CN113281431A - 低共熔溶剂的合成方法及提取和纯化刺五加苷b的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低共熔溶剂的合成方法及使用其提取和纯化刺五加苷B的方法，包括以下步骤：将氯化胆碱、L‑脯氨酸、水混合；将混合后的组分进行恒温搅拌，合成低共熔溶剂，将刺五加烘干后研磨成粉末，过60‑80目筛；将刺五加粉末置于提取罐中，加入低共熔溶剂，然后进行恒温搅拌，得到刺五加苷B的提取液。使用本发明低共熔溶剂，采用恒温加热搅拌法提取刺五加中刺五加苷B的方法高效、绿色、安全、成本低廉，与70％乙醇溶剂相比，对刺五加中刺五加苷B具有较高的提取效率和较为简便的纯化流程。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，更具体的说是涉及一种低共熔溶剂的合成方法及使用其提取和纯化刺五加苷B的方法。
背景技术
刺五加[Acanthopanaxsenticosus(Rupr.rtMaxim.)Harms]为植物刺五加的干燥根及根茎，主要分布于中国东北，在俄罗斯、韩国、朝鲜和日本等国也有发现。《中华本草》记载，刺五加具有补肝肾；强筋骨；利水补肾等功效。现代药理学研究表明，刺五加苷B对中枢神经具有兴奋作用，其效应不同于苯丙胺类化合物，刺五加苷B不仅毒性低，而且不扰乱正常的睡眠，刺五加甙具有抗疲劳作用，强于人参提取物及人参甙。刺五加中的刺五加甙E，对辐射抗性具有积极作用。当刺五加多糖用作免疫增强剂时，它不仅可以促进免疫细胞(例如T细胞，B细胞，NK细胞和M细胞)更有效地发挥免疫调节作用，还可以介导白介素，干扰素，它还可以促进肿瘤坏死因子等细胞因子，产生并扩展免疫细胞，增强人体免疫力，并最终发挥其抗肿瘤作用。
有机溶剂提取法是最常用的中药有效成分提取技术，它利用样品中各组分在同一溶剂中溶解度的差异，使其完全或部分分离的方法，要求提取溶剂的极性与分析物的极性相近，即相似相溶原理，使分析物能进入溶液而样品中其他物质处于不溶状态。在工业上，90％-95％乙醇溶液提取苷元，而约60％乙醇用于提取苷，60％-80％乙醇用于提取类黄酮。然而，这种方法提取成分多，组成复杂，不利于刺五加苷B的进一步纯化，而且大量使用有机溶剂可能对人类和环境造成危险。
针对上述现有技术问题，近年来研究发展出超临界流体萃取技术、半仿生提取技术、酶工程技术应用于植物化学成分的高效提取，但提取工艺复杂、酶种类繁杂、提取成本高、技术方案涉密性以及提取设备昂贵等因素限制了以上方法在中药提取领域的应用。
因此，研发一种低共熔溶剂的合成方法及使用其高效、绿色、安全、成本低的从刺五加中提取和纯化刺五加苷B的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种低共熔溶剂的合成方法及使用其高效、绿色、安全、成本低的从刺五加中提取和纯化刺五加苷B的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种低共熔溶剂的合成方法，包括以下步骤：
(1)将氯化胆碱、L-脯氨酸、水混合；
(2)将混合后的组分进行恒温搅拌，合成低共熔溶剂。
本发明的有益效果：本发明制备的低共熔溶剂采用的原料经济、易得、安全。本发明制备的低共熔溶剂粘度适中，对刺五加或刺五加苷B的提取效率高。本发明采用恒温加热搅拌法制备低共熔溶剂，制备得到的溶剂稳定性好，该法操作简便，处理条件简单，无需使用有机试剂，反应原液利用率100％，符合绿色化学指导原则。
进一步，上述氯化胆碱和L-脯氨酸的摩尔比为1:1，每1mol氯化胆碱加入水100-300mL。
进一步，步骤(1)中，上述混合转速为200-500r/min，混合时间为1.5-2h。
进一步，步骤(2)中，上述恒温温度为80-90℃，搅拌时间为1.5-2h，搅拌转速为200-500r/min。
本发明还提供一种提取刺五加苷B的方法，包括以下步骤：
1)将刺五加烘干后研磨成粉末，过60-80目筛；
2)将刺五加粉末置于提取罐中，加入上述的低共熔溶剂，然后进行恒温搅拌，得到刺五加苷B的提取液。
本发明的有益效果：使用本发明低共熔溶剂，采用恒温加热搅拌法提取刺五加中刺五加苷B的方法高效、绿色、安全、成本低廉，与70％乙醇溶剂相比，对刺五加中刺五加苷B具有较高的提取效率和较为简便的纯化流程。
