CN111289655A - 一种同时测定皮肤角质层贴片中PCA、t-UCA的分析方法 - Google Patents

一种同时测定皮肤角质层贴片中PCA、t-UCA的分析方法 Download PDF

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Abstract

一种同时测定皮肤角质层贴片中PCA、t‑UCA的分析方法，其特征是采用稀释剂对皮肤角质层贴片进行前处理后离心，得到上清液，以甲醇和磷酸二氢钾溶液为流动相，在苯基键合硅烷的色谱柱上进行等度洗脱，采用外标法计算PCA、t‑UCA的含量并对该方法进行方法学验证。本方法能够有效测定皮肤角质细胞中的PCA和t‑UCA，尤其实现了在同一色谱条件下PCA和t‑UCA与溶剂峰及皮肤中其它成分的分离，在较短时间内对PCA和t‑UCA进行准确测定，灵敏度高，重复性好。

Description

一种同时测定皮肤角质层贴片中PCA、t-UCA的分析方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，涉及一种测定皮肤角质层贴片中PCA、t-UCA的分析方法，实现了在同一色谱条件下PCA和t-UCA与溶剂峰及皮肤中其它成分的分离，在较短时间内对PCA和t-UCA进行准确测定。
背景技术
吡咯烷酮羧酸(PCA)是一种具有优良吸湿性能的天然保湿剂，作为自然保湿因子的最重要的成分大量存在于皮肤角质层中。尿刊酸是组氨酸的代谢产物，以反式(t-UCA)存在于皮肤角质层中，其作为一种紫外吸收剂，对皮肤可以起到一定的防护作用。检测皮肤角质层中的PCA和t-UCA，可以更好的了解皮肤状态，帮助化妆品企业开发出更有针对性的产品。中国专利申请CN108982716A公开了一种皮肤角质层中天然保湿因子的测定方法，其提取方法较为复杂，测定PCA和UCA的方法中，PCA出峰时间过早，容易与溶剂峰重叠造成测定不准确。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够同时快速、准确测定皮肤角质层贴片中PCA和t-UCA的方法，可用于了解皮肤状态及针对性皮肤产品的开发。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种同时测定皮肤角质层贴片中PCA、t-UCA的分析方法，用稀释剂对皮肤角质层贴片进行前处理后离心取上清液，采用反相高效液相色谱法，用苯基键合硅胶色谱柱，甲醇-磷酸二氢钾溶液为流动相进行等度洗脱。
所述方法中，前处理稀释剂为磷酸二氢钾溶液，浓度为0.02mol/L，含庚烷磺酸钠5mmol/L，磷酸调节pH至2.5。
所述流动相组成为甲醇-磷酸二氢钾溶液(3:97)，其中磷酸二氢钾溶液中含5mmol/L庚烷磺酸钠，磷酸二氢钾浓度为0.02mol/L，pH值为2.5。
所述的色谱柱为Thermo BetaBasic Phenyl，250×4.6mm，5μm。
色谱条件包括：检测波长为210nm；流动相洗脱速率为1.0mL/min；色谱柱温度为20℃；样品进样量为20μL。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明所述的同时测定皮肤角质层贴片中PCA和t-UCA的分析方法，前处理方法更为简便，分析时间更短，且可以实现在同一色谱条件下PCA、t-UCA与溶剂峰及其它皮肤成分色谱峰的较好分离，灵敏度高，重复性好，可用于皮肤角质层中PCA、t-UCA的准确测定。
附图说明
附图1对照品图谱
附图2皮肤角质层贴片样品图谱
附图3空白溶剂图谱
附图4空白贴片图谱
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步描述本发明的技术方案，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
综合考虑PCA、t-UCA的紫外吸收情况，本试验选择在两者吸收都较强的210nm处进行测定。试验发现，PCA在C18柱上保留较差，调整流动相比例，改变缓冲盐类型，调整pH值以及加入离子对试剂后等措施均无法实现PCA与溶剂峰的有效分离。考虑到苯基柱对有共轭体系的成分的选择性较好，改用苯基柱进行试验。加入离子对试剂并调整pH值，以达到尽量延长PCA的保留时间，使其与溶剂峰及皮肤贴片的未知杂峰分离的同时，尽量缩短分析时间。实施例1PCA、t-UCA的高效液相色谱分析
仪器与色谱条件
高效液相色谱仪：Agilent 1260高效液相色谱系统及工作站。
色谱柱：苯基键合硅胶色谱柱(Thermo BetaBasic Phenyl，250×4.6mm，5μm)。
配制0.02mol/L的磷酸二氢钾溶液(含庚烷磺酸钠5mmol/L)，用磷酸调节pH值至2.5作为水相，流动相中甲醇-水相比例为3:97，设置流速为1.0mL/min，检测波长为210nm，柱温为20℃。
实验步骤：
分别精密称取PCA和t-UCA适量，用甲醇溶解并定容，配成各自的对照品储备液。分别量取储备液适量，用稀释剂稀释至每1mL含PCA和t-UCA各约5μg和1μg的混合对照溶液。取样品胶带1片，加稀释剂1ml，超声30min，离心取上清液，作为供试品溶液。按上述条件进行高效液相分析，进样20μL，色谱图详见说明书附图1和附图2。结果显示，保留时间约5min的为PCA，保留时间约10min的为t-UCA。
实施例2本发明分析方法的方法学考察
专属性考察
取溶剂和空白胶带提取样品各20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，色谱图详见说明书附图3、4。结果表明，溶剂和空白胶带提取样品在PCA和t-UCA出峰位置无干扰。
检测限和定量限考察
取混合对照品溶液，逐步稀释直至各成分的信噪比S/N接近3，作为检测限，逐步稀释直至各成分的信噪比S/N接近10，作为定量限。结果PCA检测限为2.02ng，t-UCA检测限为0.409ng，PCA定量限为4.04ng，t-UCA定量限为0.822ng。
线性关系考察
分别取PCA和t-UCA对照品储备液适量，稀释剂稀释至合适浓度，摇匀，作为混合对照品储备液。取混合对照品储备液逐级稀释，制成线性供试品溶液。分别量取20μL注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标，进行线性回归，分别得回归方程。线性试验结果表明，PCA在0.101μg/ml～25.235μg/ml范围内与其峰面积呈良好线性关系；t-UCA在0.0205μg/ml～5.135μg/ml范围内与其峰面积呈良好线性关系。具体结果见表1。
表1 线性与范围
Figure BDA0002418717660000031
重复性考察
取空白胶带1张，置具塞离心试管中，加入适量对照品溶液，超声30min，离心取上清，得重复性供试品，同法制备6份。取重复性供试品和对照品20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，外标法计算胶片中各待测成分含量，并计算RSD。胶带中PCA含量的RSD为1.01％，t-UCA含量的RSD为0.69％，试验结果见表2。由结果可知，本方法重复性良好。
表2 重复性试验结果
1 2 3 4 5 6 RSD％
PCA 0.0168％ 0.0166％ 0.0163％ 0.0166％ 0.0167％ 0.0165％ 1.01％
t-UCA 0.00363％ 0.00357％ 0.00356％ 0.00361％ 0.00358％ 0.00360％ 0.69％
中间精密度考察
采用同样操作方法，由不同人员在不同高效液相色谱仪上重复上述试验，结果见表3。由结果可知，本方法重现性良好。
表3 中间精密度结果
1 2 3 4 5 6 RSD％(n＝12)
PCA 0.0168％ 0.0165％ 0.0163％ 0.0167％ 0.0165％ 0.0165％ 0.98％
t-UCA 0.00361％ 0.00355％ 0.00351％ 0.00356％ 0.00357％ 0.00358％ 0.86％
准确度考察
取混合对照品储备液适量，分别用稀释剂稀释制成50％、100％、150％对照品溶液浓度的混合对照溶液。取空白胶带1张，置具塞离心管中，加入配制好的50％对照品溶液浓度的混合对照溶液1mL，超声30min后离心取上清，平行制备3份。同法制备100％和150％的回收率供试品。分别量取回收率供试品和对照品溶液20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算待测成分的回收率。结果见表4～5。由结果可知，本方法准确度良好。
表4 PCA回收率试验结果
Figure BDA0002418717660000041
表5 t-UCA回收率试验结果
Figure BDA0002418717660000042
综上所述，本发明方法能够有效的分离皮肤提取物中PCA、t-UCA与其他成分和溶剂，能够准确、快速测定PCA和t-UCA，该方法简单、快速、准确、有效，精密度高。

