CN108426959A - 一种山楂黄酮类成分uplc指纹图谱的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种山楂黄酮类成分UPLC指纹图谱的构建方法：将山楂提取液过大孔树脂和聚酰胺树脂柱，获得供试品溶液；以儿茶素，表儿茶素，牡荆素鼠李糖苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素为对照品；测定10批以上山楂并进行分析比较，得到由23个共有特征峰构成的山楂黄酮类成分UPLC指纹图谱。本发明通过大孔树脂和聚酰胺联用的方式对山楂提取液进行纯化和富集，解决了山楂中黄酮类有效成分含量较低，干扰大的问题；构建指纹图谱的方法精密度、重现性及稳定性均良好；用时仅有17分钟，可行性强；通过指纹图谱中共有峰的有无和指纹特征，可全面地对山楂饮片的质量进行评价，保证药材质量的稳定性及临床用药有有效性与安全性。

Description

一种山楂黄酮类成分UPLC指纹图谱的构建方法
技术领域
本发明涉及中药质量检测技术领域，特别是涉及一种山楂黄酮类成分UPLC指纹图谱的构建方法及其指纹图谱。
背景技术
山楂是一种药食两用的中药，具有消食健胃、行气散瘀，化浊降脂的功效。用于肉食积滞，胃脘胀满，泻痢腹痛，瘀血经闭，产后瘀阻，心腹刺痛，胸痹心痛，疝气疼痛，髙脂血症。中药指纹图谱是指某种（某产地）中药所共有的具有特征性的某类或某几类成分的色谱或者光谱图谱。中药指纹图谱因其具有整体性、模糊性和可量化的特点，能够全面地反应中药的内在质量，目前已成为中药质量控制最有效的方法之一。然而，目前山楂的标准中尚无指纹图谱的规定，对药材质量的控制就显得非常薄弱，缺乏完善的质量评价体系，难以达到对山楂质量的有效控制。
山楂中的黄酮类成分是主要活性成分，文献报道在心血管、脂质代谢、抗氧化等多方面具有重要的生物活性；山楂黄酮具有保护实验性大鼠急性心肌缺血活性、调节大鼠肝脏LDLR转录水平和提高抗氧化能力抑制脂质过氧化物预防脂质代谢紊乱、降低高血脂大鼠血清中胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的含量，升高大鼠血清中高密度脂蛋白胆固醇的含量等作用。同时山楂中黄酮类有效成分含量较低，受其他物质干扰大。
发明内容
针对现有技术中缺乏山楂指纹图谱、山楂中有效成分黄酮类物质分析易受干扰等问题，本发明提供一种山楂黄酮类成分UPLC指纹图谱的构建方法，用时短、可操作性强。
本发明的另一目的是采用上述方法获得的山楂黄酮类成分的UPLC指纹图谱。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种山楂黄酮类成分UPLC指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
（1）取HP-20型大孔树脂和100-200目聚酰胺树脂，加95%乙醇冲洗干净，备用；取直径为2cm的玻璃色谱柱，加聚酰胺3cm高，待聚酰胺沉降完全后，加HP-20型大孔树脂8cm高，用水冲至无乙醇味，得到玻璃色谱柱；
（2）称取山楂药材或饮片的粉末约2g，精密加入甲醇30mL，超声处理20-40min，滤过，滤液减压蒸干，残渣加水20mL温热超声溶解，放冷，获得山楂提取液；
（3）将步骤（1）中制备的山楂提取液缓缓加至步骤（1）的玻璃色谱柱上，加水40-60mL洗脱，之后再加20%乙醇40-60mL洗脱，两种洗脱液弃去；继续以70%乙醇100mL洗脱，收集70%乙醇洗脱液，蒸干，残渣用乙醇或甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，定容，作为供试品溶液；
（4）分别精确称取儿茶素，表儿茶素，牡荆素鼠李糖苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素对照品，加甲醇溶解，制成对照品储备液，再分别吸取一定体积的对照品储备液，混合为浓度分别约为100μg/mL、100μg/mL、25μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、10μg/mL的混合对照品溶液；
（5）精密吸取对照品溶液或供试品溶液2μL注入超高效液相色谱仪；
色谱条件：
色谱柱：waters T3色谱柱，填料粒径1.7μm，柱长100mm，柱内径2.1mm；
流动相：以乙腈（A）-0.3%磷酸水溶液（B）为流动相，采用以下梯度条件，进行梯度洗脱：
从0-4mim，流动相A的体积百分含量由10%提高至15%，流动相B的体积百分含量由90%降低至85%；
从4-9.5mim，流动相A的体积百分含量由15%提高至17%，流动相B的体积百分含量由85%降低至83%；
从9.5-11mim，流动相A的体积百分含量由17%提高至25%，流动相B的体积百分含量由83%降低至75%；
从11-17mim，流动相A的体积百分含量由25%提高至50%，流动相B的体积百分含量由75%降低至50%；
检测波长355nm，柱温：30℃，流速：0.4mL/min；
（6）测定10批以上山楂药材或饮片并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的山楂黄酮类成分UPLC指纹图谱。
步骤（2）中，所述粉末细度为过24目筛。
