CN103323540A - 一种金水宝制剂中氨基酸的含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种虫草菌粉（Cs-4）及其制剂金水宝胶囊质量控制方法，所述质量控制方法，包括天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸含量测定，含量测定方法为高效液相色谱法。

Description

一种金水宝制剂中氨基酸的含量测定方法

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种中药制剂的质量控制方法，特别涉及一种金水宝胶囊的含量测定方法。

背景技术

金水宝制剂（如金水宝胶囊）为已经上市的产品，由发酵虫草菌粉（Cs-4）填充而得，具有补益肺肾，秘精益气功能。用于肺肾两虚，精气不足，久咳虚喘，神疲乏力，不寐健忘，腰膝痠软，月经不调，阳痿早泄；慢性支气管炎、慢性肾功能不全、高脂血症、肝硬化见上述证候者。

现有金水宝胶囊的质量标准主要包括核苷类、氨基酸类、甘露醇的薄层色谱鉴别和腺苷含量测定，其中氨基酸类鉴别包括亮氨酸、丙氨酸和缬氨酸的薄层色谱鉴别。研究表明，该制剂中氨基酸类有效成分还包括精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、酪氨酸等，多达十余种，为更好地控制金水宝胶囊的质量，有必要制定一种金水宝中氨基酸成分的含量测定方法，现有含有氨基酸产品的检测一般采用单个氨基酸的检测，或个别氨基酸的检测，尚无多种氨基酸，特别是全部必需氨基酸的检测方法，本发明通过对色谱条件的选择，找到一种同时测定多种氨基酸的方法，该方法精确度高，操作简单，只在一种色谱条件下即可检测出多种氨基酸，精密度，稳定性，重复性良好。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的金水宝制剂的质量控制方法。为此，本发明提供一种同时测定金水宝制剂中多种氨基酸的方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明为采用高效液相色谱法对金水宝制剂中含有的天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸进行含量测定。所述方法包括以下步骤：

供试品溶液的制备：称取金水宝制剂内容物，加浓盐酸，加热水解，水解物加盐酸溶解，加异硫氰酸苯酯，三乙胺衍生化，加入正己烷，取下层液，加水定容，过滤；

对照品溶液的制备：取天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸对照品适量，加盐酸配制成混合溶液；

供试品溶液和对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算每一种氨基酸的含量。

其中的色谱条件如下：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙酸钠缓冲液为流动相A，乙腈水溶液为流动相B，进行梯度洗脱。

优选的，本发明的含量测定方法。包括以下步骤：

供试品溶液的制备：取金水宝制剂内容物25-100mg至5-20ml的安瓿瓶中，加浓盐酸1-4ml，水1-4ml，熔封；至100-200℃的烘箱中水解0.5-2h，取出冷却，将水解物转移至干锅中蒸干，残渣加0.05-0.2mol/L盐酸试液溶解转移至10-50ml的容量瓶中，过滤，取续滤液2.5-10ml至三角瓶中，加异硫氰酸苯酯1-5ml，三乙胺1-5ml，衍生化0.5-2小时，加入正己烷5-20ml振摇，静止5-20min，取下层液0.5-2ml至2.5-10ml容量瓶中，加纯净水定容，过微孔滤膜即得；

对照品溶液的制备：取天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸对照品适量，加0.05-0.2mol/L的盐酸溶液配制成浓度各为0.03-0.12，0.03-0.12，0.015-0.06，0.015-0.06，0.02-0.08，0.015-0.06，0.02-0.08，0.02-0.08，0.015-0.06，0.015-0.06，0.02-0.08，0.015-0.06，0.02-0.08，0.005-0.02，0.005-0.02，0.005-0.02mg/ml的混合溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液和对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算每一种氨基酸的含量以及全部氨基酸的含量。

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为10-50cm，内径为2-8mm，粒径为2-10μm)；以pH=5-7的乙酸钠缓冲液为流动相A，60-90%的乙腈水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；柱温为20-60℃；检测波长为250-260nm。理论板数按缬氨酸峰计算应不低于3000-6000。

