CN113908139B - 一种延胡索总生物碱凝胶膏剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种延胡索总生物碱凝胶膏剂的制备方法。本发明制备步骤：(1)取丙三醇、聚丙烯酸钠、二氧化硅、乙醇和薄荷脑，搅拌均匀，作为A相；(2)取三氧化铝、柠檬酸和水溶性氮酮，加入水至全部溶解，作为B相；(3)取延胡索干浸膏，加入水，水浴加热搅拌至延胡索干浸膏全部溶于水，冷却，作为C相；(4)将A相与B相混匀，再加入C相搅拌均匀，涂布，静待，即得延胡索总生物碱凝胶膏剂。本发明制备方法得到的延胡索总生物碱凝胶膏剂透皮性良好，凝胶膏剂样品中，脱氢紫堇碱、D‑四氢药根碱、延胡索甲素、延胡索乙素含量稳定，相对较为稳定，可以明显的抑制角叉菜胶导致的足肿胀，表明延胡索总生物碱凝胶贴膏具有较好的抗炎作用。

Description

一种延胡索总生物碱凝胶膏剂的制备方法
技术领域
本发明涉及延胡索生物碱检测的技术领域，特别是一种延胡索总生物碱凝胶膏剂的制备方法。
背景技术
延胡索(Corydalis yanhusuo W.T.Wang)系罂粟科紫堇属植物干燥块茎，味辛、苦、温，归肝、脾经，具有活血、行气、止痛之功效，用于胸胁、脘腹疼痛，胸痹心痛，经痛，产后瘀阻，跌仆肿痛等症，现代研究表明，发挥其药效的主要来源于其中的有效部位总生物碱类。2015版《中国药典》关于延胡索的质量控制项主要包括：性状、显微鉴别、薄层色谱鉴别和规定了单指标成分延胡索乙素量的最低下限。中药多成分、多靶点、多环节、多层次等特有作用特点决定单一成分或单一指标性成分难以评价中药的质量，由此多指标性成分同步测定质量控制模式应运而生。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种延胡索总生物碱凝胶膏剂的制备方法。本发明制备方法得到的延胡索总生物碱凝胶膏剂透皮性良好，凝胶膏剂样品中，脱氢紫堇碱、D-四氢药根碱、延胡索甲素、延胡索乙素含量稳定，相对较为稳定，可以明显的抑制角叉菜胶导致的足肿胀，表明延胡索总生物碱凝胶贴膏具有较好的抗炎作用。质量检测方法具有具有精密度良好、线性关系良好、重复性好、稳定性良好、准确度好的优点。
本发明的技术方案：一种延胡索总生物碱凝胶膏剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)取丙三醇、聚丙烯酸钠、二氧化硅、乙醇和薄荷脑，搅拌均匀，作为A相；
(2)取三氧化铝、柠檬酸和水溶性氮酮，加入水至全部溶解，作为B相；
(3)取延胡索干浸膏，加入水，水浴加热搅拌至延胡索干浸膏全部溶于水，冷却，作为C相；
(4)将A相与B相混匀，再加入C相搅拌均匀，涂布，静待，经质量检测合格后，即得延胡索总生物碱凝胶膏剂。
前述的延胡索总生物碱凝胶膏剂的制备方法中，包括以下步骤：
(1)按重量份计，取丙三醇10-20份、聚丙烯酸钠1-3份、二氧化硅0.1-0.5份、乙醇1-3份和薄荷脑0.2-0.8份，搅拌均匀，作为A相；
(2)取三氧化铝0.05-0.15份、柠檬酸0.01-0.1份和水溶性氮酮0.1-1份，加入水至全部溶解，作为B相；
(3)取延胡索干浸膏1-5份，加入水，30-50℃水浴锅中隔水加热搅拌至延胡索干浸膏全部溶于水，冷却，作为C相；
(4)将A相与B相混匀，再加入C相搅拌均匀，涂布，静待14-34h，经质量检测合格后，即得延胡索总生物碱凝胶膏剂。
前述的延胡索总生物碱凝胶膏剂的制备方法中，包括以下步骤：
(1)按重量份计，取丙三醇13-17份、聚丙烯酸钠1.5-2.5份、二氧化硅0.2-0.4份、乙醇1.5-2.5份和薄荷脑0.3-0.7份，搅拌均匀，作为A相；
(2)取三氧化铝0.08-0.12份、柠檬酸0.03-0.07份和水溶性氮酮0.3-0.7份，加入水至全部溶解，作为B相；
(3)取延胡索干浸膏2-4份，加入水，35-45℃水浴锅中隔水加热搅拌至延胡索干浸膏全部溶于水，冷却，作为C相；
(4)将A相与B相混匀，再加入C相搅拌均匀，涂布，静待19-29h，经质量检测合格后，即得延胡索总生物碱凝胶膏剂。
前述的延胡索总生物碱凝胶膏剂的制备方法中，包括以下步骤：
(1)按重量份计，取丙三醇15份、聚丙烯酸钠2份、二氧化硅0.3份、乙醇2份和薄荷脑0.5份，搅拌均匀，作为A相；
(2)取三氧化铝0.1份、柠檬酸0.05份和水溶性氮酮0.5份，加入水至全部溶解，作为B相；
(3)取延胡索干浸膏3份，加入水，40℃水浴锅中隔水加热搅拌至延胡索干浸膏全部溶于水，冷却，作为C相；
(4)将A相与B相混匀，再加入C相搅拌均匀，涂布，静待24h，经质量检测合格后，即得延胡索总生物碱凝胶膏剂。
前述的延胡索总生物碱凝胶膏剂的制备方法中，其特征在于：所述延胡索干浸膏的制备方法如下：取延胡索粗粉，置于烧瓶中，加入乙醇，回流提取，将提取出来的提取液用旋转蒸发仪旋蒸，将提取液旋蒸至粘稠，真空干燥，即得。
前述的延胡索总生物碱凝胶膏剂的制备方法中，所述延胡索干浸膏的制备方法如下：称取延胡索粗粉，置于圆底烧瓶中，加入20倍延胡索粗粉重量的90％乙醇，回流提取3次，每次2小时，将提取出来的提取液合并，用旋转蒸发仪60℃旋蒸，将提取液旋蒸至粘稠，60℃真空干燥，即得。
前述的延胡索总生物碱凝胶膏剂的质量检测方法，采用高效液相色谱仪进行检测，色谱条件：色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD；流动相：A相为乙腈，B相为0.2％冰乙酸；柱温：45℃；进样量2μL；检测波长280nm；体积流量0.3mL/min；
包括如下步骤：
(1)对照品溶液的配置：称取脱氢紫堇碱、D-四氢药根碱、延胡索乙素和延胡索甲素作为对照品，将4种对照品分别置于容量瓶中加甲醇定容，得脱氢紫堇碱、D-四氢药根碱、延胡索乙素和延胡索甲素对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取延胡索总生物碱凝胶膏剂，置于锥形瓶中，加入甲醇，称定重，超声，放冷后用甲醇，过微孔滤头，得供试品溶液；
(3)将对照品溶液和供试品溶液分别用超高效液相色谱进样，得到对照品色谱图和供试品色谱图，根据对照品色谱图和供试品色谱图计算供试品中的脱氢紫堇碱、D-四氢药根碱、延胡索乙素和延胡索甲素成分含量；
前述的延胡索总生物碱凝胶膏剂的质量检测方法，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的配置：称取脱氢紫堇碱1.49mg、D-四氢药根碱1.17mg、延胡索乙素1.85mg和延胡索甲素1.27mg，将4种对照品置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度配制成质量浓度分别为脱氢紫堇碱149μg/mL、D-四氢药根碱117μg/mL、延胡索乙素185μg/mL和延胡索甲素127μg/mL的对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取延胡索总生物碱凝胶膏剂1g，置于50mL锥形瓶中，加入25mL甲醇，称定重，超声15min，放冷后用甲醇，过微孔滤头，得供试品溶液；
(3)将对照品溶液和供试品溶液分别用超高效液相色谱进样，得到对照品色谱图和供试品色谱图，根据对照品色谱图和供试品色谱图计算供试品中的脱氢紫堇碱、D-四氢药根碱、延胡索乙素和延胡索甲素成分含量；
前述的延胡索总生物碱凝胶膏剂的质量检测方法，所述0.2％冰乙酸用三乙胺调pH为6.0。
前述的延胡索总生物碱凝胶膏剂的质量检测方法，所述高效液相色谱的洗脱条件为0-9min，15％A→28％A；9～32min，28％A→43％A；32～35min，43％A→15％A。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:
1、本发明中延胡索总生物碱凝胶膏剂的制备方法中，最优选择步骤：(1)按重量份计，取丙三醇15份、聚丙烯酸钠2份、二氧化硅0.3份、乙醇2份和薄荷脑0.5份，搅拌均匀，作为A相；(2)取三氧化铝0.1份、柠檬酸0.05份和水溶性氮酮0.5份，加入水至全部溶解，作为B相；(3)取延胡索干浸膏3份，加入水，40℃水浴锅中隔水加热搅拌至延胡索干浸膏全部溶于水，冷却，作为C相；(4)将A相与B相混匀，再加入C相搅拌均匀，涂布，静待24h，即得延胡索总生物碱凝胶膏剂。选择此方法的依据是：根据黏合剂种类的考察，单独用聚丙烯酸钠做黏合剂综合评分最高。根据黏合剂用量的考察，聚丙烯酸钠用量过少时粘手，黏合力不强；太过多时有干壳现象，出现白斑，且黏合力也下降；根据保湿剂种类的考察，丙三醇单独最为保湿剂时保湿效果最好；根据保湿剂用量的考察，保湿剂用量过少时，基质表面相对较干燥，黏性较小，用量过于大时基质成水润状，虽有黏性，手触之抬起时拉丝状，膜残留性极差，且背衬层渗出比较多；填充剂种类的考察，使用二氧化硅作为填充剂时，基质通透透明，有较好的黏性，触之不粘手；根据单因素考察法筛选促渗剂的种类，薄荷脑与氮酮联合促渗，促渗效果最佳。
2、利用本发明的供试品的制备方法：取延胡索总生物碱凝胶膏剂1g，置50mL锥形瓶中，加入25mL甲醇，称定重量，超声15分钟，放冷后用甲醇补足损失的重量，过微孔滤膜，即得。能够有效将将凝胶膏剂中的成分提取出来。
