CN108519450B - 延胡索对照提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种延胡索对照提取物及其制备方法和应用，属于中药质量控制技术领域。该延胡索对照提取物的制备方法包括以下步骤：提取；浓缩；大孔树脂纯化；碱性氧化铝纯化；最终得延胡索对照提取物。采用特定的方法对延胡索药材进行提取和纯化，最终得到具有特定成分的延胡索对照提取物，该提取物中含有多种延胡索指标性成分，将该制备方法得到的延胡索对照提取物作为对照用于延胡索及含延胡索药味中药制剂的质量控制中，具有反馈成分信息全面的优点，并且，将该延胡索对照提取物作为对照使用，无需进行繁琐的前处理步骤，可以直接溶解后检测，具有操作简便、检测成本低的优点。

Description

延胡索对照提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及中药质量控制技术领域，特别是涉及一种延胡索对照提取物及其制备方法和应用。

背景技术

延胡索(Corydalis yanhusuo W.T.Wang)，又名：延胡、玄胡索、元胡索、元胡等。是罂粟科、紫堇属多年生草本植物，块茎为著名的常用中药，含20多种生物碱，用于行气止痛、活血散瘀、跌打损伤等。

延胡索作为一种中药材，收载于中国药典中。对于延胡索药材的鉴定，中国药典中的规定为：取本品粉末1g，加甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加浓氨试液调至碱性，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取延胡索对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述三种溶液各2～3μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮(9︰2)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中约3分钟后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

但是，在上述鉴别方法中，采用延胡索对照药材、延胡索乙素对照品为对照，鉴别延胡索中不同的生物碱成分，但这样的方法具有对照物的操作繁琐，检测成本高的缺点。

而对于延胡索药材中有效成分的质量控制，中国药典采用以延胡索乙素作为对照的高效液相色谱法进行了含量测定。但是，在该含量测定方法中，仍沿用常规的中药质量控制模式，即以至少一种单一成分的对照品等作为对照，对延胡索进行质量评价分析，这种模式又存在评价指标相对单一，检测成本高的缺陷。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，制备一种延胡索对照提取物，并将其作为对照物应用于延胡索及含延胡索的中药制剂的质量控制中，具有反馈成分信息全面，且操作简便、检测成本低的优点。

一种延胡索对照提取物的制备方法，包括以下步骤：

提取：取延胡索药材，按照每克延胡索药材20ml-40ml的量加入体积百分浓度为50％-90％乙醇水溶液，加热回流0.5-2小时，过滤，得滤液；

浓缩：回收所述滤液中的乙醇，得浓缩液；

大孔树脂纯化：将上述浓缩液用氨水调节pH值至9-10后上样加至大孔吸附树脂柱，进行洗脱，以低浓度的乙醇水溶液洗脱，弃去洗脱液；再以高浓度的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得到延胡索提取物粗品；

碱性氧化铝纯化：取上述延胡索提取物粗品，上样至碱性氧化铝柱，进行洗脱，以乙酸乙酯：甲醇体积比为6-8:2-4的混合溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，即得延胡索对照提取物。

上述延胡索对照提取物的制备方法，首先将延胡索以乙醇水溶液提取，再依次以大孔树脂和碱性氧化铝进行纯化，去除冗杂成分，最后得到具有特定成分的延胡索对照提取物。该提取物中含有多种延胡索指标性成分，将该制备方法得到的延胡索对照提取物作为对照用于延胡索及含延胡索药味中药制剂的质量控制中，具有反馈成分信息全面的优点，并且，将该延胡索对照提取物作为对照使用，无需进行繁琐的前处理步骤，可以直接溶解后检测，具有操作简便、检测成本低的优点。

在其中一个实施例中，该制备方法还包括前处理步骤，所述前处理步骤中，将延胡索药材粉碎为细粉，备用。将药材粉碎为细粉，能够提高提取效率，节约能源和溶剂，具有绿色环保的优点。

在其中一个实施例中，所述提取步骤中，按照每克延胡索药材10ml-20ml的量加入体积百分浓度为50％-90％乙醇水溶液加热回流2次，每次0.5小时，过滤，合并滤液。采用分次回流提取的方法，具有更好的提取效率。

