JP5116348B2 - 被験物質の評価又はスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
本発明は、被験物質が有している肌質に対する影響を評価する方法、或いは被験物質のなかから肌質に対する影響を有する物質をスクリーニングする方法を提供することができる。ここで、被験物質としては、特に限定されず如何なる物質であってもよい。被験物質としては、単独の物質であってもよいし、複数の構成成分からなる混合物であってもよい。被験物質としては、例えば植物からの抽出物のように未同定の物質を含むような構成であってもよいし、既知の組成物を所定の組成比で含むような構成であってもよい。また、被験物質としては、タンパク質、核酸、脂質、多糖類、有機化合物及び無機化合物のいずれでもよい。
〔実施例1〕
本実施例では、正常ヒト表皮角化細胞を重層培養し、脂質成分の一種であるセラミド成分を解析した。
正常ヒト表皮角化細胞(NHEK) (KURABO社)を使用した。
NHEKを6well Plate (Falcon社)に1wellあたり1×105Cellを播種し、コンフルエントの状態になるまで培養した。なお、NHEKの単層培養も比較例として準備したが、この比較例の培養物この時点で培養を止め回収した。
その後、重層培養用の培地 (DMEM (GIBCO社)、HamF12 (GIBCO社) 、FBS (GIBCO社) 、insulin(SIGMA社)、hydrocortisone(SIGMA社)、VitaminC(SIGMA社))に交換し、10日間培養した。尚、培地は2日に1回交換した。10日間培養した後、培養を止め細胞を回収した。これにより、各wellにNHEK細胞を重層培養することができた。
回収した細胞からBligh and Dyer法によって脂質成分を抽出した。具体的には、先ず、well中にPBS (GIBCO社)を入れ、細胞を回収した。回収した細胞にメタノール/クロロホルム=2/1(v/v)を加えてホモジェナイズした後、振とうした。その後、遠心し、上清を回収した(沈殿はタンパク質定量(BCA Protein Assay)に使用した)。PBS/クロロホルム=1/1(v/v)を加え、振とうした。その後、遠心し、有機相を回収し窒素気流下で乾固した。それに、N-heptadecanoyl-D-erythro-sphingosineを含むメタノールを加え、窒素気流下で乾固した。これにクロロホルム/メタノール=99.5/0.5(v/v)を加えて溶解し、固相抽出用シリカゲルカートリッジに適用した。クロロホルム/メタノール=99.5/0.5(v/v)を十分に適用した後、クロロホルム/メタノール=95/5(v/v)を適用し、その溶出液を得た。この溶出液を窒素気流下で乾固した後、ヘキサン/イソプロパノール/ギ酸=95/5/0.1(v/v/v)を加えて溶解することで、脂質成分を含む試料溶液とした。
本例では液体クロマトグラフ−質量分析装置を使用した。具体的には、液体クロマトグラフと質量分析装置が一体になった分析システムとして、横河アナリティカルシステムズ社、アジレント1100シリーズ LC/MSDを使用した。
分離カラムとしては、ジーエルサイエンス社、Inertsil SIL 100A-3、1.5mmφ×150mm(3μm)を使用した。ガードカラムとしては、ジーエルサイエンス社、Inertsil SIL 100A-3、1.5mmφ×10mm(3μm)を使用した。溶離液a(図1参照)としてはヘキサン/イソプロパノール/ギ酸=95/5/0.1(v/v/v)を使用し、溶離液b(図1参照)としてはヘキサン/イソプロパノール/50mmol/Lのギ酸アンモニウム水溶液=25/65/10(v/v/v)を使用した。また、グラジエント条件は表1に示した。
また、質量分析装置における分析条件は以下の通りである。イオン化法:ESI、極性:正イオン、測定質量範囲:250〜1500、フラグメンター電圧:150V、Vcap電圧:3500V、ネブライザー圧力:20psig、乾燥ガス温度:300℃、乾燥ガス流量:8L/分