3、本发明色谱条件经大量试验确定，最终确定为色谱柱：ZORBAX Eclipse PlusC18Rapid Resolution HD；流动相：A相为乙腈，B相为0.2％冰乙酸(用三乙胺调pH为6.0)；柱温：45℃；进样量2μL；检测波长280nm；体积流量0.3mL/min；高效液相色谱的检测方法为0-9min，15％A→28％A；9～32min，28％A→43％A；32～35min，43％A→15％A；本发明中色谱条件柱温选择为45℃，是因为只有柱温在45℃时各指标成分峰分离度良好；若柱温25℃时，脱氢紫堇碱分离度差，与其他峰粘连分不开，延胡索甲素也尚未分开；柱温35℃时，延胡索甲素与前峰粘连，分离度不达标；本发明中色谱条件检测波长选择为280nm，是因为此波长对脱氢紫堇碱、D-四氢药根碱、延胡索乙素和延胡索甲素这几个指标成分吸收最好；由于改变波长不影响出峰时间，只影响成分的吸收，最终导致其峰面积改变，检测波长低于或高于本发明所限定的280nm均不可取；发明人为得到最佳的色谱检测条件，还做了流动条件的考察：流动相考察时，用纯水和已睛作为流动相时，发现供试品的峰的峰推挤，拖尾严重，各个目标峰难以指认；用甲酸和已睛作为流动相时，供试品中脱氢紫堇碱拖尾较严重，且该峰有其他杂质干扰；用磷酸和已睛作为流动相时，样品中各个成分均不能很好的分离，且方法不稳定，出峰时间变化较大；用三乙胺调节pH为5时，发现样品出峰时间向前推移，导致各个峰粘连，分离度不达标；用三乙胺调节pH为7时，各个峰均严重拖尾，影响其峰型，其中以脱氢紫堇碱最为严重，因此流动相选择乙腈-0.2％乙酸(三乙胺调pH6.0)。
4、本发明质量检测方法具有精密度良好、线性关系良好、重复性好、稳定性良好、准确度好的优点；本发明采用超高效液相，较常规的高效液相来说更为精确，且在本发明色谱条件下可同时测定延胡索总生物碱凝胶膏剂中的脱氢紫堇碱、D-四氢药根碱、延胡索乙素、延胡索甲素四种有效成分，方法稳定可靠，为延胡索总生物碱凝胶膏剂的质量控制提供了较好的方法。
5、本发明提出了延胡索干浸膏的制备方法：称取延胡索粗粉，置于圆底烧瓶中，加入20倍延胡索粗粉重量的90％乙醇，回流提取3次，每次2小时，将提取出来的提取液合并，用旋转蒸发仪60℃旋蒸，将提取液旋蒸至粘稠，60℃真空干燥，即得；其中选择90％乙醇的理由是:通过不同的提取溶剂测试后，采用90％乙醇为提取溶剂最好；选择20倍量溶剂的理由是，此倍量溶剂可以得到很好的效率效果，即使用更多的溶剂也无法得到更好的提取效果，所以20倍量溶剂最佳；回流提取3次，每次2小时，是因为此条件结合，20倍量提取溶剂的提取效果最优；选择60℃进行干燥，干燥较快，干燥后成分保留多，若温度高于60℃延胡索甲素丧失较多，若温度低于60℃，干燥速度较慢。
6、本发明延胡索总生物碱凝胶膏剂的离体透皮性良好，24h内凝胶膏剂脱氢紫堇碱，D-四氢药根碱，延胡索乙素，延胡索甲素透过量良好，用本凝胶膏剂作为经皮给药制剂是可保证其能发挥稳定的药效的。
7、通过外观性状、含膏量测定、黏附性测定、赋型性检查，对延胡索总生物碱凝胶膏剂进行质量评价，结果显示外观良好，黏合力较强，各项指标均符合2015版《中国药典》规定。并且本发明建立了HPLC含量测定方法，凝胶膏剂样品中，脱氢紫堇碱、D-四氢药根碱、延胡索甲素、延胡索乙素相对较为稳定，脱氢紫堇碱平均含量为2.06mg/g，下浮15％，将脱氢紫堇碱的限度定为不少于1.75mg/g；D-四氢药根碱平均含量为0.44，下浮15％，将D-四氢药根碱的限度定为不少于0.37mg/g；延胡索乙素平均含量为0.48，下浮15％，将延胡索乙素的限度定为不少于0.41mg/g；延胡索甲素平均含量为0.29，下浮15％，将延胡索甲素的限度定为不少于0.24mg/g。
8、本发明延胡索总生物碱凝胶贴膏可以明显的抑制角叉菜胶导致的足肿胀，表明延胡索总生物碱凝胶贴膏具有较好的抗炎作用。
附图说明
图1是超高效液相色谱图；
图2是不同柱温条件下色谱图；
图3是不同检测波长条件下色谱图；
图4是各成分线性关系图；
图5是干浸膏制备流程图；
图6是空白基质制备流程图；
图7是延胡索总生物碱凝胶膏剂制备流程图；
图8是各成分不同用量效果趋势图；
图9是各成分线性图；
图10是各成分线性图；
对附图中的标记说明
图1中，A：对照品色谱图；B：样品色谱图；1：脱氢紫堇碱；2：D-四氢药根碱；3：延胡索乙素；4：延胡索甲素；
图2中，S1：柱温45℃；S2：柱温35℃；S3：柱温25℃；
图3中，S1：波长260nm；S2：波长270nm；S3：波长280nm；S4：波长290nm；S5：波长300nm；
图4中，A：脱氢紫堇碱；B：D-四氢药根碱；C：延胡索乙素；D：延胡索甲素。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
实施例1。一种延胡索总生物碱凝胶膏剂。
延胡索总生物碱凝胶膏剂制备方法如下：
(1)延胡索干浸膏的制备方法：称取延胡索粗粉，置于圆底烧瓶中，加入20倍延胡索粗粉重量的90％乙醇，回流提取3次，每次2小时，将提取出来的提取液合并，用旋转蒸发仪60℃旋蒸，将提取液旋蒸至粘稠，60℃真空干燥，即得；
(2)取丙三醇15kg、聚丙烯酸钠2kg、二氧化硅0.3kg、乙醇2kg和薄荷脑0.5kg，搅拌均匀，作为A相；
(3)取三氧化铝0.1kg、柠檬酸0.05kg和水溶性氮酮0.5kg，加入水至全部溶解，作为B相；
(4)取延胡索干浸膏3kg，加入水，40℃水浴锅中隔水加热搅拌至延胡索干浸膏全部溶于水，冷却，作为C相；
(5)将A相与B相混匀，再加入C相搅拌均匀，涂布，静待24h，经质量检测合格后，即得延胡索总生物碱凝胶膏剂。
用法用量：用热毛巾擦净皮肤，取本产品一张或数张，可剪取任意形状贴合在患处，每7小时更换一次。
实施例2。一种延胡索总生物碱凝胶膏剂。
延胡索总生物碱凝胶膏剂制备方法如下：
(1)延胡索干浸膏的制备方法：称取延胡索粗粉，置于圆底烧瓶中，加入20倍延胡索粗粉重量的90％乙醇，回流提取3次，每次2小时，将提取出来的提取液合并，用旋转蒸发仪60℃旋蒸，将提取液旋蒸至粘稠，60℃真空干燥，即得；
(2)取丙三醇10kg、聚丙烯酸钠1kg、二氧化硅0.1kg、乙醇1kg和薄荷脑0.2kg，搅拌均匀，作为A相；
(3)取三氧化铝0.05kg、柠檬酸0.01kg和水溶性氮酮0.1kg，加入水至全部溶解，作为B相；
(4)取延胡索干浸膏1kg，加入水，30℃水浴锅中隔水加热搅拌至延胡索干浸膏全部溶于水，冷却，作为C相；
(5)将A相与B相混匀，再加入C相搅拌均匀，涂布，静待14h，经质量检测合格后，即得延胡索总生物碱凝胶膏剂。
用法用量：用热毛巾擦净皮肤，取本产品一张或数张，可剪取任意形状贴合在患处，每7小时更换一次。
实施例3。一种延胡索总生物碱凝胶膏剂。
延胡索总生物碱凝胶膏剂制备方法如下：
(1)延胡索干浸膏的制备方法：称取延胡索粗粉，置于圆底烧瓶中，加入20倍延胡索粗粉重量的90％乙醇，回流提取3次，每次2小时，将提取出来的提取液合并，用旋转蒸发仪60℃旋蒸，将提取液旋蒸至粘稠，60℃真空干燥，即得；
(2)取丙三醇20kg、聚丙烯酸钠3kg、二氧化硅0.5kg、乙醇3kg和薄荷脑0.8kg，搅拌均匀，作为A相；
(3)取三氧化铝0.15kg、柠檬酸0.1kg和水溶性氮酮1kg，加入水至全部溶解，作为B相；
(4)取延胡索干浸膏5kg，加入水，50℃水浴锅中隔水加热搅拌至延胡索干浸膏全部溶于水，冷却，作为C相；
(5)将A相与B相混匀，再加入C相搅拌均匀，涂布，静待34h，
经质量检测合格后，即得延胡索总生物碱凝胶膏剂。用法用量：用热毛巾擦净皮肤，取本产品一张或数张，可剪取任意形状贴合在患处，每7小时更换一次。
实施例4。一种延胡索总生物碱凝胶膏剂。
延胡索总生物碱凝胶膏剂制备方法如下：
(1)取丙三醇13kg、聚丙烯酸钠1.5kg、二氧化硅0.2kg、乙醇1.5kg和薄荷脑0.3kg，搅拌均匀，作为A相；
(2)取三氧化铝0.08kg、柠檬酸0.03kg和水溶性氮酮0.3kg，加入水至全部溶解，作为B相；
(3)称取延胡索粗粉，置于圆底烧瓶中，加入20倍延胡索粗粉重量的90％乙醇，回流提取3次，每次2小时，将提取出来的提取液合并，用旋转蒸发仪60℃旋蒸，将提取液旋蒸至粘稠，60℃真空干燥，即得延胡索干浸膏，取延胡索干浸膏2kg，加入水，35℃水浴锅中隔水加热搅拌至延胡索干浸膏全部溶于水，冷却，作为C相；
(4)将A相与B相混匀，再加入C相搅拌均匀，涂布，静待19h，经质量检测合格后，即得延胡索总生物碱凝胶膏剂。
用法用量：用热毛巾擦净皮肤，取本产品一张或数张，可剪取任意形状贴合在患处，每8小时更换一次。
实施例5。一种延胡索总生物碱凝胶膏剂。
延胡索总生物碱凝胶膏剂制备方法如下：
(1)取丙三醇17kg、聚丙烯酸钠2.5kg、二氧化硅0.4kg、乙醇2.5kg和薄荷脑0.7kg，搅拌均匀，作为A相；
(2)取三氧化铝0.12kg、柠檬酸0.07kg和水溶性氮酮0.7kg，加入水至全部溶解，作为B相；
(3)称取延胡索粗粉，置于圆底烧瓶中，加入20倍延胡索粗粉重量的90％乙醇，回流提取3次，每次2小时，将提取出来的提取液合并，用旋转蒸发仪60℃旋蒸，将提取液旋蒸至粘稠，60℃真空干燥，即得延胡索干浸膏，取延胡索干浸膏4kg，加入水，45℃水浴锅中隔水加热搅拌至延胡索干浸膏全部溶于水，冷却，作为C相；
(4)将A相与B相混匀，再加入C相搅拌均匀，涂布，静待29h，经质量检测合格后，即得延胡索总生物碱凝胶膏剂。
用法用量：用热毛巾擦净皮肤，取本产品一张或数张，可剪取任意形状贴合在患处，每6小时更换一次。
实施例6。一种延胡索总生物碱凝胶膏剂的检测方法。