最优选的，本发明的含量测定方法。包括以下步骤：

供试品溶液的制备：精密称取经匀质处理的金水宝制剂内容物约50mg至10ml的安瓿瓶中，加浓盐酸2ml，水2ml，熔封；至150℃的烘箱中水解1h，取出冷却，将水解物转移至干锅中蒸干，残渣加0.1mol/L盐酸试液溶解转移至25ml的容量瓶中，过滤，取续滤液5ml至三角瓶中，加异硫氰酸苯酯（PITC）试液2.5ml，三乙胺试液2.5ml，衍生化1小时，加入正己烷10ml振摇，静止10min，取下层液1ml至5ml容量瓶中，加纯净水定容，过微孔滤膜即得。

对照品溶液的制备：另取天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸对照品适量，加0.1mol/L的盐酸溶液配制成浓度各为0.06、0.06、0.03、0.03、0.04、0.03、0.04、0.04、0.03、0.03、0.04、0.03、0.04、0.01、0.01、0.01mg/ml的混合溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液和对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算每一种氨基酸的含量以及全部氨基酸的含量。

色谱条件：照《中华人民共和国药典》2010年版高效液相色谱法（附录ⅥD）试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以pH=6.5的乙酸钠缓冲液（取乙酸钠7.587g，加水850ml溶解，用乙酸调pH至6.5，再加水75ml，乙腈70ml，过滤、超声即得）为流动相A，80%的乙腈水溶液为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱；柱温为40℃；检测波长为254nm。理论板数按缬氨酸峰计算应不低于5000。

表1流动相梯度比例

分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

根据本发明的测定方法，优选测定对象的金水宝制剂为金水宝胶囊，每粒胶囊总氨基酸含量不少于50mg为合格品。

本发明的测定方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：

1样品处理条件的选择：

1.1水解温度考察

按供试品溶液的制备方法，分别考察了100℃、150℃、200℃的水解效果，结果如下表2。

表2水解温度考察结果

从实验结果可以看出150℃和200℃水解时的总面积都明显的大于100℃时，但150℃与200℃差别不大，且个别氨基酸随着温度的升高含量反而降低，杂质峰的干扰也随着温度的升高而更加的严重，综合考虑水解温度定为：150℃。

1.2水解溶剂考察

按供试品溶液的制备方法，分别考察了溶剂盐酸：水（2:2）、溶剂盐酸：水（3:1）、溶剂盐酸：水（1:3）的水解效果，结果如下表3。

表3水解溶剂考察结果

从实验结果的总面积可以看出，随着盐酸含量的增加实验的总面积也增加，但2:2与3:1的结果差别细微，综合考虑水解溶剂定为：盐酸：水（2:2）。

1.3水解时间考察

按供试品溶液的制备方法，分别考察了30、45、60、90、120分钟的水解效果，结果如下表4。

表4水解时间考察结果

从总面积的结果可以看出，总面积与水解时间的关系呈抛物线关系，在60-90分钟间达到顶点，综合考虑水解时间定为：60分钟。

1.4衍生化时间考察

按供试品溶液的制备方法，分别考察了30、45、60、90、120分钟的衍生化效果，结果如下表5。

表5衍生化时间考察结果

从总面积结果及色谱图等综合考虑衍生化时间定为：60分钟。

2供试品溶液溶剂考察

试验中发现当样品溶剂含有有机相时，溶剂效应对色谱行为影响较大，不仅对个别峰型有影响，还对部分主色谱峰的分离干扰较严重。经试验最终将供试品溶液的溶剂转换成纯水，上述影响都得到了改善。

3各单对照品的确定

按表1的流动相条件，分别吸取混合对照品溶液及各单对照品溶液10μl进样，记录各色谱峰的保留时间，对比保留时间得出个单对照品的归属，结果见图1、图2，表6。

表6各氨基酸色谱峰保留时间

结果混合对照品中的16个主色谱峰的顺序依次为：天门冬氨酸（4.39min）、谷氨酸（5.14min）、丝氨酸（12.31min）、甘氨酸（13.628min）、组氨酸（15.709min）、精氨酸（19.428min）、苏氨酸（20.806min）、丙氨酸（21.936min）、脯氨酸（24.937min）、酪氨酸（29.938min）、

缬氨酸（31.161min）、甲硫氨酸（32.172min）、异亮氨酸（35.228min）、亮氨酸（35.804min）、苯丙氨酸（38.868min）、赖氨酸（43.024min）。

