CN109030671A

CN109030671A - 同时检测pku、cah和g-6pd缺乏症的串联质谱试剂盒及检测方法

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Publication number: CN109030671A
Application number: CN201810727241.4A
Authority: CN
Inventors: 李士敏; 袁京群; 吴筱丹; 葛志伟; 朱亚尔; 李家睿
Original assignee: Yida Precision (hangzhou) Technology Co Ltd
Current assignee: Yida Precision (hangzhou) Technology Co Ltd
Priority date: 2018-07-04
Filing date: 2018-07-04
Publication date: 2018-12-18
Anticipated expiration: 2038-07-04
Also published as: CN109030671B

Abstract

本发明公开了一种同时检测PKU、CAH和G‑6PD缺乏症的串联质谱试剂盒，包括：校准品、同位素内标品、孵育液、稀释剂、酶淬灭剂、复溶剂和流动相；校准品含有苯丙氨酸、17‑α‑羟孕酮和葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶；同位素内标品含有苯丙氨酸‑d8和17‑α‑羟孕酮‑d8；孵育液由水、缓冲盐、葡萄糖‑6‑磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和表面活性剂组成；稀释剂由水、缓冲盐和表面活性剂组成；流动相由流动相A和流动相B组成；流动相A为甲酸铵和/或乙酸铵的水溶液；流动相B为甲醇和/或乙腈。本发明还公开了使用所述的串联质谱试剂盒同时检测PKU、CAH和G‑6PD缺乏症的方法。本发明的试剂盒可以同时检测多种物质，并且具有灵敏度高、专属性强的特点。

Description

同时检测PKU、CAH和G-6PD缺乏症的串联质谱试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及遗传代谢疾病相关物质检测领域，尤其涉及一种同时检测PKU(苯丙酮尿症)、CAH(先天性肾上腺皮质增生症)和G-6PD缺乏症(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症)的串联质谱试剂盒及检测方法。

背景技术

苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)为常染色体隐性遗传病，因肝脏中苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)缺乏或活性不足或其辅酶四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)缺乏，导致苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)不能按正常的代谢途径转化为酪氨酸。由于酪氨酸的形成途径受阻，血液中的苯丙氨酸不能被水解，因此，苯丙氨酸在血、脑脊液、各种组织和尿液中浓度极度增高，同时产生大量苯丙酮酸、苯乙酸、苯乳酸和对羟基苯丙酮酸等旁路代谢产物并自尿中排出。高浓度的苯丙氨酸及其旁路代谢产物可导致脑细胞受损。

先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenalhyperplasia，CAH)为常染色体隐性遗传代谢病，由于类固醇激素合成过程中某种酶(如21-羟化酶、11β-羟化酶、3β-羟类固醇脱氢酶等)的先天性缺陷，导致肾上腺皮质功能减退，部分患儿伴有电解质紊乱及性腺发育异常。羟化酶缺乏症(21-hydroxylase deficiency，21-OHD)为CAH最常见的病因，占90％～95％。21-羟化酶缺乏引起肾上腺皮质合成皮质醇及醛固酮障碍，导致肾上腺皮质功能减退；酶缺乏导致其前体代谢物17-α-羟孕酮(17-α-hydroxypmgestemne)增多，经旁路代谢导致肾上腺雄激素及睾酮产生增多；皮质醇合成障碍反馈性促使垂体促肾上腺皮质激素分泌增加，刺激肾上腺皮质增生。所以，通过17-羟孕酮筛查出CAH患儿来早期预防其发生肾上腺危象及其他并发症，对改善患儿的预后有重要意义。17-α-羟孕酮(17-α-羟孕酮)是最常用的筛查21-OHD的敏感指标，目前在中国广泛应用于CAH的筛查。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase，G-6PD)缺乏症是由于红细胞膜的6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺陷，导致红细胞戊糖磷酸途径中谷胱甘肽还原酶的辅酶——还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)生成减少，使得维持红细胞膜稳定性的还原型谷胱甘肽生成减少而不能抵抗氧化损伤，最终导致红细胞破坏并溶血的一种遗传病。6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因位于X染色体上，该病系X-连锁遗传疾病。患者常因食用蚕豆而发病，俗称“蚕豆病”，部分重型患者可引起新生儿期重度高胆红素血症，或在特定条件下(氧化应激、食物或药物)诱发非免疫性溶血，危及生命。6-磷酸葡萄糖脱氢酶是糖酵解途径、柠檬酸循环以外的另一个葡萄糖分解途径的磷酸葡萄糖酸途径(磷酸戊糖途径)中的第一个酶EC1。红细胞6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖-6-磷酸(G6P)氧化成6-磷酸葡萄糖-δ-内酯，后者很快氧化成6-磷酸葡萄糖酸(6-PGA)，同时氧化型辅酶II(NADP+)被还原成NADPH。因此，可由6-PGA与G6P的比值，计算6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活力。6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症新生儿的筛查及诊断主要是通过检测干血滤纸片的6-磷酸葡萄糖脱氢酶酶活性来完成的，对预防和降低新生儿严重高胆红素血症，尤其是胆红素脑病的发生有重要作用。

