CN109239219A - 一种转移因子胶囊中多肽的定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种转移因子胶囊中多肽的定量检测方法，由“HPLC‑氨基酸差值”法测定，用建立的衍生化‑HPLC法分别测定转移因子胶囊中总氨基酸含量以及游离氨基酸含量，以两者差值代表样品中多肽含量。采用异硫氰酸苯酯(PITC)衍生化法对氨基酸进行柱前衍生；检测色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱；以甲醇‑乙腈‑水(20:60:20)为流动相A，以0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液(用冰醋酸调节pH值为6.3)为流动相B进行梯度洗脱。采用上述色谱条件分别测定转移因子胶囊中总氨基酸含量及游离氨基酸含量，以两者差值代表样品中多肽含量；经系统的验证研究该检测方法无其他物质干扰、专属性强、准确可靠，能有效地对转移因子胶囊中的多肽含量检测与监控。

Description

一种转移因子胶囊中多肽的定量检测方法

技术领域

本发明属于多组分生化药质量分析研究技术领域，具体涉及一种转移因子胶囊中多肽的定量检测方法。

背景技术

转移因子的主要成分为健康猪或牛脾脏中提取的多肽、氨基酸和核苷酸等，是一种天然双向免疫调节剂，是目前治疗免疫功能低下、缺陷等相关疾病的理想药物。小分子肽类物质是转移因子的功能标示物，并作为其主要功效成分，准确测定转移因子中的多肽含量对于优化转移因子生产工艺及控制产品质量具有重要的意义。

现有技术采用Follin-酚法(Lowry)对转移因子胶囊中多肽含量进行测定，但该方法产生干扰的物质较多，如还原物质、酚类、枸橼酸、硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸、糖类及甘油等均有干扰作用。且有文献报道，采用Follin-酚法(Lowry)测定转移因子胶囊中多肽含量，赋性剂甘露醇及其中游离氨基酸均会干扰检测结果，导致检测结果不准确，重现性差。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种转移因子口服液中核苷酸类物质的定量检测方法，该方法具有准确性高、重现性好、操作简便的优势。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了一种转移因子胶囊中多肽的定量检测方法，包括以下步骤：

1)制备转移因子胶囊中总氨基酸含量测定供试品溶液

精密称取转移因子胶囊内容物1.0g，加入6～10mL浓度为6mol/L的盐酸溶液进行微波水解，然后用6～10mL浓度为6mol/L的氢氧化钠溶液中和，再用0.1mol/L盐酸溶液定容至50mL，制得总氨基酸测定衍生用供试品溶液；将该总氨基酸测定衍生用供试品溶液采用异硫氰酸苯酯乙腈溶液进行衍生处理，制得转移因子胶囊中总氨基酸含量测定供试品溶液；

2)制备转移因子胶囊中游离氨基酸供试品溶液

精密称取转移因子胶囊内容物约1.0g，置25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液适量，振荡2min使转移因子溶解后，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为游离氨基酸测定衍生用供试品溶液；将该游离氨基酸测定衍生用供试品溶液采用异硫氰酸苯酯乙腈溶液进行衍生处理，制得转移因子胶囊中游离氨基酸供试品溶液；

3)构建标准曲线方程

精密称取各对照品氨基酸制成贮备液，然后将贮备液制成构建标准曲线所需的对照品系列溶液，再对得到对照品系列溶液进行衍生处理，然后利用高效液相色谱法对衍生后的对照品系列溶液进行检测获得色谱图，以各氨基酸对照品浓度对各氨基酸峰面积按最小二乘法进行线性回归，求出标准曲线方程及线性相关系数；

4)测定样品构建色谱图

分别精密量取步骤1)制得的转移因子胶囊中总氨基酸含量测定供试品溶液和步骤2)制得的转移因子胶囊中游离氨基酸供试品溶液，利用高效液相色谱法在与步骤3)相同的色谱检测条件下获得色谱图，提取转移因子胶囊中各氨基酸对应的色谱峰面积；

5)计算转移因子胶囊中多肽含量

根据步骤3)获得的标准曲线方程和步骤4)获得的色谱峰的面积，从各氨基酸回归方程中求出游离氨基酸及总氨基酸的含量；用总氨基酸项下测得的各氨基酸含量分别减去游离氨基酸项下测得的各氨基酸含量，并将各计算结果相加，得到转移因子胶囊中的多肽含量。

优选地，所述对照品氨基酸包括18种，分别为门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及盐酸赖氨酸。

优选地，步骤3)中，高效液相的色谱检测条件为：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱；

以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流动相A为甲醇、乙腈和水按20:60:20的体积比配成的混合溶液；流动相B为0.1mol/L的醋酸钠缓冲溶液；

