CN104614480A - 一种溪黄草水溶性总黄酮及其指纹图谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种溪黄草水溶性总黄酮及其指纹图谱检测方法。涉及中药提取物制备及其质量控制方法。制备溪黄草水溶性总黄酮的方法包括以下步骤：将溪黄草药材打成粗粉，加10BV水煎提，过滤，浓缩，过HPD100大孔树脂和聚酰胺柱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩、干燥，即得；指纹图谱检测方法包括以下步骤：对照品溶液的制备；供试品溶液的制备；色谱柱以十八烷基键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为甲醇与0.2％～2.0％冰乙酸组成的梯度洗脱液，柱温20～40℃；紫外检测波长为300～400nm；时间为80～120min；高效液相色谱法测得指纹图谱。本发明方法可以有效地用于溪黄草水溶性总黄酮的制备及其质量控制。

Description

一种溪黄草水溶性总黄酮及其指纹图谱检测方法

技术领域

本发明涉及中药提取物及其质量控制方法，具体涉及溪黄草药材水溶性总黄酮的制备及其指纹图谱检测方法的建立。

背景技术

溪黄草原植物为唇形科香茶菜属植物线纹香茶菜Isodon lophanthoides(Buch.-Ham.ex D.Don)H.Hara.的干燥地上部分。主产于长江以南的湖南、湖北、四川、云南、江西、广东、广西、福建等省区。性味苦、甘、寒,归肝、胆经，具有清热利湿、退黄、凉血散瘀的功效，用于治疗湿热黄疸、湿热泻痢、跌打瘀痛、急性黄疸型肝炎、急性胆囊炎、痢疾、肠炎等疾病。

溪黄草为华南地区民间习用草药。溪黄草作为清肝利胆药在广东大部分地区民间有着很长的使用历史。民间和历代名医把溪黄草用作清热祛湿、利胆退黄药，治疗急性黄疸型肝炎、急性胆囊炎，为预防和治疗肝胆疾病的常用药。

溪黄草水提液具有较强的抗炎、保肝活性，溪黄草水提液中具有较多的水溶性成分，其中水溶性总黄酮所占比例较大。黄酮类化合物具有多方面的生物活性。溪黄草被载入2010版《中国药典》，质量控制方法有待进一步研究。

发明内容

本发明的目的为制备溪黄草水溶性总黄酮，并建立其HPLC指纹图谱检测方法。

为达到本发明的目的所采用的技术方案：用现代色谱技术富集纯化溪黄草水溶性总黄酮，用高效液相色谱法建立溪黄草水溶性总黄酮的指纹图谱检测方法，具体包括如下步骤：

①、溪黄草水溶性总黄酮的制备：取溪黄草药材，打粗粉，加入10BV的水煎提，1.5h，3次，过滤并合并滤液，浓缩至1.6mg/mL，过HPD100大孔树脂，湿法上样，流速控制在2BV/h，4BV水洗，5BV的95％乙醇洗脱，收集95％乙醇洗脱液，浓缩回收乙醇，乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯层，水层除去少量 乙酸乙酯，浓缩至2.0mg/mL，再湿法上80-100目聚酰胺柱，流速2BV/h，2BV水洗，6BV30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩、干燥，即得；

②、对照品溶液的制备：精密称取新西兰牡荆苷-2对照品，用水配制成每1mL含新西兰牡荆苷-20.2～0.5mg/mL的溶液，作为对照品溶液；

③、供试品溶液的制备：精密称取溪黄草水溶性总黄酮粉末，用水配制成每1mL含溪黄草水溶性总黄酮0.5～1.0mg/mL的溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

④、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为甲醇与冰乙酸水溶液组成的梯度洗脱液，紫外检测：波长300-400nm。

⑤、测定：精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

进一步优选的方法可以通过下述步骤实施：

②对照品溶液的制备，采用精密称取新西兰牡荆苷-2粉末2.50mg，置于10mL具塞锥形瓶中，加水溶解，定溶至刻度，配成0.25mg/mL的新西兰牡荆苷-2溶液，即得。