检测方法采用高效液相色谱仪进行检测，色谱条件：色谱柱：ZORBAX EclipsePlus C18 Rapid Resolution HD；流动相：A相为乙腈，B相为0.2％冰乙酸(三乙胺调pH为6.0)；柱温：45℃；进样量2μL；检测波长280nm；体积流量0.3mL/min；洗脱条件为0-9min，15％A→28％A；9～32min，28％A→43％A；32～35min，43％A→15％A。
检测方法的步骤为：
(1)对照品溶液的配置：称取脱氢紫堇碱1.49mg、D-四氢药根碱1.17mg、延胡索乙素1.85mg和延胡索甲素1.27mg，将4种对照品置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度配制成质量浓度分别为脱氢紫堇碱149μg/mL、D-四氢药根碱117μg/mL、延胡索乙素185μg/mL和延胡索甲素127μg/mL的对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取延胡索总生物碱凝胶膏剂1g，置于50mL锥形瓶中，加入25mL甲醇，称定重，超声15min，放冷后用甲醇，过微孔滤头，得供试品溶液；
(3)将对照品溶液和供试品溶液分别用超高效液相色谱进样，得到对照品色谱图和供试品色谱图，根据对照品色谱图和供试品色谱图计算供试品中的脱氢紫堇碱、D-四氢药根碱、延胡索乙素和延胡索甲素成分含量。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
实验例：为研究本延胡索总生物碱凝胶膏剂的制备方法，发明人进行了大量的实验，部分实验记录如下：
一、延胡索总生物碱提取方法研究
1.延胡索总生物碱超高效液相色谱法的建立
延胡索(Corydalis yanhusuo W.T.Wang)系罂粟科紫堇属植物干燥块茎，味辛、苦、温，归肝、脾经，具有活血、行气、止痛之功效，用于胸胁、脘腹疼痛，胸痹心痛，经痛，产后瘀阻，跌仆肿痛等症，现代研究表明，发挥其药效的主要来源于其中的有效部位总生物碱类。2015版《中国药典》关于延胡索的质量控制项主要包括：性状、显微鉴别、薄层色谱鉴别和规定了单指标成分延胡索乙素量的最低下限。中药多成分、多靶点、多环节、多层次等特有作用特点决定单一成分或单一指标性成分难以评价中药的质量，由此多指标性成分同步测定质量控制模式应运而生。本研究利用超高效液相色谱建立同时测定延胡索总生物碱中比较具有代表性的脱氢紫堇碱、D-四氢药根碱、延胡索乙素及延胡索甲素4种生物碱成分。
1.1仪器与试药
安捷伦1290超高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；ZORBAX EclipsePlus C18 Rapid Resolution HD 2.1×50mm 1.8-Micron(made in USA)；AUW1200型电子天平(十万分之一，岛津)；FA1004万分之一的分析天平(上海舜宇平科学仪器有限公司)，pHS-3B精密pH计(上海虹益仪器仪表有限公司)；脱氢紫堇碱、D-四氢药根碱、延胡索乙素、延胡索甲素，以上对照品均购于成都植标化纯生物技术有限公司，其纯度均大于98％。三乙胺、色谱纯乙腈(德国默克公司)，冰乙酸为色谱级，屈臣氏蒸馏水。
1.2方法与结果
1.2.1色谱条件
色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD，流动相为乙腈(A)-0.2％冰乙酸(三乙胺调pH 6.0)(B)，柱温：45℃，进样量2μL，检测波长280nm；体积流量0.3mL/min，具体检测方法见表1-1-1。按上述色谱条件检测，各成分分离度良好，拖尾因子合格，色谱图见图1。
表1-1-1超高效液相色谱法检测方法
1.2.2溶液的配置
1.2.2.1对照品溶液的配置
采用十万分之一天平精密称取脱氢紫堇碱1.49mg，D-四氢药根碱1.17mg，延胡索乙素1.85mg，延胡索甲素1.27mg，将4种对照品置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度配制成质量浓度分别为脱氢紫堇碱149μg/mL、D-四氢药根碱117μg/mL、延胡索乙素185μg/mL、延胡索甲素127μg/mL即得混合对照品，按“1.2.1”色谱条件下进样，即得图1中“A”对照品色谱图。
1.2.2.2供试品溶液的配置
精密称取干燥延胡索生药粗粉1g，置于100mL圆底烧瓶中，精密加入90％乙醇50mL，称重，回流提取3小时。放置室温，称重，再用90％乙醇补重。取上清液，过0.22μm微孔虑头，按“1.2.1”色谱条件下进样，即得图1中“B”对照品色谱图。
1.2.3不同色谱条件考察指标成分
1.2.3.1不同温度下的考察
按“1.2.2.2”法制备供试品溶液，再按“1.2.1”项下色谱条件，保持其余色谱条件不变，只改变柱温，分别将柱温设为：25℃、35℃、45℃，色谱图见图2。
由图2可看出，柱温25℃时，脱氢紫堇碱分离度差，与其他峰粘连分不开，延胡索甲素也尚未分开；柱温35℃时，延胡索甲素与前峰粘连，分离度不达标；只有柱温在45℃时各指标成分峰分离度良好。
1.2.3.2不同检测波长下的考察
按“1.2.2.2”法制备供试品溶液，再按“1.2.1”项下色谱条件，保持其余色谱条件不变，只改变检测波长，分别将检测波长设为：260nm、270nm、280nm、290nm、300nm，色谱图见图3。
由图3可以看出，改变波长不影响其出峰时间，只影响成分的吸收，最终导致其峰面积改变，由图可看出对几个指标成分吸收最好的波长为280nm，故选择检测波长280nm。
1.2.4方法学考察
1.2.4.1仪器精密度试验
精密称取4种指标成分对照品适量，置于10mL容量瓶中，加入一定甲醇，超声使其全部溶解，待冷却至室温，再加入甲醇定容至刻度线。吸取混合对照品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件下进行测定，平行进样6次，测得峰面积及计算RSD值，具体峰面积及RSD结果见下表1-1-2，脱氢紫堇碱RSD值0.66％，D-四氢药根碱RSD值0.60％，延胡索乙素RSD值0.61％，延胡索甲素RSD值0.69％，由实验结果显示，表明仪器精密度良好。
表1-1-2精密度试验结果
1.2.4.2线性关系考察试验
精密称取4种指标成分对照品适量，置于25mL容量瓶中，加入一定甲醇，超声使其中对照品完全溶解，待冷却至室温，再加甲醇定容至刻度线，其为母液，其中各对照品浓度分别为：脱氢紫堇碱66.8μg/mL，D-四氢药根碱119.2μg/mL，延胡索乙素120.0μg/mL，延胡索甲素98.4μg/mL。用移液管精密吸取混合对照品溶液0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，分别将吸取溶液置于10mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度线。之后吸取稀释后的混合对照品，在“1.2.1”项下色谱条件下进行测定，进样量均为2μL。以样品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制对照品溶液曲线见图4，计算回归方程，具体结果见表1-1-3和表1-1-4，由表中结果可知，在其范围内线性关系良好。
表1-1-3线性范围试验结果
表1-1-4各成分线性范围试验结果
成分 回归方程 r 线性范围(μg)
脱氢紫堇碱 y＝32.604x-2.6649 0.9997 3.34～33.4
D-四氢药根碱 y＝5.5877x-1.9136 0.9999 5.69～59.6
延胡索乙素 y＝5.5923x-2.7622 0.9998 32～332
延胡索甲素 y＝5.5923x-2.7622 0.9999 27～282.4
1.2.4.3重复性试验
按“1.2.2.2”法制备供试品溶液，平行制备6份，再按“1.2.1”项下色谱条件测定，结果见表1-1-5，以所有成分含量计算，脱氢紫堇碱RSD1.51％，D-四氢药根碱RSD2.25％，延胡索乙素RSD1.35％，延胡索甲素RSD1.15％，由此有表明该方法重复性较好。
表1-1-5重复性试验结果
1.2.4.4稳定性试验
按“2.2.2”法制备供试品溶液，分别在不同的时间段0、2、4、6、8、10、12、16、24小时按“1.2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱数据，结果见表1-1-6，试验结果表1-1-明样品在24小时内稳定性良好。
表1-1-6稳定性试验结果
1.2.4.5加样回收试验
精密称取6份脱氢紫堇碱含量已知(1.356mg/g)的延胡索生药0.5g，置于100mL圆底烧瓶中，加入脱氢紫堇碱对照品0.6780mg，按“1.2.2.2”法制备供试品溶液，再按“1.2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表1-1-7；精密称取6份D-四氢药根碱含量已知(0.451mg/g)的延胡索生药0.5g，置于100mL圆底烧瓶中，加入D-四氢药根碱对照品0.2255mg，按“1.2.2.2”法制备供试品溶液，再按“1.2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表1-1-8；精密称取6份延胡索乙素含量已知(0.627mg/g)的延胡索生药0.5g，置于100mL圆底烧瓶中，加入延胡索乙素对照品0.3135mg，按“1.2.2.2”法制备供试品溶液，再按“1.2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表1-1-9；精密称取6份延胡索甲素含量已知(1.173mg/g)的延胡索生药0.5g，置于100mL圆底烧瓶中，加入延胡索甲素对照品0.5865mg，按“1.2.2.2”法制备供试品溶液，再按“1.2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表1-1-10；由此试验结果可说明该方法准确度较好。