检测过程中：波长为210～320nm，进样量为1～50μL，流速为0.5～2mL/min，柱温为20～50℃。

进一步优选地，十八烷基键合硅胶色谱柱的填料粒度为5～10μm，内径为2～5mm，长度为10～30cm。

进一步优选地，梯度洗脱时，流动相A与流动相B的变化比例如下：

0min，流动相A：3％、流动相B：97％；

16min，流动相A：12％、流动相B：88％；

19min，流动相A：13％、流动相B：87％；

30min，流动相A：26％、流动相B：74％；

40min，流动相A：42％、流动相B：58％；

50min，流动相A：50％、流动相B：50％；

50.1min，流动相A：100％、流动相B：0；

55min，流动相A：100％、流动相B：0；

55.1min，流动相A：3％、流动相B：97％；

65min，流动相A：3％、流动相B：97％。

进一步优选地，用冰醋酸调节流动相B的pH值为6.0～6.5。

优选地，步骤1)中，对照品系列溶液的制备方法如下：

精密量取各对照品氨基酸10.0mg，置于100mL量瓶中，加入0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；然后，分别精密量取对照品贮备液1mL、2mL、4mL及10mL，分别置于25mL量瓶中，加水稀释至刻度、摇匀，分别得到对照溶液1～4，同时以对照品贮备液作为对照溶液5，得到对照品系列溶液。

优选地，步骤3)中，对照品系列溶液进行衍生处理的操作如下：

分别精密量取对照品系列溶液各4.0mL，分别置于20mL具塞试管中；加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液2.0mL，1mol/L三乙胺乙腈溶液1.0mL，摇匀，室温下反应1小时后，加入8mL正己烷萃取，静置10分钟，取下层溶液用0.45um有机滤膜过滤，取续滤液即得。

优选地，步骤5)中，用总氨基酸项下测得的各氨基酸含量和游离氨基酸项下测得的各氨基酸含量是以氮计算，氨基酸的对照品的折算系数如下所示：

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

第一，采用专属性较强、准确性较高的衍生化-HPLC法分别测定转移因子胶囊中总氨基酸含量以及游离氨基酸含量，以两者差值代表样品中多肽含量；排除了赋性剂甘露醇等物质对检测结果的干扰，检测结果较现有技术Follin-酚法更准确、可靠。

第二，通过筛选色谱柱、流动相组成、流动相pH值、色谱柱柱温及优化洗脱时间梯度等措施，确定了最优检测色谱条件；采用该条件检测，液相色谱图中，各氨基酸峰峰形好，分离度高，大大降低了相邻组分峰间的重叠比例，提高了检测准确度。

第三，本发明采用微波水解法代替传统水解法，显著缩短了水解时间，提高了工作效率。

附图说明

图1为18种氨基酸对照品溶液的液相色谱图；

图2为转移因子胶囊游离氨基酸供试品溶液的液相色谱图；

图3为转移因子胶囊总氨基酸供试品溶液的液相色谱图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明实施例所用转移因子胶囊为“金花转移因子胶囊”，国药准字H20013360。

本发明转移因子胶囊总氨基酸含量测定供试品溶液的制备方法，包括下述步骤：

a、精密称取转移因子胶囊内容物约1.0g，置高通量微波消解管中，精密加入6mol/L盐酸溶液6～10mL，称定重量，置微波消解仪按下表程序进行水解：

表1转移因子胶囊总氨基酸测定微波消解程序

步骤	爬升(min)	保持(min)	温度(℃)	功率(w)
					1	5	5	100	1200
2	5	5	150	1200
					3	5	15	180	1200

b、上述转移因子胶囊内容物完成消解程序后，放冷至室温，用6mol/L盐酸溶液补足减失的重量，加入6mol/L氢氧化钠溶液6～10mL中和，并转移至50mL量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，作为总氨基酸测定衍生用供试品溶液。

c、精密量取上述衍生用供试品溶液4.0mL，置20mL具塞试管中；加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液2.0mL，1mol/L三乙胺乙腈溶液1mL，摇匀，室温下反应1小时后，加入8mL正己烷萃取，静置10分钟，取下层溶液用微孔滤膜(孔径为0.22～0.45μm)滤过，取续滤液，即得总氨基酸含量测定供试品溶液。

