CN108088934A - 一种同时检测cah多种相关物质的方法和试剂盒 - Google Patents

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CN108088934A CN201711145766.9A CN201711145766A CN108088934A CN 108088934 A CN108088934 A CN 108088934A CN 201711145766 A CN201711145766 A CN 201711145766A CN 108088934 A CN108088934 A CN 108088934A
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叶文利
陈晓敏
卢鹏飞
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Abstract

本申请公开了一种同时检测CAH多种相关物质的方法和试剂盒。本申请同时检测CAH多种相关物质的方法，包括同时检测17α羟孕酮、雄烯二酮、11‑脱氧皮质醇、21‑脱氧皮质醇和皮质醇；该方法包括(1)在混合内标准品中加有机溶剂，制成储备液，再稀释成提取工作液；(2)用提取工作液孵育待测血斑样本；(3)离心，取上清液浓缩，用45％甲醇复溶；(4)用LC‑MS/MS检测复溶产物；混合内标准品包括17α羟孕酮、雄烯二酮、11‑脱氧皮质醇、21‑脱氧皮质醇和皮质醇的同位素内标准品。本申请，一次性定量五种激素，能提供特异、灵敏、假阳性低、阳性预测值高的CAH筛查，能同时筛查11‑OHD和21‑OHD两大类CAH，提高了筛查效率和质量。

Description

一种同时检测CAH多种相关物质的方法和试剂盒
技术领域
本申请涉及先天性肾上腺皮质增生症相关物质检测领域，特别是涉及一种同时检测CAH多种相关物质的方法和试剂盒。
背景技术
先天性肾上腺皮质增生症(缩写CAH)是一组由于肾上腺皮质类固醇激素合成代谢过程中某种酶活性缺乏导致皮质醇合成障碍的常染色体隐性遗传性疾病，临床主要表现为肾上腺皮质功能减退，部分患儿伴有电解质紊乱及性腺发育异常，在新生儿期可因肾上腺皮质功能危象而危及生命。CAH根据酶缺乏分为6型，如表1所示，其中最常见的是21-羟化酶缺乏症(21-OHD)，占90％～95％，其次为11-羟化酶缺乏症(11-OHD)，占5％～8％，其它类型的较少见。
表1 CAH的缺陷类型及发病率
国际上新生儿CAH筛查，即21-OHD筛查，起始于1977年，至今已有30多个国家开展了新生儿筛查。我国CAH筛查起步于20世纪90年代初，目前全国有近百家新生儿筛查中心开展了CAH筛查。因其筛查效果显著，可降低新生儿死亡率，减少女婴外生殖器男性化而造成性别误判，改善生长发育，因此在全国普及新生儿CAH筛查已成为必然趋势。
目前CAH新生儿筛查技术主要采用时间分辨荧光分析法和酶联免疫法测定干滤纸片中17α羟孕酮(缩写17αOHP)浓度，例如美国PerkinElmer公司开发的“先天性肾上腺皮质增生症测定试剂盒(时间分辨免疫荧光法)”，和国内达瑞生物技术股份有限公司开发的“17α-羟孕酮定量测定试剂盒(时间分辨免疫荧光法)”。但是，这些技术由于存在交叉反应，特异性低，导致假阳性率高，阳性预测值低，使CAH筛查面临高度挑战。并且，单纯测定17αOHP的浓度只能检测出21-OHD中约90％左右的失盐型，有约10％的新生儿患者不能被筛查出来；同时，对于占CAH发病率相对较高的11-OHD也不能有效检出。
根据《先天性肾上腺皮质增生症新生儿筛查共识》，可采用LC-MS/MS技术进行二次筛查，LC-MS/MS是指液相色谱-串联质谱，即液相色谱与二级串联质谱联用；LC-MS/MS具有较高的特异性和敏感性，可提高阳性预测。但是，目前尚没有相关的高效检测试剂盒。
发明内容