表1-1-7脱氢紫堇碱加样回收试验结果
表1-1-8D-四氢药根碱加样回收试验结果
表1-1-9延胡索乙素加样回收试验结果
表1-1-10延胡索甲素加样回收试验结果
1.3讨论与小结
流动条件的考察：流动相考察时，用纯水和已睛作为流动相时，发现供试品的峰的峰推挤，拖尾严重，各个目标峰难以指认；用甲酸和已睛作为流动相时，供试品中脱氢紫堇碱拖尾较严重，且该峰有其他杂质干扰；用磷酸和已睛作为流动相时，样品中各个成分均不能很好的分离，且方法不稳定，出峰时间变化较大；用三乙胺调节pH为5时，发现样品出峰时间向前推移，导致各个峰粘连，分离度不达标；用三乙胺调节pH为7时，各个峰均严重拖尾，影响其峰型，其中以脱氢紫堇碱最为严重。前文也提到过不同柱温和不同波长的考察，综合前文，因此流动相选择乙腈-0.2％乙酸(三乙胺调pH6.0)，柱温45℃，检测波长280nm为最优色谱检测条件。
本实验采用超高效液相，较高效液相来说更为精确，且在该色谱条件下可同时测定延胡索中的脱氢紫堇碱、D-四氢药根碱、延胡索乙素、延胡索甲素四种有效成分，方法稳定可靠，为延胡索生药材的质量控制提供了较好的实验依据。
2.延胡索总生物碱提取工艺研究
延胡索具有较好的抗炎止痛作用，初期研究认为，延胡索的止痛主要是来源于其中有效成分延胡索乙素。但随着研究的深入，现代研究发现，延胡索止痛抗炎作用来源并非单一的有效成分，而是来自于有效部位：生物碱。生物碱包括延胡索乙素、延胡索甲素、脱氢紫堇碱、脱氢海罂粟碱、D-四氢药根碱等。本次提取工艺研究，我们以延胡索乙素、延胡索甲素、脱氢紫堇碱、D-四氢药根碱四个指标成分和出膏率为指标，涉及的变量包括提取次数、提取时间、提取体积。同时用单因素考察法考察不同提取溶剂对提取效率的影响。
2.1仪器与试药
安捷伦1290超高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；ZORBAX EclipsePlus C18 Rapid Resolution HD 2.1×50mm 1.8-Micron(made in USA)，101-3AB电热古风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)，真空干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)，AUW1200型电子天平(十万分之一，岛津)，FA1004万分之一的分析天平(上海舜宇平科学仪器有限公司)，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；95％食用酒精(东兴化工有限公司)，延胡索生药(河北金叶子药业有限公司)，pHS-3B精密pH计(上海虹益仪器仪表有限公司)，三乙胺、色谱纯乙腈(德国默克公司)，屈臣氏蒸馏水。
2.2方法与结果
2.2.1单因素考察法筛选提取工艺
2.2.1.1不同提取溶剂对提取效率的影响
精密称取延胡索粗粉1g，置于100mL圆底烧瓶中，分别加入50mL不同的提取溶剂(水、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇)，称重，回流提取3小时，放冷至室温，称重，用该提取溶剂补重，每份样品平行3份，取上清液，过0.22μm微孔柱头，按“1.2.1”项下色谱条件进行测定。以四种指标成分为检测指标，结果见表1-2-1，由实验结果表明，采用90％乙醇为提取溶剂最好。
表1-2-1不同提取溶剂对提取效率的影响(n＝3)
2.2.1.2不同提取体积对提取效率的影响
精密称取延胡索粗粉1g，置于100mL圆底烧瓶中，分别加入不同体积(10倍量溶剂、20倍量溶剂、30倍量溶剂)的90％乙醇，称重，回流提取3小时，放冷至室温，称重，用提取溶剂补重，每份样品平行三份，取上清液，过0.22μm微孔柱头，按“1.2.1”项下色谱条件进行测定。以四种指标成分为检测指标，结果见表1-2-2，由实验结果表明，20倍量溶剂与30倍量溶剂提取效率相同，从节约能源角度考虑，我们选择20倍量作为提取倍数。
表1-2-2不同提取倍数对提取效率的影响(n＝3)
结合上述实验，在接下来的考察中我们提取溶剂选择90％的乙醇，提取倍数选择药材的20倍量为提取倍数。
2.2.2正交实验
在单因素试验基础上，正交试验优选提取工艺，设计影响因素提取次数(A)、加入溶剂倍数(B)、提取时间(C)三个因素，以脱氢紫堇碱含量、D-四氢药根碱含量、延胡索乙素含量、延胡索甲素含量以及出膏率为优选指标，选取正交试验表L9(34)对提取工艺的参数进行考察。
精密称取药材，用90％乙醇作为提取溶剂，采用回流提取的方法，按照试验设计方案进行提取，提取液过0.22μm微孔柱头，按“1.2.1”项下色谱条件进行测定。出膏率是将提取液精密量取10mL于恒重好的蒸发皿中，105℃烘至恒重，称重。设计综合评分Y＝100×(四种指标成分含量/该试验中出现的最高四种指标成分含量)×0.8+100×(出膏率/该试验中出现的最大出膏率)×0.2。每个样品平行三份。试验结果采用SPSS2.1分析。正交试验因素水平表见表2-3，设计与结果见表1-2-4，具体各指标成分含量见表1-2-5，SPSS分析结果见表1-2-6。
表1-2-3因素水平表
表1-2-4试验设计与结果
表1-2-5四指标成分含量
表1-2-6SPSS分析结果
由表2-6可知，提取次数(P＜0.05)，提取时间(P＜0.05)提取倍数(P＜0.05)均有显著性差异，由此可说明提取次数，提取时间，提取倍数对综合评分有较大的影响。通过表2-4中直观分析可知因素A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C3＞C1＞C2，D为空白项，不做考虑因素，得出理论最优提取工艺为A3B2C3，也就是提取次数3次，20倍量提取溶剂，每次提取时间为2小时。
2.2.3验证性试验
由正交试验结果分析可知，理论最优提取工艺为采用回流提取法，90％乙醇作为溶剂，加入20倍量溶剂，提取三次，每次2小时，用此方法平行三份样品，按“1.2.1”项下色谱条件进行测定，结果见表1-2-7。由验证结果可知，该提取方法确为最优提取工艺。
1-2-7正交设计验证性试验结果
2.2.4延胡索干浸膏的制备
将延胡索提取液直接作为凝胶膏剂原料药存在几个问题：延胡索提取液为90％乙醇，直接用作凝胶膏剂制备时会导致凝胶膏剂难以成型，成型性差；提取液难以保证每个批次成分含量都相同，会有一定差异，此会直接导致凝胶膏剂含药量难以控制，质量难以把控；后期药效学实验涉及大批量用药，而作为原料药的提取液则难以存储。为了利于凝胶膏剂制备成型，更易把控药物质量，同时方便存取，本实验将提取液制备成干浸膏。
2.2.4.1干燥温度考察试验
干燥温度的不同对提取液中的成分的影响也是不同的，有些热敏性成分，长时间的高温干燥可能导致该成分的分解，最后丧失该成分，所以在干燥时是有必要对温度进行把控的。本次干燥温度设置不同梯度40℃，60℃，80℃。按“1.3.2”法制备供试品溶液，吸取少量溶液，过0.22μm微孔柱头，再按“1.2.1”项下色谱条件进行测定。用移液管精密移取10mL溶液三份，置于三个蒸发皿中，分别放入40℃、60℃、80℃真空干燥箱中，真空度为-0.08MPa，待其完全干燥，加入10mL90％乙醇溶解干燥品，让其完全溶解，溶解液按“1.2.1”项下色谱条件进行测定，每份样品平行三份，记录色谱数据，并与之前进行比较，具体结果见表1-2-8。从表中数据来看，温度对延胡索甲素有一定影响，特别是80℃，延胡索甲素丧失较多，而40℃和60℃相对较小，且60℃干燥相对较快，故干燥温度选择60℃。
表1-2-8不同温度干燥下结果(n＝3)
2.2.4.2干浸膏的制备
称取200g延胡索粗粉，置于5000mL圆底烧瓶中，加入4000mL90％乙醇，回流提取3次，每次2小时。此次共提取药材8kg，将提取出来的提取液合并，用旋转蒸发仪60℃旋蒸，将提取液旋蒸至轻微粘稠，60℃真空干燥，备用。具体试验流程见图5。
2.2.4.3干浸膏含量检测
精密称取干浸膏0.5g，置于50mL容量瓶中，加入一定量甲醇，超声辅助溶解，放冷至室温，定容至刻度线，取上清液过0.22μm微孔柱头，按“1.2.1”项下色谱条件进行测定，每份样品平行三份，记录色谱数据，结果见表1-2-9。
表1-2-9干浸膏含量测定结果
2.3讨论与小结
提取条件的考察：①提取方法的考察：提取时选用了回流提取法与超声提取法，结果表明，相同时间内超声提取法提取延胡索总生物碱比回流提取效率低，故选择回流提取法。②提取溶剂pH考察：生物碱属于弱碱性化合物，提取溶剂的pH值对成分的提取有一定的影响。在一定时间和一定溶剂倍数内，pH值对提取成分是有一定影响，且试验发现pH为10时提取成分含量较多，但长时间、多倍数提取溶剂、多次提取时，那么pH值的影响就是有限的，本实验提取时采用20倍量溶剂，提取3次，每次2小时，这种提取方式pH值对其提取影响很小。且考虑到实验涉及大批量提取，反复调节溶液pH，既浪费溶剂，又增添麻烦，故不用调节pH。