目前，类固醇激素和6-磷酸葡萄糖脱氢酶酶活性的测定主要采用各种不同免疫分析方法，如放射免疫分析法、荧光定量法、荧光免疫分析法和时间分辨荧光免疫分析法等。由于血中类固醇激素水平相对较低，对检测方法的要求较高，上述方法虽然能够达到一定的准确度，但仍存在不同激素间的交叉反应、灵敏度和特异度相对不高等情况，使检测结果的假阳性率增加，且每种激素的测定须使用不同试剂盒，所需的血液样本量和检测成本较高。而且，目前市售试剂盒依次实验只能检测单一指标，不能实现一次实验同时检测苯丙氨酸、17-α-羟孕酮和葡萄糖-6磷酸脱氢酶三个标志物。

发明内容

本发明提供一种可同时检测新生儿干血片上苯丙氨酸、17-α-羟孕酮和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂盒及检测方法。

本发明提供了如下技术方案：

一种同时检测PKU、CAH和G-6PD缺乏症的串联质谱试剂盒，包括：校准品、同位素内标品、孵育液、稀释剂、酶淬灭剂、复溶剂和流动相；

所述的校准品含有苯丙氨酸、17-α-羟孕酮和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；

所述的同位素内标品含有苯丙氨酸-d8和17-α-羟孕酮-d8；

所述的孵育液由水、缓冲盐、葡萄糖-6-磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和表面活性剂组成；

所述的稀释剂由水、缓冲盐和表面活性剂组成；

所述的流动相由流动相A和流动相B组成；所述流动相A为甲酸铵和/或乙酸铵的水溶液；所述流动相B为甲醇和/或乙腈。

在NADP存在的条件下，葡萄糖-6-磷酸在生物样本中G-6PD的作用下转化成6-磷酸葡萄糖酸，淬灭反应后通过串联质谱测定淬灭液中的6-磷酸葡萄糖酸含量，其中淬灭液中6-磷酸葡萄糖酸的含量与生物样本中的G-6PD含量相关。

本发明的试剂盒可检测干血片中苯丙氨酸、17-α-羟孕酮和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的含量，从而用于新生儿苯丙酮尿症、先天性肾上腺皮质增生症和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的筛查。

校准品用于制作标准工作曲线。校准品有多个，多个校准品的浓度呈梯度分布。

优选的，校准品中，苯丙氨酸的浓度为5～200ug/mL；17-α-羟孕酮的浓度为0.1～200ng/mL；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的浓度为0.02～0.8U/mL。

最优选的，所述的校准品有6个；其中，苯丙氨酸的浓度分别为5ug/mL、10ug/mL、50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL、200ug/mL；17-α-羟孕酮的浓度分别为0.1ng/mL、2ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、180ng/mL、200ng/mL；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的浓度分别为0.02U/mL、0.04U/mL、0.08U/mL、0.2U/mL、0.4U/mL、0.8U/mL。