在其中一个实施例中，所述浓缩步骤中，在30-50℃下减压回收乙醇至无醇味，得浓缩液。在减压条件下低温回收乙醇，既能避免指标成分在高温下产生变化，又能最大限度的去除乙醇，避免残留乙醇对下一步大孔吸附树脂纯化中造成不良影响。

在其中一个实施例中，所述大孔树脂纯化步骤中，所述大孔吸附树脂为D101型；且所述洗脱的具体步骤为：以3-5个柱体积的水洗脱，弃去，再以2-5个柱体积的体积百分浓度为15-25％的乙醇水溶液洗脱，弃去，再以5-8个柱体积的体积百分浓度为90-100％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得到延胡索提取物粗品；

所述碱性氧化铝纯化步骤中，所述洗脱的具体步骤为：按照每克装柱用碱性氧化铝8-12ml的量，以乙酸乙酯：甲醇体积比为6-8:2-4的混合溶液洗脱，收集洗脱液。

采用上述条件，具有较好的纯化效果。

在其中一个实施例中，所述大孔树脂纯化步骤中，所述洗脱的具体步骤为：以4个柱体积的水洗脱，弃去，再以4个柱体积的体积百分浓度为20％的乙醇水溶液洗脱，弃去，再以6.6个柱体积的体积百分浓度为95％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得到延胡索提取物粗品；

所述碱性氧化铝纯化步骤中，所述洗脱的具体步骤为：按照每克装柱用碱性氧化铝10ml的量，以乙酸乙酯：甲醇体积比为7:3的混合溶液洗脱，收集洗脱液。

采用上述条件，具有最佳的纯化效果。

在其中一个实施例中，所述浓缩步骤中，在30-50℃下减压回收乙醇；所述大孔树脂纯化步骤中，在30-50℃的条件下减压回收溶剂至干，研为细粉后干燥除尽水分，得延胡索提取物粗品；

所述碱性氧化铝纯化步骤中，先将所述延胡索提取物粗品以适量甲醇溶解，加入碱性氧化铝拌样，挥干溶剂后干法上样；

所述碱性氧化铝纯化步骤中，将所述洗脱液在30-50℃的条件下减压回收溶剂至干，研为细粉后干燥除尽水分，得延胡索对照提取物。

以上述方法操作，具有方便、效果佳的优点。

在其中一个实施例中，所述浓缩步骤中，在25-35℃下减压回收乙醇；所述大孔树脂纯化步骤中，在25-35℃的条件下减压回收溶剂至干；所述碱性氧化铝纯化步骤中，将所述洗脱液在25-35℃的条件下减压回收溶剂至干。

本法明还公开了一种延胡索对照提取物，通过上述的延胡索对照提取物的制备方法制备得到。

上述延胡索对照提取物，其中含有多种延胡索的指标性成分。因此，将该制备方法得到的延胡索对照提取物作为对照用于延胡索及含延胡索药味中药制剂的质量控制中，具有反馈成分信息全面的优点，并且，将该延胡索对照提取物作为对照使用，无需进行繁琐的前处理步骤，可以直接溶解后检测，还具有操作简便、检测成本低的优点。

本法明还公开了上延胡索对照提取物的应用，将上述的延胡索对照提取物用于延胡索及含延胡索的中药制剂的质量控制中。

将上述的延胡索对照提取物用于延胡索及含延胡索药味中药制剂的质量控制中，具有反馈成分信息全面的优点，并且，将该延胡索对照提取物作为对照使用，无需进行繁琐的前处理步骤，可以直接溶解后检测，还具有操作简便、检测成本低的优点。