質量分析装置から得られたデータを、保持時間とm/zとイオン強度との3軸を有する多段マスクロマトグラムに展開した。その後、既知のセラミド分子種についてそれぞれ保持時間及びm/zの情報を格納したデータベースを利用して、多段マスクロマトグラムに含まれる各ピークを同定した。そして、各セラミド分子のピーク面積を求め、内部標準物質に対するピーク面積比を算出し、さらにタンパク質量で除することにより、単位タンパク質量当たりの各セラミド分子の相対量を算出した。これらに予め求めてあるセラミド分子種ごとの検出感度補正係数を乗じることにより、単位タンパク質量当たりの各セラミド分子種の絶対量を算出した。
本実施例では、実施例1で調製した正常ヒト表皮角化細胞の重層培養物に対して乾癬治療薬であるビタミンD3を添加したときの脂質組成の変動を検討した。
ビタミンD3は、重層培養用の培地に交換して後、添加した。さらに、培地を2日に1回交換した後、添加した。10日間培養した後、培養を止め細胞を回収した。なお、対照としてはビタミンD3に代えてエタノールを使用した。
本実施例では、実施例1で調製した正常ヒト表皮角化細胞の重層培養物に対して肌質に影響する公知の物質を添加したときの脂質組成の変動を検討した。具体的に、本例では、保湿剤として知られるビタミンCを添加したとこの脂質組成の変動を検討した。
本実施例では、被験者から採取した皮膚角質層を用いて脂質成分の一種であるセラミド成分を解析した。
皮膚科医院に通院するアトピー性皮膚炎患者8名(16〜36歳)及びそれに対応する健常ボランティア7名(25〜37歳)、皮膚科医院に通院する乾癬患者10名(36〜74歳)及びそれに対応する健常ボランティア9名(39〜76歳)
いずれの患者においても腕の皮疹部及び隣接する無疹部、健常者においては腕における患者と同部位にテープを押し付け、皮膚角質層を剥離した。それぞれのテープを半分に切り分け、一方をセラミド成分の解析に供し、もう一方をタンパク質の定量に供した。タンパク質定量は、テープの残り半分に0.1N NaOH、1%SDS水溶液を加え、60℃で2時間加熱することにより、タンパク質を可溶化し、室温まで冷却した後2N HClを加えて中和し、BCA Protein Assayを用いて、BSAによる検量線からタンパク質の定量値を得た。
上記皮膚角質層を採取したテープに、N−heptadecanoyl−D−erythro−sphingosineを含むメタノールを加え、超音波を照射することにより脂質分子を抽出した。
上記メタノール抽出液を窒素気流下で乾固し、これにクロロホルム/メタノール=99.5/0.5(v/v)を加えて溶解し、固相抽出用シリカゲルカートリッジに適用した。クロロホルム/メタノール=99.5/0.5(v/v)を十分に適用した後、クロロホルム/メタノール=95/5(v/v)を適用し、その溶出液を得た。この溶出液を窒素気流下で乾固した後、ヘキサン/イソプロパノール/ギ酸=95/5/0.1(v/v/v)を加えて溶解し、試料溶液とした。
本例では液体クロマトグラフ−質量分析装置を使用した。具体的には、液体クロマトグラフと質量分析装置が一体になった分析システムとして、横河アナリティカルシステムズ社、アジレント1100シリーズ LC/MSDを使用した。
分離カラムとしては、ジーエルサイエンス社、Inertsil SIL 100A-3、1.5mmφ×150mm(3μm)を使用した。ガードカラムとしては、ジーエルサイエンス社、Inertsil SIL 100A-3、1.5mmφ×10mm(3μm)を使用した。溶離液a(図1参照)としてはヘキサン/イソプロパノール/ギ酸=95/5/0.1(v/v/v)を使用し、溶離液b(図1参照)としてはヘキサン/イソプロパノール/50mmol/Lのギ酸アンモニウム水溶液=25/65/10(v/v/v)を使用した。また、グラジエント条件は表2に示した。