为了使用的方便，所述的校准品采用冷冻干燥法或者冷冻离心法预包被在96孔孵育板上。

优选的，所述的同位素内标品中，苯丙氨酸-d8和17-α-羟孕酮-d8的浓度为200～500ng/mL；最优选300ng/mL。

所述的同位素内标品可以预包被于96孔孵育板上，也可以不预包被于96孔孵育板上，而是配制成内标品溶液再添加到校准品溶液中或待测样本溶液中。

优选的，所述的同位素内标品的溶剂为50％～90％的甲醇或乙腈；最优选80％的甲醇。

优选的，所述的孵育液中，缓冲盐浓度为0.5～400mmol/L，葡萄糖-6-磷酸浓度为1.0～50mmol/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸浓度为0.5～30mmol/L，表面活性剂的浓度为2～50g/L。

采用该配方的孵育液孵育样本时，均可获得理想的效果，G6PD的回收率和准确度能够达到美国疾病预防控制中心质控要求。

进一步优选的，所述的表面活性剂为皂素、聚山梨酯、泊洛沙姆、磷脂和十二烷基硫酸钠中的一种或多种；所述的缓冲液为磷酸盐缓冲盐或Tris缓冲盐。

最优选的，所述的孵育液中，缓冲盐浓度为250mmol/L，葡萄糖-6-磷酸浓度为20mmol/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸浓度为15mmol/L，表面活性剂为皂素，表面活性剂的浓度为10g/L。

优选的，所述的稀释剂中，缓冲盐浓度为0.5～400mmol/L，表面活性剂的浓度为2～50g/L。

稀释剂中各组分的浓度与各组分在孵育液中的浓度相同，可用于稀释样本。

优选的，所述的酶淬灭剂为乙腈、甲醇、乙醇、高氯酸和三氯乙酸中的一种或多种；进一步优选的，所述的酶淬灭剂为乙腈、甲醇和乙醇中的一种或多种。

所述的复溶剂为乙腈、甲醇和水中的至少一种；优选的，所述的复溶剂为乙腈水溶液，乙腈与水的体积比为1∶1。

优选的，所述的流动相A中，甲酸铵和/或乙酸铵水溶液的浓度为2～50mmol/L；所述的流动相A的pH为9～11。

采用该流动相时，具有理想的检测效果，G-6PD的回收率能够达到美国疾病预防控制中心质控要求，若流动相A的pH或甲酸铵和乙酸铵的浓度超出上述范围时，检测信号的强度会降低，准确度会下降，G-6PD的回收率会下降或者升高。

进一步优选的，所述的流动相中，流动相A为乙酸铵水溶液，乙酸铵的浓度为10mmol/L，pH为10；流动相B为乙腈。

为了检测的准确性，本发明的检测试剂盒还包括苯丙氨酸、17-α-羟孕酮和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的质控品；进一步优选的，苯丙氨酸、17-α-羟孕酮和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的质控品采用冷冻干燥法或者冷冻离心法预包被在96孔孵育板上。

进一步优选的，质控品有2个，苯丙氨酸的浓度分别为20ug/mL和180ug/mL；17-α-羟孕酮的浓度分别为10ng/mL和150ng/mL；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的浓度分别为0.03U/mL和0.6U/mL。

优选的，本发明的试剂盒还包括96孔孵育板，所述的校准品、同位素内标品按相应浓度预包被在96孔孵育板的孔中。

优选的，本发明的试剂盒还包括96孔反应板和96孔进样板。

优选的，本发明的试剂盒还包括封片。所述封片用于覆盖96孔板，以减少有机溶剂的挥发。

优选的，本发明的试剂盒还包括使用说明书。

本发明还公开了使用所述的串联质谱试剂盒同时检测PKU、CAH和G-6PD缺乏症的方法，包括以下步骤：

(1)向校准品和待测干血片样品中分别加入稀释剂、孵育液和同位素内标物溶液，进行孵育；

(2)孵育完成后加入酶淬灭剂，冷冻离心后取上清液，所述上清液用氮气吹干；

(3)将吹干后的残渣用复溶剂复溶，取上清液进行液相色谱串联质谱技术进行检测，分别记录苯丙氨酸和17-α-羟孕酮的色谱图、峰面积和内标峰面积，记录葡萄糖-6-磷酸和6-磷酸葡萄糖酸的色谱图和峰面积；