在其中一个实施例中，所述延胡索及含延胡索的中药制剂的质量控制方法为：将所述延胡索对照提取物、待测样品以薄层色谱法和/或高效液相色谱法进行检测，对比判别；

所述薄层色谱法的检测条件为：

薄层板：1％氢氧化钠溶液制备的硅胶薄层板；

展开剂：甲苯-丙酮体积比为9:2；

显色剂及检视：以碘为显色剂，置于365nm的紫外灯下检视；

所述高效液相色谱法的检测条件如下：

固定相：C₁₈色谱柱；

柱温：20-30℃；

流动相：A相为乙腈，B相为0.1％磷酸水，且B相以三乙胺调pH值至6.1，按照以下梯度洗脱程序进行：

流速：1.0ml/min；

检测器：紫外检测器；

检测波长：280nm。

采用以上方法能够很好地在薄层色谱及液相色谱中分离延胡索中的多种成分，较好的分离度将有利于后续的分析判别。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种延胡索对照提取物的制备方法，采用特定的方法对延胡索药材进行提取、大孔吸附树脂纯化和碱性氧化铝纯化，最终得到具有特定成分的延胡索对照提取物，该提取物中含有多种延胡索指标性成分。因此，将该制备方法得到的延胡索对照提取物作为对照用于延胡索及含延胡索药味中药制剂的质量控制中，具有反馈成分信息全面的优点，并且，将该延胡索提取物作为对照使用，无需进行繁琐的前处理步骤，可以直接溶解后检测，具有操作简便、检测成本低的优点。

本发明的一种延胡索对照提取物的应用，将上述的延胡索对照提取物用于延胡索及含延胡索药味中药制剂的质量控制中，除具有上述优点外，还对分析方法进行了优化，采用该分析方法，能够很好地在薄层色谱及液相色谱中分离延胡索中的多种成分，较好的分离度将有利于后续的分析判别。

并且，从延胡索对照提取物的应用中看出，延胡索对照提取物可以应用于延胡索药材、醋延胡索饮片、醋延胡索配方颗粒和元胡止痛片的的定性和/或定量分析，结果准确可靠，其整体评价效果与对照品、对照药材相当，甚至优于单用对照品作为对照的评价方法。

另外，延胡索对照提取物的使用方法与对照品类似，称重后直接溶解即可，尤其在多成分含量测定时，对照提取物溶液的配制比对照品溶液的配制更加简便。因此，对照提取物评价模式具有可行性和一定的优势，值得推广应用。

附图说明

图1为实施例1中延胡索对照提取物制备方法工艺流程图；

图2为实施例1中延胡索对照提取物的HPLC图谱；

图3为实施例1中延胡索对照提取物薄层鉴别图谱；

图4为实施例2中延胡索药材、醋延胡索饮片薄层鉴别图谱；

图5为实施例2中醋延胡索配方颗粒薄层鉴别图谱；

图6为实施例2中元胡止痛片薄层鉴别图谱；

图7为实施例3中延胡索对照提取物A的HPLC图谱；

图8为实施例3中延胡索对照提取物E的HPLC图谱；

图9为对比例中延胡索对照提取物B的HPLC图谱；

图10为对比例中延胡索对照提取物C的HPLC图谱；

图11为对比例中延胡索对照提取物D的HPLC图谱。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下实施例中使用到的试剂如下：

1.延胡索乙素对照品(中检院：110726-201516)；

2.四氢小檗碱对照品(四川省维克奇生物科技有限公司：140914)；

3.四氢黄连碱对照品(成都瑞芬思生物科技有限公司：S-113-150418)；

4.延胡索甲素对照品(四川省维克奇生物科技有限公司：140523)；

5.延胡索对照药材(中检院：120928-201208)；

6.醋延胡索饮片(市售，批号：20150909)；

7.延胡索药材(市售，批号：20160418-2)；

8.延胡索药材(市售，批号：20160418-1)；

9.醋延胡索配方颗粒(市售，批号：130801)；

10.醋延胡索配方颗粒(市售，批号：130802)；

11.醋延胡索配方颗粒(市售，批号：130803)；

12.元胡止痛片(市售，批号：151202)；

13.元胡止痛片(市售，批号：1412005)；

14.元胡止痛片(市售，批号：15010)。

实施例1

一种延胡索对照提取物，通过以下方法制备得到，其工艺流程如图1所示，具体如下：

1、前处理。

取延胡索药材，粉碎成细粉。

2、提取。

取上述延胡索细粉100g，置套式恒温器中，加入15倍量70％乙醇水溶液(1500ml)加热回流，回流2次，每次30min，静置冷却后滤过，合并滤液。

3、浓缩。

滤液在40℃减压回收乙醇至无醇味(约300mL)，得浓缩液。

4、大孔树脂纯化。

上述浓缩液有不溶物，浓缩液用氨水调其pH值至9～10，连同不溶物一起上预处理过的D101型大孔吸附树脂柱(柱内径4cm，高24cm)。

随后进行洗脱，具体为：先用水1200mL(相当于3.98个柱体积)洗脱，弃去洗脱液，再用20％乙醇水溶液1200mL(相当于3.98个柱体积)洗脱，弃去洗脱液，最后用95％乙醇2000mL洗脱，收集95％乙醇洗脱液。