一种上述构建方法获得的山楂黄酮类成分的UPLC指纹图谱，所述UPLC指纹图谱是由23个共有指纹峰构成，相对保留时间分别为1.763 min，2.905 min，3.213 min，3.657min，4.097 min，4.297 min，4.557 min，4.776 min，5.284 min，5.637 min，5.801 min，6.547 min，6.847 min，7.42 min，7.861 min，8.36 min，8.881 min，10.396 min，10.708min，10.896 min，12.428 min，12.903 min，13.953 min。
本发明具有以下优点：
本发明通过大孔树脂和聚酰胺联用的方式对山楂提取液进行纯化和富集，解决了山楂中黄酮类有效成分含量较低，干扰大的问题；通过超高效液相色谱建立山楂黄酮类成分UPLC指纹图谱；构建指纹图谱的方法精密度、重现性及稳定性均良好；用时仅有17分钟，远低于同类方法，可行性强；通过指纹图谱中共有峰的有无，可全面地对山楂饮片的质量进行评价，保证药材质量的稳定性及临床用药有有效性与安全性。
附图说明
图1为山楂黄酮类成分的UPLC共有图谱：其中，2为儿茶素、5为表儿茶素、15为牡荆素鼠李糖苷、16为金丝桃苷、17为异槲皮苷、23为槲皮素；
图2为对照品的UPLC指纹图谱：1为儿茶素、2为表儿茶素、3为牡荆素鼠李糖苷、4为金丝桃苷、5为异槲皮苷、6为槲皮素；
图3为10批山楂的UPLC指纹图谱叠加图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 山楂黄酮类成分UPLC指纹图谱的构建
（1）取HP-20型大孔树脂和100-200目聚酰胺树脂，加95%乙醇冲洗干净，备用；取直径为2cm的玻璃色谱柱，加聚酰胺3cm高，待聚酰胺沉降完全后，加HP-20型大孔树脂8cm高，用水冲至无乙醇味，得到玻璃色谱柱；
（2）精确称取山楂饮片粉末2g（过24目），精密加入甲醇30mL，超声处理30min，滤过，滤液减压蒸干，残渣加水20mL温热超声溶解，放冷，获得山楂提取液；
（3）将步骤（1）中制备的山楂提取液缓缓加至步骤（1）的玻璃色谱柱上，加水50mL洗脱，之后再加20%乙醇50mL洗脱，两种洗脱液弃去；继续以70%乙醇100mL洗脱，收集70%乙醇洗脱液，蒸干，残渣用乙醇或甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，定容，作为供试品溶液；
（4）分别取儿茶素，表儿茶素，牡荆素鼠李糖苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素对照品适量，加甲醇溶解，制成浓度分别为281μg/mL、315μg/mL、234μg/mL、113μg/mL、490μg/mL、163μg/mL的对照品储备液溶液，分别吸取上述对照品储备液1mL、3mL、0.6mL、1mL、1mL、3mL混合均匀，得到儿茶素，表儿茶素，牡荆素鼠李糖苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素浓度分别为87.8μg/mL、98.4μg/mL、24.4μg/mL、11.8μg/mL、51μg/mL、10.2μg/mL的混合对照品溶液；
（5）精密吸取对照品溶液或供试品溶液2μL注入超高效液相色谱仪；
色谱条件：
色谱柱：waters T3色谱柱，填料粒径1.7μm，柱长100mm，柱内径2.1mm；
流动相：以乙腈（A）-0.3%磷酸水溶液（B）为流动相，采用表1梯度条件，进行梯度洗脱：
表1 梯度条件
检测波长355nm，柱温：30℃，流速：0.4mL/min；
（6）测定20批山楂饮片并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的山楂黄酮类成分UPLC指纹图谱，如图1所示，包含23个共有特征峰，其中2号峰为儿茶素，5号峰为表儿茶素，15号峰为牡荆素鼠李糖苷，16号峰为金丝桃苷，17号峰为异槲皮苷，23号峰为槲皮素。
选定20批样品，将其导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，选取时间窗宽度为0.1min，以中位数生成对照谱图，经过多点校正后自动匹配，生成山楂黄酮类指纹图谱共有模式，以16号峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的23个共有峰的相对保留时间见表2。
表2 10批山楂样品共有峰
实施例2 标准指纹图谱构建方法的精密度
取实施例1中同一供试品溶液，连续进样5次，以16号峰为参照峰，计算出1-23号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值（表3、表4）均小于3%，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.90，表明仪器方法稳定，精密度良好。
表3 同一供试品连续进样5次相对峰面积RSD
表4 同一供试品连续进样5次相对保留时间RSD
实施例3 标准指纹图谱构建方法的重复性
取实施例1中同一批山楂饮片粉末，精密称取6份，按实施例1中供试品制备方法平行制备6份供试品溶液，分别进样，以16号峰为参照峰，计算出1-23号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值（表5、表6）均小于3%，表明所述构建方法重现性良好。
表5 同一样品连续进样6次相对峰面积RSD
编号 重复性1 重复性2 重复性3 重复性4 重复性5 重复性6 均值 SD RSD
1 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.22 0.21 0.003550 1.7%
