/dL、>205mg/dL的血清,
公式1:V1/V2=(C-C2)/(C1-C)
公式2:V=V1+V2
C:目标配制的浓度
C1:B牛血清浓度
C2:D牛血清浓度
V:预设配制量
V1:B牛血清体积
V2:D牛血清体积
公式3:V1/V3=(C3-C)/(C-C1)
公式4:V=V1+V3
C:目标配制的浓度
C1:A牛血清浓度
C3:胆固醇浓缩液浓度
V:预设配制量
V1:A牛血清体积
V3:胆固醇浓缩液体积
d)加入防腐剂;
e)过滤分装。
更进一步地,步骤d)中防腐剂为叠氮钠,其用量按重量体积比为0.1%,步骤e)中利用0.2μm的石棉滤板除菌过滤,然后采用安瓿瓶拉丝灌封机以1~1.2mL/支分装于2mL安瓿瓶中,熔封安瓿瓶,于-18℃±2℃保存。
利用本发明得到的牛血清胆固醇标准物质进行了一系列实验,结果表明本发明得到的牛血清胆固醇标准物质基质效应小,可以在部分系统中通用,本发明得到的牛血清胆固醇标准物质均匀性、稳定性良好。
附图说明
图1:牛血清胆固醇标准物质制备流程图;
图2:牛血清标准物质均匀性数据分布图。
具体实施方式
以下实施例、实验例仅仅对本发明进行进一步的说明,不应理解为对本发明的限制。
实施例牛血清胆固醇标准物质制备
(一)材料准备
(1)从外观性状选择澄清透明的牛血清作为备选原料,将收集的牛血清采用胆固醇酶法测定初始值,(试剂:中生北控生物科技股份有限公司胆固醇液体双试剂)在OLYMPUS AU400生化分析仪上测定胆固醇含量(中华医学会检验学会血脂测定推荐方法—血清总胆固醇酶法测定,中华检验医学杂志,1995年18卷3期,185-187页),根据测值将牛血清分为3种浓度范围,<50mg/dL、50~205mg/dL、>205mg/dL,分别用A、B、D表示3个浓度范围的血清。
(2)用超速离心分离法制备高浓度的胆固醇浓缩液,具体方法如下:将收集的浓度>205mg/dL的部分牛血清用Backman90T超速离心机,设50,000r/min,离心20h,牛血清出现明显的分层,收集LDL层,用OLYMPUS AU400生化分析仪上测定胆固醇含量在500~600mg/dl。
将以上3个浓度的牛血清以及制备的浓缩液作为原料储存备用。
(二)制备
(1)预设配制的浓度为200~205mg/dL,将50~205mg/dL和>205mg/dL的牛血清按照以下公式1-2计算配比比例,按照需要的配制量计算配制。
公式1:V1/V2=(C-C2)/(C1-C)
公式2:V=V1+V2
C:目标配制的浓度
C1:B牛血清浓度
C2:D牛血清浓度
V1:B牛血清体积
V2:D牛血清体积
(2)胆固醇含量<50mg/dL的牛血清添加胆固醇浓缩液,根据以下公式3-4添加浓缩液。
公式3:V1/V3=(C3-C)/(C-C1)
公式4:V=V1+V3
C:目标配制的浓度
C1:A牛血清浓度
C3:胆固醇浓缩液浓度
V1:A牛血清体积
V3:胆固醇浓缩液体积
将配好的牛血清按体积比加入0.1%叠氮钠,充分混匀后用0.2μm的石棉滤板除菌过滤。采用安瓿瓶拉丝灌封机以1~1.2mL/支分装于2mL安瓿瓶中,熔封安瓿瓶,存于-18℃±2℃。
实验例
实验例1均匀性检验
1.1取样方法
将按上述实施例制备的牛血清标准物质分别顺序编号后,采用随机数表决定抽取样品的号码,随机抽取30支做均匀性检验。
1.2测量方法
胆固醇酶法测定简便,具有足够的灵敏度,精密度良好(总变异系数小于1%,与胆固醇定值方法相近),故选用酶法测定作为检测牛血清标准物质均匀性的方法,检测时每次测定取样量为3μL。
选用中生胆固醇试剂盒(酶法),采用OLYMPUS AU400全自动生化分析仪,按照说明书进行测定,每支重复测定3次,进行均匀性检验。
1.3结果评定
用SPSS11.0软件进行数据分析。
1.3.1正态分布检验
表1牛血清标准物质均匀性检验测定数据
均匀性检验的原始数据见表1。偏度、峰度系数分别为0.214,2.516,数据符合正态分布见附图2,根据拉依达准则无可疑数据剔除。
1.3.2单因素方差分析检验均匀性
将表1中的数据进行方差分析,结果见表2,P值大于0.05,表明牛血清标准物质均匀性良好。
表2牛血清标准物质均匀性方差分析
实验例2稳定性监测实验