(4)以校准品中苯丙氨酸或17-α-羟孕酮的浓度为横坐标，以苯丙氨酸或17-α-羟孕酮的峰面积与相应内标物的峰面积之间的比值为纵坐标，建立校准曲线，分别计算待测干血片样品中苯丙氨酸和17-α-羟孕酮的浓度；

以校准品中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的浓度为横坐标，以6-磷酸葡萄糖酸的峰面积与葡萄糖-6-磷酸的峰面积之间的比值为纵坐标，建立校准曲线，计算待测干血片样品中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的浓度。

优选的，步骤(1)中，轧下两片直径为5.5～6.6mm的干血片，分别向校准品和干血片中加入160uL稀释剂和200uL的孵育液，盖上封片，振荡30秒后，37℃振动孵育30分钟。

优选的，步骤(2)中，孵育完成后加入400uL酶淬灭剂淬灭反应，冷冻离心机上10000r/min离心10min，取上清液用氮气吹干。

优选的，步骤(3)中，用50uL的复溶剂加入到吹干后的残渣中，振荡30分钟后，冷冻离心机上10000r/min离心10min，取上清液进行液相色谱串联质谱技术进行检测。

优选的，步骤(3)中，色谱条件为：色谱柱为BEH-C18(2.1×100mm)；柱温为45℃；流动相流速为0.3mL/min，0～1min：90％流动相A-10％流动相B，1～3min：90％→25％流动相A-10％→75％流动相B，3～4min：25％流动相A-75％流动相B，4～5min：25％→90％流动相A-75％→10％流动相B，5～5.5min：90％流动相A-10％流动相B；进样体积为10uL。

优选的，步骤(3)中，质谱条件为：采用电喷雾正、负离子多离子反应监控扫描模式，Q1/Q3离子通道分别选择为17-α-羟孕酮(正离子模式)：331.18→109.09amu、97.1amu；苯丙氨酸(负离子模式)：164.00→71.8amu；葡萄糖-6-磷酸(负离子模式)：258.76→96.94amu；6-磷酸葡糖酸(负离子模式)：274.9→96.9amu。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.本发明的试剂盒是利用液相色谱串联质谱技术，可在干血片上同时检测新生儿苯丙酮尿症、先天性肾上腺皮质增生症和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症，不仅可以降低对采血的需求，还有效提高了新生儿遗传代谢病筛查效率以及通量；

2.本发明的试剂盒所检测的样品为干血片，干血滤纸片样品收集技术具有全血样品无法比拟的优势包括样本的常温稳定性更好、微创、成本低、易保存和运输、减少潜在的病原体感染风险；

3.本发明的试剂盒使用的检测方法是液相色谱串联质谱法，该方法可以同时检测多种物质，并且具有灵敏度高、专属性强的特点。

附图说明

图1为苯丙氨酸、17-α-羟孕酮、葡萄糖-6-磷酸和6-磷酸葡萄糖酸四种物质的离子对色谱图；其中，(a)为苯丙氨酸，(b)为17-α-羟孕酮，(c)为葡萄糖-6-磷酸，(d)为6-磷酸葡萄糖酸。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。

实施例1

一、试剂盒包括：

表1试剂盒组成及主要成分

二、使用试剂盒同时检测PKU、CAH和G-6PD缺乏症的方法，包括以下步骤：

(1)孵育：打孔器在待测样品滤纸干血片上轧下约6mm直径的血片，每两个血片一起放入96孔板反应板孔中，校准品孔、质控品孔和待测样品孔分别加入160uL酶稀释液和200uL的孵育液，盖上封片，振荡30秒后，放入恒温孵育震荡器中，在37℃温度中100rpm振动孵育30分钟。

2、移液和氮吹：取出孵育后的溶液迅速加入400uL的酶淬灭剂进行淬灭反应，封片后在冷冻离心机上10000r/min离心10min，将离心后的上清液全部转移到另一个96孔板上，氮气吹干。