③供试品溶液的制备，采用精密称取溪黄草水溶性总黄酮粉末20.00mg，置于25mL具塞锥形瓶中，加20mL水，超声溶解，放冷，加水定容至25mL，配制成0.80mg/mL的溪黄草水溶性总黄酮溶液，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得；

④色谱条件，采用色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为甲醇与0.2～2.0％冰乙酸水溶液组成的梯度洗脱液；柱温20～40℃；紫外检测：波长300-400nm；流速：0.5～1.2ml/min；时间：80～120min；

⑤测定，采用精密吸取供试品溶液10μL注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法则定，得到指纹图谱。

本发明最佳的检测方法可以通过下述步骤实施:

步骤④色谱条件中流动相为甲醇与0.5％冰乙酸水溶液组成的梯度洗脱液，柱温：25℃；检测波长为334nm；流速为0.8ml/min；分析时间为110min。

步骤④色谱条件中所述的梯度洗脱，梯度洗脱程序以如下体积浓度配置进行：

0分钟时，流动相A为25％的甲醇溶液、流动相B为75％的0.5％冰乙酸水溶液；

25分钟时，流动相A为32％的甲醇溶液、流动相B为68％的0.5％冰乙酸水溶液；

40分钟时，流动相A为32％的甲醇溶液、流动相B为68％的0.5％冰乙酸水溶液；

45分钟时，流动相A为34％的甲醇溶液、流动相B为66％的0.5％冰乙酸水溶液；

70分钟时，流动相A为36％的甲醇溶液、流动相B为64％的0.5％冰乙酸水溶液；

90分钟时，流动相A为50％的甲醇溶液、流动相B为50％的0.5％冰乙酸水溶液；

110分钟时，流动相A为55％的甲醇溶液、流动相B为45％的0.5％冰乙酸水溶液。

具体见下表： 

溪黄草水溶性总黄酮的指纹图谱检测方法，具体包括如下步骤：

①、溪黄草水溶性总黄酮的制备：取溪黄草药材，打粗粉，加入10BV的水煎提，1.5h，3次，过滤并合并滤液，浓缩至1.6mg/mL，过HPD100大孔树脂，湿法上样，流速控制在2BV/h，4BV水洗，5BV的95％乙醇洗脱，收集95％乙醇洗脱液，浓缩回收乙醇，乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯层，水层除去少量乙酸乙酯，浓缩至2.0mg/mL，再湿法上80-100目聚酰胺柱，流速2BV/h，2BV水洗，6BV30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩、干燥，即得。

②、对照品溶液的制备：精密称取新西兰牡荆苷-2对照品，用水配制成每1mL含新西兰牡荆苷-2 0.2～0.5mg/mL的溶液，作为对照品溶液。

③、供试品溶液的制备：精密称取溪黄草水溶性总黄酮粉末，用水配制成每1mL含溪黄草水溶性总黄酮0.5～1.0mg/mL的溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

④、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为甲醇与冰乙酸水溶液组成的梯度洗脱液，紫外检测：波长300-400nm。

⑤、测定：精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

所述指纹图谱中有12个特征共有峰，其中1号色谱峰为新西兰牡荆苷-2参照峰，最强峰为3号色谱峰，图谱总长度为110min，具体如下： 

按照本发明所制备的溪黄草水溶性总黄酮的指纹图谱中有12个特征共有峰，其中1号色谱峰为新西兰牡荆苷-2参照峰，最强峰为3号色谱峰，图谱总长度为110min，其中单峰面积超总峰面积2％的有10个，它们是1、2、3、4、5、6、7、8、9、11号色谱峰，其中单峰面积超总峰面积10％的有4个，它们是1、3、4、8号色谱峰，其中单峰面积超总峰面积15％的有3个，它们是1、3、8号色谱峰，其中单峰面积超总峰面积20％的有2个，它们是1、3号色谱峰。

