CN108333175B

CN108333175B - 一种总胆固醇检测方法

Info

Publication number: CN108333175B
Application number: CN201810050191.0A
Authority: CN
Inventors: 杨帆; 李俊美; 张小蓬; 刘太益; 宋金玲; 王新鹏
Original assignee: Qingdao Hightop Biotech Co ltd
Current assignee: Qingdao Hightop Biotech Co ltd
Priority date: 2018-01-18
Filing date: 2018-01-18
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2038-01-18
Also published as: CN108333175A

Abstract

一种总胆固醇检测方法，包括如下步骤：1)检测试剂及其试纸的制备；2)不同浓度的总胆固醇全血质控品的制备；3)将步骤2)中得到的不同浓度的总胆固醇全血质控品分别滴到步骤1)中所得到的试纸上，试纸显示不同的颜色，使用全自动生化仪对上述不同浓度的总胆固醇全血质控品进行总胆固醇浓度检测，将同一浓度的总胆固醇全血质控品的全自动生化仪的检测结果对试纸显色结果进行标定，得到比色卡；4)利用步骤1)得到的试纸进行样本中总胆固醇浓度的检测时，将样本滴到检测试纸上，2～3min后，将试纸的显色结果与步骤3)得到的比色卡进行对比，得到样本中总胆固醇的浓度。既可以节约成本和时间，同时又能保证其稳定性、重复性、灵敏度。

Description

一种总胆固醇检测方法

技术领域

本发明属于医学体外检测试纸领域，具体涉及到一种总胆固醇的检测方法。

背景技术

近年来，随着我国经济的发展和居民生活水平的提高及人口老龄化的加速，心血管疾病已成为我国城市和乡村人群的第一死亡原因。血脂类检测对心血管疾病的诊断有重要指导意义，总胆固醇作为临床血脂项目检测指标之一，其检测受到研究者的关注。胆固醇又称胆甾醇，一种环戊烷多氢菲的衍生物。总胆固醇是指血液中所有脂蛋白所含胆固醇之总和。总胆固醇包括游离胆固醇和胆固醇酯，肝脏是合成和贮存的主要器官。胆固醇是合成肾上腺皮质激素、性激素、胆汁酸及维生素D等生理活性物质的重要原料，也是构成细胞膜的主要成分。

一方面，总胆固醇增高见于高脂血症、动脉粥样硬化、糖尿病、肾病综合征、高血压(部分)等。研究表明，高总胆固醇是冠心病的主要危险因素之一，胆固醇每升高1％，冠心病危险就增加2％。另外，心肌梗死77％归因于胆固醇水平的增高。另一方面，低总胆固醇有原发和继发两种，前者常由遗传因素引起如家族性的无或低β脂蛋白血症，后者如甲状腺功能亢进、营养不良、慢性消耗性疾病、恶性贫血、溶血性贫血等。有专家指出，当总胆固醇含量低于4.86mmol/L时，癌症发病率会增加。虽然这个数值不是很确定，但是胆固醇过低，是会影响机体功能。研究表明，血清总胆固醇(sTC)水平是诊断重型肝炎的临床联合判断指标之一，其值低于2.00mmol/L为诊断重型肝炎的重要参数。重肝患者的存活率与其sTC水平呈明显正相关，sTC低于1.00mmol/L者预后极差。

目前，检测总胆固醇的方法已达200多种，主要分为五大类：气液色谱-质谱联用法、温度测定法、分子发光法、电化学方法、比色法。由于气相和高效液相色谱法条件高，临床实验室最常用的是化学法和酶法。化学比色法须用腐蚀性的浓酸试剂，特异性差，干扰因素多，有些准确性也较差，不适于常规应用。在常规工作中现在普遍应用酶法，此法特异、灵敏、精密，用单一试剂直接测定，既便于手工操作，也适用于自动分析测大批标本。酶法制作的干化学试纸由于其方便、灵活、污染小、操作简便等优势，越来越多地应用于常规检测。但是，目前制备的总胆固醇试纸条工艺及试剂配制相对繁琐(需要两步法或需水浴)，检测时间长。例如专利CN106645763A，采用纵向垂直式，但显色时间不尽相同，此专利中要360s才可比色，相对时间较长。其他方法中要将配制试剂分开配制使用，过程比较繁琐。本发明提出了一步法配制总胆固醇试剂的方法，并在2-3min比色。且提出一种配制全血总胆固醇质控的方法，更有利于产品检测，克服了目前全血/血清质控购买难的难题。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明提供了一种总胆固醇的检测方法，既可以节约成本和时间，同时又能保证其稳定性、重复性、灵敏度。