質量分析装置から得られたデータを、保持時間とm/zとイオン強度との3軸を有する多段マスクロマトグラムに展開した。その後、既知のセラミド分子種についてそれぞれ保持時間及びm/zの情報を格納したデータベースを利用して、多段マスクロマトグラムに含まれる各ピークを同定した。そして、各セラミド分子のピーク面積を求め、内部標準物質に対するピーク面積比を算出し、さらにタンパク質量で除することにより、単位タンパク質量当たりの各セラミド分子の相対量を算出した。これらに予め求めてあるセラミド分子種ごとの検出感度補正係数を乗じることにより、単位タンパク質量当たりの各セラミド分子種の絶対量を算出した。
本実施例では、疾患ではない被験者から採取した皮膚角質層を用いて、実施例4で示した方法により、脂質成分の一種であるセラミド成分を解析した。
乾燥肌7名及びそれに対応する普通肌6名、頬部において恒常的にバリアー機能が低い低バリアー肌12名及びそれに対応する普通肌10名。
乾燥肌7名及びそれに対応する普通肌6名においては前腕屈側部に、低バリアー肌12名及びそれに対応する普通肌10名においては頬部にテープを押し付け、皮膚角質層を剥離した。それぞれのテープを半分に切り分け、一方をセラミド成分の解析に供し、もう一方をタンパク質の定量に供した。タンパク質定量は、テープの残り半分に0.1N NaOH、1%SDS水溶液を加え、60℃で2時間加熱することにより、タンパク質を可溶化し、室温まで冷却した後2N HClを加えて中和し、BCA Protein Assayを用いて、BSAによる検量線からの定量値を得た。
質量分析装置から得られたデータを、保持時間とm/zとイオン強度との3軸を有する多段マスクロマトグラムに展開した。その後、既知のセラミド分子種についてそれぞれ保持時間及びm/zの情報を格納したデータベースを利用して、多段マスクロマトグラムに含まれる各ピークを同定した。そして、各セラミド分子のピーク面積を求め、内部標準物質に対するピーク面積比を算出し、さらにタンパク質量で除することにより、単位タンパク質量当たりの各セラミド分子の相対量を算出した。
10…液体クロマトグラフ
11a、11b…高圧グラジエントポンプ
12…オートインジェクター
13…ガードカラム
14…分離カラム
20…イオン化促進液送液装置
21…ポンプ
22…ティーコネクター
30…質量分析装置
31…イオン化装置
32…質量分離検出装置
40…演算装置
a、b…溶離液
c…イオン化促進液
d…脂質試料溶液
Claims (8)
- 被験物質を作用させた被験体から得た脂質組成情報と、被験物質を作用させない被験体から得た脂質組成情報のうち、
N−アシル−6−OH−スフィンゴシン・セラミド成分、N−アシル−フィトスフィンゴシン・セラミド成分及びN−(α−OH−アシル)−スフィンゴシン・セラミド成分からなる群から選ばれる少なくとも1種の成分についてセラミド総量に対する組成比を比較し、N−アシル−6−OH−スフィンゴシン・セラミド成分の組成比が上昇するか、N−アシル−フィトスフィンゴシン・セラミド成分の組成比が上昇するか、N−(α−OH−アシル)−スフィンゴシン・セラミド成分の組成比が減少している場合、
N−アシル−スフィンゴシン・セラミド成分、N−アシル−6−OH−スフィンゴシン・セラミド成分及びN−(α−OH−アシル)−6−OH−スフィンゴシン・セラミド成分からなる群から選ばれる少なくとも1種の成分について、当該成分に含まれる分子種の平均炭素数を、各分子種の存在比を重みとした加重平均値として算出し、当該炭素数の加重平均値を比較し、少なくとも1つの成分について加重平均値が上昇している場合、
N−アシル−スフィンゴシン・セラミド成分における、炭素数34の分子種の量及び/又は全N−アシル−スフィンゴシン・セラミド成分の総量に対する組成比を比較して、炭素数34の分子種の組成比が減少している場合、又は