在监测在-18℃±2℃温度下的稳定性,采用HPLC-内标法进行测定,变化率 XT为各时间段的测定值,X0为最初测定值,根据公式计算变化率,结果见表3。
表3牛血清标准物质在-18℃±2℃下的稳定性结果
平均绝对变化率为0.07%,表明牛血清胆固醇标准物质稳定性良好。
实验例3定值实验
采用高效液相色谱(HPLC)-内标法定值,并评定不确定度。高效液相色谱(HPLC)-内标法为中华医学会检验分会推荐的我国的胆固醇测定的参考方法,定值准确可靠。量值为205.0mg/dL±3.6mg/dL。
3.1定值方法——高效液相色谱法
采用高效液相色谱法(HPLC)胆固醇测定法对牛血清标准物质定值(陈文祥,李培瑛,王抒等.中华医学会检验学会血脂测定推荐方法:血清总胆固醇测定参考方法(草案).中华医学检验杂志,1995年,18(2):114~117),用国家一级血清胆固醇标准物质(GBWO9138)校准(陈文祥,董军,李培瑛等.胆固醇纯度标准物质的研制,中华医学检验杂志.1994年,17:211~214;Abell LL,et al.Simplified method for the estimationof total cholesterol in serum and demonstration of its specificity.J Biol Chem1952,195:357.;Duncan IW,et al.The procedure for the proposed cholesterolreference method.Cl in Chem Divi sion.CDC.1982.;Cohen A,et al.Total serumcholesterol by isotope dilution/mass spectrometry:A candidate definitive method.Clin Chem1980,26:850.),本法为中华医学会检验医学分会推荐的我国血清总胆固醇测定参考方法。
3.1.1原理
用氢氧化钾乙醇溶液水解血清胆固醇酯为游离胆固醇,加入内标物后用正己烷提取胆固醇和内标,用三氧化铬-硫酸溶液氧化胆固醇和内标为相应的4-烯-3,6-二酮,用高效液相色谱测定胆固醇与内标的峰高比,用单点校准法定量。
3.1.2试剂和仪器
本方法使用的主要化学试剂如下:血清胆固醇标准物质为国家一级标准(GBWO9138),标示值为185±2.4mg/dL。内标豆甾醇购自Sigma化学公司(St.Louis,MO,美国);正己烷、乙腈、异丙醇为色谱纯试剂(Fisher Scientific);氢氧化钾、浓硫酸为Fluka(Buchs,瑞士)产品;丙酮、乙醇、三氧化铬等化学试剂均为北京化工厂分析纯产品。
本方法使用的主要仪器为Hewlett-Packard公司(Waldbronn,德国)的HPLC系统,由HP1100系列单元泵、自动进样器、紫外检测器和化学工作站组成。色谱柱为Waters公司的Nova Pak C18柱,3.9x150mm。
用无水乙醇配制浓度为200mg/dL的豆甾醇作为内标溶液。
3.1.3分析步骤
血清胆固醇酯的水解及胆固醇与内标的提取:取标准和样品,使温度升至室温,混匀。用稀释器稀释功能取标准和样品并加水解液(乙醇-8.9M KOH,V:V=9:1),设定样品体积为0.05mL,水解液体积为0.5mL,气隔0.01mL,样品及水解液置2mL安瓿中。完成标准取样后,冲洗取样系统1-2次,再进行血清取样。
将各安瓿内容物混匀,置50℃水浴中温育2h,每隔30min混匀一次。温育结束后,加水0.5mL。用稀释器稀释功能加内标溶液和提取溶剂(正己烷),设定内标体积为0.05mL,正己烷体积为1mL。熔封安瓿,水平震荡15min。取正己烷层0.2mL,50℃下减压挥发至干。
加丙酮0.4mL,加三氧化铬-硫酸溶液(2M-2M)0.02mL,混匀,室温放置5min,乙醇0.04mL终止反应。加正己烷0.5ml,混匀,加水0.5mL,旋涡混合10s。
取正己烷层0.2mL置色谱分析样品瓶中,50℃下减压挥发至干。加入0.4ml流动相复溶,进行色谱分析。
3.1.4色谱分析和计算
在C18柱上进行色谱分析。流动相为乙腈-异丙醇(90:10),流速为1mL/min,紫外检测,检测波长为250nm,进样量10μL。用胆固醇/内标峰高比定量,计算标准的峰高比,将样品的峰高带入单点校准方程计算胆固醇浓度。