为了达到上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种总胆固醇检测方法，包括如下步骤：

1)检测试剂及其试纸的制备；

2)不同浓度的总胆固醇全血质控品的制备；

3)将步骤2)中得到的不同浓度的总胆固醇全血质控品分别滴到步骤1)中所得到的试纸上，试纸显示不同的颜色，使用全自动生化仪对上述不同浓度的总胆固醇全血质控品进行总胆固醇浓度检测，将同一浓度的总胆固醇全血质控品的全自动生化仪的检测结果对试纸显色结果进行标定，得到比色卡；

4)利用步骤1)得到的试纸进行样本中总胆固醇浓度的检测时，将样本滴到检测试纸上， 2～3min后，将试纸的显色结果与步骤3)得到的比色卡进行对比，得到样本中总胆固醇的浓度。

进一步说，步骤1)所述检测试剂为含有胆固醇氧化酶、表面活性剂等的缓冲液。

进一步说，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液中的一种。

进一步说，所述的表面活性剂为吐温-20、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯苯基醚中的一种或几种，优选为TritonX-100。

进一步说，所述检测试剂还包括酶促进剂、稳定剂，所述的酶促进剂、稳定剂为胆酸钠、 BSA、Mg²⁺。

进一步说，所述检测试剂还包括色原物质，色原物质是主要反应显色成分，为N-乙基 -N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，N-乙基-N-(3- 磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐，N-(2-羟基-3- 磺丙基)-3'5-二甲氧基苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3'5-二甲基苯胺钠盐，N'N- 二(4-磺丁基)-3,5-二甲基苯胺二钠盐，N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺,二钠盐的一种或多种。

进一步说，所述总胆固醇试剂试纸的制备方法为：将1～2g/L海藻糖、0.2～0.4g/L牛血清白蛋白、0.1～1mmol/L 4-氨基安替比林、3～5mmol/L胆酸钠、0.1～1mmol/L EDTA、3～4mmol/L色原物质、8～10KU/L胆固醇酯酶、4～8KU/L胆固醇氧化酶、 10～20KU/L过氧化物酶、1～3g/L TritonX-100、4～8KU/L抗坏血酸氧化酶、4～ 6mmol/L氯化镁，用磷酸盐缓冲液(pH＝6～8，0.01M～0.2M)进行溶解，用试纸浸润后放置40～50℃烘干。

进一步说，所述试纸自上而下包括带孔PVC板Ⅰ、滤血膜、反应膜和带孔PVC板Ⅱ，所述带孔PVC板Ⅰ上一端设有一加样孔，带孔PVC板Ⅱ上与加样孔对应的设有观察孔；带孔PVC板Ⅰ和带孔PVC板Ⅱ将滤血膜、反应膜夹在中间，滤血膜、反应膜和加样孔、观察孔相对应。

进一步说，步骤2)中总胆固醇全血质控品的制备方法包括如下步骤：

①将浓度占比34％的胆固醇、体积占比16％的TritonX-100、体积占比2～3％的二甲基甲酰胺，浓度占比66％的胆固醇酯，混合煮沸溶解后，用胎牛血清进行定容，从而得到不同浓度的总胆固醇血清质控品；

②将步骤①得到的不同浓度的总胆固醇血清质控品对积压的红细胞进行成比例稀释，即得到全血质控品。

采用上述技术方案，本发明实现的有益效果如下：

(1)确定了试剂中各个原料及其最佳配比，使用一步法直接合成，生产周期短，操作简便，大大降低了生产成本，提高了生产效率，并且试纸使用时，显色时间可达到2～3min，大大缩短了显色时间；

(2)制备过程简易，可操作性强，运用两层滤血膜的设计，避免了血量过多发生渗漏的问题，大大节约了成本，并且提高了生产效率，且其中加入薄的吸水纸，将多余的血量吸收；

(3)采用胎牛血清基质质控，与临床样本显色梯度一致，有效地减少了基质效应的干扰；

(4)本发明的质控能够为胆固醇实验室研发提供模拟临床样本的检测结果避免了没有合适水平样本时无法检测的情况。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或者现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对本领域技术人员来讲，在不独处创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的试纸结构示意图；

图2为本发明检测试剂中物质浓度与显色时间的关系曲线图；

图3为本发明检测试剂中酶用量与显色时间的关系曲线图；

图4为本发明检测试剂中物质浓度与55℃破坏后稳定周期的关系曲线图；

其中，1带孔PVC板Ⅰ，2滤血膜，3反应膜，4带孔PVC板Ⅱ，5样本，6加样孔,7观察孔。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种总胆固醇检测方法，包括如下步骤：