进一步的，上述转移因子胶囊总氨基酸含量测定供试品溶液的制备方法的步骤a中的6mol/L盐酸溶液加入量优选8mL。

进一步的，上述步骤a中转移因子胶囊总氨基酸测定微波消解程序中“步骤3”的消解温度对总氨基酸含量测定结果影响较大，消解温度过低，样品中氨基酸消解不完全，总氨基酸含量检测结果偏低；消解温度过高，样品中氨基酸被破坏程度较大，总氨基酸含量检测结果也偏低。微波消解程序中“步骤3”的消解温度应为160～200℃，最优选180℃。

本发明转移因子胶囊多肽含量测定采用高效液相色谱法，分别测定转移因子胶囊中总氨基酸含量以及游离氨基酸含量，以两者差值代表样品中多肽含量。

依据18种常见氨基酸的性质及转移因子胶囊中所含氨基酸的情况，建立检测色谱条件；对建立的色谱条件进行系统的方法学验证研究，保证所建立色谱条件的耐用性、重现性及准确性。

以上所述的18种氨基酸包括：门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及盐酸赖氨酸。

所述检测色谱条件包括：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱；以甲醇-乙腈-水(20:60:20)为流动相A，以0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液(用冰醋酸调节pH值为6.3)为流动相B进行梯度洗脱。

所述的十八烷基键合硅胶色谱柱填料粒度为5～10μm，优选5μm；内径为2～5mm，优选4.6mm；长度为10cm～30cm，优选25cm。

所述流动相B中醋酸钠缓冲溶液的pH值为6.0～6.5，优选6.3。

所述流动相A-流动相B梯度洗脱的体积比为3:97(0min)，12:88(16min)，13:87(19min)，26:74(30min)，42:58(40min)，50:50(50min)，100:0(50.1min)，100:0(55min)，3:97(55.1min)，3:97(65min)。

所述的检测方法中，检测波长为210-320nm，优选254nm。

所述的检测方法中进样量为1～50μl，优选2μl。

所述的检测方法中流速为0.5～2ml/min，优选1ml/min。

所述的检测方法中柱温为20～50℃，优选35℃。

本发明提供一种“氨基酸差值法”测定转移因子胶囊中多肽含量，其步骤包括：

a、游离氨基酸的测定，照上述衍生化-HPLC法测定转移因子胶囊中游离氨基酸含量(以氮计，折算系数见表2)。

b、总氨基酸的测定，照上述方法制备转移因子胶囊总氨基酸含量测定供试品溶液，并按上述检测色谱条件测定总氨基酸含量(以氮计，折算系数见表2)。

c、总氨基酸项下测得的各氨基酸含量(以氮计)分别减去游离氨基酸项下测得的各氨基酸含量(以氮计)，并计算各结果之和，即得。

进一步的，上述“氨基酸差值法”测定转移因子胶囊中多肽含量步骤a及步骤b中转移因子胶囊游离氨基酸及总氨基酸测定供试品溶液的浓度对其测定结果影响较大，检测供试品溶液浓度过高，氨基酸峰面积与浓度不成线性，总氨基酸含量检测结果偏低；检测供试品溶液浓度过低，检测灵敏度降低，检测结果不准确。检测供试品浓度优选氨基酸含量为0.4～0.8mg/mL，最优选0.6mg/mL。

进一步的，上述步骤a及步骤b中所述的各氨基酸与氮折算系数如下表所示。

表2各氨基酸与氮折算系数

实施例1转移因子胶囊微波消解条件的筛选

以3因素3水平正交试验筛选转移因子胶囊微波消解条件，微波消解条件考察的3个因素分别为消解样品量、消解酸体积及消解温度；通过单因素试验考察确定3个因素的最佳水平值分别为消解样品量1.0g、消解酸体积8.0mL、消解温度180℃。依据上述3个因素的最佳水平值设计的3因素3水平正交试验表见表4，正交试验结果分析见表5。

表3转移因子胶囊微波消解条件筛选正交试验表

表4转移因子胶囊微波消解条件筛选正交试验结果分析表

由表4可见通过3因素3水平正交试验确定最佳的微波消解条件组合为：消解样品量1.0g、消解酸体积8.0ml、消解温度180℃；并经极差分析发现影响样品检测结果的最显著因素为消解温度。

实施例2“氨基酸差值法”法测定转移因子胶囊中多肽含量

1、色谱条件

采用Agilent高效液相色谱仪，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱；以甲醇-乙腈-水(20:60:20)为流动相A，以0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液(用冰醋酸调节pH值为6.3)为流动相B进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml，检测波长为254nm，柱温为35℃，进样体积为2μl。

表5洗脱梯度时间表

2、标准曲线的测定：

对照品贮备液的制备精密称取谷氨酸对照品15.0mg，门冬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及盐酸赖氨酸对照品各10.0mg；置100mL量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。

