CN116930385B - 一种高盐浓度制剂中化合物浓度的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高盐浓度制剂中化合物浓度的测定方法，包括如下步骤：S1、采用稀释溶液将高盐浓度制剂稀释成待测液；S2、采用稀释溶液将标准品稀释成不同浓度梯度的标准工作液；S3、采用液相色谱质谱联用法对待测液、标准工作液进行测定；其中，稀释溶液包括：稀释剂和乙腈水溶液，稀释剂包括：NaCl：130‑150mM，KCl：3‑4mM，HEPES：8‑12mM，D‑葡萄糖：8‑12mM，NaH2PO4·2H2O：1.0‑1.5mM，MgCl2·6H2O：0.8‑1.2mM，CaCl2·2H2O：1.8‑2.2mM。本发明能够减少高盐浓度制剂对质谱的影响，而且测定的精密度和准确度高。
Description
技术领域
本发明涉及试剂检测技术领域，尤其是涉及一种高盐浓度制剂中化合物浓度的测定方法。
背景技术
在hERG试验中，需要对配制的药物制剂进行药物浓度的准确测定，要求测定回收率在90-110％之间。然而，由于某些药物的配制浓度较低(小于1uM)，因此常采用LC-MS或LC-MS/MS来进行检测。
此外，由于制备药物制剂的溶媒比较复杂，其中含有大量的盐离子，这些高盐浓度制剂中的高浓度盐离子对质谱的寿命及药物浓度的检测结果均造成很大的影响。然而，常规的检测方法无法对高盐浓度制剂中的药物浓度进行准确测定，导致hERG申报或GLP试验无法准确测定。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高盐浓度制剂中化合物浓度的测定方法，该方法能够减少高盐浓度制剂对质谱的影响，对高盐浓度制剂中化合物测定的精密度和准确度高。
本发明提供一种高盐浓度制剂中化合物浓度的测定方法，包括如下步骤：
S1、采用稀释溶液将高盐浓度制剂稀释成待测液；
S2、采用稀释溶液将标准品稀释成不同浓度梯度的标准工作液；
S3、采用液相色谱质谱联用法对待测液、标准工作液进行测定；
其中，所述稀释溶液包括：稀释剂和乙腈水溶液，所述稀释剂包括：NaCl：130-150mM，KCl：3-4mM，HEPES：8-12mM，D-葡萄糖：8-12mM，NaH2PO4·2H2O：1.0-1.5mM，MgCl2·6H2O：0.8-1.2mM，CaCl2·2H2O：1.8-2.2mM。
优选的，步骤S1包括：
S11、称取高盐浓度制剂，加入适量乙醇，混匀溶解后得到母液，再用乙醇将母液稀释得到不同浓度的中间液；
S12、将步骤S11的母液和中间液加入到含有稀释剂的容器中，涡旋超声得到不同浓度的制剂样品；
S13、从步骤S12的制剂样品上、中、下层各取一份，再用稀释溶液分别稀释，得到不同浓度梯度的待测液。
优选的，步骤S2包括：
S21、称取标准品，加入适量乙醇，混匀溶解后得到标准品储备液；
S22、将步骤S21的标准品储备液用稀释溶液稀释得到不同浓度梯度的标准工作液。
优选的，步骤S3的液相色谱质谱联用法中采用C18色谱柱，流动相的水相为0.1％甲酸水溶液，流动相的有机相为0.1％乙腈水溶液。
本发明对高盐浓度制剂不作严格限制，例如可以为维拉帕米(Verapamil)、雷诺嗪(Ranolazine)或阿米替林(Amitriptyline)中的任一种。
在一个具体实施方式中，所述高盐浓度制剂为维拉帕米时，步骤S3中液相色谱质谱联用法的分析条件为：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×50mm Column；
流动相(水相)：0.1％甲酸水溶液；
流动相(有机相)：0.1％乙腈水溶液；
采集时间：4min；
流速：0.5mL/min；
进样量：5μL；
柱温：35±5℃；
样品仓温度：20±5℃；
母离子：455.10
锥孔电压：15V
离子源温度：600℃
梯度洗脱比例(有机相：水相)，详见下表15。
表15分析条件
在另一个具体实施方式中，所述高盐浓度制剂为维拉帕米时，步骤S3中液相色谱质谱联用法的分析条件为：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×50mm Column；
流动相(水相)：0.1％甲酸水溶液；
流动相(有机相)：0.1％乙腈水溶液；
采集时间：3min；
流速：0.5mL/min；
进样量：1μL；
柱温：35±5℃；
样品仓温度：15±5℃；
母离子：455.10
锥孔电压：20V
离子源温度：600℃
梯度洗脱比例(有机相：水相)，详见下表6。