进一步，步骤1)中，上述烘干温度为80℃，烘干时间为1-2h。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：上述烘干条件有利于低共熔溶剂对刺五加提取及提高提取效率。
进一步，步骤2)中，每1g刺五加粉末加入低共熔溶剂20-40mL。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：在此料液比下，刺五加苷B的提取效率较高。
进一步，步骤2)中，上述恒温温度为80-90℃，搅拌时间为2h，搅拌转速为500r/min。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：在该条件下，提取条件温和，提取较完全。
本发明还提供一种刺五加苷B提取液的纯化方法，包括以下步骤：
A大孔树脂预处理：首先将大孔树脂用95wt％乙醇浸泡24h，充分溶胀后，用乙醇以2BV/h的速率淋洗，然后用去离子水洗尽乙醇，再然后用5wt％盐酸溶液浸泡2h并以2BV/h的速率用超纯水淋洗至中性，再用2wt％NaOH溶液浸泡2h并以2BV/h的速率用超纯水淋洗至中性，最后将处理后的大孔树脂加双重纯水水面没过大孔树脂，储存在干燥器内，备用；
B样品纯化：采用上述刺五加苷B的提取液作为样品，玻璃层析柱15mm×500mm内进行,床层高度为柱高2/3，取大孔树脂200g，湿法上柱，柱体积BV和树脂在玻璃柱内的高度分别为150mL和32cm，以2BV/h上样40mL，流出液每5mL为一个检测单位，通过HPLC法进行测定刺五加苷B浓度，经200mL纯水洗脱后，用60％乙醇作为洗脱剂，进行洗脱，完成刺五加苷B的提取液的纯化。
本发明的有益效果：本发明纯化方法简便，大孔树脂使用前需进行预处理，洗脱残留未聚合的单体及影响分析工作的致孔剂、分散剂、防腐剂，将处理后的大孔树脂加双重纯水储存在干燥器内，以保证树脂含水率稳定，刺五加苷B的提取液的纯化后刺五加苷B回收率为71.39±1.64％。
附图说明
图1空白溶剂总离子流色谱图中两种本底离子；
图2空白溶剂总离子流色谱图中两种本底离子的高分辨质谱MS1信息：
A、邻苯二甲酸酯的酸酐[M+H]+m/z149.02306；
B、邻苯二甲酸二丁酯[M+H]+m/z279.15845；
图3大孔树脂法60％乙醇纯化前(a.)后(b.)刺五加苷B提取离子色谱图；
图4刺五加苷B标准品色谱图；
图5刺五加苷B二级质谱图；
图6提取液中刺五加苷B在两种树脂柱中动态解吸附曲线。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(一)低共熔溶剂的合成方法，包括以下步骤：
(1)将0.1mol氯化胆碱、0.1molL-脯氨酸、20mL超纯水混合，混合转速为500r/min，混合时间为2h；
(2)将混合后的组分进行恒温搅拌，恒温温度为80℃，搅拌时间为2h，搅拌转速为500r/min，合成低共熔溶剂。
(二)提取刺五加苷B的方法，包括以下步骤：
1)将刺五加烘干后研磨成粉末，过60目筛，烘干温度为80℃，烘干时间为2h；
2)将1g刺五加粉末置于提取罐中，加入低共熔溶剂20mL，然后进行恒温搅拌，恒温温度为80℃，搅拌时间为2h，搅拌转速为500r/min，得到刺五加苷B的提取液。
(三)将刺五加苷B的提取液离心，离心转速为10000r/min，离心时间为5min，取上清液采用0.22um微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱串联轨道阱质谱法法检测滤液中刺五加苷B含量。
实施例2
(一)低共熔溶剂的合成方法，包括以下步骤：
(1)将0.1mol氯化胆碱、0.1molL-脯氨酸、10mL超纯水混合，混合转速为200r/min，混合时间为1.5h；
(2)将混合后的组分进行恒温搅拌，恒温温度为85℃，搅拌时间为1.5h，搅拌转速为200r/min，合成低共熔溶剂。
(二)提取刺五加苷B的方法，包括以下步骤：
1)将刺五加烘干后研磨成粉末，过70目筛，烘干温度为80℃，烘干时间为1h；
2)将1g刺五加粉末置于提取罐中，加入低共熔溶剂30mL，然后进行恒温搅拌，恒温温度为80℃，搅拌时间为2h，搅拌转速为500r/min，得到刺五加苷B的提取液。