95％乙醇洗脱液在40℃的条件下减压回收溶剂至干，减压干燥24小时以上，研为细粉后继续减压干燥12小时以上，得延胡索提取物粗品；

5、碱性氧化铝纯化。

取上述延胡索提取物粗品的细粉约0.5g，加适量甲醇溶解，加碱性氧化铝(200～300目)5g拌样，挥干溶剂，取100g碱性氧化铝(200～300目)装柱，柱内径4cm，干法上样。

随后进行洗脱，具体为：用乙酸乙酯:甲醇(7:3)混合溶液1000mL(即每克装柱用碱性氧化铝10ml的量)洗脱，收集洗脱液。

将所述洗脱液在40℃的条件下减压回收溶剂至干，减压干燥48小时以上，研为细粉后继续减压干燥12小时以上，得延胡索对照提取物A。

按照上述方法，制备了6个批次的延胡索对照提取物，以高效液相色谱法进行检测。

一、供试品制备。

1、延胡索对照提取物溶液的制备。

取实施例1中1-6批次的延胡索对照提取物5mg，以10ml甲醇溶解，即得。

2、对照品溶液的制备。

取原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、脱氢紫堇碱、海罂粟碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、延胡索甲素、脱氢海罂粟碱、D-四氢药根碱和四氢黄连碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含原阿片碱20μg、盐酸巴马汀20μg、盐酸小檗碱10μg、脱氢紫堇碱100μg、海罂粟碱40μg、延胡索乙素40μg、四氢小檗碱5μg、延胡索甲素40μg、脱氢海罂粟碱10μg、D-四氢药根碱10μg和四氢黄连碱5μg的混合对照品溶液，即得。

二、检测。

测定条件如下：

固定相：UltimateAQ-C₁₈色谱柱(250×4.6mm，5μm)；

柱温：25℃；

流动相：A相为乙腈，B相为0.1％磷酸水，且B相以三乙胺调pH值至6.1，按照以下梯度洗脱程序进行：

表1.梯度洗脱程序

流速：1.0ml/min；

检测器：紫外检测器；

检测波长：280nm。

三、结果。

得到如图2所示的延胡索对照提取物HPLC图谱，标号为1的色谱峰为原阿片碱(t_R＝29.818min)；标号为4的色谱峰为小檗碱(t_R＝44.523min)；标号为5的色谱峰为脱氢紫堇碱(t_R＝46.711min)；标号为6的色谱峰为海罂粟碱(t_R＝48.192min)；标号为7的色谱峰为D-四氢药根碱(t_R＝49.646min)；标号为8的色谱峰为延胡索乙素(t_R＝54.852min)；标号为9的色谱峰为四氢小檗碱(t_R＝58.245min)；标号为10的色谱峰为四氢黄连碱(t_R＝59.428min)；标号为11的色谱峰为延胡索甲素(t_R＝59.914min)；标号为12的色谱峰为脱氢海罂粟碱(t_R＝60.987min)。

并以对照品计算这几种成分的含量(以干燥品计算，含量以wt％计)，结果如下表所示。

表2.不同批次中各化学成分的含量及总量(％)

批次	1	2	3	4	5	6
							原阿片碱	4.57	5.93	4.78	4.75	3.67	4.12
巴马汀	4.83	6.68	4.45	4.86	3.61	3.9
							小檗碱	1.45	1.52	1.34	1.66	0.99	1.05
脱氢紫堇碱	19.19	30.19	20.21	19.31	24.99	20.83
							海罂粟碱	6.89	7.54	7.14	6.02	8.62	9.06
D-四氢药根碱	2.43	1.95	2.43	4.18	4.09	3.35
							延胡索乙素	6.62	4.64	7.14	8.04	6.53	7.6
四氢小檗碱	1.22	0.84	1.41	1.77	0.99	1.19
							四氢黄连碱	1.22	0.96	0.68	1.32	0.31	0.93
延胡索甲素	10.54	2.53	12.67	11.78	10.7	11.89
							脱氢海罂粟碱	2.56	1.37	1.98	1.4	2.58	2.45
总含量	61.52	64.15	64.22	65.09	67.07	66.37