表6分析条件
在一个具体实施方式中，所述高盐浓度制剂为雷诺嗪时，步骤S3中液相色谱质谱联用法的分析条件为：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×50mm Column；
流动相(水相)：0.1％甲酸水溶液；
流动相(有机相)：0.1％乙腈水溶液；
采集时间：4min；
流速：0.5mL/min；
进样量：1μL；
柱温：35±5℃；
样品仓温度：20±5℃；
母离子：428.00
锥孔电压：15V
离子源温度：600℃
梯度洗脱比例(有机相：水相)，详见下表16。
表16分析条件
在另一个具体实施方式中，所述高盐浓度制剂为雷诺嗪时，步骤S3中液相色谱质谱联用法的分析条件为：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×50mm Column；
流动相(水相)：0.1％甲酸水溶液；
流动相(有机相)：0.1％乙腈水溶液；
采集时间：2min；
流速：0.5mL/min；
进样量：5μL；
柱温：35±5℃；
样品仓温度：15±5℃；
母离子：428.00
锥孔电压：15
离子源温度：600℃
梯度洗脱比例(有机相：水相)，详见下表10。
表10分析条件
在一个具体实施方式中，所述高盐浓度制剂为阿米替林时，步骤S3中液相色谱质谱联用法的分析条件为：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×50mm Column；
流动相(水相)：0.1％甲酸水溶液；
流动相(有机相)：0.1％乙腈水溶液；
采集时间：4min；
流速：0.5mL/min；
进样量：5μL；
柱温：35±5℃；
样品仓温度：20±5℃；
母离子：278.00
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离子源温度：600℃
梯度洗脱比例(有机相：水相)，详见下表17。
表17分析条件
在另一个具体实施方式中，所述高盐浓度制剂为阿米替林时，步骤S3中液相色谱质谱联用法的分析条件为：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×50mm Column；
流动相(水相)：0.1％甲酸水溶液；
流动相(有机相)：0.1％乙腈水溶液；
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进样量：5μL；
柱温：35±5℃；
样品仓温度：15±5℃；
母离子：278.00
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离子源温度：600℃
梯度洗脱比例(有机相：水相)，详见下表12。
表12分析条件
优选的，所述稀释剂含量为稀释溶液体积分数的5-10％；更优选的，所述稀释剂含量为稀释溶液体积分数的5％、6％、7％、8％、9％或10％。
优选的，所述乙腈水溶液中乙腈的体积分数为40-60％；更优选的，所述乙腈水溶液中乙腈的体积分数为40％、50％、60％。
优选的，所述稀释剂包括：NaCl：140mM，KCl：3.5mM，HEPES：10mM，D-葡萄糖：10mM，NaH2PO4·2H2O：1.25mM，MgCl2·6H2O：1mM，CaCl2·2H2O：2mM。
优选的，所述稀释剂的配制包括如下步骤：按照稀释剂的组成加入各个试剂，再加入一定量的水使其完全溶解后，用NaOH溶液将pH调至7-8，混匀抽滤后得到稀释剂。
优选的，步骤S1和S2中采用低吸附性的配制容器进行各溶液的配制，低吸附性的配制容器可以是表面光滑的玻璃器具，例如容量瓶等。
优选的，还包括以下步骤：使用Empower数据处理软件进行色谱峰的积分、曲线拟合及浓度回算。具体的，拟合方程为y＝ax+b，其中a为方程的斜率，b为方程的截距，x为待测液浓度，y为待测液的峰面积，权重系数为待测液浓度计算公式为：/>
有益效果：
本发明利用液相色谱质谱联用法测定高盐浓度制剂中化合物浓度的方法，采用特定的稀释溶液配制待测液、标准工作液，能够减少高盐浓度制剂对质谱的影响，而且对高盐浓度制剂中化合物测定的精密度和准确度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中采用5％稀释剂-50％乙腈水溶液稀释标曲和制剂结果；
图2为本发明对比例1中采用50％乙腈水溶液稀释标曲和制剂结果；