一种中药中可能含有多种成分，有效成分可能也尚不明确，且可能并非单一的有效成分发挥药效，而是多种成分联合发挥药效。故该实验以延胡索总生物碱中4种成分及出膏率为指标联合考察，尽可能多的保留中药中的有效成分。
二、延胡索总生物碱凝胶膏剂制备工艺研究
3.延胡索总生物碱凝胶膏剂成型工艺研究
凝胶膏剂即巴布剂，2010版《中国药典》将巴布剂改为凝胶膏剂。凝胶膏剂是从古代泥罨剂发展起来的，其以水溶性高分子材料聚合物为骨架基质材料的外用贴剂。凝胶膏剂由防黏层、主药、骨架基质及背衬层组成。在制剂中，骨架基质对剂型有着很大的影响，其决定着制剂的粘黏性、释药性以及保持药物的稳定性等重要因素。凝胶膏剂的骨架基质一般由粘合剂，保湿剂，填充剂，促渗剂及交联剂组成。本试验就用单因素法先筛选出各个基质材料的种类，在用单因素法筛选其用量，正交试验优选出最优的成型工艺。
3.1仪器与试药
DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)，医用无纺布，FA1004型电子天平(上海舜玉平科学仪器有限公司)，超声波清洗机(天津市泰斯特仪器有限公司)，初粘力测试仪；聚丙烯酸钠，二氧化硅，薄荷脑，水溶性氮酮，1,2-丙二醇(西陇化工有限公司)，异丙醇(上海申博化工有限公司)，丙三醇(重庆川江化工试剂厂)等基质筛选试剂均为分析级别；延胡索干浸膏。
3.2方法与结果
3.2.1凝胶膏剂空白基质初步确立
参考有关文献及结合预实验结果，确定空白基质处方及制法为：称取一定量卡波姆加入一定量水搅拌溶胀一晚，作为A相；称取一定量丙三醇，丙二醇，聚丙烯酸钠，高岭土，乙醇，搅拌均匀，作为B相；称取一定量三氧化铝，柠檬酸，水溶性氮酮，加入适量的水搅拌至全部溶解，作为C相。先将A相与B相混合搅拌均匀，再混合C相。混匀之后均匀涂布，常温下待12小时即成型。其中卡波姆、聚丙烯酸钠为粘合剂；丙三醇为保湿剂；高岭土为填充剂；丙二醇及水溶性氮酮为促渗剂；三氧化铝，柠檬酸为交联剂。具体试验流程见图6，各成分具体用量见表2-1-1。
表2-1-1空白基质处方用量
成分 作用 处方用量(g)
聚丙烯酸钠 黏合剂 0.8
卡波姆 黏合剂 0.2
丙三醇 保湿剂 10
丙二醇 促渗剂 0.5
高岭土 填充剂 0.3
乙醇 交联调节剂 2
三氯化铝 交联调节剂 0.1
柠檬酸 交联调节剂 0.05
水溶性氮酮 促渗剂 0.5
3.2.2凝胶膏剂评价方法的建立
3.2.2.1凝胶膏剂外观评价性状的建立
基质的均匀性评分标准：基质均一，细腻，无颗粒感(10分)；基质均一、细腻，有少量颗粒物(8～9分)；基质不均匀，存在较多颗粒物，颗粒感较强(4～7分)；基质不均匀，出现色泽不匀，及出现块状颗粒物(1～3分)；基质不均匀，色泽不匀，出现条状颗粒物(0)。
基质表面光泽评分标准：反复粘撕防黏层，无粘黏，基质表面平整光滑(10分)；反复粘撕防黏层，轻微粘黏，基质表面有轻微不平整(8～9分)；反复粘撕防黏层，基质粘黏防黏层，表面出现凹洞(4～7分)；反复粘撕防黏层，基质大量粘黏防黏层，表面出现较多、较大凹洞(1～3分)；反复粘撕防黏层，基质大量粘黏防黏层，表面出现大量凹洞，基质不平整(0)。
基质延展性评分标准：基质极易搅拌，极易涂布(10分)；基质易搅拌，易涂布(8～9分)；基质搅拌与涂布都较困难(4～7分)；基质难以搅拌，涂布困难不匀(1～3分)；基质极难搅拌，不能涂布(0)。
背衬层渗出度评分标准：涂布完成，待基质成型背衬层无渗出(10分)；背衬层渗出占总涂布面积的1/6内(8～9分)；背衬层渗出占总涂布面积的1/6～3/6范围内(4～7分)；背衬层渗出占总涂布面积的3/6～5/6范围内(1～3分)；背衬层渗出占总涂布面积的5/6以上(0)。
膜残留性渗出度评分标准：取制备完成的凝胶膏剂，除去防黏层后，另覆上一块称好重量尺寸为5cm×5cm的防黏层，用500g重物压其20min，之后取下该防黏层称重，计算防黏层前后重量差异。膜前后重量差异在10mg内(10分)；10.0～30mg(8～9分)；30～50mg(4～7分)；50mg～100mg(1～3分)；100mg以上(0)。
皮肤追随性评分标准：将凝胶膏剂贴于受试者的手背上，用力甩20下。不掉落(10分)；第14～19次脱落(8～9分)；第10～13次脱落者(4～7分)；第3～9次脱落(1～3分)；第1～2次脱落(0分)。
3.2.2.2凝胶膏剂初粘力评价方法
取凝胶膏剂样品，揭取防黏层，将其修剪为宽度5cm，膏体向上将其固定于初粘力装置上，调整装置斜坡为30°，膏体最上部与初粘力测试小球距离为5cm，测试小球均符合《中国药典》规定，每块凝胶膏剂平行测试3次，如果3次均黏住同一型号的小球，那么测试结果为黏住钢球号；如果2次黏住较大号钢球，1次黏住小号钢球，那么取较大号钢球；如果2次黏住较小号，1次黏住大号钢球，那么取小号钢球；如果三次黏住钢球结果均不相同，那么取小号钢球。评分标准为(测得值/该组中黏住的最大小球×20分)。
3.2.2.3凝胶膏剂持粘力评价方法
取凝胶膏剂样品，将其剪成10cm×10cm大小，保证测试板清洁，凝胶膏剂下端悬挂500g重物，将膏体面紧紧的按压于测试板上垂直放置，记录膏体在5min内下滑的距离。每块凝胶膏剂平行测试3次，取其平均值，评分标准为(该组中下滑最小值/测得值×20分)。
3.2.2.4凝胶膏剂综合评分
本研究综合多指标，以多指标进行评价，只为能全面反映各个因素对凝胶膏剂的影响。本研究综合评分将各个考察指标统一来进行考察。实验中外观评价指标包括基质均匀性、基质表明光泽、基质延展性、背衬层渗出度、膜残留性、皮肤追随性，其能够直观的反应制剂的优劣好坏，重要性不言而喻。而初粘力与持黏力则是能反应制剂的性能，为客观指标。据此赋予权重系数，综合评分(Y)＝外观指标(60分)+初黏力(20分)+持黏力(20)
3.2.3单因素法考察空白基质处方
3.2.3.1黏合剂种类的考察
黏合剂可以说至关重要，其决定着基质的性能，原本处方黏合剂为卡波姆与聚丙烯酸钠。根据文献显示，常用凝胶膏剂黏合剂还有明胶、羧甲基纤维素钠等，本研究选用不同黏合剂(卡波姆、聚丙烯酸钠、明胶、羧甲基纤维素钠)，将其单独作为黏合剂以及两两配对作为黏合剂，但都控制总用量为1g。更改不同黏合剂，其余处方不变，按“3.2.1”处方制备凝胶膏剂，每个样品平行3份。具体试验结果见表2-1-2。实验结果表明，卡波姆与聚丙烯酸钠联合运用作为黏合剂时，其膜残留性最好，但基质表面不均匀，有较多颗粒感，溶胀过后的卡波姆不易搅拌；聚丙烯酸钠与明胶联合运用作为黏合剂时，基质均一性较好，但基质成粉性，导致表面光泽差，膜残留性也差；羧甲基纤维素钠粘性较好，但成膏速度极快，还未搅拌均匀便成膏了，搅拌与涂布困难，延展性差；卡波姆与明胶联合运用作为黏合剂时，易搅拌与涂布，但其成膏性极差，背衬层渗出也较多。由结果可看出，单独用聚丙烯酸钠做黏合剂综合评分最高。
表2-1-2单因素法考察黏合剂种类(n＝3)
3.2.3.2黏合剂用量的考察
通过以上实验结果，我们选用聚丙烯酸钠作为黏合剂。现分别考察其作为黏合剂时不同用量(0.5g、1g、1.5g、2g)，每个样品平行3份。结果见表2-1-3，聚丙烯酸钠用量过少时粘手，黏合力不强；太过多时有干壳现象，出现白斑，且黏合力也下降，故最后聚丙烯酸钠用量为1.5g。
3.2.3.3保湿剂种类的考察
分别考察不同保湿剂，保湿剂选用单独作为保湿剂的丙二醇，丙三醇，以及联合运用丙二醇，丙三醇(其比例为1：1)作为保湿剂来进行考察。考察指标用累计失水率来进行考察，方法为将不同保湿剂的凝胶膏剂放入鼓风干燥机中(温度为40℃)，分别在4小时，8小时，12小时，24小时称重，通过计算得出最优保湿剂的种类，其中每个样品平行3份，具体实验结果见表2-1-4。通过实验结果表明丙三醇单独作为保湿剂时保湿效果最好。累计失水率＝[(m1-m2)/m1]×100％，其中m1为凝胶最初质量，m2为凝胶失水后的质量。
表2-1-4不同保湿剂累计失水率结果(n＝3)
3.2.3.4保湿剂用量的考察
通过上述保湿剂种类的筛选实验发现，保湿剂对凝胶膏剂的成型性影响也较大，故此考察保湿剂的用量，保湿剂选用丙三醇用量分别为5g、10g、15g、20g，每个样品平行3份。具体实验结果见表2-1-5。结果表明保湿剂用量过少时，基质表面相对较干燥，黏性较小，用量过于大时基质成水润状，虽有黏性，手触之抬起时拉丝状，膜残留性极差，且背衬层渗出比较多，最佳实验用量为15g。
表2-1-5单因素法考察保湿剂用量(n＝3)
3.2.3.5填充剂种类的考察
分别考察不同填充剂，选用填充剂甘羟铝，二氧化硅，氧化锌，高岭土和不使用填充剂，其用量均为0.3g，每个样品平行3份。具体结果见表2-1-6。实验结果表明少量填充剂几乎不用影响基质的黏合性质，改变的是基质的外观形状。不使用填充剂时，基质通透透明，但粘触之手，呈拉丝状；使用甘羟铝作为填充剂时，基质偏硬，黏性较差；使用氧化锌作为填充剂时，基质中有白色粉末状物，不溶于基质；使用高岭土作为填充剂时，基质呈粉色，不通透透明；而使用二氧化硅作为填充剂时，基质通透透明，有较好的黏性，触之不粘手。故选择二氧化硅作为填充剂。
表2-1-6单因素法考察填充剂种类(n＝3)
3.2.4单因素考察法筛选促渗剂的种类