从上述结果中可以看出，采用本实施例的方法制备得到的延胡索对照提取物，具有较高含量的脱氢紫堇碱和延胡索甲素，且不同批次之间的延胡索对照提取物中各成分含量相对稳定。

再将上述6个批次的延胡索对照提取物，以薄层色谱法进行检测。

一、供试品制备。

1、延胡索对照提取物溶液的制备：取实施例1中1-6批次的延胡索对照提取物适量，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为供试品溶液。

2、对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品、四氢小檗碱对照品、四氢黄连碱对照品和延胡索甲素对照品适量，分别加甲醇制成每1ml分别含延胡索乙素0.2mg，四氢小檗碱0.3mg，四氢黄连碱0.1mg和延胡索甲素0.3的溶液，作为对照品溶液。

3、延胡索对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材粉末1g，加甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加浓氨试液调至碱性，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。

4、延胡索药材溶液的制备同延胡索对照药材溶液。

二、检测。

照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述溶液各1～3μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮(9:2)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中约3分钟后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯(365nm)下检视。

具体测定条件如下：

薄层板：1％氢氧化钠溶液制备的高效硅胶预制薄层板(HPTLC Silica gel 60，Merck批号：HX68850041)；

展开剂：甲苯-丙酮(9:2)；

显色剂及检视：碘显色，UV(365nm)下检视。

三、结果。

结果如图3所示，标号1为延胡索乙素对照品、标号2为四氢小檗碱对照品、标号3为四氢黄连碱对照品、标号4为延胡索甲素对照品、标号5为延胡索对照药材、标号6-11为上述批号1-6的延胡索对照提取物。

从延胡索对照提取物薄层色谱图中可以看出：延胡索对照提取物的薄层色谱图与延胡索药材图谱、延胡索对照药材图谱斑点对应性好，图谱信息量丰富。

实施例2

将上述实施例1制备得到的延胡索对照提取物用于延胡索药材、醋延胡索饮片、醋延胡索配方颗粒和元胡止痛片的鉴别和含量测定中。

一、延胡索药材、醋延胡索饮片的薄层鉴别。

1、供试品制备。

(1)供试品溶液的制备。

延胡索对照药材溶液的制备同实施例1。

延胡索药材和醋延胡索饮片：取延胡索药材和醋延胡索饮片粉末各1g，加甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加浓氨试液调至碱性，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

2、检测。

测定条件同实施例1。

3、结果。

结果如图4所示，标号1为延胡索乙素对照品、标号2为四氢小檗碱对照品品、标号3为四氢黄连碱对照品、标号4为延胡索甲素对照品、标号5为延胡索对照药材、标号6-11为延胡索对照提取物1-6、标号12为醋延胡索饮片(20150909)、标号13为延胡索药材(批号：20160418-2)、标号14为延胡索药材(批号20160418-1)。

从上述薄层色谱图中可以看出：将延胡索对照提取物应用于延胡索药材、醋延胡索饮片的薄层鉴别中，结果显示延胡索对照提取物图谱与延胡索药材、醋延胡索饮片的图谱显相同颜色的荧光斑点。延胡索对照提取物鉴别效果与延胡索对照药材类似，优于单用对照品鉴别的效果。

二、醋延胡索配方颗粒的薄层鉴别。

1、供试品制备。

(1)供试品溶液的制备。

延胡索对照药材溶液的制备同实施例1。

醋延胡索配方颗粒：取醋延胡索配方颗粒0.5g，研细，加甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加浓氨试液调至碱性，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

2、检测。

测定条件同实施例1。

3、结果。

结果如图5所示，标号1为延胡索乙素对照品、标号2为四氢小檗碱对照品品、标号3为四氢黄连碱对照品、标号4为延胡索甲素对照品、标号5为延胡索对照药材、标号6-11为延胡索对照提取物1-6、标号12为醋延胡索配方颗粒(批号：130801)、标号13为醋延胡索配方颗粒(批号：130802)、标号14为醋延胡索配方颗粒(批号：130803)。