具体如下： 

1号峰，平均保留时间RT为27.51min，RSD为0.50％，峰面积为4350095.0，RSD为31.57％；

2号峰，平均保留时间RT为39.60min，RSD为0.35％，峰面积为787286.2，RSD为32.74％；

3号峰，平均保留时间RT为44.17min，RSD为0.28％，峰面积为5153721.0，RSD为31.64％；

4号峰，平均保留时间RT为46.80min，RSD为0.27％，峰面积为2331366.0，RSD为36.27％；

5号峰，平均保留时间RT为57.63min，RSD为0.62％，峰面积为799540.2，RSD为27.53％；

6号峰，平均保留时间RT为60.82min，RSD为0.44％，峰面积为401560.2，RSD为32.41％；

7号峰，平均保留时间RT为63.41min，RSD为0.35％，峰面积为760259.2，RSD为29.30％；

8号峰，平均保留时间RT为67.24min，RSD为0.26％，峰面积为2896423.0，RSD为30.69％；

9号峰，平均保留时间RT为68.77min，RSD为0.22％，峰面积为645521.3，RSD为28.04％；

10号峰，平均保留时间RT为71.25min，RSD为0.18％，峰面积为145838.7，RSD为33.18％；

11号峰，平均保留时间RT为76.82min，RSD为0.16％，峰面积为477461.3，RSD为40.66％；

12号峰，平均保留时间RT为92.48min，RSD为0.10％，峰面积为176274.2，RSD为64.53％；

RT为5min以前出现的峰为溶剂峰。

本发明的原理是从溪黄草的水溶性成分研究发现，溪黄草水溶性成分主要为水溶性黄酮碳苷类化合物，且该类化合物具有多方面的生物活性。富集纯化得到溪黄草水溶性总黄酮，建立HPLC指纹图谱检测方法，其水溶性总黄酮的指纹图谱能从色谱的整体面貌上体现溪黄草水溶性黄酮成分含量情况。用本方法测定从市面上收集的溪黄草水溶性总黄酮均能得到相同、相近的指纹图谱。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明所提供的方法所制备的溪黄草水溶性总黄酮，能进行进一步的药理药效学实验，为进一步开发利用溪黄草资源提供科学依据。

(2)指纹图谱注重各个构成指纹特征峰的前后顺序相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定个别化学城分而判定溪黄草水提物整体质量的片面性，又减少了为质量达标而认为处理的可能性。

(3)本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

(4)该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。

附图说明

图1 溪黄草水溶性总黄酮的HPLC指纹图谱。

图2 10批溪黄草药材的水溶性总黄酮特征指纹图谱。

图3 溪黄草水溶性总黄酮HPLC共有模式的指纹图谱。

具体实施方式

为能进一步了解本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，解析本发明的优点与精神，藉由以下结合附图与具体实施方式对本发明的详述得到进一步的了解。

实施例一：检测溪黄草水溶性总黄酮的指纹图谱

1.仪器与试药 

1.1仪器  实验室专用超纯水机(重庆利迪现代水技术设备有限公司)；家用万能粉碎机FZ-230型(温岭市牧屿百乐机床厂)；超声波清洗器(ULTRASONIC；360w，250kHz)；电热恒温水浴锅DK-98-11A；电热鼓风干燥箱101-1AB型；FEJ-200电子称(d＝0.1g)；万分之一电子天平(Sartorius BP110s，德国sartorius公司)；十万分之一电子天平(Sartorius CP2250，德国sartorius公司)；日本岛津高效液相色谱仪1(SIL-20A prominence AUTO SAMPLER,LC-20AT prominence LIQUID CHROMATOGRAPH,DGU-20A5 prominence DEGASSER,SPD-M20A prominence DIODE ARRAY DETECTOR,CTO-20A prominence column oven)；日本岛津高效液相UV-1色谱仪2(SIL-20A prominence Auto sampler、SPD-20A prominence UV/VIS Detector、 DGU-20A5prominence Degasser、LC-20AT prominence Liquid chromatograph、CTO-20A prominence Column oven)；高效液相柱：Dikma Diamonsil(2)(C18250mm×4.6mm，5μm)柱；