N−アシル−ジヒドロスフィンゴシン・セラミド成分、N−アシル−スフィンゴシン・セラミド成分、N−アシル−6−OH−スフィンゴシン・セラミド成分、N−(α−OH−アシル)−スフィンゴシン・セラミド成分、N−(α−OH−アシル)−6−OH−スフィンゴシン・セラミド成分、N−(α−OH−アシル)−フィトスフィンゴシン・セラミド成分及びN−(ω−OH−アシル)アシル−スフィンゴシン・セラミド成分からなる群から選ばれる少なくとも1種の成分について、不飽和結合が1以上多い分子種の割合を比較し、少なくとも1つの成分について不飽和結合が1以上多い分子種が減少している場合、
上記被験物質が乾癬治療剤と類似した機能を有すると判断する、被験物質の評価又はスクリーニング方法。 - N−アシル−フィトスフィンゴシン・セラミド成分の量が上昇している場合、N−アシル−フィトスフィンゴシン・セラミド成分のセラミド総量に対する組成比が上昇している場合、又はN−アシル−スフィンゴシン・セラミド成分に含まれる分子種の平均炭素数の加重平均値が上昇している場合、上記被験物質が乾癬治療剤と類似した機能を有すると判断する請求項1記載の被験物質の評価又はスクリーニング方法。
- 被験物質を作用させた被験体から得た脂質組成情報と、被験物質を作用させない被験体から得た脂質組成情報のうち、
N−アシル−6−OH−スフィンゴシン・セラミド成分及びN−(α−OH−アシル)−6−OH−スフィンゴシン・セラミド成分からなる群から選ばれる少なくとも1種の成分についてセラミド総量に対する組成比を比較し、N−アシル−6−OH−スフィンゴシン・セラミド成分の組成比が上昇するか、N−(α−OH−アシル)−6−OH−スフィンゴシン・セラミド成分の組成比が上昇している場合、
N−アシル−スフィンゴシン・セラミド成分、N−アシル−6−OH−スフィンゴシン・セラミド成分及びN−(α−OH−アシル)−6−OH−スフィンゴシン・セラミド成分からなる群から選ばれる少なくとも1種の成分について、当該成分に含まれる分子種の平均炭素数を、各分子種の存在比を重みとした加重平均値として算出し、当該炭素数の加重平均値を比較し、加重平均値が上昇している場合、
N−アシル−スフィンゴシン・セラミド成分における、炭素数34の分子種の量及び/又は全N−アシル−スフィンゴシン・セラミド成分の総量に対する組成比を比較して、炭素数34の分子種の組成比が減少している場合、又は
N−アシル−6−OH−スフィンゴシン・セラミド成分及びN−(ω−OH−アシル)アシル−スフィンゴシン・セラミド成分からなる群から選ばれる少なくとも1種の成分について、不飽和結合が1以上多い分子種の割合を比較し、少なくとも1つの成分について不飽和結合が1以上多い分子種が減少している場合、
上記被験物質が、保湿効果を有する乾燥肌改善剤、保湿効果を有するアトピー性皮膚炎治療剤又は保湿効果を有するバリアー機能改善剤と類似した機能を有すると判断する、被験物質の評価又はスクリーニング方法。 - N−アシル−6−OH−スフィンゴシン・セラミド成分の量が上昇している場合、N−アシル−6−OH−スフィンゴシン・セラミド成分のセラミド総量に対する組成比が上昇している場合、上記被験物質が保湿効果を有する乾燥肌改善剤、保湿効果を有するアトピー性皮膚炎治療剤又は保湿効果を有するバリアー機能改善剤と類似した機能を有すると判断する請求項3記載の被験物質の評価又はスクリーニング方法。
- 被験体が、動物から採取した皮膚、死体皮膚、細胞、再構成した細胞並びに皮膚組織、角層、血液、体液、毛髪、及び臓器からなる群から選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする請求項1乃至4いずれか一項記載の被験物質の評価又はスクリーニング方法。
- 上記被験体が培養細胞である請求項1乃至4いずれか一項記載の被験物質の評価又はスクリーニング方法。
- 上記培養細胞がケラチノサイトである請求項6記載の被験物質の評価又はスクリーニング方法。
- 上記ケラチノサイトは重層培養されたものである請求項7記載の被験物質の評価又はスクリーニング方法。
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