(三)将刺五加苷B的提取液离心，离心转速为10000r/min，离心时间为5min，取上清液采用0.22um微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱串联轨道阱质谱法法检测滤液中刺五加苷B含量。
实施例3
(一)低共熔溶剂的合成方法，包括以下步骤：
(1)将0.1mol氯化胆碱、0.1molL-脯氨酸、30mL超纯水混合，混合转速为300r/min，混合时间为1.8h；
(2)将混合后的组分进行恒温搅拌，恒温温度为90℃，搅拌时间为1.8h，搅拌转速为300r/min，合成低共熔溶剂。
(二)提取刺五加苷B的方法，包括以下步骤：
1)将刺五加烘干后研磨成粉末，过80目筛，烘干温度为80℃，烘干时间为1.5h；
2)将1g刺五加粉末置于提取罐中，加入低共熔溶剂40mL，然后进行恒温搅拌，恒温温度为85℃，搅拌时间为2h，搅拌转速为500r/min，得到刺五加苷B的提取液。
(三)将刺五加苷B的提取液离心，离心转速为10000r/min，离心时间为5min，取上清液采用0.22um微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱串联轨道阱质谱法法检测滤液中刺五加苷B含量。
实施例4
(一)低共熔溶剂的合成方法，包括以下步骤：
(1)将0.1mol氯化胆碱、0.1molL-脯氨酸、20mL超纯水混合，混合转速为400r/min，混合时间为1.6h；
(2)将混合后的组分进行恒温搅拌，恒温温度为82℃，搅拌时间为1.6h，搅拌转速为400r/min，合成低共熔溶剂。
(二)提取刺五加苷B的方法，包括以下步骤：
1)将刺五加烘干后研磨成粉末，过70目筛，烘干温度为80℃，烘干时间为1.2h；
2)将1g刺五加粉末置于提取罐中，加入低共熔溶剂30mL，然后进行恒温搅拌，恒温温度为85℃，搅拌时间为2h，搅拌转速为500r/min，得到刺五加苷B的提取液。
(三)将刺五加苷B的提取液离心，离心转速为10000r/min，离心时间为5min，取上清液采用0.22um微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱串联轨道阱质谱法法检测滤液中刺五加苷B含量。
实施例5
(一)低共熔溶剂的合成方法，包括以下步骤：
(1)将0.1mol氯化胆碱、0.1molL-脯氨酸、10mL超纯水混合，混合转速为200r/min，混合时间为1.5h；
(2)将混合后的组分进行恒温搅拌，恒温温度为82℃，搅拌时间为1.7h，搅拌转速为300r/min，合成低共熔溶剂。
(二)提取刺五加苷B的方法，包括以下步骤：
1)将刺五加烘干后研磨成粉末，过70目筛，烘干温度为80℃，烘干时间为1.7h；
2)将1g刺五加粉末置于提取罐中，加入低共熔溶剂20mL，然后进行恒温搅拌，恒温温度为87℃，搅拌时间为2h，搅拌转速为500r/min，得到刺五加苷B的提取液。
(三)将刺五加苷B的提取液离心，离心转速为10000r/min，离心时间为5min，取上清液采用0.22um微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱串联轨道阱质谱法法检测滤液中刺五加苷B含量。
对比例1
(一)70％乙醇提取刺五加苷B的方法，包括以下步骤：
1)将刺五加烘干后研磨成粉末，过60目筛，烘干温度为80℃，烘干时间为2h；
2)将1g刺五加粉末置于提取罐中，加入70％乙醇溶剂20mL，然后进行恒温搅拌，恒温温度为80℃，搅拌时间为2h，搅拌转速为500r/min，得到刺五加苷B的提取液。
(二)将刺五加苷B的提取液离心，离心转速为10000r/min，离心时间为5min，取上清液采用0.22um微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱串联轨道阱质谱法法检测滤液中刺五加苷B含量。
一、根据实施例1-5和对比例1所述利用超高效液相色谱法串联四极杆轨道阱质谱法(UHPLC-ESI-Orbitrap-MS/MS)检测刺五加苷B的提取液中刺五加苷B的含量，具体步骤如下：
a、将提取液进行UHPLC-ESI-Orbitrap-MS/MS测定，刺五加苷B质谱数据利用CompoundDiscoverer3.1TM软件鉴定；