图3为本发明对比例2中采用稀释剂稀释标曲和制剂结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例对表1中的维拉帕米高盐浓度制剂(简称Verapamil制剂)进行测定，具体的配制及测定步骤如下：
表1受试物Verapamil制剂信息
| 名称 | Verapamil |
| 来源 | Sigma |
| 批号 | MK4993V |
| 性状 | 白色粉末 |
| 纯度 | 100％ |
| 分子量 | 491.06 |
| 保存条件 | 2-8℃ |
| 失效日期 | / |
1、制备中间液
遮光条件下称取约5mg Verapamil受试物于2mL离心管中，用移液器加入适量乙醇，混匀溶解后得到10mM母液，再用乙醇将母液梯度稀释得到Formulation4-M，Formulation3-M，Formulation2-M，Formulation1-M中间液，具体详见下表2。
表2中间液配制
2、制备稀释剂
以配制2L的稀释剂为例，称取量详见下表3，加入一定量的超纯水使其完全溶解后，然后用NaOH溶液将pH调至7.4后转移至2L的容量瓶，再用超纯水定容至2L，混匀抽滤后得到稀释剂，配制完成后2-8℃冰箱保存。
表3稀释剂配制
| 组分 | 浓度(mM) | 质量(g) |
| NaCl | 140.00 | 58.44 |
| KCl | 3.50 | 74.55 |
| HEPES | 10.00 | 238.30 |
| D-Glucose | 10.00 | 180.16 |
| NaH2PO4·2H2O | 1.25 | 156.01 |
| MgCl2·6H2O | 1.00 | 203.30 |
| CaCl2·2H2O | 2.00 | 147.01 |
3、制剂配制
将0.100mM、0.3mM、1.00mM、3.00mM的中间液，10.00mM的母液分别取50μL加入到含有50mL的稀释剂的光滑的玻璃容器稀释后涡旋超声10min后得到制剂样品，方法详见下表4。
表4制剂样品配制
4、制备稀释溶液
(1)50％乙腈水溶液配制
先用量筒量取500mL的乙腈于流动相瓶中，再加入500mL的超纯水,混匀后得到1000mL的50％乙腈水溶液，室温可保存1个月。
(2)5％稀释剂-50％乙腈水溶液配制
取50％乙腈水溶液950mL，再加入50mL的稀释剂，混匀后得到1000mL的稀释溶液(必要时可超声)，室温可保存1个月。
5、制备待测液
将步骤3配制的制剂按如下方法处理：从0.10μM，0.30μM，1.00μM，3.00μM，10μM的制剂样品上、中、下层取1份(每份0.1mL)于15mL离心管中，然后再将各浓度制剂用稀释溶液分别稀释10倍、10倍、100倍、100倍和1000倍。
6、标准工作液的配制
标准品和受试物为同一物质，基本信息详见受试物信息。
称取约5mg Verapamil标准品于15mL离心管中，用移液器加入适量乙醇，混匀溶解后即得1mM储备液。
用稀释溶液将储备液稀释成浓度分别为2.5nM、5nM、10nM、20nM、40nM和80nM的标准工作液。标准工作液用于储备液比对、标准曲线建立和系统适应性，标准工作液的配制方法详见下表5。
表5标准工作液的配制
7、液相色谱质谱测定
采用液相色谱质谱联用法对上述各浓度的待测液进行测定，液相色谱条件如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×50mm Column；
流动相(水相)：0.1％甲酸水溶液；
流动相(有机相)：0.1％乙腈水溶液；
采集时间：3min；
流速：0.5mL/min；
进样量：1μL；
柱温：35±5℃；
样品仓温度：15±5℃；
母离子：455.10
锥孔电压：20V
离子源温度：600℃
梯度洗脱比例(有机相：水相)，详见下表6。
表6分析条件
使用Empower数据处理软件进行色谱峰的积分、曲线拟合及浓度回算；拟合方程为y＝ax+b，其中a为方程的斜率，b为方程的截距，x为待测液浓度，y为待测液的峰面积，权重系数为待测液浓度计算公式为：/>
8、结果与分析
按照上述步骤分别在两天配制三次对0.10μM，0.30μM，1.00μM，3.00μM，10μM的受试物制剂上、中、下层取1份(每份0.1mL)于15mL离心管中，然后再将各浓度制剂用稀释剂分别稀释10倍、10倍、100倍、100倍和1000倍。三次精密度和准确度测定结果汇总如表7-9所示。
表7批次01精密度和准确度
注：精密度(CV％)＝SD/平均值×100；准确度偏差Bias(％)＝(测定浓度-理论浓度)/理论浓度×100。