分别考察不同促渗剂对延胡索总生物碱凝胶膏剂的促渗作用，用上述筛选好的条件，加入一定量的延胡索干浸膏，制备成含延胡索药物的延胡索总生物碱凝胶膏剂，改变其中不同促渗剂的种类，选用不同的促渗剂：不用促渗剂，丙二醇：氮酮(0.5g：0.5g)，氮酮(1g)，冰片(1g)，薄荷脑(1g)，冰片：氮酮(0.5g:0.5g)，薄荷脑：氮酮(0.5g:0.5g)，冰片：薄荷脑(0.5g:0.5g)，以累计透过率为考察指标，具体方法及结果见“第二章第二节”。由结果可知，薄荷脑与氮酮联合促渗，促渗效果最佳。
3.2.5延胡索总生物碱凝胶膏剂制备方法的建立
最终确立延胡索总生物碱凝胶膏剂制法为：称取一定量丙三醇，聚丙烯酸钠，二氧化硅，乙醇，薄荷脑，搅拌均匀，作为A相；称取一定量三氧化铝，柠檬酸，水溶性氮酮，加入适量的水搅拌至全部溶解，作为B相；取一定量延胡索干浸膏，加入适量水，水浴锅(40℃)隔水加热搅拌至干浸膏全部溶于水，无块状物，冷却，作为C相；现将搅拌完成的A相与B相混匀，在加入药物C相搅拌均匀，涂布，静待24小时，即得延胡索总生物碱凝胶膏剂。具体制备流程见图7。
3.2.6正交试验优选延胡索总生物碱凝胶膏剂基质处方：
根据单因素实验经验，认为对剂型的成型性影响最大的因素有丙三醇用量，聚丙烯酸钠用量，水的用量，及醇用量，再根据“3.2.5”制备工艺制备延胡索总生物碱凝胶膏剂，对此处方进行优化，其中平均每份样品平行3份。综合评分(Y)＝基质均匀性(10分)+基质表明光泽(10)+基质延展性(10)+背衬层渗出度(10分)+膜残留性(10分)+皮肤追随性(10分)+初黏力(20分)+持黏力(20分)。正交因素水平表见表2-1-8，试验设计及结果见表2-1-9，图8为SPSS软件分析各成分用量不同而产生的趋势图。
表2-1-8正交因素水平
表2-1-9实验设计及结果(1)
表2-1-9实验设计及结果(2)
通过SPSS软件分析，丙三醇用量，乙醇用量以及水用量均对综合评分有显著性差异(P＜0.05)。根据SPSS分析结果如图8，从图直观看出丙三醇用量15g时为最佳用量，聚丙烯酸钠用量为1.5g时为最佳用量，随着乙醇用量的增加，基质的性能越差，随着水用量的增加，基质的性能也越差。可直观看出丙三醇用量A2＞A3＞A1，聚丙烯酸钠用量为B1＞B3＞B2，乙醇用量为C1＞C2＞C3，水用量为D1＞D2＞D3。故理论最优成型工艺为A2B1C1D1。
3.2.7验证性试验
按照正交试验优选出的结果，丙三醇15g、聚丙烯酸钠1g、醇1g、水用量为10％，其他条件不变再按“3.2.5”制备延胡索总生物碱凝胶膏剂，每个样品平行3份，结果见表2-1-10。结果表明，理论最优成型处方综合评分不如正交试验中最优成型处方综合评分。
表2-1-10验证性试验结果
3.2.8延胡索总生物碱凝胶膏剂制备工艺
称取丙三醇15g，聚丙烯酸钠2g，二氧化硅0.3g，乙醇2g，薄荷脑0.5g，搅拌均匀，作为A相；称取三氧化铝0.1g，柠檬酸0.05g，水溶性氮酮0.5g，加入适量的水搅拌至全部溶解，作为B相；取延胡索干浸膏3g，加入适量水，水浴锅(40℃)隔水加热搅拌至干浸膏全部溶于水，冷却，作为C相；现将搅拌完成的A相与B相混匀，在加入药物C相搅拌均匀，涂布，静待24小时，即得延胡索总生物碱凝胶膏剂。结果表明该制备工艺制备的延胡索总生物碱凝胶膏剂均匀细腻，易于涂布，有良好的黏合性。
3.3讨论与小结
单因素考察法：①在对填充剂种类进行筛选后，最终确定填充剂为二氧化硅。之后对二氧化硅的用量进行了考察，选择了0.3g、0.6g、0.9g、1.2g，试验结果发现0.3～0.9g范围内对剂型影响都不大，一旦达到1.2g，那么剂型就会变得干燥，黏合力及持黏力下降都比较明显。按理论来说0.3～0.9g范围都是填充剂的适合用量范围，但从节约角度出发该实验最终选择了0.3g。②干浸膏用量筛选时，选择了1g、1.5g、2g、2.5g、3g、3.5g、4g、4.5g、5g，为保证药效，浸膏的用量应该是越多越好，但发现了两个难以克服的点：(1)浸膏要先在水里面完全溶解才能加入到剂型中，水的比例是一定的，一旦强行增加水的比例，那么剂型也是会改变，所以浸膏用量太多导致在水中不溶；(2)当减少浸膏用量，达到在水中勉强能溶解时，溶解液呈粘稠状，加入剂型中时，黏性虽然增加，但剂型变得黏手，呈拉丝状。综上两个问题，我们难以达到浸膏用量大，剂型成型性好，故在保证剂型成型的前提条件下尽量多加入浸膏，最终浸膏用量选择3g。③乙醇作为交联调剂，在单因素考察时乙醇的用量选择了不用乙醇、2g、4g、6g，实验结果表明，不用乙醇时膏剂成型较快，延展性相对较差，4g时乙醇延展性好，易搅拌与涂布，但成型时间过于长，而且有轻微的渗透无纺布现象。达到6g时，其成型时间更长，铺在无纺布上呈水状，要过比较长时间才能成型，且渗透无纺布现象较为严重，所以选择乙醇的用量为2g较为合适，而正交试验也验证了这一点。
凝胶膏剂在评价其优劣上，现目前很多基础研究都是采用的主观评价，主观性较强，不同的人对同一块膏剂的打分和认定均不同，主观性较强。而该实验采取的指标较多，有外观评价指标，还有剂型的性能评价指标，且各指标之间分数细则较为明确，不会有太大的主观偏差，是一个比较可靠的评价方法。
4.延胡索总生物碱凝胶膏剂体外透皮试验
凝胶膏剂作为外用制剂，考察其是否具有体外透过性是完全有必要的，如载药量相同的药物，体外试验的透过率就是药效的“金指标”，透过药物越多，代表着药效可能越好。前期研究结果显示:延胡索总生物碱的溶解性差，而角质层是水溶性药物透皮吸收的主要屏障，所以针对延胡索总生物碱凝胶膏剂对促渗剂的筛选在此显得尤为重要。本研究考察不同促渗剂对延胡索总生物碱凝胶膏剂的促渗作用，还确定了，该制剂的透过量，为延胡索总生物碱凝胶膏剂提供了可靠的药效学依据。
4.1仪器与试药
捷伦1290超高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；ZORBAX Eclipse PlusC18 Rapid Resolution HD 2.1×50mm 1.8-Micron(made in USA)；Franz扩散池；超声波清洗机(天津市泰斯特仪器有限公司)；AUW1200型电子天平(十万分之一，岛津)；FA1004万分之一的分析天平(上海舜宇平科学仪器有限公司)；九水合硫化钠(西陇化工股份有限公司)；脱氢紫堇碱、D-四氢药根碱、延胡索乙素、延胡索甲素，以上对照品均购置于成都植标化纯生物技术有限公司，其纯度均大于98％。三乙胺、色谱纯乙腈(德国默克公司)，冰乙酸为色谱级，屈臣氏蒸馏水。
4.2试验动物
雄性SD大鼠(200±50g)30只，购于长沙市天勤生物技术有限公司。动物合格证号：SCXK(军)2019-0121
4.3方法与结果
4.3.1透皮试验含量方法的测定
色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD，流动相为乙腈(A)-0.2％冰乙酸(三乙胺调pH 6.0)(B)，柱温：45℃，进样量2μL，检测波长280nm；体积流量0.3mL/min，梯度洗脱(0～9min,15％→28A；9～32min,28％→43％A；32～35min,43％→15％A)；
4.3.2线性关系考察试验
精密称取脱氢紫堇碱对照品，D-四氢药根碱对照品，延胡索乙素对照品，延胡索甲素对照品适量，置于50mL容量瓶中，加入一定甲醇，超声使其中对照品完全溶解，待冷却至室温，再加甲醇定容至刻度线，其为母液，其中各对照品浓度分别为：脱氢紫堇碱280.32μg/mL，D-四氢药根碱128.75μg/mL，延胡索乙素63.91μg/mL，延胡索甲素62.58μg/mL。用移液管精密吸取混合对照品母液0.2mL，2mL，4mL，5mL，6mL，8mL，将其分别移入10mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度线，轻震摇匀。之后吸取稀释后的混合对照品，在“1.1.2.1”项下色谱条件下进行测定，进样量均为2μL。以样品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制对照品溶液曲线见图9，计算回归方程，具体结果见表2-2-1、表2-2-2，由表中结果可知，在其范围内线性关系良好。
表2-2-1线性范围实验结果
表2-2-2各成分线性范围试验结果
4.3.3接收液的考察
按“3.2.5”法制备延胡索总生物碱凝胶膏剂，精密称取延胡索总生物碱凝胶膏剂2g六份，置于50mL的锥形瓶中，分别取不同接收液(生理盐水，30％乙醇-生理盐水，50％乙醇-生理盐水，PBS，30％-乙醇PBS，50％-乙醇PBS)20mL作为延胡索凝胶的溶剂，锥形瓶口用保鲜膜密封，称重，超声10分钟，放冷至室温，称重，不足则用相同的溶剂补重，吸取上清液，过0.22μm微孔柱头，按“4.3.1”项下色谱条件进行测定，结果见表2-2-3。由实验结果表明，延胡索总生物碱凝胶膏剂对于单纯的生理盐水或PBS作溶剂时都难溶于溶解，故单纯的生理盐水或PBS都不适合做接收液，由试验结果，接收液选择用30％乙醇-生理盐水。
表2-2-3接收液考察结果(n＝3)
4.3.4离体皮肤的剥取
SD大鼠脊椎脱臼法处死，用宠物剃毛机剔除大鼠腹部绒毛，再用棉签蘸取事先配好的8％九水合硫化钠溶液，涂与大鼠腹部，用手搓揉，以脱去大鼠腹部余下未脱净的柔毛。将腹部皮肤取下，用生理盐水清洗干净，将皮肤角质层朝下，脂肪层朝外铺于干净的玻璃板上，用镊子慢慢夹去皮肤下的脂肪层，期间不要锉破皮肤，保证皮肤的完整性。取好的皮肤用生理盐水洗净，铺平放于-20℃下保存，用时拿出，常温下解冻，储存时间不超过1个月。