本申请的目的是提供一种改进的同时检测CAH多种相关物质的方法和试剂盒。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种同时检测CAH多种相关物质的方法，该方法可以同时检测17α羟孕酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇和皮质醇；该方法包括以下步骤，
(1)提取工作液的制备：直接在混合内标准品中加入有机溶剂，混合均匀，制成内标准品储备液，采用有机溶剂对内标准品储备液进行稀释，制成提取工作液；在使用量比较大的情况下，也可以直接在混合内标准品中加入大量有机溶剂，制成提取工作液；
(2)采用步骤(1)制备的提取工作液对待测血斑样本进行孵育；
(3)对步骤(2)孵育的产物进行离心，取上清液，对上清液进行浓缩，并采用45％甲醇复溶；本申请的一种实现方式中，采用氮气吹干，浓缩；
(4)采用LC-MS/MS对45％甲醇复溶的产物进行检测，获得待测血斑样本中17α羟孕酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇和皮质醇的信息；
其中，混合内标准品包括17α羟孕酮同位素内标准品、雄烯二酮同位素内标准品、11-脱氧皮质醇同位素内标准品、21-脱氧皮质醇同位素内标准品和皮质醇同位素内标准品。
需要说明的是，本申请的检测方法，通过对提取工作液进行改进，具体的，在提取工作液中同时添加17α羟孕酮同位素内标准品、雄烯二酮同位素内标准品、11-脱氧皮质醇同位素内标准品、21-脱氧皮质醇同位素内标准品和皮质醇同位素内标准品，并采用液相色谱-串联质谱，在检测外周血制备而成的干血片样本时，仅需约6μL血液样本就可以一次性定量五种激素，根据五种激素的检测情况，能够提供特异性强、灵敏度高、假阳性率低、阳性预测值高的CAH筛查，并且，能够同时筛查11-OHD和21-OHD两大类常见的缺陷型CAH，提高了CAH筛查效率和筛查质量。
还需要说明的是，本申请的提取工作液中，17α羟孕酮同位素内标准品、雄烯二酮同位素内标准品、11-脱氧皮质醇同位素内标准品、21-脱氧皮质醇同位素内标准品和皮质醇同位素内标准品，可以采用市售的各种同位素标准品，如美国剑桥实验室提供的17α羟孕酮同位素标准品、皮质醇同位素标准品，cerilliant公司提供的11-脱氧皮质醇同位素标准品、21-脱氧皮质醇同位素标准品，sigma公司提供的雄烯二酮同位素标准品等，在此不做具体限定。
优选的，步骤(4)中，液相色谱分离采用的流动相由水相和有机相组成；水相由水中添加流动相添加剂A和流动相添加剂B制成；有机相由甲醇中添加流动相添加剂A和流动相添加剂B制成；其中，流动相添加剂A为乙酸铵，流动相添加剂B为甲酸。
优选的，步骤(2)中，孵育的条件为，20～40℃、400rpm～800rpm条件下振荡30～60分钟。
优选的，步骤(1)中，有机溶剂为甲醇。
优选的，本申请的方法还包括，采用标准曲线对17α羟孕酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇和皮质醇进行绝对定量；标准曲线为对含有已知梯度浓度标准品的人全血滤纸干血片的检测结果进行线性拟合得到的曲线，通过标准曲线可以直接计算待测血斑样本中17α羟孕酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇或皮质醇的浓度。
本申请的一种实现方式中，标准曲线由分别含有八个浓度点0.5、2.5、12.5、25、50、100、200、400ng/mL标准品的人全血滤纸干血片的检测结果拟合而成。各浓度点的人全血滤纸干血片中，17α羟孕酮标准品、雄烯二酮标准品、11-脱氧皮质醇标准品、21-脱氧皮质醇标准品和皮质醇标准品的浓度都相同；例如含400ng/mL标准品的人全血滤纸干血片中，五个标准品的浓度都是400ng/mL。以17α羟孕酮标准曲线为例，八个浓度点的人全血滤纸干血片中分别含有17α羟孕酮标准品的浓度分别为0.5、2.5、12.5、25、50、100、200、400ng/mL；通过八个浓度点标准品人全血滤纸干血片的检测结果进行线性拟合，得到17α羟孕酮的标准曲线，由该标准曲线可以直接计算待测血斑样本中17α羟孕酮的浓度。因此，本申请的标准曲线实际上由17α羟孕酮标准曲线、雄烯二酮标准曲线、11-脱氧皮质醇标准曲线、21-脱氧皮质醇标准曲线和皮质醇标准曲线组成。