1.2试剂  新西兰牡荆苷-2对照品(广州中医药大学新药中心，为自己分离，纯度98％)；甲醇(色谱纯,德国Merck公司)；冰乙酸(AR级，天津市大茂化学试剂厂)；重蒸去离子水(实验室制备)。

2.高效液相色谱 

2.1色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为甲醇-冰乙酸水溶液组成的梯度洗脱液，流速为0.8mL/min，柱温：25℃，紫外检测波长为334nm，时间110min。

梯度洗脱程序如下表：

梯度洗脱条件 

2.2溪黄草水溶性总黄酮的制备：取溪黄草药材5.0g，打粗粉，加入10BV的水煎提，1.5h，3次，过滤并合并滤液，浓缩至1.6mg/mL，过HPD100大孔树脂，湿法上样，流速控制在2BV/h，4BV水洗，5BV的95％乙醇洗脱，收集95％乙醇洗脱液，浓缩回收乙醇，乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯层，水层除去少量乙酸乙酯，浓缩至2.0mg/mL，再湿法上80-100目聚酰胺柱，流速2BV/h，2BV水洗，6BV30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩、干燥，即得；

2.3对照品溶液的制备：对照品溶液的制备，采用精密称取新西兰牡荆苷-2 粉末2.50mg，置于10mL具塞锥形瓶中，加水溶解，定溶至刻度，配成0.25mg/mL的新西兰牡荆苷-2溶液，即得。

2.4供试品溶液的制备：供试品溶液的制备，采用精密称取溪黄草水溶性总黄酮粉末20.00mg，置于25mL具塞锥形瓶中，加20mL水，超声溶解，放冷，加水定容至25mL，配制成0.80mg/mL的溪黄草水溶性总黄酮溶液，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得。

2.5测定：精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μL注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱，如图1。

实施例二：10批溪黄草药材水溶性总黄酮指纹图谱

取溪黄草药材10批次，按实施例一方法制备溪黄草水溶性总黄酮并按实施例一条件进行检测，得10批样品的HPLC图谱。通过10批HPLC图谱的比较，进行相似度评价，确定其特征共有峰：