1)检测试剂及其试纸的制备：

将1～2g/L海藻糖、0.2～0.4g/L牛血清白蛋白、0.1～1mmol/L 4-氨基安替比林、3～5mmol/L胆酸钠、0.1～1mmol/L EDTA、3～4mmol/L色原物质、8～10KU/L胆固醇酯酶、4～8KU/L胆固醇氧化酶、10～20KU/L过氧化物酶、1～3g/L TritonX-100、 4～8KU/L抗坏血酸氧化酶、4～6mmol/L氯化镁，用磷酸盐缓冲液(pH＝6～8，0.01M～ 0.2M)进行溶解，用试纸浸润后放置40～50℃烘干。

所述试纸自上而下包括带孔PVC板Ⅰ1、滤血膜2、反应膜3和带孔PVC板Ⅱ4，所述带孔PVC板Ⅰ1上一端设有一加样孔6，带孔PVC板Ⅱ4上与加样孔6对应的设有观察孔7；带孔PVC板Ⅰ1和带孔PVC板Ⅱ4将滤血膜2、反应膜3夹在中间，滤血膜2、反应膜3和加样孔6、观察孔7相对应。

2)不同浓度的总胆固醇全血质控品的制备：

①将浓度占比34％的胆固醇、体积占比16％的TritonX-100、体积占比2-3％的二甲基甲酰胺，浓度占比66％的胆固醇酯，混合煮沸溶解后，用胎牛血清进行定容，从而得到不同浓度的总胆固醇血清质控品；

4)利用步骤1)得到的试纸进行样本5中总胆固醇浓度的检测时，将样本5滴到检测试纸上，2～3min后，将试纸的显色结果与步骤3)得到的比色卡进行对比，得到样本5中总胆固醇的浓度。

为确定检测试剂中各组分的最佳浓度用量，本发明采用如下方法：在保证同一显色深度，且梯度良好的前提下，利用控制变量法，将各个试剂进行定量配制，其主要物质量的变化与显色时间或稳定性的关系图如附图2-4所示，有附图曲线可得出：4-氨基安替比林的最佳浓度为0.1～1mmol/L，色原物质的最佳浓度为3～4mmol/L，胆固醇酯酶的最佳浓度为8～ 10KU/L，胆固醇氧化酶的最佳浓度为4～8KU/L，过氧化物酶的最佳浓度为10～20KU/L，胆酸钠的最佳浓度为3～5mmol/L，氯化镁的最佳浓度为4～6mmol/L。

采用本发明对50个未知样本进行检测，所得出的结果，与全自动生化仪判定结果相比较，如下表所示：

实施例1：

一种总胆固醇检测方法，包括如下步骤：

1)检测试剂及其试纸的制备：

将1g/L海藻糖、0.2g/L牛血清白蛋白、1mmol/L 4-氨基安替比林、5mmol/L胆酸钠、1mmol/L EDTA、3mmol/L色原物质、8KU/L胆固醇酯酶、4KU/L胆固醇氧化酶、 10KU/L过氧化物酶、3g/L TritonX-100、8KU/L抗坏血酸氧化酶、6mmol/L氯化镁，用磷酸盐缓冲液(pH＝6～8，0.01M～0.2M)进行溶解，用试纸浸润后放置40～50℃烘干。

2)不同浓度的总胆固醇全血质控品的制备：

①将浓度占比34％的胆固醇、体积占比16％的TritonX-100、体积占比2％的二甲基甲酰胺，浓度占比66％的胆固醇酯，混合煮沸溶解后，用胎牛血清进行定容，从而得到不同浓度的总胆固醇血清质控品,例如要配制12.93mmol/L的质控品，则需称取胆固醇0.0085g、TritonX-100 805 μL、二甲基甲酰胺115μL、胆固醇酯0.0165g，混合煮沸溶解后，用胎牛血清进行定容至5mL，得到预期浓度的总胆固醇血清质控品；

实施例2：

一种总胆固醇检测方法，包括如下步骤：

1)检测试剂及其试纸的制备：

将2g/L海藻糖、0.4g/L牛血清白蛋白、1mmol/L 4-氨基安替比林、3mmol/L胆酸钠、0.1mmol/L EDTA、4mmol/L色原物质、10KU/L胆固醇酯酶、8KU/L胆固醇氧化酶、20KU/L过氧化物酶、1g/L TritonX-100、4KU/L抗坏血酸氧化酶、4mmol/L氯化镁，用磷酸盐缓冲液(pH＝6～8，0.01M～0.2M)进行溶解，用试纸浸润后放置40～50℃烘干。

