CN112461950A - 一种锯叶棕果实中水解氨基酸的测定方法 - Google Patents

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程琴
覃旭
吴密
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杨祥燕
崔明勇
陈庆南
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Abstract

本发明公开了一种水解氨基酸的分析方法，包括以下步骤：S1.锯叶棕果实干燥、粉碎，取粉碎后的样品进行水解及提取，得锯叶棕果实提取液；S2.制作标准曲线，采用HPLC进行梯度洗脱测定；S3.取锯叶棕果实提取液，按照步骤S2的HPLC色谱条件进行测定。通过本发明能快速分析出锯叶棕果实中的水解氨基酸成分。

Description

一种锯叶棕果实中水解氨基酸的测定方法
技术领域
本发明涉及锯叶棕成分分析技术领域，尤其是一种锯叶棕果实中水解氨基酸的测定方法。
背景技术
锯叶棕，又名锯棕叶或锯棕榈，属于棕榈科锯叶棕属，是一种常见的棕榈科植物，通常生长在北美洲气候炎热的地区。它是锯叶棕属唯一代表植物，是一种重要的药用棕榈植物，同时也可作为观赏植物，供庭院种植。
据《美国药典》、《英国药典》及文献记载，锯叶棕的果实有抗菌消炎、祛痰平喘、镇静、解痉、调节内分泌、催欲生Chemicalbook精、促进乳房生长发育和泌乳能力、利尿、促进食欲以及抗肿瘤之效。可治疗酒精中毒、头痛、风湿病等50多种疾病。
锯叶棕果实中除含有大量的油脂成分，还含有多糖、氨基酸、黄酮类物质等，为在原料环节对锯叶棕果实的质量进行控制，建立其中的成分分析方法是非常有必要的。
发明内容
本发明公开了一种水解氨基酸的分析方法，能快速分析出锯叶棕果实中的水解氨基酸成分。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种锯叶棕果实中水解氨基酸的测定方法，包括以下步骤：
S1. 锯叶棕果实干燥、粉碎，取粉碎后的样品进行水解及提取，得锯叶棕果实提取液；
S2. 制作标准曲线：取天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸以及胱氨酸标准品，溶于去离子水，采用HPLC进行测定，HPLC的色谱条件为：
梯度洗脱，流动相A：0.1 mol/L醋酸钠溶液-乙腈，按照体积比93:7配制，流动相B：乙腈－水按体积比8: 2配制，梯度洗脱程序为：0~14min，流动相A的体积分数由100%线性下降至85%，14~29min，流动相A的体积分数由85%线性下降至66%，29~30min，流动相A的体积分数由66%线性下降至0%，30~37min，流动相A的体积分数为0%，37~37.1min，流动相A的体积分数由0%线性增加至100%，37.1~45min，流动相A的体积分数为100%；流速：1.0 mL/min；检测波长：254nm；色谱柱：C18，4.6×250 mm，5μm；进样量：10μL；柱温箱：40℃；
S3. 取锯叶棕果实提取液，按照步骤S2的HPLC色谱条件进行测定。
进一步的，所述步骤S1具体包括以下操作：取350 mg的样品置于20 mL的水解管中，加入16 mL 6mol/L 的盐酸溶液，真空脱气30min，充氮封管，在110℃下水解22~24小时，取出水解管，冷却后打开水解管，用去离子水无损转移到50 mL容量瓶中，并定容；取1 mL水解液于容器中，于真空中脱酸抽干，加1 mL水再抽干，再加1 mL水再抽干备用；准确加入1mL 0.02 mol/L 的盐酸溶液，充分溶解，得一次处理溶液；
量取所述一次处理溶液500 μL，置于离心管中，加入1 mol/L三乙胺乙腈溶液250 μL，混匀，加入0.1 mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液25 μL，混匀，室温放置1~1.5小时，加2 mL正己烷，振摇，放置10 ~20min，取下层溶液用0.22 μm的水相膜滤膜过滤，得锯叶棕果实提取液。
以上所述的水解氨基酸的分析方法，可快速分离出17种氨基酸成分，分离效果好，能为锯叶棕果实质量的控制，以及确保锯叶棕果实相关药物临床使用疗效，提供必要的理论保证。
附图说明
图1是17种氨基酸标准品的HPLC色谱图。
其中，天门冬氨酸1，苏氨酸2，丝氨酸3，谷氨酸4，甘氨酸5，丙氨酸6，胱氨酸7，缬氨酸8，蛋氨酸9，异亮氨酸10，亮氨酸11，酪氨酸12，苯丙氨酸13，赖氨酸14，组氨酸15，脯氨酸16，精氨酸17。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于以下实施例。
1.1试验材料与仪器设备
材料：锯叶棕果实，采摘于广西壮族自治区亚热带作物研究所种质资源圃中引种成活的锯叶棕，去果核后的果肉置于35℃的鼓风干燥箱中鼓风干燥，经粉碎过40目筛后装袋备用；
试剂：17种氨基酸酸混合标准品、浓盐酸、异硫氰酸苯酯、三乙胺、乙腈（色谱纯）、醋酸钠、氯仿。
主要仪器设备：分析天平（感量为0.0001g）、离心机、ThermoFisher U3000液相色谱仪。
1.2 试验方法
S1. 取350 mg的样品置于20 mL的水解管中，加入16 mL 6mol/L 的盐酸溶液，真空脱气30分钟，充氮封管，在110℃下水解22~24小时，取出水解管，冷却后打开水解管，用去离子水无损转移到50 mL容量瓶中，并定容，准确取1 mL 水解液于小瓶中，于真空中脱酸抽干，加1 mL水再抽干，再加1 mL水再抽干备用。准确加入1mL 0.02 mol/L 的盐酸溶液，充分溶解，得一次处理溶液。
精密量取一次处理溶液500μL，置于5 mL塑料离心管中，精密加入1 mol/L三乙胺乙腈溶液250μL，混匀，精密加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液25μL，混匀，室温放置1小时，加2 mL正己烷，剧烈振摇，放置10 min，取下层溶液用0.22μm的水相膜滤膜过滤后待上机分析。
S2. 制作标准曲线：取天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸以及胱氨酸标准品，溶于去离子水，采用HPLC进行测定，HPLC的色谱条件为：
梯度洗脱，流动相A：0.1 mol/L醋酸钠溶液-乙腈，按照体积比93:7配制，醋酸钠溶液的配制方法为：取无水醋酸钠8.2 g，加水900 mL溶解，用冰醋酸调pH至6.5，然后加水至1000mL，流动相B：乙腈－水按8: 2配制，梯度洗脱程序为：0~14min，流动相A的体积分数由100%线性下降至85%，流动相B的体积分数由0%线性增加至15%，14~29min，流动相A的体积分数由85%线性下降至66%，流动相B的体积分数由15%线性增加至34%，29~30min，流动相A的体积分数由66%线性下降至0%，流动相B的体积分数由34%线性增加至100%，30~37min，流动相A的体积分数为0%，流动相B的体积分数为100%，37~37.1min，流动相A的体积分数由0%线性增加至100%，流动相B的体积分数由100%线性下降至0%，37.1~45min，流动相A的体积分数为100%；流速：1.0 mL/min；检测波长：254nm；色谱柱：C18，4.6×250 mm，5μm；进样量：10μL；柱温箱：40℃。
结合图1所示，17种氨基酸标准品得到很好的分离。
S3. 取锯叶棕果实提取液，按照步骤S2的HPLC色谱条件进行测定。
2检测结果及数据分析
测定结果见下表：
氨基酸名称 相对含量/%
天门冬氨酸 5.98
苏氨酸 3.54
丝氨酸 2.92
谷氨酸 7.42
甘氨酸 2.98
丙氨酸 3.81
胱氨酸 0.52
缬氨酸 3.06
蛋氨酸 1.62
异亮氨酸 2.80
亮氨酸 4.92
酪氨酸 2.75
苯丙氨酸 2.75
赖氨酸 3.93
组氨酸 2.00
精氨酸 3.77
由上述测定结果可见，采用本发明的方法可以测定出锯叶棕果实中氨基酸的含量，果实中含有上述17种氨基酸，其中有7种为人体必需氨基酸，即亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸及缬氨酸，此外，在17种氨基酸中，谷氨酸含量最高。从表中还可以看出果实蛋白酸水解液中呈鲜味的氨基酸谷氨酸和天冬氨酸的相对含量分别为7.42%和5.98%，呈甜味的氨基酸丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸总和为15.22%。呈甜味和鲜味的氨基酸总和达到28.62%。