表8批次02精密度和准确度
表9批次03精密度和准确度
表7-9及图1结果表明：两天内分别配制的3批样品制剂，使用5％稀释剂-50％乙腈水溶液稀释标曲和制剂均满足Verapamil制剂浓度准确度和精密度检测要求。
实施例2
本实施例对雷诺嗪高盐浓度制剂(简称Ranolazine制剂)进行测定，配制及测定步骤如下：
1、制备中间液
在遮光条件下称取约5mg Ranolazine制剂于10mL离心管中，用移液器加入适量超纯水，混匀溶解后制成100mM母液，再采用超纯水将母液梯度稀释为终浓度0.30mM、3.00mM、30.00mM的中间液。
2、制备稀释剂
按表3配制2L稀释剂：在称取各组分后，加入一定量的超纯水使各组分完全溶解，然后用NaOH溶液将pH值调至7.4后转移至2L的容量瓶，再用超纯水定容至2L，混匀抽滤后得到稀释剂，配制完成后于2-8℃冰箱保存。
3、制剂配制
分别取50μL的0.30mM、3.00mM、30.00mM的中间液与50mL的稀释剂溶液混合后超声20分钟后，分别制得浓度为300nM、3000nM、30000nM的高盐浓度制剂。
4、制备稀释溶液
将乙腈与水混合，制得体积含量为50％的乙腈水溶液，简称为50％乙腈水溶液；将上述稀释剂与50％乙腈水溶液混合，制得稀释溶液，稀释溶液中稀释剂的体积含量为5％。
5、制备待测液
从步骤3配制的300nM、3000nM、30000nM的制剂上、中、下层取1份(每份0.1mL)于15mL离心管中，然后再将各浓度制剂用稀释溶液分别稀释10倍、100倍和1000倍分别得到30nM、30nM、30nM的待测液。
6、标准工作液的配制
用稀释溶液将100mM母液稀释成浓度分别为5.00nM、10.00nM、20.00nM、40.00nM、80.00nM和160.00nM的标准工作液。
7、液相色谱质谱测定
采用液相色谱质谱联用法对上述各浓度的待测液进行测定，液相色谱条件如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×50mm Column；
流动相(水相)：0.1％甲酸水溶液；
流动相(有机相)：0.1％乙腈水溶液；
采集时间：2min；
流速：0.5mL/min；
进样量：5μL；
柱温：35±5℃；
样品仓温度：15±5℃；
母离子：428.00
锥孔电压：15
离子源温度：600℃
梯度洗脱比例(有机相：水相)，详见下表10。
表10分析条件
测定结果见表11。
表11测定结果
表11结果表明：使用5％稀释剂-50％乙腈水溶液稀释标曲和制剂均满足Ranolazine制剂浓度准确度和精密度检测要求。
实施例3
本实施例对Amitriptyline高盐浓度制剂(简称Ami制剂)进行测定，配制及测定步骤如下：
1、制备中间液
在遮光条件下称取约5mg Amitriptyline制剂于10mL离心管中，用移液器加入适量超纯水，混匀溶解后制成100mM母液，再采用超纯水将母液梯度稀释为终浓度0.30mM、3.00mM、30.00mM的中间液。
2、制备稀释剂
按表1配制2L稀释剂；在称取各组分后，加入一定量的超纯水使各组分完全溶解，然后用NaOH溶液将pH值调至7.4后转移至2L的容量瓶，再用超纯水定容至2L，混匀抽滤后得到稀释剂，配制完成后于2-8℃冰箱保存。
3、制剂配制
分别取50μL的0.30mM、3.00mM、30.00mM的中间液与50mL的上述稀释剂混合后超声20分钟后，分别制得浓度为300nM、3000nM、30000nM的高盐浓度制剂。
4、制备稀释溶液
将乙腈与水混合，制得体积含量为50％的乙腈水溶液，简称为50％乙腈水溶液；将上述稀释剂与50％乙腈水溶液混合，制得稀释溶液，稀释溶液中稀释剂的体积含量为5％。
5、制备待测液
从300nM、3000nM、30000nM的制剂上、中、下层取1份(每份0.1mL)于15mL离心管中，然后再将各浓度制剂用稀释溶液分别稀释10倍、100倍和1000倍分别得到30nM、30nM、30nM的待测液。
6、标准工作液的配制
用稀释溶液将100mM母液稀释成浓度分别为5.00nM、10.00nM、20.00nM、40.00nM、80.00nM、160.00nM和320.00nM的标准工作液。
7、液相色谱质谱测定
采用液相色谱质谱联用法对上述各浓度的待测液进行测定，液相色谱条件如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×50mm Column；
流动相(水相)：0.1％甲酸水溶液；