3、复溶和移液：将50uL的复溶剂加入到吹干后的残渣中，振荡器振荡30分钟后，在冷冻离心机上10000r/min离心10min，将上清液转移到96孔板进样板孔内。

4、上机检测：将处理后的上清液进行检测分析，并记录校准品与待测样品中17-α-羟孕酮和苯丙氨酸的色谱图、峰面积与内标峰面积，记录葡萄糖-6-磷酸和6-磷酸葡萄糖酸的色谱图和峰面积。

(1)色谱条件：

a)色谱柱：BEH C₁₈(2.1×100mm)色谱柱；

b)流动相：流动相A，流动相B；

c)流速：0.3mL/min；

d)梯度洗脱条件：

表2梯度洗脱条件

e)柱温：

f)进样量：10uL。

(2)质谱条件：

a)离子源：

表3离子源条件

b)扫描模式：

采用MRM模式进行检测，各化合物的LC-MS参数见表4。

表4分析物的LC-MS参数

5、检测结果的计算：

苯丙氨酸、17-α-羟孕酮、葡萄糖-6-磷酸和6-磷酸葡萄糖酸四种物质的离子对色谱图如图1所示。

(1)标准曲线的绘制方法：苯丙氨酸和17-α-羟孕酮以6个校准品的标示浓度(苯丙氨酸：5ug/mL、10ug/mL、50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL、200ug/mL；17-α-羟孕酮：0.1ng/mL、2ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、180ng/mL、200ng/mL；)为横坐标(x)，以6个校准品的实际检测峰面积与相应内标峰面积比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶以6个校准品的标示浓度(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶：0.02U/mL、0.04U/mL、0.08U/mL、0.2U/mL、0.4U/mL、0.8U/mL)为横坐标(x)，以6个校准品的实际检测6-磷酸-葡萄糖酸的峰面积与葡萄糖-6-磷酸的峰面积比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线。

(2)标准曲线方程的拟合：以6个校准品的峰面积与内标峰面积的比值或是峰面积比值(y)对标示浓度(x)进行线性回归。可获得回归方程，并计算出相关系数(R)，要求R不小于0.9900。

苯丙氨酸、17-α-羟孕酮和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的线性方程，如表5所示：

表5丙氨酸、17-α-羟孕酮和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的线性方程

分析物名称	线性方程	相关系数(R²)
			苯丙氨酸	y＝2.5e⁵x+1.38e⁴	R²＝0.9995
17-α-羟孕酮	y＝3.35e³x+2.66e³	R²＝0.9982
			6-磷酸葡萄糖脱氢酶	y＝0.801x-0.00361	R²＝0.9876

该检测方法的回收率在80％～120％之间，符合检测要求，多次测量的RSD小于5％，符合分析测试要求。

三、方法验证

据相关文献报道，苯丙酮尿症(PKU)是新生儿先天性苯丙氨酸羟化酶缺陷所引起的苯丙氨酸代谢障碍疾病。并根据新生儿血中苯丙氨酸浓度划分为经典型和轻度苯丙酮尿症两类，经典型苯丙酮尿症：血苯丙氨酸≥1200umol/L(≥200ug/mL)，轻度苯丙酮尿症：血苯丙氨酸360～1200umol/L(60～200ug/mL)；先天性肾上腺皮质增生症(CAH)为常染色体隐性遗传代谢病，17-α-羟孕酮阳性切值的合理设定是CAH筛查的关键。通常17-α-羟孕酮＞300nmol/L(100ng/mL)为经典型，17-α-羟孕酮6～300nmol/L(2～100ng/mL)主要见于非经典型，或21-羟化酶缺乏杂合子或假阳性，17-α-羟孕酮＜6nmol/L(2ng/mL)为非经典型者或正常者，结合国内实验室的经验，推荐足月儿或正常体重儿(≥2500g)的17-α-羟孕酮阳性切值为30nmol/L(10ng/mL)；早产儿或低体重儿(＜2500g)为50nmol/L(16.5ng/mL)。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)缺乏症是由于红细胞破坏并溶血的一种遗传病，筛查的阳性切值多设定为0.01～6.2U/g血红蛋白，正常人的G-6-PD值一般均在9～35.5U/g血红蛋白。