Claims (3)

1.一种锯叶棕果实中水解氨基酸的测定方法，其特征在于包括以下步骤：
S1. 锯叶棕果实干燥、粉碎，取粉碎后的样品进行水解及提取，得锯叶棕果实提取液；
S2. 制作标准曲线：取天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸以及胱氨酸标准品，溶于去离子水，采用HPLC进行测定，HPLC的色谱条件为：
梯度洗脱，流动相A：0.1 mol/L醋酸钠溶液-乙腈，按照体积比93:7配制，流动相B：乙腈-水按体积比8: 2配制，梯度洗脱程序为：0~14min，流动相A的体积分数由100%线性下降至85%，14~29min，流动相A的体积分数由85%线性下降至66%，29~30min，流动相A的体积分数由66%线性下降至0%，30~37min，流动相A的体积分数为0%，37~37.1min，流动相A的体积分数由0%线性增加至100%，37.1~45min，流动相A的体积分数为100%；流速：1.0 mL/min；检测波长：254nm；色谱柱：C18柱，4.6×250 mm，5μm；进样量：10μL；柱温箱：40℃；
S3. 取锯叶棕果实提取液，按照步骤S2的HPLC色谱条件进行测定。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：
所述步骤S1具体包括以下操作：取350 mg的样品置于20 mL的水解管中，加入16 mL6mol/L 的盐酸溶液，真空脱气30min，充氮封管，在110℃下水解22~24小时，取出水解管，冷却后打开水解管，用去离子水无损转移到50 mL容量瓶中，并定容；取1 mL 水解液于容器中，于真空中脱酸抽干，加1 mL水再抽干，再加1 mL水再抽干备用；准确加入1mL 0.02 mol/L 的盐酸溶液，充分溶解，得一次处理溶液；
量取所述一次处理溶液500 μL，置于离心管中，加入1 mol/L三乙胺乙腈溶液250 μL，混匀，加入0.1 mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液25 μL，混匀，室温放置1~1.5小时，加2 mL正己烷，振摇，放置10 ~20min，取下层溶液用0.22 μm的水相膜滤膜过滤，得锯叶棕果实提取液。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：
所述醋酸钠溶液的配制方法为：取无水醋酸钠8.2 g，加水900 mL溶解，用冰醋酸调pH至6.5，然后加水至1000 mL。
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