2 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.36 0.35 0.004404 1.3%
3 0.38 0.38 0.39 0.38 0.39 0.38 0.38 0.001459 0.4%
4 0.44 0.44 0.44 0.44 0.45 0.44 0.44 0.003168 0.7%
5 0.49 0.49 0.49 0.49 0.50 0.51 0.50 0.008358 1.7%
6 0.51 0.51 0.51 0.52 0.51 0.53 0.52 0.005270 1.0%
7 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55 0.56 0.55 0.004922 0.9%
8 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.59 0.57 0.007305 1.3%
9 0.63 0.64 0.63 0.63 0.64 0.65 0.64 0.008475 1.3%
10 0.67 0.68 0.68 0.67 0.68 0.69 0.68 0.005124 0.8%
11 0.69 0.69 0.69 0.67 0.69 0.70 0.69 0.008436 1.2%
12 0.78 0.78 0.78 0.79 0.78 0.80 0.79 0.006437 0.8%
13 0.82 0.81 0.82 0.83 0.82 0.83 0.82 0.006447 0.8%
14 0.89 0.90 0.89 0.89 0.90 0.90 0.89 0.004923 0.6%
15 0.94 0.95 0.95 0.94 0.96 0.96 0.95 0.007752 0.8%
16 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.000000 0.0%
17 1.06 1.07 1.07 1.06 1.07 1.08 1.07 0.005756 0.5%
18 1.24 1.25 1.25 1.24 1.28 1.26 1.25 0.013871 1.1%
19 1.28 1.28 1.28 1.29 1.29 1.30 1.29 0.005893 0.5%
20 1.30 1.32 1.32 1.36 1.36 1.33 1.33 0.024998 1.9%
21 1.49 1.51 1.52 1.53 1.53 1.54 1.52 0.017308 1.1%
22 1.54 1.55 1.55 1.54 1.54 1.56 1.55 0.008082 0.5%
23 1.67 1.68 1.68 1.67 1.69 1.72 1.68 0.018858 1.1%
表6 同一供试品连续进样6次相对保留时间RSD
编号 保留时间 重复性1 重复性2 重复性3 重复性4 重复性5 重复性6 均值 SD RSD
1 1.763 0.051 0.051 0.052 0.053 0.051 0.053 0.05 0.00133 2.6%
2 2.905 0.421 0.423 0.427 0.446 0.421 0.421 0.43 0.00993 2.3%
3 3.213 0.100 0.101 0.103 0.106 0.100 0.100 0.10 0.00230 2.3%
4 3.657 0.036 0.034 0.036 0.034 0.036 0.036 0.04 0.00107 3.0%
5 4.097 0.030 0.032 0.032 0.031 0.032 0.031 0.03 0.00085 2.7%
6 4.297 0.024 0.023 0.024 0.025 0.023 0.025 0.02 0.00058 2.4%
7 4.557 0.024 0.025 0.025 0.023 0.024 0.025 0.02 0.00066 2.7%
8 4.776 0.039 0.037 0.039 0.038 0.039 0.040 0.04 0.00090 2.3%
9 5.284 0.028 0.027 0.028 0.028 0.028 0.029 0.03 0.00055 2.0%
10 5.637 0.039 0.036 0.037 0.038 0.039 0.037 0.04 0.00125 3.3%
11 5.801 0.180 0.185 0.188 0.180 0.180 0.180 0.18 0.00341 1.9%
12 6.547 0.044 0.045 0.045 0.047 0.044 0.044 0.04 0.00105 2.3%
13 6.847 0.146 0.146 0.155 0.147 0.146 0.146 0.15 0.00387 2.6%
14 7.42 0.023 0.023 0.023 0.022 0.023 0.023 0.02 0.00052 2.3%
15 7.861 0.129 0.138 0.131 0.134 0.129 0.129 0.13 0.00350 2.7%
16 8.36 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.00 0.00000 0.0%
17 8.881 0.586 0.564 0.574 0.569 0.586 0.586 0.58 0.00982 1.7%
18 10.396 0.021 0.021 0.022 0.022 0.021 0.021 0.02 0.00048 2.2%