表4牛血清标准物质HPLC法测定结果
3.4不确定度评定
采用HPLC内标法(同3.1),用人血清国家一级标准物质(GBW09138)进行单点定标,用胆固醇/内标峰高比定量,计算标准物质的峰高比,将峰高比对浓度,将样品的峰高比代入以下公式中计算样品胆固醇浓度,并计算不确定度。
方程式:
CSam为样品胆固醇浓度(mg/dL),CCal为标准溶液胆固醇浓度(mg/dL),RSam和RCal分别为样品和标准的峰高比。
1、各量值不确定度的计算
表5牛血清胆固醇标准物质定值不确定度可能来源及分量
*由分析SRM结果估计,可能原因包括内标性质、色谱分离等
(1)测量结果重复性标准不确定度U:
(2)血清标准物质的标准不确定度:1.2mg/dL
(3)测量结果可能偏差相对标准不确定度:
(4)从上述2.3、3.2测定结果可以看出,070113批牛血清胆固醇标准物质的均一性和稳定性良好,对测定值不确定度的影响很小,可以忽略不计。
2、相对标准不确定度:
标准不确定度:U(C)=1.8mg/dL
扩展不确定度:U=3.6mg/dL(K=2)
本发明公开的牛血清胆固醇标准物质可以为临床实验室胆固醇测定提供适合的标准品,提高胆固醇测定的准确性;为胆固醇测定实验室室内质量控制和室间质量评价提供参考品;为厂家生产质控品的定值提供参考物质。
2007年3月,北京是海淀教委中小学卫生保健所应用“牛血清胆固醇标准物质”作为校准品和本发明的试剂配套,参加卫生部北京老年医学研究所血脂分析标准化计划,血清胆固醇测定结果符合美国胆固醇教育计划(NCEP)制定的技术目标。
2007年8月至11月,在7套临床检验生化全自动分析系统中进行基质效应试验,目的在于分析该标准物质和人血清的基质的差异性,是否在临床生化分析系统中通用,结果表明:牛血清胆固醇标准物质在7套临床检验生化全自动分析系统中无基质效应,7套系统为Beckman\Dade\Roche封闭系统,Hitachi-Roche试剂-c.f.a.s校准品\Olympus仪器-Roche试剂-c.f.a.s校准品分析系统\Hitachi仪器-中生液双-中生校准品分析系统\Olympus-中生液双-中生校准品分析系统。
Claims (7)
1.一种牛血清胆固醇标准物质,其特征在于通过如下方法制备:
a)选择澄清透明的牛血清,采用胆固醇酶法测定初始值;根据测值将牛血清归类;
b)采用超速离心法制备高浓度胆固醇浓缩液,采用胆固醇酶法测定初始值;
c)预设配制浓度;
按照需要的配制量及根据牛血清的分类,通过以下公式1-2或公式3-4计算配比比例进行配制,其中A、B、D分别表示浓度范围在<50mg/dL、50~205mg/dL、>205mg/dL的血清,
公式1:V1/V2=(C-C2)/(C1-C)
公式2:V=V1+V2
C:目标配制的浓度
C1:B牛血清浓度
C2:D牛血清浓度
V:预设配制量
V1:B牛血清体积
V2:D牛血清体积
公式3:V1/V3=(C3-C)/(C-C1)
公式4:V=V1+V3
C:目标配制的浓度
C1:A牛血清浓度
C3:胆固醇浓缩液浓度
V:预设配制量
V1:A牛血清体积
V3:胆固醇浓缩液体积
d)加入防腐剂;
e)过滤分装。
2.根据权利要求1所述的牛血清胆固醇标准物质,其特征在于步骤d)中的防腐剂为叠氮钠。
3.根据权利要求2所述的牛血清胆固醇标准物质,其特征在于所说的叠氮钠的用量按重量体积比为0.1%。
4.根据权利要求1所述的牛血清胆固醇标准物质,其特征在于步骤e)利用石棉滤板除菌过滤,然后采用安瓿瓶拉丝灌封机以1~1.2mL/支分装于2mL安瓿瓶中。
5.根据权利要求4所述的牛血清胆固醇标准物质,其特征在于石棉滤板为0.2μm的石棉滤板。
6.根据权利要求1所述的牛血清胆固醇标准物质,其特征在于还包括在-18℃±2℃保存步骤e)得到的产品。
7.权利要求1-6中任意一项所述的牛血清胆固醇标准物质的应用,其特征在于用作临床实验室胆固醇测定标准品、胆固醇测定实验室室内质量控制和室间质量评价提供参考品或厂家生产质控品的定值参考物质。
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