4.3.5离体透皮试验
将处理好的离体皮肤置于接受池上部，用橡皮筋将皮肤固定在接受池口处，接受池加入考察好的接收液(30％乙醇-生理盐水)，排进接受里的气泡，以确保皮肤与接收液之间无空隙。将接受池放入Franz扩散池中，调制接受池参数：搅拌速度300r/min，水温37℃。分别在2,4,6,8,10,12,24小时取样，取样量为1mL，过微孔柱头，按“2.2.3.1”方法进样，同时补充相同体积的接收液。计算单位面积内累计透过量Q。
按以下公式计算各时间点的单位面积累积透过量(Q/μg·cm-2)
Qn＝(Cn×V总+∑Ci×V取)/A式中，Cn为第n个取样点测得的药物质量浓度(μg·mL-1)；V总为实际加入接受池里接受液的体积(mL)；Ci为第i(i≤n-1)个取样点测得的药物质量浓度(μg·mL-1)；A为有效透皮面积；V取为取样体积；计算出累计透过量Q(μg·cm-2)。
其中V总＝6.5mL，A＝2.8cm2，V取＝1mL。
4.3.6单因素考察法筛选促渗剂的种类
按“3.2.4”方法，分别考察不同促渗剂对延胡索总生物碱凝胶膏剂的促渗作用，加入一定量的延胡索干浸膏，制备以延胡索药物为原料的延胡索总生物碱凝胶膏剂，改变其中不同促渗剂的种类，选用不同的促渗剂：不用促渗剂，丙二醇：氮酮(0.5g；0.5g)，氮酮(1g)，冰片(1g)，薄荷脑(1g)，冰片：氮酮(0.5g:0.5g)，薄荷脑：氮酮(0.5g:0.5g)，冰片：薄荷脑(0.5g:0.5g)，按“4.3.5”离体试验方法，在接受池上的离体皮肤贴上不同促渗剂的凝胶膏剂3g，以4中指标成分考察24小时累计透过量以筛选何种促渗剂促渗离体促渗效果最优。由表中试验结果可知，24小时累计透过量最优的促渗剂为薄荷脑与氮酮联合促渗用量为0.5g：0.5g。
表2-2-4不同促渗剂24小时累计透过量考察结果(n＝2)
4.3.7最优处方凝胶膏剂透皮试验
按“3.2.8”优选出来的最优成型工艺制备凝胶膏剂，按“4.3.5”离体试验方法，在接受池上的离体皮肤贴上不同促渗剂的凝胶膏剂3g，分别在不同时间段取样，分别计算出各个时段累计透过量Q，以累积渗透量Q对时间t进行线性回归，所得Q-t直线回归方程斜率即为释放速率常数J(μg·cm-2·h-1)。求得累积释放量后，将累积渗透量Q与时间t进行方程拟合，并求得回归系数，回归系数最大的方程即为最佳拟合方程。共有以下3种方式：零级方程Q＝kt，一级方程ln(1-Q)＝-kt，Higuchi方程Q＝k*t1/2，结果见表2-2-5，2-2-6。由表中结果，可知脱氢紫堇碱与延胡索甲素最佳拟合方程为零级方程，D-四氢药根碱与延胡索乙素最佳拟合方程为Higuchi方程，24h凝胶膏剂脱氢紫堇碱，D-四氢药根碱，延胡索乙素，延胡索甲素透皮试验结果如下，由表中数据可显示凝胶膏剂中4种指标成分24小时透过量良好。
表2-2-5凝胶膏剂透皮试验结果(n＝3)
表2-2-6凝胶膏剂释放方程拟合结果
4.4讨论与小结
本研究全方位的考察了延胡索总生物碱凝胶膏剂的离体透皮效果。做此方面研究旨在于：1、确定了延胡索总生物碱凝胶膏剂的离体透皮效果，证实了延胡索总生物碱凝胶膏剂的离体透皮性良好，后期药效学实验用该凝胶膏剂作为经皮给药制剂是可保证其能发挥稳定的药效的；2、对剂型中使用的促渗剂的种类进行了筛选，一般来说，促渗剂对不同的剂型及不同药物促渗效果各不相同，因此为了保证经皮给药的药效，筛选适合该剂型的促渗剂是很有必要的。
5.延胡索总生物碱凝胶膏剂质量评价
本节对延胡索总生物碱凝胶膏剂进行了质量评价，根据《中国药典》2015版项下有关对凝胶膏剂的检查项目进行了检查，包括含膏量，赋型性，粘附力；采用超高效液相色谱法对凝胶膏剂中的脱氢紫堇碱、D-四氢药根碱，延胡索乙素，延胡索甲素等成分进行了含量测定。
5.1.仪器与试药
捷伦1290超高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；ZORBAX Eclipse PlusC18Rapid Resolution HD 2.1×50mm 1.8-Micron(made in USA)；超声波清洗机(天津市泰斯特仪器有限公司)；电热古风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；AUW1200型电子天平(十万分之一，岛津)；FA1004万分之一的分析天平(上海舜宇平科学仪器有限公司)；脱氢紫堇碱、D-四氢药根碱、延胡索乙素、延胡索甲素，以上对照品均购置于成都植标化纯生物技术有限公司，其纯度均大于98％。三乙胺、色谱纯乙腈(德国默克公司)，冰乙酸为色谱级，屈臣氏蒸馏水；自制延胡索总生物碱凝胶膏剂。
5.2方法与结果
5.2.1延胡索总生物碱凝胶膏剂性状
按“2.1.2.7”法制备即得延胡索总生物碱凝胶膏剂，本品为外用凝胶贴剂，以聚丙烯薄膜为防黏层，以无纺布为背衬层，膏体为褐棕色的，均一，光滑平整，具有一定黏性的黏稠半固体。
5.2.2含膏量的检测
取不同批次延胡索总生物碱凝胶膏剂(20191112、20191115、20191120)，每个批次分别取3片，标记，除去防黏层，精密称重，将其置于不锈钢煎煮锅中，加足量水，盖上锅盖，加热煮沸，直至膏体与无纺布分离。取出无纺布，用水洗涤至无纺布无膏体残留，晾干，放置鼓风干燥箱(105℃)烘30分钟，转移至干燥器中冷却30分钟，取出，精密称重，减少重量即为膏体重量。按相应面积换算为100cm2。具体含膏量结果见表2-3-1。
表2-3-1延胡索总生物碱凝胶膏剂含膏量结果(n＝3)
5.2.3赋型性检查
取不同批次延胡索总生物碱凝胶膏剂(20191112、20191115、20191120)，每个批次分别取3片，标记，除去防黏层，置于恒温恒湿箱(相对湿度64％，温度37℃)中30分钟，取出，用夹子固定在夹角为60°的钢板上，放置24小时，膏面均无流淌现象，说明自制延胡索总生物碱凝胶膏剂符合赋型性要求。
5.2.4黏附性检查
取不同批次延胡索总生物碱凝胶膏剂(20191112、20191115、20191120)，每个批次分别取3片，标记，除去防黏层，在室温下放置2小时，按“2.1.2.2.2”法对其进行初黏力测试，实验结果见表2-3-2。由实验结果可知，延胡索总生物碱凝胶膏剂符合要求。
2-3-2延胡索总生物碱凝胶膏剂初黏力测试结果
批次 初黏力测试钢球
20191112 16
20191115 16
20191120 15
5.2.5含量测定
5.2.5.1色谱条件
流动相为乙腈(A)-0.2％冰乙酸(三乙胺调pH 6.0)(B)，柱温：45℃，进样量2μL，检测波长280nm；体积流量0.3mL/min，具体检测方法见表2-3-3。
表2-3-3色谱检测方法
5.2.5.2对照品溶液的配制方法
精密称定脱氢紫堇碱，D-四氢药根碱，延胡索乙素，延胡索甲素对照品适量，加甲醇溶解，混合对照品溶液。
5.2.5.3供试品前处理方法研究
提取溶剂优选
取延胡索总生物碱凝胶膏剂，精密称取同一批次凝胶膏剂1g，置于50mL锥形瓶中，用移液管精密移取不同溶剂(30％乙醇，50％乙醇，70％乙醇，无水乙醇，甲醇)25mL作为提取溶剂，用保鲜膜密封锥形瓶口，称重，超声20分钟，放冷至室温，称重，不足则用用相同的提取溶剂补重，取上清液，过0.22μm微孔柱头，每个样品平行3份，按“2.3.2.5.1”法进样，具体结果见表2-3-4。结果表明用纯甲醇作为提取溶剂提取出来的成分更多。
表2-3-4不同提取溶剂提取结果(n＝3)
提取时间优选
取延胡索总生物碱凝胶膏剂，精密称取同一批次凝胶膏剂1g，置于50mL锥形瓶中，用移液管精密移取25mL甲醇溶液至锥形瓶中，用保鲜膜密封锥形瓶口，称重，分别超声提取5分钟、15分钟、25分、35分钟，放冷至室温，称重，不足则用用相同的提取溶剂补重，取上清液，过0.22μm微孔柱头，每个样品平行3份，按“5.2.5.1”法进样，具体结果见表2-3-5。结果表明15分钟左右就能将凝胶膏剂中的成分提取出来，从节约时间和资源考虑，故选择超声提取时间为15分钟。
表2-3-5不同提取时间提取结果(n＝3)
综合上述两项考察结果，从节约能源与时间的角度出发，供试品的制备方法为：取延胡索总生物碱凝胶膏剂1g，置50mL锥形瓶中，加入25mL甲醇，称定重量，超声15分钟，放冷后用甲醇补足损失的重量，过微孔滤膜，即得。
5.2.5.4线性关系考察试验
精密称取脱氢紫堇碱对照品，D-四氢药根碱对照品，延胡索乙素对照品，延胡索甲素对照品适量，置于50mL容量瓶中，加入一定甲醇，超声使其中对照品完全溶解，待冷却至室温，再加甲醇定容至刻度线，其为母液，其中各对照品浓度分别为：脱氢紫堇碱280.32μg/mL，D-四氢药根碱128.75μg/mL，延胡索乙素63.91μg/mL，延胡索甲素62.58μg/mL。用移液管精密吸取混合对照品母液0.5mL，1mL，2mL，3mL，4mL，5mL，将其分别移入10mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度线，轻震摇匀。之后吸取稀释后的混合对照品，在“5.2.5.1”项下色谱条件下进行测定，进样量均为2μL。以样品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制对照品溶液曲线见图10，计算回归方程，具体结果见表2-3-6、表2-3-7，由表中结果可知，在其范围内线性关系良好。
表2-3-6线性范围实验结果
表2-3-7各成分线性范围试验结果