Claims (6)

1.一种同时测定皮肤角质层贴片中PCA、t-UCA的分析方法，其特征是，用稀释剂对皮肤角质层贴片进行前处理后离心取上清液，采用反相高效液相色谱法，用苯基键合硅胶色谱柱，甲醇-磷酸二氢钾溶液为流动相进行等度洗脱，检测波长为210nm。
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征是，所述色谱柱为Thermo BetaBasic Phenyl，250×4.6mm，5μm。
3.如权利要求1所述的分析方法，其特征是，所述甲醇-磷酸二氢钾溶液比例为3:97，其中磷酸二氢钾溶液浓度为0.02mol/L，含有庚烷磺酸钠5mmol/L，磷酸调节pH至2.5。
4.如权利要求1所述的分析方法中，其特征是，色谱条件包括：检测波长为210nm，流动相洗脱速率为1.0mL/min，色谱柱温度为20℃，样品进样量为20μL。
5.如权利要求1所述的分析方法，其特征是，皮肤角质层贴片前处理方法为：取皮肤角质层贴片1片，加入稀释剂1mL，超声30min，离心取上清。
6.如权利要求1所述的分析方法，其特征是，所述前处理稀释剂为磷酸二氢钾溶液，浓度为0.02mol/L，含庚烷磺酸钠5mmol/L，磷酸调节pH至2.5。
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