19 10.708 0.020 0.020 0.020 0.021 0.021 0.020 0.02 0.00060 3.0%
20 10.896 0.045 0.044 0.044 0.043 0.045 0.045 0.04 0.00086 1.9%
21 12.428 0.067 0.069 0.067 0.065 0.067 0.067 0.07 0.00120 1.8%
22 12.903 0.083 0.087 0.086 0.086 0.083 0.083 0.08 0.00180 2.1%
23 13.953 0.048 0.046 0.049 0.049 0.048 0.048 0.05 0.00089 1.9%
实施例4 标准指纹图谱的稳定性
取同一份供试品溶液，分别于0，2，4，8，16，24h进样检测，以16号峰为参照峰，计算出1-23号共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值（表7、表8）均小于3%，表明供试品溶液至少在24小时内稳定。
表7 同一供试品溶液24h内进样相对峰面积RSD
编号 0 2 4 8 16 24 均值 SD RSD
1 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.001802 0.8%
2 0.35 0.35 0.35 0.35 0.36 0.36 0.35 0.004884 1.4%
3 0.38 0.38 0.38 0.38 0.39 0.39 0.38 0.004099 1.1%
4 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.45 0.44 0.003211 0.7%
5 0.49 0.49 0.49 0.49 0.51 0.52 0.50 0.014062 2.8%
6 0.51 0.51 0.52 0.53 0.53 0.53 0.52 0.010105 1.9%
7 0.55 0.55 0.55 0.55 0.54 0.57 0.55 0.012004 2.2%
8 0.57 0.57 0.57 0.57 0.56 0.58 0.57 0.006508 1.1%
9 0.63 0.63 0.64 0.63 0.64 0.65 0.64 0.008156 1.3%
10 0.67 0.67 0.67 0.68 0.68 0.69 0.68 0.005261 0.8%
11 0.69 0.69 0.70 0.68 0.69 0.69 0.69 0.006737 1.0%
12 0.78 0.78 0.79 0.79 0.79 0.80 0.79 0.005223 0.7%
13 0.82 0.82 0.82 0.82 0.82 0.83 0.82 0.004205 0.5%
14 0.89 0.89 0.89 0.90 0.91 0.91 0.90 0.010785 1.2%
15 0.94 0.94 0.96 0.95 0.96 0.95 0.95 0.007974 0.8%
16 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0 0.0%
17 1.06 1.06 1.07 1.06 1.06 1.08 1.07 0.005931 0.6%
18 1.24 1.24 1.25 1.24 1.25 1.26 1.25 0.006123 0.5%
19 1.28 1.28 1.29 1.29 1.29 1.30 1.29 0.006535 0.5%
20 1.30 1.30 1.33 1.34 1.37 1.33 1.33 0.025503 1.9%
21 1.49 1.51 1.52 1.53 1.53 1.58 1.52 0.029716 2.0%
22 1.54 1.54 1.55 1.54 1.55 1.58 1.55 0.013589 0.9%
23 1.67 1.68 1.69 1.66 1.69 1.72 1.69 0.021256 1.3%
表8 同一供试品溶液24h内进样相对保留时间RSD
编号 保留时间 0 2 4 8 16 24 均值 SD RSD
1 1.763 0.051 0.050 0.050 0.050 0.048 0.048 0.05 0.00136 2.7%
2 2.905 0.421 0.422 0.420 0.420 0.417 0.416 0.42 0.00219 0.5%
3 3.213 0.100 0.102 0.101 0.098 0.100 0.095 0.10 0.00242 2.4%
4 3.657 0.036 0.035 0.034 0.034 0.034 0.034 0.03 0.00088 2.5%
5 4.097 0.030 0.031 0.030 0.029 0.029 0.029 0.03 0.00085 2.9%
6 4.297 0.023 0.023 0.022 0.022 0.022 0.021 0.02 0.00060 2.7%
7 4.557 0.024 0.023 0.023 0.023 0.023 0.022 0.02 0.00063 2.7%
8 4.776 0.039 0.039 0.039 0.038 0.038 0.037 0.04 0.00084 2.2%
9 5.284 0.028 0.027 0.027 0.027 0.027 0.026 0.03 0.00081 3.0%