从上述薄层色谱图中可以看出：将延胡索对照提取物应用于醋延胡索配方颗粒的薄层鉴别中，结果显示延胡索对照提取物图谱与醋延胡索配方颗粒的图谱显相同颜色的荧光斑点。延胡索对照提取物鉴别效果与延胡索对照药材类似，优于单用对照品鉴别的效果。

三、元胡止痛片的薄层鉴别。

1、供试品制备。

(1)供试品溶液的制备。

延胡索对照药材溶液的制备同实施例1。

元胡止痛片：取元胡止痛片10片，除去包衣，研细，加甲醇50mL，超声处理30分钟，滤过，滤液加中性氧化铝5g，振摇数分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水适量使溶解，加浓氨试液调节pH值至9～10，用乙醚振摇提取3次，每次10mL，乙醚液蒸干，残渣加甲醇lmL使溶解，作为供试品溶液。

2、检测。

测定条件同实施例1。

3、结果。

结果如图6所示，标号1为延胡索乙素对照品、标号2为四氢小檗碱对照品品、标号3为四氢黄连碱对照品、标号4为延胡索甲素对照品、标号5为延胡索对照药材、标号6-11为延胡索对照提取物1-6、标号12为元胡止痛片(批号：151202)、标号13为元胡止痛片(批号：1412005)、标号14为元胡止痛片(批号:15010)。

从上述薄层色谱图中可以看出：将延胡索对照提取物应用于元胡止痛片的薄层鉴别中，结果显示延胡索对照提取物图谱与元胡止痛片的图谱显相同颜色的荧光斑点。延胡索对照提取物鉴别效果与延胡索对照药材类似，优于单用对照品鉴别的效果。

四、高效液相色谱含量测定。

1、供试品制备。

(1)醋延胡索饮片、延胡索药材和醋延胡索配方颗粒供试品溶液的制备。

延胡索药材和醋延胡索饮片：取延胡索药材和醋延胡索饮片粉末各0.5g，精密称定，置于平底烧瓶中，精密加入70％甲醇20mL，称定重量，冷浸1h，加热回流30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

醋延胡索配方颗粒：取醋延胡索配方颗粒，研细，取0.5g，精密称定，置于平底烧瓶中，精密加入70％甲醇50mL，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，并用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(2)延胡索对照提取物溶液的制备。

参照实施例1。

(3)对照品溶液的制备。

取原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、脱氢紫堇碱、海罂粟碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、延胡索甲素、脱氢海罂粟碱、D-四氢药根碱和四氢黄连碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含原阿片碱20μg、盐酸巴马汀20μg、盐酸小檗碱10μg、脱氢紫堇碱100μg、海罂粟碱40μg、延胡索乙素40μg、四氢小檗碱5μg、延胡索甲素40μg、脱氢海罂粟碱10μg、D-四氢药根碱10μg和四氢黄连碱5μg的混合对照品溶液，即得。

2、检测。

以高效液相色谱法进行检测，具体条件参照实施例1。

3、结果。

分别以对照品和延胡索对照提取物中成分的峰面积计算醋延胡索饮片、延胡索药材和醋延胡索配方颗粒的含量，结果如下表所示。

表3.醋延胡索饮片、延胡索药材和醋延胡索配方颗粒中各成分的含量结果比较(n＝2)

从上述结果中可以看出，将延胡索对照提取物应用于延胡索药材、醋延胡索饮片和醋延胡索配方颗粒的含量测定项，检测结果显示：对照提取物计算法和对照品计算法的结果差异小。表明延胡索对照提取物可以应用于延胡索药材、醋延胡索饮片和醋延胡索配方颗粒的含量测定，结果可靠。