本申请的一种实现方式中，八个浓度点标准品人全血滤纸干血片的制备方式包括：在空白全血中加入不同浓度的标准品，配制成含不同目标物浓度的全血溶液，每个血斑是取50μL全血点在采集卡上得到，通风橱内晾干4h以上，密封保存。标准曲线由八个浓度点组成，即cal1至cal8的浓度分别为：0.5、2.5、12.5、25、50、100、200、400ng/mL。
需要说明的是，本申请的方法中，标准曲线采用与待测血斑样本一样的基质和形式，保障了结果的准确性；并且，采用标准曲线系列进行绝对定量，使得检测值更加准确。
本申请的另一面公开了一种同时检测CAH多种相关物质的试剂盒，其中，CAH多种相关物质包括17α羟孕酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇和皮质醇，该试剂盒用于采用LC-MS/MS对待测血斑样本进行检测，试剂盒包括独立包装的以下组分，
(A)混合同位素内标准品；
(B)标准曲线制品，标准曲线制品为含有已知梯度浓度的17α羟孕酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇和皮质醇，五种激素的人全血滤纸干血片；本申请的一种实现方式中，具体采用八个浓度点组成，即cal1至cal8的浓度依序为：0.5、2.5、12.5、25、50、100、200、400ng/mL，本申请的标准曲线制品中同时混合有五种激素标准品，在同一浓度点的标准曲线制品中五种激素标准品的浓度相同，例如cal1标准曲线制品中五种激素标准品的浓度都是0.5ng/mL；
(C)质控品，质控品为含有已知浓度的17α羟孕酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇和皮质醇，五种激素的人全血滤纸干血片；本申请的一种实现方式中，质控品包括低浓度、中浓度和高浓度三套质控品；
(D)流动相添加剂A，流动相添加剂A为乙酸铵；
(E)流动相添加剂B，流动相添加剂B为甲酸；
(F)QA制品，QA制品为含有17α羟孕酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇和皮质醇，五种激素的纯标准品；
其中，混合同位素内标准品由17α羟孕酮同位素内标准品、雄烯二酮同位素内标准品、11-脱氧皮质醇同位素内标准品、21-脱氧皮质醇同位素内标准品和皮质醇同位素内标准品混合而成。
需要说明的是，本申请的试剂盒中，质控品用于评估检测的稳定性和准确性，即检测质控品中各个分析物浓度的波动范围，本申请的一种实现方式中，用变异系数CV表示，CV＝标准偏差/均值，通过质控品的多次检测结果，分析各个分析物的CV值，当CV≤20％时，表示仪器状态良好，采集数据良好。QA制品用于检测系统的适配性，例如样本上机检测前，先检测QA，看色谱柱的性能是否满足要求，质谱的灵敏度是否达到要求。标准曲线制品用于对待测分析物进行绝对定量。流动相添加剂A和流动相添加剂B用于制备液相色谱分离的流动相。
优选的，本申请的试剂盒中还包括V型底96孔板、铝箔封口膜、甲醇、色谱柱和使用说明书中的至少一种。
需要说明的是，V型底96孔板、铝箔封口膜、甲醇和色谱柱可以选择性的加入试剂盒中，以方便使用，也可以单独另行购置；除此之外，其它的试验耗材也可以加入到试剂盒中，或单独购置，在此不做具体限定。使用说明书实际上就是按照本申请的方法和实施例中记载的内容所编写的试验操作步骤。
本申请的再一面公开了本申请的试剂盒，在制备先天性肾上腺皮质症疾病检测药物或装置中的应用。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请的检测方法，可以一次性定量检测五种激素，根据五种激素的检测情况，能够提供特异性强、灵敏度高、假阳性率低、阳性预测值高的CAH筛查，并且，能够同时筛查11-OHD和21-OHD两大类常见的缺陷型CAH，提高了CAH筛查效率和筛查质量。