指纹图谱中有12个特征共有峰，现将图谱的保留时间、峰面积的平均值以及点总峰面积汇总，具体如下：

1号峰，平均保留时间RT为27.51min，RSD为0.50％，峰面积为4350095.0，RSD为31.57％；

2号峰，平均保留时间RT为39.60min，RSD为0.35％，峰面积为787286.2，RSD为32.74％；

3号峰，平均保留时间RT为44.17min，RSD为0.28％，峰面积为5153721.0，RSD为31.64％；

4号峰，平均保留时间RT为46.80min，RSD为0.27％，峰面积为2331366.0，RSD为36.27％；

5号峰，平均保留时间RT为57.63min，RSD为0.62％，峰面积为799540.2，RSD为27.53％；

6号峰，平均保留时间RT为60.82min，RSD为0.44％，峰面积为401560.2，RSD为32.41％；

7号峰，平均保留时间RT为63.41min，RSD为0.35％，峰面积为760259.2， RSD为29.30％；

8号峰，平均保留时间RT为67.24min，RSD为0.26％，峰面积为2896423.0，RSD为30.69％；

9号峰，平均保留时间RT为68.77min，RSD为0.22％，峰面积为645521.3，RSD为28.04％；

10号峰，平均保留时间RT为71.25min，RSD为0.18％，峰面积为145838.7，RSD为33.18％；

11号峰，平均保留时间RT为76.82min，RSD为0.16％，峰面积为477461.3，RSD为40.66％；

12号峰，平均保留时间RT为92.48min，RSD为0.10％，峰面积为176274.2，RSD为64.53％；

RT为5min以前出现的峰为溶液峰。

所述溪黄草水溶性总黄酮的指纹图谱中有12个特征共有峰，其中1号色谱峰为新西兰牡荆苷-2参照峰，最强峰为3号色谱峰，图谱总长度为110min，其中单峰面积超总峰面积2％的有10个，它们是1、2、3、4、5、6、7、8、9、11号色谱峰，其中单峰面积超总峰面积10％的有4个，它们是1、3、4、8号色谱峰，其中单峰面积超总峰面积15％的有3个，它们是1、3、8号色谱峰，其中单峰面积超总峰面积20％的有2个，它们是1、3号色谱峰。

相似度评价：将10批溪黄草水溶性总黄酮的色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(中国药典委员会2004A版)”，选1号峰(新西兰牡荆苷-2)作为参照，如图2，确定了12个共有峰。采用中位数法自动匹配自动生成对照谱R，得各药材相似度。10批次溪黄草的相似度大于0.90。见表1。

表1  10批溪黄草药材水溶性总黄酮指纹图谱的相似度

通过上述方法所建立的溪黄草水溶性总黄酮HPLC共有模式的指纹图谱如图3所示。

以上所述实施例仅表达了本发明的部分实施方式，于此所揭示的实施例与所有观点，应被视为用以说明本发明，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以权利要求为准，并涵盖合法均等物。

Claims (5)

1.一种溪黄草水溶性总黄酮及其指纹图谱检测方法，其包括以下步骤 ：

①、溪黄草水溶性总黄酮的制备 ：取溪黄草药材，打粗粉，加入10BV的水煎提，1.5h，3次，过滤并合并滤液，浓缩至1.6mg/mL，过HPD100大孔树脂，湿法上样，流速控制在2BV/h，4BV水洗，5BV的95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱液，浓缩回收乙醇，乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯层，水层除去少量乙酸乙酯，浓缩至2.0mg/mL，再湿法上80-100目聚酰胺柱，流速2BV/h，2BV水洗，6BV30%乙醇洗脱，收集30%乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩、干燥，即得；

、对照品溶液的制备：精密称取新西兰牡荆苷-2对照品，用水配制成每1mL含新西兰牡荆苷-2　0.2～0.5mg/mL的溶液，作为对照品溶液；

、供试品溶液的制备：精密称取溪黄草水溶性总黄酮粉末，用水配制成每1mL含溪黄草水溶性总黄酮0.5～1.0mg/mL的溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液；

、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为甲醇与冰乙酸水溶液组成的梯度洗脱液，紫外检测：波长300-400nm；

、测定：精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的一种溪黄草水溶性总黄酮及其指纹图谱检测方法，其特征在于：

所述步骤对照品溶液的制备，采用精密称取新西兰牡荆苷-2粉末2.50mg，置于10 mL具塞锥形瓶中，加水溶解，定溶至刻度，配成0.25mg/mL的新西兰牡荆苷-2溶液，即得；

所述步骤供试品溶液的制备，采用精密称取溪黄草水溶性总黄酮粉末20.00mg，置于25 mL具塞锥形瓶中，加20 mL水，超声溶解，放冷，加水定容至25 mL，配制成0.80mg/mL的溪黄草水溶性总黄酮溶液，过0.45 μm滤膜，取续滤液，即得；

所述步骤色谱条件，采用色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为甲醇与0.2～2.0%冰乙酸水溶液组成的梯度洗脱液；柱温20～40℃；紫外检测：波长300-400nm；流速：0.5～1.2ml/min；时间：80～120min;

所速步骤测定，采用精密吸取供试品溶液10μL注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法则定，得到指纹图谱。