b、精密称取刺五加苷B标准品各10mg至100mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，作为标准溶液贮备液刺五加苷B，取刺五加苷B标准溶液贮备液依次稀释至5、10、20、50、100倍标准溶液，摇匀，按步骤a方法进行UHPLC-ESI-Orbitrap-MS/MS测定峰面积；
c、取步骤b测得的刺五加苷B标准品溶液色谱峰面积，计算得回归方程及线性系数:y＝10224712538X+58306688,R2＝0.9917；
d、取步骤b测得的刺五加苷B标准品溶液色谱峰面积，计算得刺五加苷B定量限为138.1723ng/mL。
e、取步骤b测得的刺五加苷B标准品溶液色谱峰面积进行精密度考察，以重复性试验考察方法精密度，在0.1、0.01、0.002mg/mL范围内刺五加苷B标准品溶液浓度实测值为0.1107±0.0011、0.0103±0.0002、0.0019±0.00009mg/mL，RSD％值分别为1.01％、1.96％、1.69％结果均在限定范围内，系统误差不影响实验测定结果。
f、步骤a完成后，取步骤b刺五加苷B标准品溶液0.2、0.01、0.002mg/mL加入实施例6刺五加苷B提取液以回收率实验结果考察方法准确度。计算得刺五加苷B回收率：92.1％、89.9％、82.3％、103.2％、106.5％、89.3％，该检测方法准确度良好。
g、利用步骤c测得回归方程，计算刺五加苷B的提取液中刺五加苷B含量。实施例1-5及对比例1刺五加苷B的提取液中刺五加苷B含量结果见表1。
表1刺五加苷B含量
实施例6
刺五加苷B提取液的纯化方法，包括以下步骤：
A、大孔树脂预处理：首先将AB-8型大孔树脂用95wt％乙醇浸泡24h，充分溶胀后，用乙醇以2BV/h的速率淋洗，然后用去离子水洗尽乙醇，再然后用5wt％盐酸溶液浸泡2h并以2BV/h的速率用超纯水淋洗至中性，再用2wt％NaOH溶液浸泡2h并以2BV/h的速率用超纯水淋洗至中性，最后将处理后的大孔树脂加双重纯水储存在干燥器内，备用；
B、样品纯化：采用实施例2刺五加苷B的提取液作为样品，玻璃层析柱15mm×500mm内进行，床层高度为柱高2/3，取大孔树脂200g，湿法上柱，柱体积BV和树脂在玻璃柱内的高度分别为150mL和32cm，以2BV/h上样40mL，流出液每5mL为一个检测单位，通过HPLC法进行测定三种目标产物浓度，经200mL纯水洗脱后，用60％乙醇作为洗脱剂，进行洗脱，完成刺五加苷B的提取液的纯化。
不同浓度的乙醇为纯化溶剂对刺五加苷B的洗脱效果见表2，图1为空白提取液(60％乙醇)总离子流色谱图，图中A和B两个色谱峰为空白溶剂中的两个本底物质，经液质联用分析，两种物质分别为邻苯二甲酸酯的酸酐A和邻苯二甲酸二丁酯B，解吸附曲线见图2；对刺五加苷B提取液纯化液进行含量测定，完成刺五加苷B的提取液的纯化后，刺五加苷B回收率为71.39±1.64％，结果见表3；
由表2-3可知用两种大孔树脂纯化刺五加苷B时，洗脱液为60％乙醇时的洗脱能力最强，刺五加苷B的收率最高，而且，其中AB-8大孔树脂纯化结果优于HPD100C大孔树脂。由图1-2可知：空白溶剂中含有两个杂质峰，因此在纯化过程不应考虑这两个色谱峰的存在。
图3a图为刺五加低共熔溶剂提取液总离子流色谱图，由图3可见，在保留时间1分钟左右，有水溶性强的杂质峰，11-13分钟有空白溶剂本底峰A和B，在7-9分钟，有刺五加苷B和一伴随物质峰，图3b提取液经水洗后，再用60％乙醇洗脱后洗脱液的总离子流色谱图，由图可见水溶性杂质峰和伴随物质峰均消失，证明本发明的提取方法在后续提纯过程中纯化过程简便，纯化效果佳。
图4为刺五加苷B标准品总离子流色谱图，其保留时间与提取液中刺五加苷B的保留时间一致，图5为刺五加苷B的二级质谱图，这两个图通过色谱保留时间和质谱裂解证明图3中保留时间在7-9分钟出现的色谱峰为刺五加苷B。
图6为刺五加苷B提取液在纯化过程中的动态解析图，结果表明，刺五加苷B纯化过程中，使用60％乙醇时，洗脱效果最佳。
实施例7
刺五加苷B提取液的纯化方法，包括以下步骤：
A、大孔树脂预处理：首先将HPD100C型大孔树脂用95wt％乙醇浸泡24h，充分溶胀后，用乙醇以2BV/h的速率淋洗，然后用去离子水洗尽乙醇，再然后用5wt％盐酸溶液浸泡2h并以2BV/h的速率用超纯水淋洗至中性，再用2wt％NaOH溶液浸泡2h并以2BV/h的速率用超纯水淋洗至中性，最后将处理后的大孔树脂加双重纯水储存在干燥器内，备用；