对82个预先收集并使用不记名的新生儿样品来进行相关性研究，将样品点渍于whatman903滤纸上，干燥并运用本实施例所述的方法检测结果，测得80新生儿干血斑样品中苯丙氨酸的含量为5～29.8ug/mL，检测结果为正常，并且这个结果与串联质谱内标比值法的检测结果一致；

此外，检测的新生儿样品，79个干血滤纸片样品中17-α-羟孕酮的平均值为2.5ng/mL，检测为正常，其中一个干血滤纸片样品的含量58ng/mL，检测结果超过10ng/mL，诊断为先天性肾上腺皮质增生症，此方法与酶联免疫法的检测结果一致。

最后，测得其中7新生儿干血斑样品中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性值在16±3.5U/mL左右，2个样品小于1.9U/mL小于规定阳性切值0.01～6.2U/g，诊断为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症，该方法与全自动生化分析仪上的双速率法结果(17.86土4.84U/mL)一致。

实施例2、3

与实施例1相比，分别将酶淬灭剂替换为甲醇、乙腈∶甲醇＝1∶1(V/V)。

取同一质控样，分别采用不同的酶淬灭剂，按照实施例1的方法检测6-磷酸葡萄糖脱氢酶含量，实施例2和3的酶淬灭剂均可获得理想的检测效果，并且不影响苯丙氨酸和17-α-羟孕酮的检测结果。

实施例4～10

与实施例1相比，将试剂盒中的复溶剂替换为如表6所示的配方。

取同一质控样，分别采用表6所示配方的复溶剂，按照实施例1的方法检测苯丙氨酸、17-α-羟孕酮和6-磷酸葡萄糖脱氢酶含量，均可获得理想的检测效果，并且实验的重复性较好。

表6不同复溶剂的组成配方

实施例	复溶剂组分及其比例
		实施例1	乙腈∶水＝1∶1
实施例4	乙腈
		实施例5	甲醇
实施例6	甲醇∶水＝1∶1
		实施例7	乙醇∶水＝1∶1
实施例8	乙腈∶水＝4∶1
		实施例9	甲醇∶水＝4∶1
实施例10	乙醇∶水＝4∶1

实施例11～16

需要预包被的校准品中包括苯丙氨酸、17-α-羟孕酮、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苯丙氨酸-d8和17-α-羟孕酮-d8。按照表7所示的先后顺序包被所有的溶液，按照实施例1的方法检测苯丙氨酸、17-α-羟孕酮和6-磷酸葡萄糖脱氢酶含量，均可获得理想的检测效果。

表7校准品预包被顺序

实施例17

取一质控样品预先包被内标溶液苯丙氨酸-d8和17-α-羟孕酮-d8，加入160uL酶稀释液和200uL的孵育液，盖上封片，振荡30秒后，放入恒温孵育震荡器中，在37℃温度中100rpm振动孵育30分钟。

取同一质控样品没有包被内标液，加入20uL内标液的混合液，加入160uL酶稀释液和200uL的孵育液，盖上封片，振荡30秒后，放入恒温孵育震荡器中，在37℃温度中100rpm振动孵育30分钟。

按照实施例1的方法检测苯丙氨酸、17-α-羟孕酮和6-磷酸葡萄糖脱氢酶含量，都可以获得较理想的检测结果。

实施例18～22

与实施例1相比，分别将流动相替换为如表8所示的配方，按照实施例1的方法检测苯丙氨酸、17-α-羟孕酮和6-磷酸葡萄糖脱氢酶含量，都可以获得较理想的检测结果，超出表8所示的配方范围后，信号强度变低，准确度下降，回收率会下降或者升高。

表8不同流动相配方

流动相配方	流动相B	流动相A
			实施例1	乙腈	10mmol/L乙酸铵，pH10
实施例18	甲醇	10mmol/L乙酸铵，pH10
			实施例19	甲醇∶乙腈＝1∶1	10mmol/L甲酸铵，pH9
实施例20	甲醇∶乙腈＝1∶1	20mmol/L甲酸铵，pH11
			实施例21	甲醇∶乙腈＝99∶1	20mmol/L甲酸铵，pH10
实施例22	甲醇∶乙腈＝4∶1	5mmol/L乙酸铵，pH10