标准曲线系列溶液的制备分别精密量取对照品贮备液1mL、2mL、4mL、10mL，分置于20mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液1～4；对照溶液5同对照品贮备液。

标准曲线系列溶液的衍生分别精密量取上述标准曲线系列溶液各4.0mL，分置20mL具塞试管中；加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液2.0mL，1mol/L三乙胺乙腈溶液1.0mL，摇匀，室温下反应1小时后，加入8ml正己烷萃取，静置10分钟，取下层溶液用0.45um有机滤膜过滤，取续滤液即得。

测定法分别精密量取上述衍生后的标准曲线系列溶液各2μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以各氨基酸对照品浓度对各氨基酸峰面积按最小二乘法进行线性回归，求出标准曲线方程及线性相关系数(r>0.999)。

3、样品的测定：

游离氨基酸供试品溶液的制备精密称取转移因子胶囊内容物约1.0g，置25mL量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液适量，振荡2min使转移因子溶解后，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为游离氨基酸测定衍生用供试品溶液。

总氨基酸供试品溶液的制备精密称取转移因子胶囊内容物约1.0g，置高通量微波消解管中，精密加入6mol/L盐酸溶液8mL，称定重量，置适宜的微波消解仪按下表1所示程序进行消解；完成消解程序后，放冷至室温，用6mol/L盐酸溶液补足减失的重量，加入6mol/L氢氧化钠溶液8mL中和，并转移至50ml量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，作为总氨基酸测定衍生用供试品溶液。

供试品溶液的衍生分别精密量取上述游离氨基酸及总氨基酸供试品溶液各4.0mL，分置20mL具塞试管中；分别加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液2.0mL，1mol/L三乙胺乙腈溶液1.0mL，摇匀，室温下反应1小时后，分别加入8mL正己烷萃取，静置10分钟，取下层溶液用0.45um有机滤膜过滤，取续滤液即得。

测定法精密量取上述衍生后的游离氨基酸及总氨基酸供试品溶液各2μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；从各氨基酸回归方程中求出游离氨基酸及总氨基酸含量。总氨基酸项下测得的各氨基酸含量(以氮计)分别减去游离氨基酸项下测得的各氨基酸含量(以氮计)，并计算各结果之和即得转移因子胶囊多肽含量。

实施例3“氨基酸差值法”法及Follin-酚法测定转移因子胶囊多肽含量结果比较

分别采用“氨基酸差值法”及Follin-酚法测定同10批转移因子胶囊中多肽含量，结果显示由于“氨基酸差值法”排除了甘露醇等物质的干扰，因此其检测结果略低于Follin-酚法；检测结果见表6。“氨基酸差值法”测定转移因子胶囊中多肽含量较Follin-酚法专属性强、准确度高、重现性好。

表6两种方法测定转移因子胶囊多肽含量结果比较表

综上所述，本发明公开的检测转移因子胶囊中多肽含量的方法，解决了现有技术中干扰物质多且影响大，检测结果重现性差的技术难题。本发明转移因子胶囊中多肽含量是由“HPLC-氨基酸差值”法测定，用建立的衍生化-HPLC法分别测定转移因子胶囊中总氨基酸含量以及游离氨基酸含量，以两者差值代表样品中多肽含量。其特征在于采用异硫氰酸苯酯(PITC)衍生化法对氨基酸进行柱前衍生；检测色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱；以甲醇-乙腈-水(20:60:20)为流动相A，以0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液(用冰醋酸调节pH值为6.3)为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱的体积比为3:97(0min)，12:88(16min)，13:87(19min)，26:74(30min)，42:58(40min)，50:50(50min)，100:0(50.1min)，100:0(55min)，3:97(55.1min)，3:97(65min)；使用UV检测器，检测波长为254nm；柱温为35℃；进样体积为2μl。采用上述色谱条件分别测定转移因子胶囊中总氨基酸含量及游离氨基酸含量，以两者差值代表样品中多肽含量；经系统的验证研究该检测方法无其他物质干扰、专属性强、准确可靠，能有效地对转移因子胶囊中的多肽含量检测与监控。

Claims (9)

1.一种转移因子胶囊中多肽的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备转移因子胶囊中总氨基酸含量测定供试品溶液

精密称取转移因子胶囊内容物1.0g，加入6～10mL浓度为6mol/L的盐酸溶液进行微波水解，然后用6～10mL浓度为6mol/L的氢氧化钠溶液中和，再用0.1mol/L盐酸溶液定容至50mL，制得总氨基酸测定衍生用供试品溶液；将该总氨基酸测定衍生用供试品溶液采用异硫氰酸苯酯乙腈溶液进行衍生处理，制得转移因子胶囊中总氨基酸含量测定供试品溶液；