B、样品纯化：采用实施例2刺五加苷B的提取液作为样品，玻璃层析柱15mm×500mm内进行，床层高度为柱高2/3，取大孔树脂200g，湿法上柱，柱体积BV和树脂在玻璃柱内的高度分别为150mL和32cm，以2BV/h上样40mL，流出液每5mL为一个检测单位，通过HPLC法进行测定三种目标产物浓度，经200mL纯水洗脱后，用60％乙醇作为洗脱剂，进行洗脱，完成刺五加苷B的提取液的纯化。
对刺五加苷B提取液纯化液进行含量测定，完成刺五加苷B的提取液的纯化后，刺五加苷B回收率为53.17±3.17％，结果见表3；不同浓度的乙醇为纯化溶剂对刺五加苷B的洗脱效果见表2；由表2-3可知：用两种大孔树脂纯化刺五加苷B时，洗脱液为60％乙醇时的洗脱能力最强，刺五加苷B的收率最高，而且，其中AB-8大孔树脂纯化结果优于HPD100C大孔树脂。
表2提取液中刺五加苷B在两种大孔树脂不同乙醇洗脱液中浓度
表3两种大孔树脂对刺五加苷B纯化效率的比较
| 指标 | 实施例6 | 实施例7 |
| 刺五加苷B提取液浓度(mg/mL) | 0.02373±0.00054 | 0.02372±0.00067 |
| 刺五加苷B吸附量(mg/g) | 0.17330±0.00063 | 0.16281±0.02241 |
| 刺五加苷B解吸量(mg/g) | 0.12371±0.00483 | 0.08663±0.01230 |
| 刺五加苷B解吸率％ | 71.39±1.64 | 53.17±3.17 |
对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (9)
1.一种低共熔溶剂的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将氯化胆碱、L-脯氨酸、水混合；
(2)将混合后的组分进行恒温搅拌，合成低共熔溶剂。
2.根据权利要求1所述的一种低共熔溶剂的合成方法，其特征在于，所述氯化胆碱和L-脯氨酸的摩尔比为1:1，每1mol氯化胆碱加入水100-300mL。
3.根据权利要求1所述的一种低共熔溶剂的合成方法，其特征在于，步骤(1)中，所述混合转速为200-500r/min，混合时间为1.5-2h。
4.根据权利要求1所述的一种低共熔溶剂的合成方法，其特征在于，步骤(2)中，所述恒温温度为80-90℃，搅拌时间为1.5-2h，搅拌转速为200-500r/min。
5.一种提取刺五加苷B的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将刺五加烘干后研磨成粉末，过60-80目筛；
2)将刺五加粉末置于提取罐中，加入权利要求1-4任一项所述的低共熔溶剂，然后进行恒温搅拌，得到刺五加苷B的提取液。
6.根据权利要求5所述的一种提取刺五加苷B的方法，其特征在于，步骤1)中，所述烘干温度为80℃，烘干时间为1-2h。
7.根据权利要求5所述的一种提取刺五加苷B的方法，其特征在于，步骤2)中，每1g刺五加粉末加入低共熔溶剂20-40mL。
8.根据权利要求5所述的一种提取刺五加苷B的方法，其特征在于，步骤2)中，所述恒温温度为80-90℃，搅拌时间为2h，搅拌转速为500r/min。
9.一种刺五加苷B提取液的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、大孔树脂预处理：首先将大孔树脂用95wt％乙醇浸泡24h，充分溶胀后，用乙醇以2BV/h的速率淋洗，然后用去离子水洗尽乙醇，再然后用5wt％盐酸溶液浸泡2h并以2BV/h的速率用超纯水淋洗至中性，再用2wt％NaOH溶液浸泡2h并以2BV/h的速率用超纯水淋洗至中性，最后将处理后的大孔树脂加双重纯水水面没过大孔树脂，储存在干燥器内，备用；
B、样品纯化：采用权利要求5-8任一项所述刺五加苷B的提取液作为样品，玻璃层析柱15mm×500mm内进行,床层高度为柱高2/3，取大孔树脂200g，湿法上柱，柱体积BV和树脂在玻璃柱内的高度分别为150mL和32cm，以2BV/h上样40mL，流出液每5mL为一个检测单位，通过HPLC法进行测定刺五加苷B浓度，经200mL纯水洗脱后，用60％乙醇作为洗脱剂，进行洗脱，完成刺五加苷B的提取液的纯化。
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