附图说明
图1是本申请实施例中检测结果判读图；
图2是本申请实施例中QA制品的LC-MS/MS检测结果图；
图3是本申请实施例中疑似阳性样本的色谱图；
图4是本申请实施例中健康人样本的色谱图。
具体实施方式
现有的试剂盒主要采用时间分辨荧光分析法和酶联免疫法，存在交叉反应、特异性低、导致假阳性率高、阳性预测值低等不足，并且，无法有效检出11-OHD。虽然《先天性肾上腺皮质增生症新生儿筛查共识》中提及可以采用LC-MS/MS技术进行二次筛查，以提高灵敏度和阳性预测值；但是，目前并没有相关的试剂盒。为此，本申请经过大量的研究和试验提出了一种特别用于LC-MS/MS检测先天性肾上腺皮质增生症的试剂盒，并提供了相应的试剂盒的使用方法。
本申请的方法和试剂盒，仅需2个血点，约6μL血液样本就可以一次性定量五种激素，根据五种激素的定量结果，可以特异性强、灵敏度高的进行CAH筛查；本申请的方法和试剂盒是直接对五种激素的量进行检测，不存在交叉反应的问题，并且假阳性率低；更为重要的是，本申请的方法和试剂盒能够同时筛查11-OHD和21-OHD两大类常见的缺陷型CAH，提高了CAH筛查效率和筛查质量。
下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
本例的试剂盒包括独立包装的以下组分：
(A)混合同位素内标准品，1瓶，1瓶混合同位素内标准品的重量为100ng；其中，包括25ng的17α羟孕酮同位素内标准品13C3-17αOHP、25ng的雄烯二酮同位素内标准品、12.5ng的11-脱氧皮质醇同位素内标准品、12.5ng的21-脱氧皮质醇同位素内标准品和25ng的皮质醇同位素内标准品；
(B)标准曲线制品，1套；标准曲线制品为含有已知梯度浓度的17α羟孕酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇和皮质醇，五种激素的人全血滤纸干血片，1套总计8张，分别标记为cal1至cal8；
cal1中含有0.5ng/mL的17α羟孕酮、0.5ng/mL的雄烯二酮、0.5ng/mL的11-脱氧皮质醇、0.5ng/mL的21-脱氧皮质醇和0.5ng/mL的皮质醇；
cal2中含有2.5ng/mL的17α羟孕酮、2.5ng/mL的雄烯二酮、2.5ng/mL的11-脱氧皮质醇、2.5ng/mL的21-脱氧皮质醇和2.5ng/mL的皮质醇；
cal3中含有12.5ng/mL的17α羟孕酮、12.5ng/mL的雄烯二酮、12.5ng/mL的11-脱氧皮质醇、12.5ng/mL的21-脱氧皮质醇和12.5ng/mL的皮质醇；
cal4中含有25ng/mL的17α羟孕酮、25ng/mL的雄烯二酮、25ng/mL的11-脱氧皮质醇、25ng/mL的21-脱氧皮质醇和25ng/mL的皮质醇；
cal5中含有50ng/mL的17α羟孕酮、50ng/mL的雄烯二酮、50ng/mL的11-脱氧皮质醇、50ng/mL的21-脱氧皮质醇和50ng/mL的皮质醇；
cal6中含有100ng/mL的17α羟孕酮、100ng/mL的雄烯二酮、100ng/mL的11-脱氧皮质醇、100ng/mL的21-脱氧皮质醇和100ng/mL的皮质醇；
cal7中含有200ng/mL的17α羟孕酮、200ng/mL的雄烯二酮、200ng/mL的11-脱氧皮质醇、200ng/mL的21-脱氧皮质醇和200ng/mL的皮质醇；
cal8中含有400ng/mL的17α羟孕酮、400ng/mL的雄烯二酮、400ng/mL的11-脱氧皮质醇、400ng/mL的21-脱氧皮质醇和400ng/mL的皮质醇；
(C)质控品，3套；质控品为含有已知浓度的17α羟孕酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇和皮质醇，五种激素的人全血滤纸干血片，3套质控品总计包括人全血滤纸干血片3张，即低浓度质控品、中浓度质控品、高浓度质控品各1张；其中，低浓度质控品中五种激素的浓度都是5ng/mL，中浓度质控品中五种激素的浓度都是50g/mL，高浓度质控品中五种激素的浓度都是125g/mL；