4精密度实验

按供试品溶液的制备方法制备1份供试品溶液，按色谱条件进样6次，测定，按峰面积分别计算RSD即得，结果见表7。

表7精密度实验结果

结果RSD均符合要求，精密度良好。

5稳定性实验

按供试品溶液的制备方法制备1份供试品溶液，分别按0、2、4、8、16、24h六个时间点进样，测定，按峰面积分别计算RSD即得，结果见表8。

表8稳定性实验结果

结果RSD均符合要求，稳定性良好。

6重复性实验

按供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，分别进样，测定，按峰折合面积分别计算RSD即得，结果见表9。

表9重复性实验结果

结果RSD均符合要求，重复性良好。

7线性实验

将配制好的对照品溶液按2ml、5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml的进样量进样，以面积对浓度计算线性，结果见表10。

表10线性实验结果

结果线性方程分别为天门冬氨酸y=24087x-11359r=0.9997，谷氨酸y=20334x-3377.1r=0.9997，丝氨酸y=20958x-7199r=0.9999，甘氨酸y=30319x-11392r=0.9999，组氨酸y=3757x-385.49r=0.9991，精氨酸y=13981x-12232r=0.9999，苏氨酸y=14274x-5354r=0.9999，丙氨酸y=31795x-7964.1r=0.9999，脯氨酸y=28009x-6086.5r=0.9999，酪氨酸y=6689x-3601.6r=1，缬氨酸y=19294x-5459.7r=0.9999，甲硫氨酸y=3486.7x-1072.4r=0.9995，异亮氨酸y=16133x-5451.9r=0.9999，亮氨酸y=23889x-6377.1r=0.9999，苯丙氨酸y=12051x-5016r=0.9997，赖氨酸y=26701x-12325r=0.9999，线性良好，符合要求。

9回收率实验

精密称取已知含量的样品25mg，平行处理6份，每份中分别加入相当于样品含量100%的各氨基酸对照品的量，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得，结果见表11。

表11回收率实验结果

结果各氨基酸RSD符合要求，回收率良好。

10检测限

按供试品溶液的制备方法制备1份供试品溶液，并将供试品溶液稀释15倍后再进样10μl用上述色谱条件测定，进样6次，峰面积最小的甲硫氨酸(Met)的色谱峰S／N≥3，故认为该方法可用于氨基酸的定性检测。

本发明质量控制方法对产品的质量控制更为有效，较现有方法准确度、灵敏度、稳定性均较高。本发明的方法既可以用于金水宝胶囊，又可以用于其原料及其他制剂，如片剂，颗粒剂等。

附图说明

图1空白样品图谱

图2混合对照品图谱

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1金水宝胶囊

处方：发酵虫草菌粉(Cs-4)330g

制法：取发酵虫草菌粉(Cs-4)，粉碎成细粉，装入胶囊，制成1000粒，即得。

质量控制方法：

供试品溶液的制备：精密称取经匀质处理的金水宝胶囊内容物约50mg至10ml的安瓿瓶中，加浓盐酸2ml，水2ml，熔封；至150℃的烘箱中水解1h，取出冷却，将水解物转移至干锅中蒸干，残渣加0.1mol/L盐酸试液溶解转移至25ml的容量瓶中，过滤，取续滤液5ml至三角瓶中，加异硫氰酸苯酯（PITC）试液2.5ml，三乙胺试液2.5ml，衍生化1小时，加入正己烷10ml振摇，静止10min，取下层液1ml至5ml容量瓶中，加纯净水定容，过微孔滤膜即得。

对照品溶液的制备：另取天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸对照品适量，加0.1mol/L的盐酸溶液配制成浓度各为0.06、0.06、0.03、0.03、0.04、0.03、0.04、0.04、0.03、0.03、0.04、0.03、0.04、0.01、0.01、0.01mg/ml的混合溶液，作为对照品溶液。

色谱条件：照《中华人民共和国药典》2010年版高效液相色谱法（附录ⅥD）试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以pH=6.5的乙酸钠缓冲液（取乙酸钠7.587g乙酸钠，加水850ml溶解，用乙酸调pH至6.5，再加水75ml，乙腈70ml，过滤、超声即得）为流动相A，80%的乙腈水溶液为流动相B，按表1中的梯度程序进行梯度洗脱；柱温为40℃；检测波长为254nm。理论板数按缬氨酸峰计算应不低于5000。