成分 回归方程 r 线性范围(μg)
脱氢紫堇碱 y＝33.137x-22.658 0.9998 13.55～135.50
D-四氢药根碱 y＝5.6936x-3.066 0.9997 5.83～58.30
延胡索乙素 y＝5.7604x-2.42 0.9995 3.09～30.09
延胡索甲素 y＝5.9044x-1.2008 0.9997 2.90～29.00
5.2.5.5仪器精密度考察试验
精密称取脱氢紫堇碱对照品，D-四氢药根碱对照品，延胡索乙素对照品，延胡索甲素对照品适量，置于10mL容量瓶中，加入一定甲醇，超声使其中对照品完全溶解，待冷却至室温，再加甲醇定容至刻度线，其中各对照品浓度分别为：脱氢紫堇碱22.46μg/mL，D-四氢药根碱41.42μg/mL，延胡索乙素41.87μg/mL，延胡索甲素34.94μg/mL。吸取混合对照品溶液，在“5.2.5.1”项下色谱条件下进行测定，进样量均为2μL。具体结果见表2-3-8。由实验结果表明仪器精密度良好。
表2-3-8仪器精密度考察试验
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5.2.5.6重复性试验
精密称取六份延胡索总生物碱凝胶膏剂1g，置于50mL锥形瓶中，用移液管精密加入25mL甲醇，用保鲜膜密封锥形瓶瓶口，称重，超声15分钟，放冷至室温，称重，用甲醇补重。吸取上清液，过0.22μm微孔柱头，在“5.2.5.1”项下色谱条件下进行测定，进样量均为2μL。具体结果见表2-3-9。结果表明延胡索总生物碱凝胶膏剂重复性良好。
表2-3-9重复性试验结果
5.2.5.7稳定性性试验
精密称取延胡索总生物碱凝胶膏剂1g，置于50mL锥形瓶中，用移液管精密加入25mL甲醇，用保鲜膜密封锥形瓶瓶口，称重，超声15分钟，放冷至室温，称重，用甲醇补重。吸取上清液，过0.22μm微孔柱头，分别在0小时，2小时，4小时，6小时，8小时，10小时，12小时，16小时，24小时，按“5.2.5.1”项下色谱条件下进行测定，进样量均为2μL。具体结果见表2-3-10。试验结果表明，延胡索总生物碱凝胶膏剂在24小时内稳定性良好。
表2-3-10稳定性试验结果
5.2.5.8加样回收试验
精密称取含量已知的六份延胡索总生物碱凝胶膏剂(脱氢紫堇碱2.109mg/g，D-四氢药根碱0.433mg/g，延胡索乙素0.481mg/g，延胡索甲素0.288mg/g)每份0.5g，置于50mL锥形瓶中，用移液管精密加入25mL甲醇，再分别加入脱氢紫堇碱1.0545mg，D-四氢药根碱0.2165mg，延胡索乙素0.2405mg，延胡索甲素0.144mg，用保鲜膜密封锥形瓶瓶口，称重，超声15分钟，冷却至室温，称重，用甲醇补重。吸取上清液，过0.22μm微孔柱头，按“5.2.5.1”项下色谱条件下进行测定，进样量均为2μL。具体结果见表2-3-11，2-3-12，2-3-13，2-3-14。由试验结果可知该方法准确度较好，稳定可靠。
表2-3-11凝胶膏剂中脱氢紫堇碱加样回收试验结果
表2-3-12凝胶膏剂中D-四氢药根碱加样回收试验结果
表2-3-13凝胶膏剂中延胡索乙素加样回收试验结果
表2-3-13凝胶膏剂中延胡索甲素加样回收试验结果
5.3讨论与小结：
通过外观性状、含膏量测定、黏附性测定、赋型性检查，对延胡索总生物碱凝胶膏剂进行质量评价，结果显示外观良好，黏合力较强，各项指标均符合2015版《中国药典》规定。建立了HPLC含量测定方法，凝胶膏剂样品中，脱氢紫堇碱、D-四氢药根碱、延胡索甲素、延胡索乙素相对较为稳定，脱氢紫堇碱平均含量为2.06mg/g，下浮15％，将脱氢紫堇碱的限度定为不少于1.75mg/g；D-四氢药根碱平均含量为0.44，下浮15％，将D-四氢药根碱的限度定为不少于0.37mg/g；延胡索乙素平均含量为0.48，下浮15％，将延胡索乙素的限度定为不少于0.41mg/g；延胡索甲素平均含量为0.29，下浮15％，将延胡索甲素的限度定为不少于0.24mg/g。
6.延胡索总生物碱凝胶膏剂药效学评价
6.1镇痛作用
将SD大鼠雌雄分开饲养，每笼5只，30只大鼠共分为6笼。将其饲养于贵州中医药丹溪楼动物房内，内有空调，24小时开机，保持温度为(22±2℃)。自由进食饮水，适应性喂养5天。之后将大鼠随机分组，每组雌雄各半，即一笼雄鼠(每笼5只)一笼雌鼠(每笼5只)为一组，每组10只大鼠，共分为3组；(1)模型对照组(不给药)；(2)阳性药对照组(云南白药膏)；(3)延胡索总生物碱凝胶贴膏组。
压痛仪测大鼠痛阈值
用YLS-3E型压痛仪测大鼠痛阈值，该压痛仪加压范围在：0-3000g，痛阈值测试指标测定原理是将压力慢慢加大，待动物因压力加大而产生疼痛而嘶鸣时，停止，记录数据，此数据就是该动物的痛阈值。在第8天给药1小时后，抓取大鼠，将其装入在固定筒内，待大鼠在固定筒内稳定平静，采用扁压型压头压痛大鼠尾部，在大鼠尾部距尾尖3cm处出用红色记号笔标记，标记后用压痛仪压痛标记部位，待大鼠因疼痛而挣扎嘶鸣，停止压痛，记录压痛数据，此为大鼠痛阈值。每只大鼠测三次，取平均值。
试验结果
所有试验结果计量资料均以均数±标准差表示，采用SPSS21.0软件进行分析，两组间差异显著性检验采用两两独立样本的t检验,多组均数间显著性比较用单因素，以P<0.05表示差异有统计学意义。
表6.1大鼠痛阈值试验影响结果
注：各组与空白组比较：*P<0.05，**P<0.01。
从表中看出，与空白对照组比较，各组均有显著性差异，表明自制延胡索总生物碱凝胶膏剂却有镇痛作用。
6.2抗炎作用
将SD大鼠雌雄分开饲养，每笼5只，30只大鼠共分为6笼。将其饲养于贵州中医药丹溪楼动物房内，内有空调，24小时开机，保持温度为(22±2℃)。自由进食饮水，适应性喂养5天。之后将大鼠随机分组，每组雌雄各半，即一笼雄鼠(每笼5只)一笼雌鼠(每笼5只)为一组，每组10只大鼠，共分为3组；(1)模型对照组；(2)阳性药对照组(云南白药膏)；(3)延胡索总生物碱凝胶贴膏组。
为保证每只动物给药的一致性，预先将延胡索总生物碱凝胶膏剂及阳性药云南白药膏贴剪成4cm×5cm均匀小药块。除空白对照组不做任何处理外，将其余组大鼠，称重，按体重用5％水合氯醛溶液麻醉，麻醉剂量为每100g～0.6mL。待大鼠完全麻醉，先用宠物剃毛机将大鼠腹部长毛全部剔除干净，因大鼠腹部还残留有小绒毛剃毛机已很难再剔除干净，所以再涂上人用脱毛膏，将大鼠腹部朝上，静待10分钟，用温水洗去腹部脱毛膏，腹部小绒毛也随之而去除，其腹部露出无毛光滑的皮肤。脱毛完成，按照不同的分组对大鼠进行不同的处理：空白组，不使用任何处理；阳性药对照组，将阳性药云南白药膏贴贴于大鼠腹部裸露的皮肤上；延胡索总生物碱凝胶贴膏组延胡索总生物碱凝胶贴膏，将贴于大鼠腹部裸露的皮肤上。按照此法，每隔2天做促渗处理和给药1次。共给药9次，给药天数18天。
足肿胀检测实验
第18天给药1小时后，大鼠右足皮下注射1％角叉菜胶0.1mL，注射之后大鼠右足马上出现发红肿胀等炎症现象。用玻璃容器法检测足肿胀。玻璃容器法：选用15mL离心管，将水装入大约4/5位置处，用红色标记笔标标注该水位线记为A，一人抓住大鼠身体，不让其挣扎，另一人用红色记号笔在大鼠脚踝处标记，标记好后，将大鼠足部放入装入4/5水的离心管中，水位线刚好没过大鼠脚踝处的标记，此时离心管中水位线上升，用红色标记笔标记好上升位置，记为B。之后将大鼠足部取出，大鼠足部会黏带一部分水，此时的离心管水位线低于A标记处，先用1mL注射器滴定水至A标记处，接着再用1mL注射器滴定到B标记处，记录从A标记处滴到B标记处时所用的毫升数，此时的毫升数就为大鼠足部体积V。用玻璃容器法先检测未注射角叉菜胶前的足部体积记为V0，分别检测注射角叉菜胶，2小时后足部体积V2，4小时后足部体积V4，6小时后足部体积V6，8小时后足部体积V8。不同时间肿胀度＝Vi-V0，其中Vi为注射角叉菜胶后不同时间足部体积，V0为未注射角叉菜胶前足部体积。
表6.2大鼠痛足肿胀试验影响结果
注：各组与空白组比较：*P<0.05，**P<0.01。
结果表明，延胡索总生物碱凝胶贴膏可以明显的抑制角叉菜胶导致的足肿胀，表明延胡索总生物碱凝胶贴膏具有较好的抗炎作用。

Claims (2)

1.一种延胡索总生物碱凝胶膏剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）按重量份计，取丙三醇15份、聚丙烯酸钠2份、二氧化硅0.3份、乙醇2份和薄荷脑0.5份，搅拌均匀，作为A相；
（2）取三氧化铝0.1份、柠檬酸0.05份和水溶性氮酮0.5份，加入水至全部溶解，作为B相；
（3）取延胡索干浸膏3份，加入水，40℃水浴锅中隔水加热搅拌至延胡索干浸膏全部溶于水，冷却，作为C相；所述延胡索干浸膏的制备方法如下：取延胡索粗粉，置于烧瓶中，加入乙醇，回流提取，将提取出来的提取液用旋转蒸发仪旋蒸，将提取液旋蒸至粘稠，真空干燥，即得；
（4）将A相与B相混匀，再加入C相搅拌均匀，涂布，静待24h，经质量检测合格后，即得延胡索总生物碱凝胶膏剂。
2.根据权利要求1所述的延胡索总生物碱凝胶膏剂的制备方法，其特征在于：所述延胡索干浸膏的制备方法如下：称取延胡索粗粉，置于圆底烧瓶中，加入20倍延胡索粗粉重量的90%乙醇，回流提取3次，每次2小时，将提取出来的提取液合并，用旋转蒸发仪60℃旋蒸，将提取液旋蒸至粘稠，60℃真空干燥，即得。
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