所述试纸自上而下包括带孔PVC板Ⅰ、滤血膜、反应膜和带孔PVC板Ⅱ，所述带孔PVC板Ⅰ上一端设有一加样孔，带孔PVC板Ⅱ上与加样孔对应的设有观察孔；带孔PVC板Ⅰ和带孔PVC板Ⅱ将滤血膜、反应膜夹在中间，滤血膜、反应膜和加样孔、观察孔相对应。

2)不同浓度的总胆固醇全血质控品的制备：

①将浓度占比34％的胆固醇、体积占比16％的TritonX-100、体积占比3％的二甲基甲酰胺，浓度占比66％的胆固醇酯，混合煮沸溶解后，用胎牛血清进行定容，从而得到不同浓度的总胆固醇血清质控品,例如要配制12.93mmol/L的质控品，则需称取胆固醇0.0085g、TritonX-100 805μL、二甲基甲酰胺115μL、胆固醇酯0.0165g，混合煮沸溶解后，用胎牛血清进行定容至5mL，得到预期浓度的总胆固醇血清质控品；

实施例3：

一种总胆固醇检测方法，包括如下步骤：

1)检测试剂及其试纸的制备：

将1.5g/L海藻糖、0.3g/L牛血清白蛋白、0.5mmol/L 4-氨基安替比林、4mmol/L胆酸钠、0.7mmol/L EDTA、3.5mmol/L色原物质、9KU/L胆固醇酯酶、6KU/L胆固醇氧化酶、15KU/L过氧化物酶、2g/L TritonX-100、6KU/L抗坏血酸氧化酶、5mmol/L氯化镁，用磷酸盐缓冲液(pH＝6～8，0.01M～0.2M)进行溶解，用试纸浸润后放置40～50℃烘干。

2)不同浓度的总胆固醇全血质控品的制备：

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种总胆固醇检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）检测试剂及其试纸的制备；

2）不同浓度的总胆固醇全血质控品的制备；

3）将步骤2）中得到的不同浓度的总胆固醇全血质控品分别滴到步骤1）中所得到的试纸上，试纸显示不同的颜色，使用全自动生化仪对上述不同浓度的总胆固醇全血质控品进行总胆固醇浓度检测，将同一浓度的总胆固醇全血质控品的全自动生化仪的检测结果对试纸显色结果进行标定，得到比色卡；

4）利用步骤1）得到的试纸进行样本中总胆固醇浓度的检测时，将样本滴到检测试纸上，2～3min后，将试纸的显色结果与步骤3）得到的比色卡进行对比，得到样本中总胆固醇的浓度;

步骤2）中总胆固醇全血质控品的制备方法包括如下步骤：

①将浓度占比34%的胆固醇、体积占比16%的TritonX-100、体积占比2～3 %的二甲基甲酰胺，浓度占比66%的胆固醇酯，混合煮沸溶解后，用胎牛血清进行定容，从而得到不同浓度的总胆固醇血清质控品；

②将步骤①得到的不同浓度的总胆固醇血清质控品对积压的红细胞进行成比例稀释，即得到全血质控品；

所述总胆固醇试剂试纸的制备方法为：将1～2 g/L 海藻糖、0.2～0.4 g/L 牛血清白蛋白、0.1～ 1 mmol/L 4-氨基安替比林、3 ～5 mmol/L 胆酸钠、0.1～ 1 mmol/L EDTA、3～ 4 mmol/L 色原物质、8 ～10 KU/L 胆固醇酯酶、4～ 8 KU/L 胆固醇氧化酶、10 ～20KU/L 过氧化物酶、1 ～ 3 g/L TritonX-100、4 ～8 KU/L 抗坏血酸氧化酶、4～6 mmol/L氯化镁，用pH = 6～8，0.01 M～0.2 M的磷酸盐缓冲液进行溶解，用试纸浸润后放置40～50℃烘干。

2.根据权利要求1所述的一种总胆固醇检测方法，其特征在于：所述试纸自上而下包括带孔PVC板Ⅰ、滤血膜、反应膜和带孔PVC板Ⅱ，所述带孔PVC板Ⅰ上一端设有一加样孔，带孔PVC板Ⅱ上与加样孔对应的设有观察孔；带孔PVC板Ⅰ和带孔PVC板Ⅱ将滤血膜、反应膜夹在中间，滤血膜、反应膜和加样孔、观察孔相对应。