3.根据权利要求1所述的一种溪黄草水溶性总黄酮及其指纹图谱检测方法，其特征在于：

所述步骤色谱条件中流动相为甲醇与0.5%冰乙酸水溶液组成的梯度洗脱液，柱温：25℃；检测波长为334nm；流速为0.8ml/min；分析时间为110min。

4.根据权利要求2或3所述的一种溪黄草水溶性总黄酮及其指纹图谱检测方法，其特征在于：

所述步骤色谱条件中所述的梯度洗脱，梯度洗脱程序以如下体积浓度配置进行：

0分钟时，流动相A为25%的甲醇溶液、流动相B为75%的0.5%冰乙酸水溶液；

25分钟时，流动相A为32%的甲醇溶液、流动相B为68%的0.5%冰乙酸水溶液；

40分钟时，流动相A为32%的甲醇溶液、流动相B为68%的0.5%冰乙酸水溶液；

45分钟时，流动相A为34%的甲醇溶液、流动相B为66%的0.5%冰乙酸水溶液；

70分钟时，流动相A为36%的甲醇溶液、流动相B为64%的0.5%冰乙酸水溶液；

90分钟时，流动相A为50%的甲醇溶液、流动相B为50%的0.5%冰乙酸水溶液；

110分钟时，流动相A为55%的甲醇溶液、流动相B为45%的0.5%冰乙酸水溶液。

5.一种溪黄草水溶性总黄酮及其指纹图谱检测方法，其特征在于：

溪黄草水溶性总黄酮指纹图谱的建立，具体包括如下步骤：

①、溪黄草水溶性总黄酮的制备 ：取溪黄草药材，打粗粉，加入10BV的水煎提，1.5h，3次，过滤并合并滤液，浓缩至1.6mg/mL，过HPD100大孔树脂，湿法上样，流速控制在2BV/h，4BV水洗，5BV的95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱液，浓缩回收乙醇，乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯层，水层除去少量乙酸乙酯，浓缩至2.0mg/mL，再湿法上80-100目聚酰胺柱，流速2BV/h，2BV水洗，6BV30%乙醇洗脱，收集30%乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩、干燥，即得；

、对照品溶液的制备：精密称取新西兰牡荆苷-2对照品，用水配制成每1mL含新西兰牡荆苷-2　0.2～0.5mg/mL的溶液，作为对照品溶液；

、供试品溶液的制备：精密称取溪黄草水溶性总黄酮粉末，用水配制成每1mL含溪黄草水溶性总黄酮0.5～1.0mg/mL的溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液；

、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为甲醇与冰乙酸水溶液组成的梯度洗脱液，紫外检测：波长300-400nm；

、测定：精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱；

所述指纹图谱中有12个特征共有峰，其中1号色谱峰为新西兰牡荆苷-2参照峰，最强峰为3号色谱峰，图谱总长度为110min，具体如下：

1号峰，平均保留时间RT为27.51min，RSD为0.50%，峰面积为4350095.0，RSD为31.57%；

2号峰，平均保留时间RT为39.60min，RSD为0.35%，峰面积为787286.2，RSD为32.74%；

3号峰，平均保留时间RT为44.17min，RSD为0.28%，峰面积为5153721.0，RSD为31.64%；

4号峰，平均保留时间RT为46.80min，RSD为0.27%，峰面积为2331366.0，RSD为36.27%；

5号峰，平均保留时间RT为57.63min，RSD为0.62%，峰面积为799540.2，RSD为27.53%；

6号峰，平均保留时间RT为60.82min，RSD为0.44%，峰面积为401560.2，RSD为32.41%；

7号峰，平均保留时间RT为63.41min，RSD为0.35%，峰面积为760259.2，RSD为29.30%；

8号峰，平均保留时间RT为67.24min，RSD为0.26%，峰面积为2896423.0，RSD为30.69%；

9号峰，平均保留时间RT为68.77min，RSD为0.22%，峰面积为645521.3，RSD为28.04%；

10号峰，平均保留时间RT为71.25min，RSD为0.18%，峰面积为145838.7，RSD为33.18%；

11号峰，平均保留时间RT为76.82min，RSD为0.16%，峰面积为477461.3，RSD为40.66%；

12号峰，平均保留时间RT为92.48min，RSD为0.10%，峰面积为176274.2，RSD为64.53%。