(D)流动相添加剂A，1瓶；流动相添加剂A为乙酸铵；
(E)流动相添加剂B，1瓶；流动相添加剂B为甲酸；
(F)QA制品，1瓶；QA制品为含有纯17α羟孕酮、纯雄烯二酮、纯11-脱氧皮质醇、纯21-脱氧皮质醇和纯皮质醇的纯标准品，1瓶QA制品的重量为0.25ng；其中，包括0.05ng的17α羟孕酮、0.025ng的雄烯二酮、0.1ng的11-脱氧皮质醇、0.025ng21-脱氧皮质醇和0.05ng的皮质醇；
(G)V型底96孔板，2块；
(H)铝箔封口膜，2张；
(I)使用说明书，1份。
试剂盒于-20℃以下保存。另外，根据使用需求，试剂盒中还可以放置甲醇、色谱柱等耗材，在此不做具体限定。
使用说明书中披露了本例试剂盒的主要成份和使用方法，其中，主要成份包括以上(A)-(I)。使用方法包括试剂的配制，和同时检测17α羟孕酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇和皮质醇等五种激素的方法，详细如下：
1.日常工作液制备
提取工作液配制：向1瓶混合同位素内标准品中加入250μL甲醇，溶解同位素内标准品，制成内标准品储备液；然后按照内标准品储备液:甲醇为1:99的比例进行稀释，制成提取工作液。
2.打孔并加样
使用自动或手动打孔器在干血斑上将滤纸血片打孔，并将滤纸血片移入提供的V型截底的洁净微孔板的板孔内。纸盘的直径应约为3.2mm，即1/8英寸。
试验时，每个板孔只加入两个干血点。每个板都设置标准曲线制品孔、质控品孔；标准曲线制品孔包括Cal1至Cal8八个孔，每个孔放相应编号的2个人全血滤纸干血点；质控品孔包括高浓度、中浓度、低浓度三个孔，每个孔放相应浓度的2个人全血滤纸干血点。
使用多道移液器以反向加样法给每个含有滤纸血点的板孔内添加200μL的提取工作液。用封膜封好，将挥发量降低到最小。
3.孵育
将微孔板置于孵育器或振荡器内，在25℃，550rpm条件下振荡30分钟。
4.浓缩
孵育完成后，3000rpm，4℃离心20min，取150μL上清至V型底的上机板的板孔内，使用氮气吹干。
5.复溶
每个孔中加入75μL 45％甲醇，用封膜封好，然后置于振荡器上涡旋震荡1min，3000rpm，4℃离心5min，使浓缩产物复溶。
6.质谱上机检测
采用LC-MS/MS对复溶的产物进行检测。
其中，液相色谱分离采用的流动相由水相和有机相组成，
流动A，即水相：500mL纯水中分别加入200μL流动相添加剂A和200μL流动相添加剂B；
流动B，即有机相：500mL甲醇中分别加入200μL流动相添加剂A和流动相添加剂B；
在QA瓶内加入500μL 50％甲醇，震荡1min。QA复溶后直接进行LC-MS/MS分析检测，通过QA判断液相系统的性能是否正常，即色谱峰的保留时间是否正常，峰形是否正常，质谱的灵敏度是否达到要求，即应看到每个化合物的质谱响应。
7.定量结果报告
根据仪器设定程序自动得到各个分析物的浓度，具体的，自动获得17α羟孕酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇和皮质醇，五种激素的浓度，并且，根据标准曲线Cal1至Cal7对五种激素进行绝对定量。
根据以上五种激素的定量检测，同时筛查11-OHD和21-OHD两大类常见的缺陷型CAH。具体的，五种激素检测的判读流程如图1所示，图中，Y＝Yes，N＝No，Negative代表阴性，即健康人群，Positive代表阳性，即患病；F1＝17OHP男性阈值为7.1，女性阈值为4.1，小于F1为健康，大于F1进行下一步判读；F2＝(17OHP+A4)/F，F2的阈值为2.51，大于F2为21-OHD，小于F2进行下一步判读；F3＝11DOC，F3的阈值为10.1，大于F3为11-OHD，小于F3进行下一步判读；F4＝21DOC，F4的阈值为1.7，大于F4为21-OHD，小于F4为健康。