10 5.637 0.039 0.039 0.041 0.039 0.039 0.038 0.04 0.00107 2.7%
11 5.801 0.180 0.180 0.179 0.177 0.177 0.177 0.18 0.00161 0.9%
12 6.547 0.044 0.045 0.045 0.043 0.043 0.042 0.04 0.00083 1.9%
13 6.847 0.146 0.143 0.144 0.143 0.143 0.142 0.14 0.00114 0.8%
14 7.42 0.023 0.022 0.023 0.022 0.022 0.022 0.02 0.00048 2.1%
15 7.861 0.129 0.128 0.127 0.127 0.126 0.125 0.13 0.00150 1.2%
16 8.36 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.00 0.00000 0.0%
17 8.881 0.586 0.564 0.572 0.562 0.582 0.568 0.57 0.00973 1.7%
18 10.396 0.021 0.021 0.020 0.021 0.021 0.021 0.02 0.00057 2.7%
19 10.708 0.020 0.020 0.021 0.021 0.020 0.020 0.02 0.00058 2.8%
20 10.896 0.045 0.044 0.044 0.042 0.043 0.043 0.04 0.00090 2.1%
21 12.428 0.067 0.067 0.066 0.063 0.064 0.064 0.07 0.00167 2.6%
22 12.903 0.083 0.084 0.085 0.086 0.084 0.083 0.08 0.00099 1.2%
23 13.953 0.048 0.046 0.045 0.045 0.045 0.045 0.05 0.00111 2.4%

Claims (3)

1.一种山楂黄酮类成分UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取HP-20型大孔树脂和100-200目聚酰胺树脂，加95%乙醇冲洗干净，备用；取直径为2cm的玻璃色谱柱，加聚酰胺3cm高，待聚酰胺沉降完全后，加HP-20型大孔树脂8cm高，用水冲至无乙醇味，得到玻璃色谱柱；
（2）称取山楂药材或饮片的粉末约2g，精密加入甲醇30mL，超声处理20-40min，滤过，滤液减压蒸干，残渣加水20mL温热超声溶解，放冷，获得山楂提取液；
（3）将步骤（1）中制备的山楂提取液缓缓加至步骤（1）的玻璃色谱柱上，加水40-60mL洗脱，之后再加20%乙醇40-60mL洗脱，两种洗脱液弃去；继续以70%乙醇100mL洗脱，收集70%乙醇洗脱液，蒸干，残渣用乙醇或甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，定容，作为供试品溶液；
（4）分别精确称取儿茶素，表儿茶素，牡荆素鼠李糖苷，金丝桃苷，异槲皮苷，槲皮素对照品，加甲醇溶解，制成对照品储备液，再分别吸取一定体积的对照品储备液，混合为浓度分别约为100μg/mL、100μg/mL、25μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、10μg/mL的混合对照品溶液；
（5）精密吸取对照品溶液或供试品溶液2μL注入超高效液相色谱仪；
色谱条件：
色谱柱：waters T3色谱柱，填料粒径1.7μm，柱长100mm，柱内径2.1mm；
流动相：以乙腈（A）-0.3%磷酸水溶液（B）为流动相，采用以下梯度条件，进行梯度洗脱：
从0-4mim，流动相A的体积百分含量由10%提高至15%，流动相B的体积百分含量由90%降低至85%；
从4-9.5mim，流动相A的体积百分含量由15%提高至17%，流动相B的体积百分含量由85%降低至83%；
从9.5-11mim，流动相A的体积百分含量由17%提高至25%，流动相B的体积百分含量由83%降低至75%；
从11-17mim，流动相A的体积百分含量由25%提高至50%，流动相B的体积百分含量由75%降低至50%；
检测波长355nm，柱温：30℃，流速：0.4mL/min；
（6）测定10批以上山楂药材或饮片并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的山楂黄酮类成分UPLC指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，所述粉末细度为过24目筛。
3.一种如权利要求1或2所述的构建方法获得的山楂黄酮类成分的UPLC指纹图谱，其特征在于，所述UPLC指纹图谱是由23个共有指纹峰构成，相对保留时间分别为1.763 min，2.905 min，3.213 min，3.657 min，4.097 min，4.297 min，4.557 min，4.776 min，5.284min，5.637 min，5.801 min，6.547 min，6.847 min，7.42 min，7.861 min，8.36 min，8.881min，10.396 min，10.708 min，10.896 min，12.428 min，12.903 min，13.953 min。
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