实施例3

一、延胡索对照提取物制备。

一种延胡索对照提取物，按照实施例1的方法制备，区别仅在于，在需要进行减压回收溶剂的步骤均采用30℃减压回收，得延胡索对照提取物E。

二、检测。

对实施例1制备得到的延胡索对照提取物A和本实施例制备得到的延胡索对照提取物E进行HPLC检测。

1、检测条件。

固定相：DIKMA-C₁₈色谱柱(250×4.6mm，5μm)；

柱温：25℃；

流动相：A相为乙腈，B相为0.1％磷酸水，且B相以三乙胺调pH值至6.1，按照以下梯度洗脱程序进行：

表4.梯度洗脱程序

流速：1.0ml/min；

检测器：紫外检测器；

检测波长：280nm。

2、检测结果。

分别得到如图7(延胡索对照提取物A)和图8(延胡索对照提取物E)所示的延胡索对照提取物HPLC图谱。

图7中，标号为1的色谱峰为原阿片碱(t_R＝29.216min)；标号为4的色谱峰为小檗碱(t_R＝41.169min)；标号为5的色谱峰为脱氢紫堇碱(t_R＝43.745min)；标号为6的色谱峰为海罂粟碱(t_R＝50.247min)；标号为7的色谱峰为D-四氢药根碱(t_R＝52.683min)；标号为8的色谱峰为延胡索乙素(t_R＝57.088min)；标号为9的色谱峰为四氢小檗碱(t_R＝61.128min)；标号为10的色谱峰为四氢黄连碱(t_R＝62.616min)；标号为11的色谱峰为延胡索甲素(t_R＝63.288min)；标号为12的色谱峰为脱氢海罂粟碱(t_R＝64.195min)。

图8中，标号为1的色谱峰为原阿片碱(t_R＝29.488min)；标号为4的色谱峰为小檗碱(t_R＝41.487min)；标号为5的色谱峰为脱氢紫堇碱(t_R＝44.280min)；标号为6的色谱峰为海罂粟碱(t_R＝50.818min)；标号为7的色谱峰为D-四氢药根碱(t_R＝52.730min)；标号为8的色谱峰为延胡索乙素(t_R＝57.201min)；标号为9的色谱峰为四氢小檗碱(t_R＝61.203min)；标号为10的色谱峰为四氢黄连碱(t_R＝62.786min)；标号为11的色谱峰为延胡索甲素(t_R＝63.341min)；标号为12的色谱峰为脱氢海罂粟碱(t_R＝64.217min)。

从延胡索对照提取物A和E的HPLC图谱中可以看出，温度的升高会导致8号峰之前的色谱小峰(椭圆框内)随着温度的增加而慢慢变大，考虑到指标性成分的标识作用，在本实施例中，延胡索对照提取物E的效果优于延胡索对照提取物A。

对比例

本对比例的延胡索对照提取物，采用以下不同的制备方法制备得到：

一、正丁醇萃取法纯化(萃取法)。

取延胡索药材粉末适量加15倍量70％乙醇加热回流提取2次，每次0.5小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至近干后，用20mL水溶解并用氨水调节pH值至9～10，用等量水饱和的正丁醇萃取三次，合并萃取液，萃取液减压浓缩至干，即得延胡索对照提取物B。

二、D101型大孔吸附树脂纯化法。

取延胡索药材粉末适量加15倍量70％乙醇加热回流提取2次，每次0.5小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至近干后，用20mL水溶解并用浓氨试液调pH值至9～10后，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为2cm，柱高为12cm)，先用水200mL洗脱，再用20％乙醇水溶液200mL洗脱，最后用95％乙醇200mL洗脱，弃去水洗液及20％乙醇洗脱液，收集95％乙醇洗脱液，水浴蒸干，减压干燥12小时以上，即得延胡索对照提取物C。

三、先水饱和正丁醇萃取后再上大孔树脂

取延胡索药材粉末适量加15倍量70％乙醇加热回流提取2次，每次0.5小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至近干后，用20mL水溶解并用氨水调节pH值至9～10，用等量水饱和的正丁醇萃取三次，合并萃取液，萃取液减压浓缩至干，残渣用20mL水溶解后，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为2cm，柱高为12cm)，先用水200mL洗脱，再用20％乙醇水溶液200mL洗脱，最后用95％乙醇200mL洗脱，弃去水洗液及20％乙醇洗脱液，收集95％乙醇洗脱液，水浴蒸干，减压干燥12小时以上，即得延胡索对照提取物D。