其中，17OHP即17α羟孕酮的浓度，A4即雄烯二酮浓度，F即皮质醇浓度，11DOC即11-脱氧皮质醇的浓度，21DOC即21-脱氧皮质醇浓度。
试验例：
本例分别对1例21-羟化酶缺乏症，1例11-羟化酶缺乏症和1例疑似先天性肾上腺皮质增生症的血液样本进行了检测。所有血液样本由深圳华大生命科学研究院提供和保存。
按照本例提供的试剂盒的使用方法，本例首先对质控品进行了检测，以评估仪器是否波动，即检测质控品中各个分析物浓度的波动范围，用变异系数CV表示，CV＝标准偏差/均值，当CV≤20％时则表示仪器状态良好，方法稳定，采集数据良好。本例在不同天内对质控品进行了三批检测，批次1进行9个重复试验，批次2进行14个重复试验，批次3进行14个重复试验。计算各分析物浓度每批次的CV值和各批次间的CV值，如表2所示。
表2质控品各分析物的CV值
化合物 批次1(n＝9) 批次2(n＝14) 批次3(n＝14) 批间
17α羟孕酮 8.15％ 9.08％ 7.63％ 8.91％
雄烯二酮 7.30％ 7.57％ 6.39％ 7.12％
11-脱氧皮质醇 7.82％ 9.84％ 7.21％ 8.67％
21-脱氧皮质醇 5.87％ 7.87％ 8.43％ 7.87％
皮质醇 8.45％ 8.67％ 8.47％ 9.15％
表2中，n为重复次数。
表2的结果显示，各分析物的CV值都小于20％，证明仪器状态良好，采集数据良好，可以用于检测。
按照本例提供的试剂盒的使用方法，对QA制品进行了LC-MS/MS检测，以检测系统的适配性。结果如图2所示，结果显示，色谱峰的保留时间未偏移，色谱峰形对称，同时，21DOC与Cort和11DOC(S)为同分异构体，三者的保留时间分别为2.07、2.27、2.39，从图上可以看出，三个色谱峰基本达到基线分离，说明液相系统的性能正常；每个化合物均有明显的响应，说明质谱的灵敏度符合要求，液相质谱系统适合进一步对样本进行检测。
按照本例提供的试剂盒及其使用方法，对21-羟化酶缺乏症、11-羟化酶缺乏症和疑似先天性肾上腺皮质增生症的血液样本进行检测，结果如表3和图3、图4所示。
表3样本检测的各激素的浓度(单位：ng/mL)
样本 17αOHP 雄烯二酮 11-脱氧皮质醇 21-脱氧皮质醇 皮质醇
21-OHD样本 40.78 26.61 0.56 0.37 1.87
11-OHD样本 1.13 16.58 134.24 0.35 4.76
疑似CAH样本 1.65 0.69 0.07 0.21 28.3
表3的结果显示，21羟化酶缺陷样本，即21-OHD样本中，17αOHP含量为40.78ng/mL，大于10ng/mL，(17αOHP+雄烯二酮)/皮质醇的值为36.04，大于2.5；判定其为21-羟化酶缺乏症。
11羟化酶缺陷样本，11-OHD样本中，11-脱氧皮质醇含量为134.24ng/mL，大于10ng/mL，(11-脱氧皮质醇)/皮质醇的值为28.2，大于1.1；判定其为11-羟化酶缺乏症。
但是，疑似CAH样本经本例的试剂盒筛查，确认为阴性样本。
图3为疑似阳性样本的色谱图，图4为正常样本的色谱图，即正常健康人样本的色谱图。图3和图4的结果显示，疑似阳性样本与正常人的图谱相比，会出现一些与17OHP为同分异构体的干扰物质峰，采用时间分辨免疫荧光法分析由于抗体存在交叉反应，不能区别17OHP和其结果相似的同分异构体，因此导致17OHP的定量结果偏高。本例中由于使用色谱柱，将干扰物质进行分离，因此定量结果不受干扰，疑似阳性样本判断为阴性。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (8)

1.一种同时检测CAH多种相关物质的方法，其特征在于：所述CAH多种相关物质包括17α羟孕酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇和皮质醇；
所述方法包括以下步骤，