分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每粒含总氨基酸不得少于50mg。

样品：为本公司生产的金水宝胶囊，规格为：0.33g/粒，批号为：110901、110902、110903、110904、110905、110906、110907、110810、110811、110812，共十批，其包装均为市售包装。检测结果见表12。

表1210批样品测定结果

从结果可以看出，本实验方法重现性良好，可用于金水宝胶囊中氨基酸成分的含量测定。

Claims (4)

1.一种金水宝制剂中氨基酸的含量测定方法，其特征在于，所述氨基酸包括：天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸。

2.如权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

供试品溶液的制备：称取金水宝胶囊内容物，加浓盐酸，加热水解，水解物加盐酸溶解，加异硫氰酸苯酯，三乙胺衍生化，加入正己烷，取下层液，加水定容，过滤；

对照品溶液的制备：取天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸对照品适量，加盐酸配制成混合溶液；

供试品溶液和对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算每一种氨基酸的含量；

其中的色谱条件如下：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙酸钠缓冲液为流动相A，乙腈水溶液为流动相B，进行梯度洗脱。

3.如权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

供试品溶液的制备：取金水宝胶囊内容物25-100mg至5-20ml的安瓿瓶中，加浓盐酸1-4ml，水1-4ml，熔封；至100-200℃的烘箱中水解0.5-2h，取出冷却，将水解物转移至干锅中蒸干，残渣加0.05-0.2mol/L盐酸试液溶解转移至10-50ml的容量瓶中，过滤，取续滤液2.5-10ml至三角瓶中，加异硫氰酸苯酯1-5ml，三乙胺1-5ml，衍生化0.5-2小时，加入正己烷5-20ml振摇，静止5-20min，取下层液0.5-2ml至2.5-10ml容量瓶中，加纯净水定容，过微孔滤膜即得；

对照品溶液的制备：取天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸对照品适量，加0.05-0.2mol/L的盐酸溶液配制成浓度各为0.03-0.12，0.03-0.12，0.015-0.06，0.015-0.06，0.02-0.08，0.015-0.06，0.02-0.08，0.02-0.08，0.015-0.06，0.015-0.06，0.02-0.08，0.015-0.06，0.02-0.08，0.005-0.02，0.005-0.02，0.005-0.02mg/ml的混合溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液和对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算每一种氨基酸的含量以及全部氨基酸的含量；

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为10-50cm，内径为2-8mm，粒径为2-10μm；以pH=5-7的乙酸钠缓冲液为流动相A，60-90%的乙腈水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；柱温为20-60℃；检测波长为250-260nm，理论板数按缬氨酸峰计算应不低于3000-6000。

4.如权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

供试品溶液的制备：精密称取经匀质处理的金水宝胶囊内容物约50mg至10ml的安瓿瓶中，加浓盐酸2ml，水2ml，熔封；至150℃的烘箱中水解1h，取出冷却，将水解物转移至干锅中蒸干，残渣加0.1mol/L盐酸试液溶解转移至25ml的容量瓶中，过滤，取续滤液5ml至三角瓶中，加异硫氰酸苯酯试液2.5ml，三乙胺试液2.5ml，衍生化1小时，加入正己烷10ml振摇，静止10min，取下层液1ml至5ml容量瓶中，加纯净水定容，过微孔滤膜；

对照品溶液的制备：另取天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸对照品适量，加0.1mol/L的盐酸溶液配制成浓度各为0.06、0.06、0.03、0.03、0.04、0.03、0.04、0.04、0.03、0.03、0.04、0.03、0.04、0.01、0.01、0.01mg/ml的混合溶液；

分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定得到色谱图，根据色谱图计算每一种氨基酸的含量以及全部氨基酸的含量；

其中的色谱条件如下：照中华人民共和国药典2010年版附录ⅥD高效液相色谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm；以pH=6.5的乙酸钠缓冲液为流动相A，80%的乙腈水溶液为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱；柱温为40℃；检测波长为254nm，理论板数按缬氨酸峰计算应不低于5000；其中乙酸钠缓冲液的制备方法如下：取乙酸钠7.587g，加水850ml溶解，用乙酸调pH至6.5，再加水75ml，乙腈70ml，过滤、超声即得；

流动相梯度洗脱表

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