将本对比例制备得到的延胡索对照提取物B、C和D以高效液相色谱法进行检测，检测方法同上，检测结果如图9-11和下表所示。

表5不同延胡索对照提取物中各成分含量(％)

提取物	B	C	D
				原阿片碱	1.74	3.28	3.83
巴马汀	1.56	2.18	0.87
				小檗碱	0.45	0.66	0.25
脱氢紫堇碱	11.85	14.22	16.81
				海罂粟碱	2.48	4.77	5.46
D-四氢药根碱	/	/	/
				延胡索乙素	1.65	3.8	4.45
四氢小檗碱	0.36	0.79	0.46
				四氢黄连碱	/	/	/
延胡索甲素	1.31	4.96	3.25
				脱氢海罂粟碱	0.74	0.68	2.38
总含量	22.14	35.32	37.75

从上表中可以看出，与实施例1得到的延胡索对照提取物比较，延胡索对照提取物B、C和D中所含有的各指标性成分的总含量均较低；且不含有D-四氢药根碱和四氢黄连碱，无法全面体现延胡索成分的全面信息。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种延胡索对照提取物的制备方法，包括以下步骤：

提取：取延胡索药材，按照每克延胡索药材20ml-40ml的量加入体积百分浓度为50％-90％乙醇水溶液，加热回流0.5-2小时，过滤，得滤液；

浓缩：在30-50℃下减压回收所述滤液中的乙醇，得浓缩液；

大孔树脂纯化：大孔吸附树脂为D101型；将上述浓缩液用氨水调节pH值至9-10后上样加至大孔吸附树脂柱，进行洗脱，所述洗脱的具体步骤为：以4个柱体积的水洗脱，弃去，再以4个柱体积的体积百分浓度为20％的乙醇水溶液洗脱，弃去，再以6.6个柱体积的体积百分浓度为95％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，在30-50℃的条件下减压回收溶剂，得到延胡索提取物粗品；

碱性氧化铝纯化：取上述延胡索提取物粗品，以适量甲醇溶解，加入碱性氧化铝拌样，挥干溶剂后干法上样至碱性氧化铝柱，进行洗脱，所述洗脱的具体步骤为：按照每克装柱用碱性氧化铝10ml的量，以乙酸乙酯：甲醇体积比为7:3的混合溶液洗脱，收集洗脱液，在30-50℃的条件下减压回收溶剂，即得延胡索对照提取物。

2.根据权利要求1所述的延胡索对照提取物的制备方法，其特征在于，所述提取步骤中，按照每克延胡索药材10ml-20ml的量加入体积百分浓度为50％-90％乙醇水溶液加热回流2次，每次0.5小时，过滤，合并滤液。

3.根据权利要求1所述的延胡索对照提取物的制备方法，其特征在于，所述浓缩步骤中，在25-35℃下减压回收乙醇；所述大孔树脂纯化步骤中，在25-35℃的条件下减压回收溶剂至干；所述碱性氧化铝纯化步骤中，将所述洗脱液在25-35℃的条件下减压回收溶剂至干。

4.一种延胡索对照提取物，其特征在于，通过权利要求1-3任一项所述的延胡索对照提取物的制备方法制备得到。

5.一种延胡索对照提取物的应用，其特征在于，将权利要求4所述的延胡索对照提取物用于延胡索及含延胡索的中药制剂的质量控制中。

6.根据权利要求5所述的延胡索对照提取物的应用，其特征在于，所述延胡索及含延胡索的中药制剂的质量控制方法为：将所述延胡索对照提取物、待测样品以薄层色谱法和/或高效液相色谱法进行检测，对比判别；

所述薄层色谱法的检测条件为：

薄层板：1％氢氧化钠溶液制备的硅胶薄层板；

展开剂：甲苯-丙酮体积比为9:2；

显色剂及检视：以碘为显色剂，置于365nm的紫外灯下检视；

所述高效液相色谱法的检测条件如下：

固定相：C₁₈色谱柱；

柱温：20-30℃；

流动相：A相为乙腈，B相为0.1％磷酸水，且B相以三乙胺调pH值至6.1，按照以下梯度洗脱程序进行：

流速：1.0ml/min；

检测器：紫外检测器；

检测波长：280nm。

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