(1)提取工作液的制备：直接在混合内标准品中加入有机溶剂，混合均匀，制成内标准品储备液，采用所述有机溶剂对所述内标准品储备液进行稀释，制成提取工作液；
(2)采用步骤(1)制备的提取工作液对待测血斑样本进行孵育；
(3)对步骤(2)孵育的产物进行离心，取上清液，对上清液进行浓缩，并采用45％甲醇复溶；
(4)采用LC-MS/MS对45％甲醇复溶的产物进行检测，获得待测血斑样本中17α羟孕酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇和皮质醇的信息；
所述混合内标准品包括17α羟孕酮同位素内标准品、雄烯二酮同位素内标准品、11-脱氧皮质醇同位素内标准品、21-脱氧皮质醇同位素内标准品和皮质醇同位素内标准品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，液相色谱分离采用的流动相由水相和有机相组成；
所述水相由水中添加流动相添加剂A和流动相添加剂B制成；
所述有机相由甲醇中添加流动相添加剂A和流动相添加剂B制成；
所述流动相添加剂A为乙酸铵，所述流动相添加剂B为甲酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，孵育的条件为，20～40℃、400rpm～800rpm条件下振荡30～60分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，有机溶剂为甲醇。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：还包括，采用标准曲线对所述17α羟孕酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇和皮质醇进行绝对定量；所述标准曲线为对含有已知梯度浓度标准品的人全血滤纸干血片的检测结果进行线性拟合得到的曲线，通过所述标准曲线可以直接计算所述待测血斑样本中17α羟孕酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇或皮质醇的浓度。
6.一种同时检测CAH多种相关物质的试剂盒，所述CAH多种相关物质包括17α羟孕酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇和皮质醇，所述试剂盒用于采用LC-MS/MS对待测血斑样本进行检测，其特征在于：
所述试剂盒中包括独立包装的以下组分，
(A)混合同位素内标准品；
(B)标准曲线制品，所述标准曲线制品为含有已知梯度浓度的17α羟孕酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇和皮质醇，五种激素的人全血滤纸干血片；
(C)质控品，所述质控品为含有已知浓度的17α羟孕酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇和皮质醇，五种激素的人全血滤纸干血片；
(D)流动相添加剂A，所述流动相添加剂A为乙酸铵；
(E)流动相添加剂B，所述流动相添加剂B为甲酸；
(F)QA制品，所述QA制品为含有17α羟孕酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇和皮质醇，五种激素的纯标准品；
所述混合同位素内标准品由17α羟孕酮同位素内标准品、雄烯二酮同位素内标准品、11-脱氧皮质醇同位素内标准品、21-脱氧皮质醇同位素内标准品和皮质醇同位素内标准品混合而成。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括V型底96孔板、铝箔封口膜、甲醇、色谱柱和使用说明书中的至少一种。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，在制备先天性肾上腺皮质症疾病检测药物或装置中的应用。
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