流动相(有机相)：0.1％乙腈水溶液；
采集时间：2min；
流速：0.5mL/min；
进样量：5μL；
柱温：35±5℃；
样品仓温度：15±5℃；
母离子：278.00
锥孔电压：15V
离子源温度：600℃
梯度洗脱比例(有机相：水相)，详见下表12。
表12分析条件
测定结果见表13。
表13测定结果
表13结果表明：使用5％稀释剂-50％乙腈水溶液稀释标曲和制剂均满足Amitriptyline制剂浓度准确度和精密度检测要求。
对照例1
本对照例的稀释溶液采用50％乙腈水溶液(即不添加稀释剂)，其余与实施例1一致。
采用实施例1的液相色谱质谱联用法对上述各浓度的待测液进行测定，测定结果见表14。
表14测定结果
注：精密度(CV％)＝SD/平均值×100；准确度偏差Bias(％)＝(测定浓度-理论浓度)/理论浓度×100。
表14及图2结果表明：采用50％乙腈水溶液稀释标曲和制剂，部分制剂准确度和精密度未达到合格标准。
对照例2
本对照例的稀释溶液采用表3的稀释剂(即不添加乙腈水溶液)，其余与实施例1一致。
采用实施例1的液相色谱质谱联用法对上述各浓度的待测液进行测定，测定结果见图3。从图中可以看出：使用稀释剂来稀标曲，结果显示标曲不成线性关系(r<0.99)，无法满足要求，无法使用稀释剂去处理标曲和制剂。
注：用稀释剂稀释的标曲，Verapamil-K0071-C2,Verapamil-K0071-C4,Verapamil-K0071-C5未出峰。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (7)
1.一种高盐浓度药物制剂中药物浓度的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、采用稀释溶液将高盐浓度药物制剂样品稀释成待测液；所述药物制剂为维拉帕米、雷诺嗪或阿米替林中的任一种；具体步骤如下：
S11、称取药物制剂，加入适量乙醇，混匀溶解后得到母液，再用乙醇将母液稀释得到不同浓度的中间液；
S12、将步骤S11的母液和中间液加入到含有稀释剂的容器中，涡旋超声得到不同浓度的高盐浓度药物制剂样品；
S13、从步骤S12的制剂样品上、中、下层各取一份，再用稀释溶液分别稀释，得到不同浓度梯度的待测液；
S2、采用稀释溶液将药物标准品稀释成不同浓度梯度的标准工作液；
S3、采用液相色谱质谱联用法对待测液、标准工作液进行测定；
其中，所述稀释溶液包括：稀释剂和乙腈水溶液，所述稀释剂含量为稀释溶液体积分数的5％，所述乙腈水溶液中乙腈的体积分数为50％；所述稀释剂包括：NaCl：130-150mM，KCl：3-4mM，HEPES：8-12mM，D-葡萄糖：8-12mM，NaH2PO4·2H2O：1.0-1.5mM，MgCl2·6H2O：0.8-1.2mM，CaCl2·2H2O：1.8-2.2mM。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2包括：
S21、称取药物标准品，加入适量乙醇，混匀溶解后得到标准品储备液；
S22、将步骤S21的标准品储备液用稀释溶液稀释得到不同浓度梯度的标准工作液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3的液相色谱质谱联用法中采用C18色谱柱，流动相的水相为0.1％甲酸水溶液，流动相的有机相为0.1％乙腈水溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述稀释剂包括：NaCl：140mM，KCl：3.5mM，HEPES：10mM，D-葡萄糖：10mM，NaH2PO4·2H2O：1.25mM，MgCl2·6H2O：1mM，CaCl2·2H2O：2mM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述稀释剂的配制包括如下步骤：按照稀释剂的组成加入各个试剂，再加入一定量的水使其完全溶解后，用NaOH溶液将pH调至7～8，混匀抽滤后得到稀释剂。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1和S2中采用玻璃器具进行试剂的配制。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：使用Empower数据处理软件进行色谱峰的积分、曲线拟合及浓度回算。
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