实施例23～28

与实施例1相比，试剂盒中，内标物没有预包被在96孔孵育板中，而是需要后续配制成一定浓度的内标溶液加入校准样和待测样中。

内标溶液中苯丙氨酸-d8和17-α-羟孕酮-d8的浓度均为300ng/mL。所采用的内标稀释液的溶剂如表9所示，按照实施例1的方法检测苯丙氨酸、17-α-羟孕酮和6-磷酸葡萄糖脱氢酶含量，都可以获得较理想的检测结果。

表9不同内标稀释液配方

实施例	内标稀释液配方
		实施例23	50％甲醇
实施例24	80％甲醇
		实施例25	甲醇∶乙腈＝4∶6
实施例26	甲醇∶乙腈＝1∶1
		实施例27	甲醇
实施例28	乙腈

实施例29

与实施例1相比，将步骤(1)中的孵育时间调整为15min，按照实施例1的方法检测6-磷酸葡萄糖脱氢酶含量，也可获得较理想的检测结果。

孵育时间越久，产物6-PGA的含量就越高，底物G-6P的量会减少，变化趋势比较明显，并且孵育时间的变化不影响苯丙氨酸和17-α-羟孕酮的检测结果。

以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种同时检测PKU、CAH和G-6PD缺乏症的串联质谱试剂盒，其特征在于，包括：校准品、同位素内标品、孵育液、稀释剂、酶淬灭剂、复溶剂和流动相；

所述的校准品含有苯丙氨酸、1-α-羟孕酮和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；

所述的同位素内标品含有苯丙氨酸-d8和17-α-羟孕酮-d8；

所述的稀释剂由水、缓冲盐和表面活性剂组成；

2.根据权利要求1所述的串联质谱试剂盒，其特征在于，校准品有多个，多个校准品的浓度呈梯度分布；

校准品中，苯丙氨酸的浓度为5～200ug/mL；17-α-羟孕酮的浓度为0.1～200ng/mL；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的浓度为0.02～0.8U/mL。

3.根据权利要求1所述的串联质谱试剂盒，其特征在于，所述的孵育液中，缓冲盐浓度为0.5～400mmol/L，葡萄糖-6-磷酸浓度为1.0～50mmol/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸浓度为0.5～30mmol/L，表面活性剂的浓度为2～50g/L。

4.根据权利要求3所述的串联质谱试剂盒，其特征在于，所述的表面活性剂为皂素、聚山梨酯、泊洛沙姆、磷脂和十二烷基硫酸钠中的一种或多种；所述的缓冲液为磷酸盐缓冲盐或Tris缓冲盐。

5.根据权利要求1所述的串联质谱试剂盒，其特征在于，所述的流动相A中，甲酸铵和/或乙酸铵水溶液的浓度为2～50mmol/L；所述的流动相A的pH为9～11。

6.根据权利要求5所述的串联质谱试剂盒，其特征在于，所述的流动相中，流动相A为乙酸铵水溶液，乙酸铵的浓度为10mmol/L，pH为10；流动相B为乙腈。

7.一种使用权利要求1～6任一项所述的串联质谱试剂盒同时检测PKU、CAH和G-6PD缺乏症的方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，色谱条件为：色谱柱为BEH-C18；柱温为45℃；流动相流速为0.3mL/min，0～1min：90％流动相A-10％流动相B，1～3min：90％→25％流动相A-10％→75％流动相B，3～4min：25％流动相A-75％流动相B，4～5min：25％→90％流动相A-75％→10％流动相B，5～5.5min：90％流动相A-10％流动相B；进样体积为10uL。

9.根据根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，质谱条件为：采用电喷雾正、负离子多离子反应监控扫描模式，Q1/Q3离子通道分别选择为17-α-羟孕酮：331.18→109.09amu、97.1amu；苯丙氨酸：164.00→71.8amu；葡萄糖-6-磷酸：258.76→96.94amu；6-磷酸葡糖酸：274.9→96.9amu。