2)制备转移因子胶囊中游离氨基酸供试品溶液

精密称取转移因子胶囊内容物约1.0g，置25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液适量，振荡2min使转移因子溶解后，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为游离氨基酸测定衍生用供试品溶液；将该游离氨基酸测定衍生用供试品溶液采用异硫氰酸苯酯乙腈溶液进行衍生处理，制得转移因子胶囊中游离氨基酸供试品溶液；

3)构建标准曲线方程

精密称取各对照品氨基酸制成贮备液，然后将贮备液制成构建标准曲线所需的对照品系列溶液，再对得到对照品系列溶液进行衍生处理，然后利用高效液相色谱法对衍生后的对照品系列溶液进行检测获得色谱图，以各氨基酸对照品浓度对各氨基酸峰面积按最小二乘法进行线性回归，求出标准曲线方程及线性相关系数；

4)测定样品构建色谱图

分别精密量取步骤1)制得的转移因子胶囊中总氨基酸含量测定供试品溶液和步骤2)制得的转移因子胶囊中游离氨基酸供试品溶液，利用高效液相色谱法在与步骤3)相同的色谱检测条件下获得色谱图，提取转移因子胶囊中各氨基酸对应的色谱峰面积；

5)计算转移因子胶囊中多肽含量

根据步骤3)获得的标准曲线方程和步骤4)获得的色谱峰的面积，从各氨基酸回归方程中求出游离氨基酸及总氨基酸的含量；用总氨基酸项下测得的各氨基酸含量分别减去游离氨基酸项下测得的各氨基酸含量，并将各计算结果相加，得到转移因子胶囊中的多肽含量。

2.根据权利要求1所述的转移因子胶囊中多肽的定量检测方法，其特征在于，所述对照品氨基酸包括18种，分别为门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及盐酸赖氨酸。

3.根据权利要求1所述的转移因子胶囊中多肽的定量检测方法，其特征在于，步骤3)中，高效液相的色谱检测条件为：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱；

以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流动相A为甲醇、乙腈和水按20:60:20的体积比配成的混合溶液；流动相B为0.1mol/L的醋酸钠缓冲溶液；

检测过程中：波长为210～320nm，进样量为1～50μL，流速为0.5～2mL/min，柱温为20～50℃。

4.根据权利要求3所述的转移因子胶囊中多肽的定量检测方法，其特征在于，十八烷基键合硅胶色谱柱的填料粒度为5～10μm，内径为2～5mm，长度为10～30cm。

5.根据权利要求3所述的转移因子胶囊中多肽的定量检测方法，其特征在于，梯度洗脱时，流动相A与流动相B的变化比例如下：

0min，流动相A：3％、流动相B：97％；

16min，流动相A：12％、流动相B：88％；

19min，流动相A：13％、流动相B：87％；

30min，流动相A：26％、流动相B：74％；

40min，流动相A：42％、流动相B：58％；

50min，流动相A：50％、流动相B：50％；

50.1min，流动相A：100％、流动相B：0；

55min，流动相A：100％、流动相B：0；

55.1min，流动相A：3％、流动相B：97％；

65min，流动相A：3％、流动相B：97％。

6.根据权利要求3所述的转移因子胶囊中多肽的定量检测方法，其特征在于，用冰醋酸调节流动相B的pH值为6.0～6.5。

7.根据权利要求1所述的转移因子胶囊中多肽的定量检测方法，其特征在于，步骤1)中，对照品系列溶液的制备方法如下：

精密量取各对照品氨基酸10.0mg，置于100mL量瓶中，加入0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；然后，分别精密量取对照品贮备液1mL、2mL、4mL及10mL，分别置于25mL量瓶中，加水稀释至刻度、摇匀，分别得到对照溶液1～4，同时以对照品贮备液作为对照溶液5，得到对照品系列溶液。

8.根据权利要求1所述的转移因子胶囊中多肽的定量检测方法，其特征在于，步骤3)中，对照品系列溶液进行衍生处理的操作如下：

分别精密量取对照品系列溶液各4.0mL，分别置于20mL具塞试管中；加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液2.0mL，1mol/L三乙胺乙腈溶液1.0mL，摇匀，室温下反应1小时后，加入8mL正己烷萃取，静置10分钟，取下层溶液用0.45um有机滤膜过滤，取续滤液即得。

9.根据权利要求1所述的转移因子胶囊中多肽的定量检测方法，其特征在于，步骤5)中，用总氨基酸项下测得的各氨基酸含量和游离氨基酸项下测得的各氨基酸含量是以氮计算，氨基酸的对照品的折算系数如下所示：